KR20140118680A

KR20140118680A - 생체분자와 단일가닥핵산의 결합정보를 생성하기 위한 기준물질 및 핵산칩, 이들의 제조방법 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 장치

Info

Publication number: KR20140118680A
Application number: KR1020130125675A
Authority: KR
Inventors: 김성천
Original assignee: 김성천
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2014-10-08
Also published as: US20160362720A1; KR101829668B1; US10072286B2

Abstract

본 발명은 둘 또는 그 이상의 생체분자들로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들과 분석단일가닥핵산의 결합정보 생성을 위한 기준물질 및 핵산칩, 이들의 제조방법, 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법에 관한 것으로 기준물질 및 핵산칩은 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 것에 사용된다.

Description

생체분자와 단일가닥핵산의 결합정보를 생성하기 위한 기준물질 및 핵산칩, 이들의 제조방법 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 장치{Nucleic acid chip and Reference Substance for Obtaining Bind information of sigle-stranded nucleic acid and Biomolecule, Manufacturing Method Thereof, and Method and apparatus for analyzing Biomolecules Using Nucleic acid chip and Reference Substances}

본 발명은 둘 또는 그 이상의 생체분자들로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들의 생물학적 의미 예측을 기준물질 및 핵산칩, 이들의 제조방법, 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 장치에 관한 것이다.

생체시료를 구성하는 수많은 생체분자(단백질 및 탄소화물)들의 프로파일을 생산하는 기술은, 물리학, 생화학 및 생물정보학의 발달로 널리 개발되었으나, 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 장치에 대한 필요성이 매우 높다.

생체분자를 포함하는 생체시료에서 이들 생체분자들의 양적인 상태를 종합화한 정보, 즉 생체분자의 프로파일(profile)을 생산하는 방법은, 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 목표를 이루기 위한 하나의 수단이지만, 미생물, 세포, 조직 등에 유용하게 사용할 수 있어 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다.

생체시료에 있는 생체분자들의 프로파일을 이용한 생물학적 의미를 분석하기 위한 임상 의사 결정 지원 시스템(Clinical Decision Support System)는 환자 진료에서 의사가 진단과 치료에 관한 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정을 지원하는 시스템이다. 임상 의사 결정 지원 시스템은 크게 사례 기반 기계학습 추론 시스템(Case Based Machine Learning Inference System)과 전문가 시스템(Expert System)으로 나누어진다. 사례 기반 기계학습 추론 시스템은 질환이 판정된 환자들의 임상 정보(Clinical Information) 및 생물학적 정보 즉 생체분자 프로파일데이터들을 수집한 후 기계학습을 이용하여 주어진 임상 정보와 생물학적 정보 등으로 질환을 추론 또는 판별할 수 있도록 하는 시스템이다. 전문가 시스템은 의학 전문가에 의해 사전에 정해진 규칙(Rule)을 사용하여 질병을 진단하는 시스템이다.

핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체이며 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로 인산, 당 및 퓨린(아데닌 또는 구아닌) 또는 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)이다. 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥으로 존재하고, 단일가닥핵산은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오티드들 간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 생성하는데, 이런 입체구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.

일반적으로 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)과 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 생성함으로써 효소적 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다.

핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 생성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 생성하여 안정화된다.

핵산이 단백질을 포함하는 분자에 대하여 하나의 단일가닥핵산(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들이 선별되고 있다.

특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법은 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 선별된 핵산을 소위 압타머(aptamer)라 한다(Tuerk C. and Gold L.; Science, 249, pp505-510, 1990).

이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질이나 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 핵산들(압타머들)이 선별되고 있다.

그러나, 기존의 SELEX를 통한 핵산선별방법은 특정물질(예, 단백질)에 특이적으로 결합하는 핵산을 선별하기에 앞서, 우선적으로 해당 단백질(특정물질)을 대량으로 생산하고 정제한 다음에, 생산된 단백질에 단일가닥핵산 라이브러리를 반응시키고 선택과 증폭을 반복하여 결합력이 강력한 핵산(압타머)을 선정하는 방법으로서, 핵산을 선별하기 위한 우선 특정물질을 확보하는 것이 필수적이었다. 따라서 종래의 SELEX를 통한 핵산 선별방법은, 생체시료에 포함된 수많은 미지의 생체분자들 집단에 의미를 가지는 집단으로서의 핵산들을 선별하고 이용하는 것에 관한 기술 사상은 전혀 인식하고 있지 아니하였다. 생체분자-단일가닥핵산의 선택은 다양한 방법으로 할 수 있는데, 생체분자를 고정시켜 복합체를 수확하고 세척하는 방법 및 모세관 전기영동방법 등이 있다.

생체시료인 조직, 세포덩어리, 세포 및 미생물 등을 구성하는 미지분자를 포함한 생체분자들의 프로파일은, 물리, 화학적인 성질을 이용하여 여러 가지 방법으로 만들어지고 있으며, 일반적으로 생체분자의 분자량 또는 pI값 등을 이용하여 전기영동을 하여 생체시료에서 생체분자의 양적인 상태인 생체분자의 프로파일을 확인하고 있다.

또한 프로파일을 분석하여 유용한 생체분자를 결정하고 이를 분리한 후, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) 등으로 이들의 구성성분을 확인하는 방법 등이 수행되고 있다. 최근에는 (SELDI-TOFMS(Surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)에 의해 단백질 프로파일에 대한 많은 연구가 진행되고 있다(Adam et al., Cancer Research, 62, 3609-3614. 2002; Li et al., Clinical Chemistry, 48, 1296-1304. 2002; and Petricoin et al., The Lancet, 359,572-577. 2002).

또한 최근에는 단백체에 대한 병렬고속분석(High Throughput Screening) 기법으로 단백질칩(Protein chip) 또는 압타머칩(Aptamer chip)(Smith et al., Mol Cell Protomics, 11-18. 2003; and McCauley et al., Anal Biochem, 319(2), 244-250. 2003)이 개발되어 사용되고 있다. 이런 병렬고속분석에는 사용되는 지지체로 유리슬라이드, 바이오센서의 감지표면, 비드, 나노입자 등이 있다.

단백질칩은 항체의 배열 상태를 알고 있기 때문에 특정물질의 구분 및 정량에 대한 탐색 및 분석이 가능하다. 단백질칩의 제작 방법에는 항체를 마이크로어레이어(Microarrayer)를 이용하여 스폿팅(spotting)하여 고정하는 방법이 있다. 단백질칩 감지기술은 단백질칩이 하나의 칩으로 가능한 많은 정보를 제공하기 위한 좁은 면적에 고밀도로 여러 항체들이 집적되어 있는 상태에서 발생하는 매우 약한 신호를 감지할 수 있어야 한다. 또한 단백질에 대한 생체정보가 늘어남에 따라 그 집적도가 더욱 높아질 추세로 발달하고 있어 이를 정량적으로 빠르고 정확하게 검출하는 새로운 방법이 요구되고 있다.

현재까지 검출방법은 주로 레이저 유발 형광법(laser induced fluorescence)이 많이 쓰이고 있으며 전기화학적 검출 방법 등이 개발되고 있다. 상기와 같이 다양한 과정을 통해 단백질칩을 이용한 생체시료에서특정 단백질들의 프로파일을 생산 및 분석하는 방법들이 개발되어 있지만 고가의 기기 및 시약을 사용하고 있으며 복잡한 과정을 수행해야 하는 등의 문제가 있으며 또한 항체를 제작할 수 있는 분자에 대해서만 제작이 가능한 한계가 있다.

압타머칩은 단백질칩에 항체를 사용하는 것 대신 압타머(핵산)를 사용하는 것이 상이하고 이외 다른 요소들은 매우 유사하다.

상기와 같이 단백질칩 및 압타머칩을 이용한 생체시료에서 생체분자의 양적인 상태 즉, 프로파일을 생산하는 방법들이 개발되어 있지만, 고가의 기기 및 시약을 사용하고 있으며 복잡한 과정을 수행해야 하는 등의 문제가 있다. 특히 지금까지의 단백질칩이나 압타머칩은 항체 또는 압타머를 제작할 수 있는 이미 알려진 단백질에 대해서만 제한적으로 제작이 가능한 한계가 있다.

생체시료는 수백만 개의 단백질로 구성되어 있다고 알려지고 있으나, 현재 알려진 단백질의 수는 수 만개에 불과한 실정이므로, 생체시료에서 미지의 단백질들과 같은 미지의 생체분자의 양적상태, 즉 프로파일을 생산하는 기술의 필요성은 매우 높다.

본 발명자는 단백체에 대한 프로파일을 생산하는 reverse-SELEX(대한민국 특허등록 10-0670799호 참조), 압타머기반 핵산칩 (대한민국 ?허등록 제10-0464225 참조) 및 압타머기반 핵산칩을 이용한 생물학적 의미 분석 기술(대한민국 특허등록 제10-0923048호 참조) 등을 제안하였으나, 단백체 프로파일을 생산하는 병렬고속분석할 때 적절한 기준물질 및 정도관리 방안을 제시하지 못 하고 있어 프로파일 생산 및 분석에 적절한 정도관리를 할 수 없는 문제점이 있어 본 발명은 이를 해결하기 위해 제안되었다.

생체시료의 생체분자를 총체적으로 분석하는 연구는, 의학적으로 질병에 관련된 생체분자의 프로파일을 분석함으로써, 질병을 진단할 수 있는 생체분자, 치료성적을 분석할 수 있는 생체분자, 질병 발병 및 진행에 중요한 역할을 하는 생체분자, 질병에 대한 감수성 관련된 생체분자, 및 신약개발의 표적분자를 구명하는 것에 사용할 있을 것이다.

본 발명의 목적은, 내부정도관리하면서 둘 또는 그 이상의 생체분자들로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들과 분석단일가닥핵산들의 결합정보 생성을 위한 기준물질, 핵산칩, 이들의 제공방법, 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 장치가 제공되며, 이들을 이용하여 효율적으로 생성한 결합정보로부터 생체분자들이 관련된 질병 정보를 포함한 각종 생물학적 의미를 분석할 수 있도록 하고자 하는 것이다.

본 발명에 따라, 내부정도관리하면서 둘 또는 그 이상의 생체분자들로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들과 분석단일가닥핵산의 결합정보 생성을 위한 기준물질 및 핵산칩, 이들의 제조방법, 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 장치가 제공되며, 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩은 생체시료에 포함된 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위해 사용되는 것이다.

상기 핵산칩은 하나 또는 그 이상의 물질을 동시에 분석하는 용도로 핵산으로 제조된 리간드가 고착된 지지체를 지칭한다. 지지체가 바람직하게는 고체유리 또는 나일론 기판일 수 있다. 핵산칩은 고체 유리 또는 나일론 기판위에 제작된 2차원 프로브 매트릭스로 나온다. 단일 핵산칩에서 가능한 많은 특징에 대한 분석을 수행하는 것이 매우 바람직하다. 이것은 단일 기판에서 프로브 밀도 및 양에 있어서의 상당한 증가를 필요로 한다. 일반적으로, 500m보다 작은 프로브 고정위치를 갖는 (즉, 제곱센티미터 당 400프로브보다 큰 밀도)마이크로어레이는 고밀도 마이크로어레이로 언급되고, 그렇지 않은 것들은 " 저밀도" 마이크로어레이이다. 일반적으로 핵산칩은 수 백 개 내지 수십만 개의 매우 다양한 염기서열을 가지는 핵산을 작은 공간에 배열시켜 고정된 기지(旣知)의 핵산과 미지(未知)의 핵산 시료와의 혼성화(hybridization)를 통하여 미지시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 핵산 마이크로어레이는 기존의 Southern blot, Norther blot, 돌연변이 검색 등을 대체하여 동시에 최소한 수백 개 이상의 염기서열 부위를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점을 가지고 있다.

일반적으로 기준물질은 정성정량분석, 각종 시험, 검사 시 비교를 위한 내부정도관리 물질로, 본 발명에서는 분석하고자하는 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들을 분석단일가닥핵산을 사용하여 분석하는데, 이런 정성정량 분석이 내부정도관리를 하기 위한 물질을 뜻한다. 상기 기준물질은 분석하고자하는 시료에 항상 일정량으로 존재하는 물질이 이상적이나 그렇지 못한 경우 시료에 포함되지 않는 물질인 외래물질을 사용할 수 있으며 바람직하게 분석하고자하는 시료가 생체시료인 경우 상기 생체시료에 포함되지 않는 외래생체분자들로 구성될 수 있다. 정도관리는 관리용 시료와 같은 외적기준을 사용하지 않고, 매회의 측정으로 얻을 수 있는 일군의 검사결과를 분석하여 측정치의 정밀도를 관리해 나가는 내부정도관리를 의미한다.

본 발명에서 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료에 있는 생체분자와 무작위 염기서열로 이루어진 무작위 단일가닥핵산인 핵산라이브러리를 반응시켜 확보되어 결정된 단일가닥핵산의 염기서열로 안정적인 이차구조가 예측되는 단일가닥핵산을 결합단일가닥핵산 그리고 상기 결합단일가닥핵산을 기초하여 제조된 핵산칩으로 생물학적 의미를 분석하기 위해 확보된 프로파일로 선정된 단일가닥핵산을 분석단일가닥핵산이라고 명명하였다. 또한, 상기 기준물질에 결합하는 단일가닥핵산으로 상기 정도관리 목적으로 결정된 단일가닥핵산을 정도관리 단일가닥핵산이라고 지칭하였다. 이런 단일가닥핵산은 모두 압타머의 일종이다.

본 발명에서 용어 압타머(aptamer)는 저분자 화합물로부터 단백질까지 다양한 종류의 리셉터에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 작은(20~60 뉴클레오타이드) 단일가닥핵산(DNA 또는 RNA) 조각을 뜻한다. 압타머의 개발은 셀렉스(SELEX)라는 방법을 통해 시험관에서 이루어진다. 셀렉스는 'Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment'의 약자로서 1990년에 처음으로 개발되었는데(Tuerk, C. and Gold, L., 1990, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249 (4968), 505-510; Ellington, A.D. and Szostak, J.W., 1990, In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346 (6287), 818-822), 이 방법을 이용하여 특정 분자에 높은 결합력을 갖는 핵산압타머를 얻게 된다. 압타머는 리셉터에 대해 나노몰-피코몰 수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 핵산분자로 여겨지고 있다. 압타머는 셀렉스를 통해 시험관에서 선별하게 된다. 셀렉스의 중심 원리는 많은 수의 무작위로 존재하는 개체 중에서 특정한 형질을 지니는 개체만이 생존하게 되고, 이렇게 생존한 개체는 그 집단 내에서 차지하는 비중이 점점 높아져 마침내 집단을 지배하게 되는 진화의 개념과 매우 유사하다. 단 셀렉스에서의 개체는 단일가닥핵산이며, 선택압은 특정 리셉터에 대한 결합력이 된다. 따라서 먼저 많은 수의 무작위(random) 서열을 가지는 핵산 라이브러리를 만들어야 하며, 이 라이브러리 내에 존재할 것으로 기대되는 특정 리셉터에 대해 높은 결합력을 가지는 개체를 골라낼 수 있는 분획과정이 필요하며, 골라낸 압타머를 증폭하여 핵산 풀 내에서의 비율을 증가시키고 다음 라운드의 선택을 진행할 수 있게 증폭단계가 필요하게 된다. 압타머의 셀렉스에 대한 구체적인 방법 및 시약/재료 등은 공지되어 있다(Marshall, K.A. and Ellington, A.D., 2000, In vitro selection of RNA aptamers. Methods Enzymol 318, 193-214; Fitzwater, T. and Polisky, B., 1996, A SELEX primer. Methods Enzymol 267, 275-301). 또한 본 발명자는 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들에 무작위 염기서열로 이루어진 무작위 단일가닥핵산으로 구성된 핵산라이브러리를 반응시켜 각각의 생체분자에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산을 선정하는 방법을 제안하였다(대한민국 특허등록 제10-0923048호).

본 발명은 무작위 염기서열로 구성된 무작위 단일가닥핵산으로 구성된 핵산라이브러리에서 둘 또는 그 이상의 생체분자들을 포함하는 생체시료에 있는 생체분자에 결합하는 결합단일가닥핵산 및 분석단일가닥핵산을 선정하기 위한 정도관리 기준물질을 사용하고 정도관리 단일가닥핵산을 핵산분석방법으로 분석하여 내부정도관리하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명자는 상기 생체시료에 있는 생체분자와 압타머를 반응시켜 생성된 생체분자-압타머 복합체에 있는 압타머를 핵산분석방법으로 분석하여 리셉터인 생체분자를 분석하는 방법(대한민국 특허등록 제 10-0670799호) 제안하였다. 상기 생체시료에 있는 생체분자와 압타머 복합체에 있는 압타머를 분석하는 핵산분석방법은 PCR(polymeras chain reaction), LCR(ligase chain reaction), SDA(strand displacement amplification), TMA(transcription-mediated amplification), bDNA(branched DNA), Invader 방법 및 RCA(rolling circle amplification) 등으로 할 수 이다. 바람직하게는 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체에 있는 단일가닥핵산을 주형으로 PCR하여 생성된 증폭산물을 추가적으로 분석하는 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 정도관리 기준물질은 상기 생체시료에 포함되지 않는 생체분자를 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

도1을 살펴보면, 상기 생체시료에 있는 생체분자 및 기준물질과 무작위 염기서열로 이루어진 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 상기 결합단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 결정한 후, 상기 결합단일가닥핵산의 염기서열을 기초하여 상기 제조된 핵산칩으로 분석단일가닥핵산 결정에 사용하고 또한, 상기 분석단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열로 상기 제조한 핵산칩으로 생체시료에서 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 단계를 수행하는 이런 일렬 과정을 알 수 있다.

상기 핵산칩으로 검사하는 생체시료는 전사체 또는 단백질체 등이 대표적인 예이다. 전사체를 분석하는 경우 기준물질로 거의 모든 조직에 일정한 양으로 발현되는 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 또는 β-actin mRNA 등이 내부정도관리 목적으로 사용되고 있으나, 명확한 정량분석을 목적으로 사용하는 기준물질은 없어 외부정도관리에 의존하고 있다.

또한 둘 또는 그 이상의 단백질로 구성된 생체시료에서 단백질에 결합하는 리간드를 선정하는 방법은 본 발병자에 의해 제안된 Reverse-SELEX(대한민국 특허등록 제10-0923048호). 그리고 Cell-selex(Homann, M. and Goringer, H.U., 1999, Nucleic Acids Res 27 (9), 2006-2014)가 있다. 본 발명은 상기 reverse-SELEX로 둘 또는 그 이상의 생체분자가 있는 생체시료에 있는 생체분자에 결합하는 리간드를 효율적으로 선정하기 위한 정도관리 목적 기준물질을 제공하고자한다.

또한, 단백질체를 분석하는 경우 정량 및 정성 분석에 사용할 수 있는 유용한 기준물질이 없는 상황으로 단백질체를 분석하기 위한, 정도관리 및 정량분석에 어려움이 많은 실정이다. 이에 따라 본 발명에서 기준물질을 사용하여 상기 시료를 분석하기 위한, 유용한 내부정도관리 및 정량분석 방법을 제시하고자한다.

바람직하며, 본 발명에서 기준물질은 인간유래 생체시료를 분석하는 경우 인간유래 생체시료에 포함되지 않는 생체분자로 식물특이생체분자를 사용할 수 있다. 현재 인간 게놈 프로젝트 및 식물의 일종인 애기장대(Arabidopsis thaliana)게놈 프로젝트가 종결되어 식물특이단백질들이 보고되어 있다. 본 발명에서는 인간유래 생체시료를 분석하기 위한, 기준물질로 식물특이단백질을 사용할 수 있다.

상기 생체시료에 포함되는 생체분자 및 기준물질에 결합하는 물질은 항체, 펩타이드, 및 단일가닥핵산 등이 있으며 바람직하게 단일가닥핵산일 수 있다.

본 발명은 상기 생체시료에 포함되지 않는 생체분자를 결정하며 결정된 외래 생체분자들로부터 정도관리 단일가닥핵산을 제조하는 단계; 상기 생체시료에 포함된 생체분자들로부터 상기 결합단일가닥핵산들을 제조하는 단계; 및 상기 정도관리 단일가닥핵산 및 상기 결합단일가닥핵산의 염기서열을 사용하여 구성되고 합성된 포착프로브가 고착된 지지체를 제조하는 단계; 를 포함하는 방법으로 제조되고, 상기 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 분석단일가닥핵산을 선정하기 위한, 상기 생체시료, 상기 기준물질, 상기 결합단일가닥핵산, 상기 정도관리 단일가닥핵산 및 상기 핵산칩을 사용하여 상기 생체분자들과 상기 결합단일가닥핵산들의 결합프로파일을 생성하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

도2를 살펴보면, 상기 생체시료에 있는 생체분자의 결합단일가닥핵산과 정도관리 단일가닥핵산을 선정하여 핵산칩을 제조하고 상기 생체시료에 있는 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 상기 분석단일가닥핵산을 결정하는 일렬 과정을 알 수 있다.

본 발명에 따른 상기 기준물질들과 결합하는 단일가닥핵산에서 결정되는 정도관리 단일가닥핵산을 결정하는 방법은 기준물질과 무작위 염기서열을 가진 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 기준물질과 단일가닥핵산을 분리하고 이런 일렬의 선택과 증폭을 반복적으로 수행하여 기준물질에 결합하는 단일가닥핵산을 선정하는 표준 SELEX 방법(Tuerk C. and Gold L., 1990, Science, 249; 505-510)으로 구성될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료에 존재하는 생체분자와 결합하는 단일가닥핵산을 선정하는 방법은 생체분자들이 포함된 생체시료와 무작위 염기서열을 가진 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 상기 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 Rervers-SELEX 방법(대한민국 특허등록 제10-0923048호)을 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 결합단일가닥핵산들을 제조하는 방법은 상기 생체분자들에 상기 무작위 염기서열을 가진 단일가닥핵산들을 반응시켜 얻은 반응용액에 있는 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 단계; 상기 복합체들로부터 단일가닥핵산들을 분리하여 증폭하여 단일가닥핵산 DNA를 제조하는 단계; 및 상기 단일가닥핵산 DNA들을 클로닝 벡터에 삽입하여 단일클론을 확보하고 상기 단일가닥핵산의 염기서열을 결정함으로써 상기 결합단일가닥핵산을 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석 단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 방법은 상기 반응용액에 있는 상기 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 세척하고, 상기 생체분자들과 상기 단일가닥핵산들의 결합력의 크기에 기초하여 일정 결합력 이상의 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 선택하는 방법은 상기 반응용액을 모세관 전기영동하여 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 선택하는 방법은 상기 반응용액을 나이트로셀룰로스 및 나일론으로 구성된 구조체에 처리하여 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 선택 및 증폭을 반복적으로 다수회 실행하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석 단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

상기 무작위 염기서열을 가지는 무작위 단일가닥핵산들은, 아래와 같은 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이중가닥의 DNA를 제조한 후, 생체외 전사(in vitro transcription)를 통하여 RNA 무작위 단일가닥핵산으로 제조할 수 있다.

5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N40 CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3' (여기에서 밑줄 친 염기배열은 핵산 라이브러리의 고정된 부위이고, N40은 각위 치에 A, G, T, C등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.)

PCR(Polymerase Chain Reaction)에 이용되는 FW 프라이머(5'-GGGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3': 서열번호 1)는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5'말단과 염기결합을 할 수 있고 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위한 프로모터 염기서열을 포함하고 있다.

PCR의 RE 프라이머(5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3': 서열번호 2)는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 3'말단과 염기결합을 할 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 생체분자결합 단일가닥핵산들은 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 단일가닥핵산들이며, 생체외 전사로 합성하고 정제하여 준비한다.

합성된 무작위 단일가닥핵산들은 예를 들어 10¹⁵염기서열/L의 농도로 생체시료에 처리하여 생체분자와 30분간 반응시켜 생체분자-단일가닥핵산을 생성시킬 수 있다. 이때 반응온도는 SELEX 수행온도보다 낮은 온도에서 수행하는 것이 이상적이며, 바람직하게는 20 내지 37의 온도에서 반응을 수행한다.

보편적으로 단백질 및 단일가닥핵산들을 과량으로 처리하여 생체분자와 결합하는 단일가닥핵산들의 비특이적인 결합을 방지하며, 바람직하게는 효모 tRNA(yeast tRNA), 살몬스펌 DNA(salmon sperm DNA) 또는 인간 태반 DNA(human placental DNA)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체의 선택은 상기 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 세척하고, 상기 생체분자들과 상기 단일가닥핵산들의 결합력의 크기에 기초하여 일정 결합력 이상의 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 방법, 상기 반응용액을 모세관 전기영동하여 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 방법 또는 상기 반응용액을 나이트로셀룰로스 및 나일론의 구조체에 처리하여 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 방법 등으로 할 수 있다.

상기 생체분자-단일가닥핵산에서 분리된 단일가닥핵산들은 RTPCR(Reverse Transcription-PCR)하여 얻은 산물을 클로닝 벡터에 삽입하여 대장균 클론을 확보하고 그 염기서열을 결정할 수 있다.

본 발명은 상기 포착프로브가 고착하는 지지체는 유리슬라이드, 바이오센서의 감지표면, 비드, 나노입자 등을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 포착프로브는 상기 결합단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열들과 이들의 상보적인 염기서열들 중에 선택되는 적어도 하나의 염기서열로 구성하여 합성하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체분자에 있는 생체분자들과 결합단일가닥핵산들의 결합프로파일을 생성하는 방법은 상기 기준물질, 상기 생체시료, 상기 정도관리 단일가닥핵산 및 상기 결합단일가닥핵산으로부터 표지물질이 있는 분석타깃프로브를 제조하는 단계; 상기 포착프로브에 상응하는 상기 결합단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 혼합 및 증폭하여 표지물질이 있는 비교타깃프로브를 제조하는 단계; 상기 분석타깃프로브와 상기 비교타깃프로브을 혼합하여 상기 타깃프로브를 제조하는 단계; 및 상기 타깃프로브들과 상기 지지체의 상기 포착프로브들을 혼성화 반응을 시켜 결합프로파일을 생성하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 분석타깃프로브를 제조하는 방법은 상기 기준물질들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질I를 상기 생체시료에 첨가한 분석시료를 준비하는 단계; 상기 분석시료와 상기 결합단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산으로 구성된 단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체 및 기준물질-단일가닥핵산 복합체를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 복합체들에서 단일가닥핵산들을 분리, 증폭 및 표지하여 분석타깃프로브를 제조하는 단계; 를 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 분석타깃프로브를 제조하는 방법은 상기 생체시료와 상기 결합단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체로부터 단일가닥핵산을 분리하는 단계; 및 상기 분리된 단일가닥핵산에 정도관리 단일가닥핵산들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질II를 혼합하여 증폭 및 표지로 상기 분석타깃프로브를 제조하는 단계; 를 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 생체분자들의 생물학적 의미 분석을 위한 분석 단일가닥핵산의 선별은 상기 포착프로브들의 기여도에 기초하여, 상기 생체분자의 생물학적 의미를 분석할 수 있는 범위 내에서, 상기 포착프로브들을 선별함으로써, 상기지지체에 고착하는 상기 포착프로브들의 개수를 감소시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 결합단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열을 사용하여 합성된 포착프로브가 지지체에 고착된 구성으로 되어 있고, 상기 분석단일가닥핵산을 선정하기 위한 상기 결합단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산의 결합정보를 생성하는 것을 특징으로 하는 핵산칩을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 핵산칩을 이용한 분석단일가닥핵산을 선정하는 방법은, 포착프로브는 지지체에 고착되는 분자로 생체분자 및 기준물질에 결합하는 단일가닥핵산들이거나 또는 이들의 정보를 갖고 있는 물질 중에 선택되는 적어도 하나의 물질들로 구성된 것이다.

상기 타깃프로브는 포착프로브와 결합하는 분자로 분석타깃프로브와 비교타깃프로브를 혼합하거나 전자만으로 구성될 수도 있다. 실험구 생체시료에 있는 생체분자에 결합하는 단일가닥핵산에서 유래하는 타깃프로브를 분석타깃프로브 그리고 대조구 생체시료에 있는 생체분자에 결합하는 단일가닥핵산에서 유래하거나 인위적으로 생체분자 및 기준물질에 결합하는 단일가닥핵산풀에서 제조되는 타깃프로브를 비교타깃프로브라 한다. 바람직하게는 타깃프로브는 분석타깃프로브와 비교타깃프르브로 구성된다.

상기 생체시료에 잇는 생체분자와 단일가닥핵산의 결합정보는 생체분자 결합단일가닥핵산에서 제조되는 타깃프로브와 포착프로브의 상보적 결합에 의해 발생하는 신호를 지칭하며, 바람직하게는 지지체를 구성하는 포착프로브에 상응하는 스폿으로 이루어진 프로파일인데, 각각 스폿을 구성하는 포착프로브에 결합한 타깃프로프의 결합단일가닥핵산에 있는 표지물질에서 발생하는 신호로 바람직하게 형광정도를 의미한다. 상기 결합정보는 타깃프로브의 분석타깃프로브 및 비교분석프로브의 신호의 조합이며, 궁극적으로 생체시료에서 생체분자 결합단일가닥핵산의 분포상태를 나타내고 이로부터 단일가닥핵산에 결합하는 생체분자의 분포상태를 추론할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 생체시료에서 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 분석단일가닥핵산을 선정하기 위한, 핵산칩을 제조하는 방법은 결정된 분석단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열들과 상기 이들의 상보적인 염기서열들 중에 선택되는 적어도 하나의 염기서열을 사용하거나, 또한, 생체분자 결합 단일가닥핵산의 염기서열에 완전하게 상보적 결합을 하는 염기서열로 구성된 포착프로브를 사용하여 합성된 포착프로브들이 지지체에 고착되어 있는 구성으로 될 수 있다.

상기 포착프로브는 혼성화 정도에 매우 큰 영향을 미치는 핵심요소이므로, 그 염기서열 구성의 결정은 매우 중요하다. 본 발명의 핵산칩에 고착되는 각각의 포착프로브는 특징적인 염기로 구성되며, 포착 단일가닥핵산들과 타깃 단일가닥핵산들의 결합체들은 적절한 Tm 값을 유지해야 한다. 이에 따라 결합체의 혼성화 정도는 형광이 표지된 타깃프로브들에 의해 오염되지 않은 자신의 시그널 값을 유지할 수 있도록 해야 한다.

따라서 포착프로브들의 염기서열은, 상기 핵산라이브러리의 무작위 단일가닥핵산들로부터 선별된 생체분자결합 단일가닥핵산들, 상기 분석 단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열을 기초하여 결정할 수 있다. 구체적으로 포착프로브는 핵산라이브러리의 무작위적인 부분에 해당하는 40개의 뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 사용한다. 후자의 경우 인위적인 염기서열을 추가할 수 있다. 바람직하게 포착프로브은 내지 20bp의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 단일가닥핵산들이다.

또한, 본 발병에서 포착프로브가 고착될 수 있는 지지체는 유리슬라이드, 바이오센서의 감지표면, 비드, 나노입자 등에서 선택할 수 있으며 바람직하게는, 지지체는 유리슬라이드이다.

상기 지지체의 종류에 따라 포착프로브와 결합하는 증폭산물의 신호를 분석하는 방법이 선택될 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따른 핵산칩은, 관련 기술 분야에 널리 알려진 방법으로 포착프로브들을 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 슬라이드를 바로 원심 분리하여 건조시킨 다음, 사용 전까지 빛이 차단된 상태로 보관을 한다.

기존에 공지된 다양한 방법(M. schena; DNA microarray; a practical approach, Oxford, 1999)으로 포착프로브들이 규칙적으로 핵산칩을 제작할 수 있다.

핵산칩으로 생체시료를 분석하는 경우 타깃프로브는 일반적으로 전사체를 분석하는 경우는 질병부위 유래 생체시료는 분석생체시료로 하고, 정상적인 부위를 비교생체시료로 하여 전자에서 분석타깃프로브를 후자에서 비교타깃프로브를 제작하여 이들을 혼합한 후 타깃프로브로 사용한다. 그러나 적절한 비교생체시료가 없는 경우는 분석생체시료에서 유래한 단일타깃프로브를 타깃프로브로도 사용할 수 있다.

바람직하게 타깃프로브는 내지 140bp의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 단일가닥핵산들일 수 있다.

또한, 본 발명에서는 분석타깃프로브는 다음과 같이 둘 가지 방법으로 제조할 수 있다, 기준물질들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질I을 생체시료에 혼합하여 분석타깃프로브를 준비하는 경우와 상기 생체분자-단일가닥핵산에서 분리된 단일가닥핵산에 정도관리 단일가닥핵산들을 각각 다른 양으로 구성된 기준물질II을 혼합하여 분석타깃프로브를 준비하는 경우이다.

비교타깃프로브는 포착프로브와 상보적인 염기서열인 핵산으로 생체분자결합 단일가닥핵산들과 정도관리 단일가닥핵산들로 구성된 단일가닥핵산 풀로부터 합성하는 단일가닥핵산일 수 있다.

이와 같은 이유로, 생체분자의 생물학적 의미 분석에 대한 각각의 포착프로브들의 기여도를 분석하고, 생체분자의 생물학적 의미를 분석할 수 있는 범위 내에서, 분석된 기여도에 기초하여 포착프로브들을 선별함으로써, 이로써 생체분자를 분석하는 것에 의미를 가지는 분석단일가닥핵산들을 발굴할 수 있게 된다.

본 발명은 상기 분석단일가닥핵산을 사용하여 상기 생체시료에 있는 생체분자 분석을 위한 상기 정도관리 기준물질을 사용하고 상기 정도관리 단일가닥핵산을 핵산분석방법으로 분석하여 내부 정도관리하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 분석단일가닥핵산을 사용하여 상기 생체시료에 있는 생체분자 분석을 핵산분석방법으로 하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석 방법를 제공한다.

도3을 살펴보면, 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 이용하여 상기 생체시료에서 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 핵산칩을 제조하여 생체시료에 있는 생체분자와 상기 분석단일가닥핵산의 결합프로파일을 생성하는 일렬의 과정을 알 수 있다.

본 발명자는 상기 생체시료에 있는 생체분자와 압타머를 반응시켜 생성된 생체분자-압타머 복합체에서 압타머를 핵산분석방법으로 분석하여 리셉터인 생체분자를 분석하는 방법은 대한민국 특허등록 제 10-0670799-0000에 게재하였다. 상기 생체시료에 있는 생체분자와 압타머 복합체에 있는 압타머를 분석하는 핵산분석방법은 PCR(polymeras chain reaction), LCR(ligase chain reaction), SDA(strand displacement amplification), TMA(transcription-mediated amplification), bDNA(branched DNA), Invader 방법 및 RCA(rolling circle amplification) 등으로 할 수 이다. 바람직하게는 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체에 있는 핵산을 PCR하여 생성된 증폭산물을 추가적으로 분석하는 할 수 있다.

본 발명은 상기 정도관리 기준물질은 상기 생체시료에 포함되지 않는 생체분자를 특징으로 하는, 생체분자 분석 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열을 사용하여 합성된 상기 포착프로브를 지지체에 고착하는 단계; 상기 기준물질, 상기 생체시료, 상기 정도관리 단일가닥핵산, 및 상기 분석단일가닥핵산으로부터 표지물질이 있는 타깃프로브를 제조하는 단계; 상기 타깃프로브를 상기 지지체의 상기 포착프로브에 혼성화 반응시켜 결합정보를 획득하는 단계; 및 상기 획득된 결합정보와 이미 확보되어 있는 결합정보 데이터를 비교하여 상기 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 타깃프로브를 준비하는 방법은 상기 기준물질, 상기 생체시료, 상기 정도관리 단일가닥핵산, 및 상기 분석단일가닥핵산으로부터 표지물질이 있는 분석타깃프로브를 제조하는 단계; 상기 포착프로브에 상응하는 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 혼합, 증폭하여 표지물질이 있는 비교타깃프로브를 제조하는 단계; 및 상기 분석타깃프로브 및 상기 비교타깃프로브로 구성된 타깃프로브를 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석방법를 제공한다.

도 4 및 5를 살펴보면, 상기 분석 단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 이용하여 핵산칩을 제조하여 상기 생체시료에 포함된 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 과정에서 정도관리를 목적으로 기준물질 및 정도관리 단일가닥핵산을 이용하여 분석하는 일렬의 과정을 알 수 있다.

본 발명은 상기 포착프로브들이 고착하는 지지체는 유리슬라이드, 바이오센서의 감지표면, 비드, 나노입자 등을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석방법을 제공한다.

본 발명은 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열에 완전하게 상보적 결합을 하는 염기서열로 구성된 상기 포착프로브를 특징으로 하는 생체분자 분석방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 포착프로브는 상기 분석단일가닥핵산과 상보적 결합을 하는 염기서열로 구성할 수 있으며 상기 분석단일가닥핵산은 상기 생체시료를 구성하는 상기 결합단일가닥핵산들에서 선정되어 생체시료에서 생체분자의 생물적인 의미를 분석하기 위한 사용되는 압타머이다. 따라서 상기 포착프로브는 상기 복합체에 있는 상기 분석단일가닥핵산을 주형으로 PCR하여 획득하는 증폭산물에 있는 상기 특정 분석단일가닥핵산의 염기서열과 상보적 결합을 할 수 있음으로 궁극적으로 상기 복합체에 있는 분석단일가닥핵산을 분석하고 이 결과로 리셉터인 단백질을 정량분석할 수 있게 된다.

또한, 상기 포착프로브는 혼성화 정도에 매우 큰 영향을 미치는 핵심요소이므로, 그 염기서열 구성의 결정은 매우 중요하다. 본 발명의 핵산칩에 고착되는 각각의 포착프로브는 특징적인 염기로 구성되며, 포착 단일가닥핵산들과 타깃 단일가닥핵산들의 결합체들은 적절한 Tm 값을 유지해야 한다. 이에 따라 결합체의 혼성화 정도는 형광이 표지된 타깃프로브들에 의해 오염되지 않은 자신의 시그널 값을 유지할 수 있도록 해야 한다.

본 발명에 따른 내부정도관리를 하면서 상기 핵산칩을 이용한 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 방법은, 포착프로브는 지지체에 고착되는 분자로 생체분자 및 기준물질에 결합하는 분석단일가닥핵산들이거나 또는 이들의 정보를 갖고 있는 물질 중에 선택되는 적어도 하나의 물질들로 구성된 것이다.

본 발명은 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체와 상기 기준물질-단일가닥핵산 복합체에서 분리된 단일가닥핵산을 표지 및 증폭하기 위한, 표지물질이 있는 프라이머와 상기 복합체에 포함된 분석단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 특정염기서열을 포함하는 영역과 이들을 각각 지시하는 염기서열 영역이 있는 태그로 구성된 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 생체분자분석방법을 제공한다.

또한, 본 발명에 생체분자-단일가닥핵산 복합체와 기준물질-단일가닥핵산 복합체에서 분리된 단일가닥핵산을 표지 및 증폭하기 위한, 표지물질이 있는 프라이머와 특정단일가닥핵산을 지시하는 태그가 있는 프라이머를 사용할 수 있다.

"태그"는 반응에서 폴리뉴클레오티드를 확인 및/또는 폴리뉴클레오티드의 원천을 추적하는데 이용되는 독특한 뉴클레오티드 서열들을 말한다. 태그 서열은 프라이머의 5말단 또는 3말단에 있을 수 있다. 포착프로브 염기서열들은 크기 및 조성에서 광범위하게 다변할 수 있다; 다음의 참고자료들은 특정 구체예들에 적합한 일련의 포착프로브 염기서열들을 선택하는 지침을 제시한다(미국 특허 제5,635,400호; Brenner et al, 2000, PNAS., 97: 1665-1670; Shoemaker et al, 1996, Nature Genetics, 14: 450-456; 유럽 특허공개 0799897A1; 미국 특허 제 5,981,179호). 그리고 이와 유사한 것들. 특정 구체예들에서, 포착프로브 염기서열은 4 내지 36개의 뉴클레오티드들, 또는 6 내지 30개의 뉴클레오티드들, 또는 8 내지 20개의 뉴클레오티드들 범위의 길이를 보유할 수 있다.

본 발명은 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 지시하는 태그의 염기서열에 완전하게 상보적 결합을 하는 염기서열로 구성된 상기 포착프로브를 특징으로 하는 생체분자 분석방법을 제공한다.

상기 포착프로브는 태그와 상보적인 염기서열을 사용하여 제조할 수 있으며 이런 포착프로브는 상기 복합체에 있는 분석단일가닥핵산을 주형으로 PCR하여 생성된 PCR산물에 있는 태그 염기서열과 완전하게 상보적 결합을 하여 PCR산물을 분석할 수 있으며 상기 포착프로브와 PCR산물이 생성하는 스폿의 신호를 분석하여 상기 복합체에 있는 분석단일가닥핵산을 분석할 수 있다.

상기 비교타깃프로브는 상기 포착프로브와 상보적인 염기서열인 핵산으로 생체분자결합 단일가닥핵산들과 정도관리 단일가닥핵산들로 구성된 단일가닥핵산 풀로부터 합성하는 단일가닥핵산일 수 있다.

일반적으로 핵산칩으로 전사체를 분석하는 경우 타깃프로브는 질병부위를 실험구인 분석생체시료로 하고, 정상적인 부위를 대조구인 비교생체시료로 하여 전자에서 분석타깃프로브를 후자에서 비교타깃프로브를 제조하여 이들을 혼합한 후 타깃프로브로 사용한다. 그러나 적절한 비교생체시료가 없는 경우는 분석생체시료에서 유래한 단일타깃프로브를 타깃프로브로도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 분석타깃프로브는 다음과 같이 둘 가지 방법으로 제조할 수 있다, 기준물질들이 각각 다른 양으로 구성된 표준물질I을 생체시료에 혼합하여 분석타깃프로브를 준비하는 경우와 상기 생체분자-단일가닥핵산에서 분리된 단일가닥핵산에 정도관리 단일가닥핵산들을 각각 다른 양으로 구성된 표준물질II을 혼합하여 분석타깃프로브를 준비하는 경우이다.

본 발명은 상기 분석타깃프로브를 제조하는 방법은 상기 기준물질들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질I를 상기 생체시료에 첨가한 분석시료를 준비하는 단계; 상기 준비한 분석시료와 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산으로 구성된 단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체 및 기준물질-단일가닥핵산 복합체를 분리하는 단계; 및 상기 복합체에서 분석단일가닥핵산을 분리, 증폭 및 표지하여 분석타깃프로브를 준비하는 단계; 를 특징으로 하는 생체분자분석방법을 제공한다.

본 발명은 상기 분석타깃프로브를 준비하는 방법은 상기 생체시료에 있는 생체분자들과 상기 분석단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 생체분자-단일가닥핵산 복합체에서 분리된 분석단일가닥핵산에 정도관리 단일가닥핵산들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질II를 혼합, 증폭 및 표지하여 상기 표지된 분석타깃프로브를 제조하는 단계; 를 특징으로 하는 생체분자 분석방법을 제공한다.

본 발명은 실험구인 상기 생체시료에 있는 생체분자에 상기 분석단일가닥핵산을 반응시켜 제조되는 분석타깃프로브와 대조구인 상기 생체시료에 있는 생체분자에 상기 분석단일가닥핵산을 반응시켜 제조되는 비교타깃프로브를 혼합하여 제조된 타깃프로브로 상기 핵산칩을 분석하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석방법 및 분석장치를 제공한다.

실험구 생체시료에 있는 생체분자에 결합하는 분석단일가닥핵산에서 유래하는 타깃프로브를 분석타깃프로브 그리고 대조구 생체시료에 있는 생체분자에 결합하는 분석단일가닥핵산에서 유래하거나 인위적으로 생체분자 및 기준물질에 결합하는 분석단일가닥핵산풀에서 제조되는 타깃프로브를 비교타깃프로브라 한다. 바람직하게는 타깃프로브는 분석타깃프로브와 비교타깃프르브로 구성된다.

상기 타깃프로브는 포착프로브와 결합하는 분자로 분석타깃프로브와 비교타깃프로브를 혼합하거나 전자만으로 구성될 수도 있다.

본 발명은 상기 표지물질은 비오틴(Biotin), Cy2, GFP, YO-PRO-1, YOYO-1, Calcein, FITC, FlourX, ALEXA 488, Rhodamine 110, ABI 5-FAM, Oregon Green 500, Oregon green 488, RiboGreen, Rhodamine Green, Rhodamine 123, Magnesium Green, Calcium Green, TO-PRO-1, TOTO-1, ABI JOE, BODIPY 530/550, Dil, BODIPY TMR, BODIPY558/568, BODIPY564/570, Alexa 546, TRITC, Magnesium Orange, Phycoerythrin R & B, Rhodamine Phalloidin, Calcium Orange, Pyronin Y, Rhodamine B, ABI TAMRA, Rhodamine Red, Cy3.5, ABI ROX, Calcium Crimson, Alexa 594, Texas Red, Nile Red, YO-PRO-3, YOYO-3, R-phycocyanin, C-phycocyanin, TOPRO-3, TOTO-3, DiD DilC(5), Thiadicarbocyainie, Cy5.5, Cy5 또는 Cy3에서 선택되는 형광색소를 사용하는 것을 특징으로 하는 생체분자의 분석방법 및 분석장치를 제공한다.

상기 분석단일가닥핵산과 상기 생체시료에 있는 생체분자가 반응하여 생성된 복합체에 있는 분석단일가닥핵산을 주형으로 상기 표지물질이 있는 프라이머를 이용하여 PCR하여 확보한 증폭산물을 상기 포착프로브와 반응시키며 상기 포착프로브는 표지물질이 있는 증폭산물의 단일가닥핵산과 상보적 결합하여 이중가닥핵산을 생성한다. 따라서 상기 포착프로브가 구성하는 스폿은 표지물질에 기초한 신호가 발생하면 이 신호로 분석단일가닥핵산을 분석할 수 있으며 상기 분석단일가닥핵산가 생성한 복합체내 리셉터인 단백질을 정량분석할 수 있다. 따라서 표지물질은 다양한 범위에서 분석목적에 따라 선택할 수 있으며 바람직하게는, Cy3 혹은 Cy5를 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 분석단일가닥핵산들 및 상기 정도관리단일가닥핵산들의 염기서열들을 사용하여 제조된 상기 포착프로브들이 지지체에 고착된 구성으로 되어 있고, 상기 생체시료에 포함된 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 상기 생체분자들과 상기 분석단일가닥핵산들의 결합정보를 생성하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는 핵산칩을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 생체시료에서 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 핵산칩을 제조하는 방법은 결정된 분석단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열들과 상기 이들의 상보적인 염기서열들 중에 선택되는 적어도 하나의 염기서열을 사용하거나, 또한, 생체분자결합 단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산을 지시하는 태그의 염기서열에 완전하게 상보적 결합을 하는 염기서열로 구성된 포착프로브를 사용하여 합성된 포착프로브들이 지지체에 고착되어 있는 구성으로 될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 생체시료에서 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 핵산칩은 상기 분석 단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 정보를 사용하여 합성된 포착프로브들이 지지체에 고착되어 구성되어 있다.

본 발명에 따른 핵산칩은, 동일 유사한 정도의 정밀도로 미지 생채분자의 생물학적 의미를 분석할 수만 있다면, 핵산칩에 고착하는 포착프로브의 수를 작게 하는 것이 핵산칩의 제작비용 및 분석의 효율성 측면에서 바람직하다.

상기 결합정보는 생체분자에 결합하는 분석단일가닥핵산에서 제조되는 타깃프로브와 포착프로브의 상보적 결합에 의해 발생하는 신호를 지칭하며, 바람직하게는 지지체를 구성하는 포착프로브에 상응하는 스폿으로 이루어진 프로파일인데, 각각 스폿을 구성하는 포착프로브에 결합한 타깃프로프의 단일가닥핵산에 있는 표지물질에서 발생하는 신호로 바람직하게 형광정도를 의미한다. 상기 결합정보는 타깃프로브의 분석타깃프로브 및 비교분석프로브의 신호의 조합이며, 궁극적으로 생체시료에서 생체분자에 결합한 단일가닥핵산의 분포상태를 나타내고 이로부터 단일가닥핵산에 결합하는 생체분자의 분포상태를 추론할 수 있다.

이와 같은 이유로, 생체분자의 생물학적 의미 분석에 대한 각각의 포착프로브들의 기여도를 분석하고, 생체분자의 생물학적 의미를 분석할 수 있는 범위 내에서, 분석된 기여도에 기초하여 포착프로브들을 선별함으로써, 본 발명의 핵산칩에 고착하는 포착프로브들의 수를 감소시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생체분자를 분석하게 되면, 관련결합정보 데이터들이 축적되고, 이로부터 생체분자 생물학적 의미의 분석에 기여를 하는 특이적인 단일가닥핵산이 자연스럽게 밝혀지게 되며, 이로써 생체분자를 분석하는 것에 의미를 가지는 바이오마커들을 발굴할 수 있게 된다.

본 발명은 상기 생체시료에 포함되지 않는 외래분자들로 구성되어 있고, 상기 분석단일가닥핵산으로 상기 생체시료에 포함된 생체분자의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 분석과정의 정도관리 및 생체시료에 포함된 생체분자들의 정량분석을 하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는 기준물질을 제공한다.

본 발명은 상기 생체시료에 있는 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 기준물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 기준물질을 이용한 생체분자 분석방법을 통해 실시하는 것을 특징으로 하고, 상기 생체시료에 있는 생체분자들을 준비하는 시료처리장치, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 제조하고 이를 증폭하는 모듈 및 상기 증폭된 산물을 분석하는 모듈로 구성된 증폭장치를 포함하는 생체분자 분석하는 시스템을 특징으로 하는 생체분자 분석장치를 제공한다.

본 발명의 생체분자 분석 방법을 보다 효율적으로 측정하기 위하여, 생체분자를 포함하는 시료에서 생체분자를 분리하는 시료처리장치 그리고 상기 생체분자-분석단일가닥핵산 및 기준물질-단일가닥핵산 복합체를 제조하고 이를 증폭하는 모듈 및 상기 증폭된 산물을 분석하는 모듈로 구성된 증폭장치를 포함하는 분석결합단일가닥핵산 및 기준물질을 이용한 생체분자 분석 장치에 있어서, 본 발명의 시스템은 혼합챔버, 용해챔버 및 반응챔버으로 구성된 시료처리장치 및 증폭장치로 구성되고 이들이 통합되어 운영될 수도 있다.

관심 대상의 생체분자를 함유하고 있는 것으로 여겨지는 샘플의 분석은 일련의 샘플 준비 단계를 수반하며, 혼합챔버와 용해챔버로 구성된 시료처리장치에서 이루어진다. 이들 단계에는 여과, 세포 용해, 생체분자, 생체분자-단일가닥핵산 복합체 제조 및 시약과의 혼합을 포함할 수 있다. 생체분자분석 결과에 대한 확신을 갖기 위한서는 샘플 준비 과정의 오염에 대한 제어가 유용할 것이다. 핵산 증폭 반응을 위한 샘플을 조제하고, 샘플 조제의 유효성을 검증하는 방법을 제공한다.

샘플은 세포, 포자, 미생물, 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 실체를 함유하는 것으로 여겨지며, 이 표적 실체는 적어도 하나의 표적 생체분자를 포함한다. 상기 방법은, 샘플과 샘플 조제 대조군과 혼합하는 혼합챔버를 갖는 장치 안으로 샘플을 도입하는 단계를 포함한다. 샘플 조제 대조군은 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 샘플 조제대조군은 정도관리 물질을 포함한다. 상기 장치는 또한 용해 챔버와 반응 챔버를 구비한다. 샘플은 혼합 챔버에서 샘플 조제 대조군과 혼합된다.

상기 방법은 또한 샘플 조제 대조군 및 샘플 내에 존재하는 경우의 표적 실체를 용해 챔버에서 용해 처리하여 생체분자를 정제하는 단계, 생체분자-단일가닥핵산 복합체 생성하는 단계, 용해챔버 내에 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 반응 챔버 내에서 핵산 증폭 조건에 노출시키는 단계와, 적어도 하나의 정도관리 물질의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 정도관리 물질의 긍정적 검출은 샘플 조제 과정이 만족스러웠음을 나타내는 반면, 정도관리 물질을 검출할 수 없으면 샘플이 부적절하게 조제되었음을 나타낸다.

본 발명은 핵산 증폭 반응을 위한 샘플을 조제하고, 그 샘플 조제의 유효성을 검증하는 증폭장치를 제공한다. 샘플은 세포, 포자, 미생물, 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 실체를 함유하는 것으로 여겨지며, 이 표적 실체는 적어도 하나의 표적 생체분자를 포함한다. 상기 장치는, 샘플과 혼합될 샘플 조제 대조군을 수용하는 제1 챔버가 있는 본체를 포함한다. 샘플 조제 대조군은 세포, 포자, 미생물, 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 샘플 조제 대조군은 정도관리 물질을 포함한다.

상기 본체는 또한 샘플 내에 존재하는 경우의 표적 실체 및 샘플 조제 대조군을 용해 처리하여 이들로부터 생체분자를 유리시키고 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 분리하는 용해 챔버를 포함하다. 또한 유리된 생체분자와 분석단일가닥핵산을 반응시켜 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 생성하는 용해 챔버를 포함한다. 상기 본체는 또한 증폭 및 검출을 위한 핵산을 유지하는 반응 챔버를 포함한다.

상기 장치는 샘플 조제 대조군과 혼합된 샘플이 있는 제1 챔버에서 용해 챔버 안으로 흐르도록 안내하며, 용해 챔버에서 유리된 생체분자를 반응 챔버 안으로 흐르도록 안내하는 적어도 하나의 흐름 제어기를 더 포함한다.

몇몇 실시예에서, 용해 챔버는 샘플이 용해 챔버를 통해 흐를 때에, 샘플 내에 존재하는 경우의 표적 실체 및 샘플 조제 대조군을 포획하는 효소, 적어도 하나의 필터 및 고상 물질을 수용하며, 상기 장치는 용해 챔버를 통해 흐른 사용된 샘플 유체를 수용하는 적어도 하나의 폐기 챔버를 더 포함하며, 상기 적어도 하나의 흐름 제어기는 또한 용해 챔버를 통해 흐른 사용된 샘플 유체를 폐기 챔버로 흐르도록 안내할 수 있다.

몇몇 실시예에서, 상기 장치는 용해 챔버에 초음파를 제공하기 위한 용해 챔버의 벽에 결합된 초음파 트랜스듀서를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 장치는 샘플 조제 대조군 및 표적 실체를 파열시키기 위한 용해 챔버 내에 비드를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 용해 과정의 유효성을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로부터 이루어진 군으로부터 선택된 표적 실체를 함유하는 것으로 여겨지는 샘플을 샘플 조제대조군과 혼합하는 단계를 포함한다. 표적 실체는 적어도 하나의 정도관리 물질을 포함한다. 샘플 조제 대조군은 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 샘플 조제 대조군은 정도관리 물질을 포함한다. 샘플 조제 대조군과 샘플 내에 존재하는 경우의 표적 실체의 혼합물은 용해 처리된다. 상기 방법은 또한 용해 처리 중에 샘플 조제 대조군으로부터 생체분자가 유리되었는지를 결정하도록 정도관리 물질의 존재 여부를 검출하는 단계를 더 포함한다. 정도관리 물질의 긍정적 검출은 샘플 조제 과정이 만족스럽다는 것을 나타내는 반면, 정도관리물질을 검출할 수 없으면 샘플이 부적절하게 조제되었음을 나타낸다.

몇몇 실시예에서, 상기 방법은 용해 처리 전에, 샘플 조제 대조군 및 샘플 내에 존재하는 경우의 표적 실체를 고상 물질에 의해 포획하기 위한, 샘플조제 대조군과 혼합된 샘플이 고상 물질을 수용하는 챔버를 통해 흐르게 하는 단계를 포함한다.

몇몇 실시예에서, 샘플은 샘플과 샘플 조제 대조군을 혼합하기 전에 예비 여과될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 용해 처리는 샘플 조제 대조군 및 표적 실체를 초음파 에너지에 노출시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 용해 처리는 또한 샘플 조제 대조군 및 표적 실체를 파열시키기 위한 비드를 교반시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 샘플 조제 대조군은 포자이다. 몇몇 실시예에서, 혼합단계는 샘플 조제 대조군을 함유하는 건조 비드를 분해하는 것을 포함한다.

몇몇 실시예에서, 용해 처리는 화학적 용해제와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 마커 핵산 서열은 마커 핵산서열을 (예를 들면, PCB에 의해) 증폭시키고, 증폭된 마커 핵산 서열을 검출함으로써 검출된다. 몇몇 실시예에서, 마커 핵산 서열은 마커 핵산 서열에 결합될 수 있는 프로브로부터의 신호가 한계값을 초과하는 지를 결정함으로써 검출된다.

증폭장치의 반응 용기의 반응 챔버 내의 반응 혼합물은 핵산 증폭조건에 노출된다. 반응을 이용한 RNA 또는 DNA 주형의 증폭은 공지되어 있다[미국 특허 제4,683,195호; 미국 특허 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis et. al.,, 1990)]. DNA의 핵산증폭은 DNA를 열변성시키고, 증폭될 DNA 분절에 측접하는 서열에 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하며, 어닐링된 프라이머를 DNA 중합효소에 의해 연장시키는 것으로 이루어진 사이클의 반복을 수반한다. 프라이머는 표적 서열의 대향하는 가닥(strand)에 교배되는 한편, 중합 효소에 의한 DNA 합성이 프라이머 사이의 영역에 걸쳐 진행되도록 배향되어, DNA 분절의 양을 효과적으로 두 배로 만든다. 또한, 확장 생성물은 또한 보완적이며 프라이머를 결합할 수 있기 때문에, 개개의 연속적인 사이클은 이전 사이클에서 합성된 DNA의 양을 실질적으로 두 배로 만든다. 이는 사이클 당 2n(여기서, n은 사이클 수)의 비율로 특정 표적 분절의 지수적 축적을 가져온다. 증폭반응 및 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)과 같은 방법이 핵산 서열을 직접 증폭시키는 데에 사용될 수 있다. 등온 증폭 반응이 또한 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.

핵산 증폭 반응은 바람직하게는 반응용기내의 반응 혼합물을 증폭반응에 필요한 온도로 가열 및/또는 냉각시키는 열처리장비를 사용하여 수행한다. 그러한 열처리 장비는 또한 샘플 조제 대조군의 마커 핵산 서열 및 샘플에서 테스트하기 위한 하나 이상의 표적 핵산 서열을 검출하는 하나 이상의 검출 기구를 포함할 수 있다. 반응용기 내의 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 광학적 검출기가내장된 바람직한 열처리 장비(미국 특허 제6,369,893호; 미국 특허 제6,391,541호)를 사용할 수 있다. 또한, 반응 혼합물의 온도를 제어하고, 이 반응 혼합물에서 핵산 서열을 검출하기 위한 본 발명에 적합한 많은 기타 공지의 방법이 있다.

또한 샘플 조제 대조군의 정도관리 물질 및 샘플에서 테스트하기 위한, 하나 이상의 정도관리물질의 검출은 프로브를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 반응 용기는 광학적으로 검출될 수 있는 프로브로부터의 신호가 통과하는 하나 이상의 투명 또는 광투과성 벽을 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 포착프로브가 핵산 서열을 검출 및 정량화하는 데에 사용될 수 있다. 핵산 포착프로브를 채용하는 다양한 수많은 분석법이 있다. 이들 포착프로브 중 일부는 다른 분자 또는 반족(moiety)과의 상호 작용에서 변화로 인해 형광원의 형광 발광에서의 변화를 갖는 신호를 생성한다.

증폭 생성물의 검출을 위한 다른 바람직한 방법으로, 형광 프로브는 형광 리포터 염료(fluorescent reporter dye) 모듈에 의해 표지화된 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 포착프로브의 분열은 리포터 염료의 형광 강도의 증가를 발생시킨다.

샘플 내에 표적 생체분자의 검출 또는 그것의 결여를 확신하기 위한, 샘플 조제의 오염을 제어해야 한다. 이는 샘플 조제 대조군이 샘플 내의 표적 실체(예를 들면, 생체분자를 함유하고 있는 표적 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물)와 동일한 처리를 받아야 하는 이유이다. 샘플 조제 대조군의 정도관리 물질이 검출된다면, 샘플 조제는 만족스러운 것으로 간주된다. 정도관리 물질의 존재가 검출될 수 없다면, 샘플 조제는 부적절한 것으로 간주되며, 표적 핵산서열에 대한 테스트의 결과는 "미정"인 것으로 간주된다. 바람직하게는 정도관리 물질의 존재여부는 타깃프로브에 결합할 수 있는 포착프로브로부터의 신호가 한계값, 예를 들면 분석법에 대해 유효한 것으로 간주되도록 만족하거나 초과해야 하는 미리 정해진 형광 발광의 한계값을 초과하는 지를 결정함으로써 검출된다.

유체제어 장치는 원하는 프로토콜에 따라 컴퓨터로 제어될 수 있다. 단일 밸브를 사용하면 단지 하나의 실패 요소로 인해 높은 제조 수율을 생성할 수 있다. 유체 제어 및 처리 구성 부재의 통합은 컴팩트한 장치(예를 들면, 소형 카트리지 형태)를 얻을 수 있고, 성형 및 조립의 자동화를 용이하게 한다. 전술한 바와 같이, 그러한 시스템은 유리하게는 희석 및 혼합 능력, 중간 세척 능력 및 확실한 가압 능력을 포함할 수 있다. 시스템 내의 유체 경로는 시스템 내의 유체의 오염을 최소화하고 또 그러한 유체의 수용 및 제어를 용이하게 하도록 통상 폐쇄된다. 반응 용기는 편리하게는 분리 및 교환 가능하며, 몇몇 실시예에서는 폐기 가능하다.

본 발명에서는 상기 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보 데이터를 이용한 생물적인 의미 분석을 위한 구성은 환자군의 상기 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보와 대조군의 상기 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보 데이터를 입력 받고 데이터베이스를 구축하는 모듈; 상기 입력된 결합정보 데이터를 이용하여 분석 시스템에서 전 처리를 수행하는 모듈; 상기 전 처리된 결과를 가지고 환자의 모델을 생성하는 모듈; 상기 생성된 모델을 로딩하여 내원한 환자에 적용하여 블라인드 테스트(Blind test)인 진단을 수행하는 모듈; 및 교차검정을 통해 시스템의 성능을 평가하는 모듈; 을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석방법 및 장치를 제공한다.

본 발명에서 상기 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보데이터를 이용한 생물적인 의미 예측시스템은 예시적으로 진단이지만 이에만 국한된 것이 아니다.

본 발명으로 생성되는 많은 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보 데이터는 고차원의 특성을 갖는 방대란 양의 정보로 세포, 조직이나 질병에 관련된 다양한 정보를 생산할 수 있다. 상기 입력된 데이터를 이용하여 분석 시스템에서 전 처리를 수행하는 모듈은 환자의 상태에 영향을 미치는 특징들을 찾아내고 분류 성능을 향상시키기 위한 다변량 분석방법은 정확한 치료와 진단을 위해 중요 변수를 찾아 차원을 축소하거나 특성의 변형을 통해 주요 특질들을 찾아내는 특징 추출(Feature Selection) 절차이다.

특질 추출은 세부적으로 클래스 정보를 학습에 사용하는 지 여부에 따라 무감독 학습(Unsupervised Learning) 또는 감독 학습방식(Supervised Learning) 방식이 있다. 무감독 학습 방식에 주로 활용되고 있는 PCA(Principal Component Analysis) 또는 ICA(Independent Component Analysis)는 변수들의 특성을 고려하여 특질을 추출할 수 있다. 감독방식은 클래스 정보와 변수간의 통계적인 유의성이나 변수들 간의 상관관계를 활용하여 변수를 선택하는 방식이다. 이 방식은 주어진 특질 집합에서 전 방향(Forward) 또는 후 방향(Backward)으로 특질들을 순차적으로 추가하거나 제거해가면서 분류기에 적용시킨 성능을 통하여 주요 특질을 산출할 수 있다.

상기 전 처리된 결과를 가지고 학습을 수행하여 환자의 모델을 생성하는 모듈은 선택된 특질들을 적합한 분류기(Classifier)를 통해 각 클래스별로 분류하는 절차이다.

본 발명에서 인공신경망(Artificial Neural Network)을 사용하였는데, 입력과 출력에 따라 행동을 결정하는 특성 때문에 패턴인식, 함수근사, 분류기법 등 다양한 분야에서 응용되고 있다. 인공신경망은 그 구조는 여러 개의 층(layers), 노드(nodes), 신경망간 연결 가중치로 구성된다. 본 발명에 사용하는 신경망 층간 연결방식은 전향(Feed-forward)방식이다. 입력패턴에 다라 각 노드에 대한 신경망 연결 가중치와 활성화 함수를 이용하여 출력값을 산출하였다. 생성된 결합정보를 통하여 어떤 일을 처리했을 때 추정한 값과 실제 결과 값이 상이한 경우, 산출된 값을 실제 결과 값과 비교하면서 오차를 줄이는 과정을 반복해서 찾아내는 방식이다.

상기 환자의 모델을 생성하는 방법은 선형 모델(linear models), 지지 벡터 기계(support vector machines), 신경망(neural networks), 분류 및 회귀 트리(classification and regression trees), 앙상블 학습법(ensemble learning methods), 판별식 분석(discriminant analysis), 근접 네이버 방법(nearest neighbor method), 베이즈 네트워크(Bayesian networks), 독립 성분 분석(independent components analysis)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석방법 및 장치를 제공한다.

정확하고 종합적인 메커니즘(Mechanism)이 밝혀지지 않은 대다수의 질환들에 대해서는 사례를 기반으로 하는 진단의 중요성이 매우 크다고 할 수 있다. 그러나 특정 기계학습 기법에 국한하여 고안된 기존의 사례 기반 기계학습 추론 시스템은 정확도가 낮아 개선된 시스템의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 또한, 기존의 시스템은 학습된 임상 검사 항목 모두를 이용한 질환 판별기로만 고안되어 있으며 각 질환별 임상 검사 항목의 중요도나 우선순위를 활용할 수 있는 방법을 제공하고 있지 않다.

본 발명은 의사의 정확한 질환 진단을 지원하기 위한 사례 기반 기계학습 추론을 이용한 질환 진단 및 검사항목 선정 시스템에 관한 것으로, 환자들의 사례 데이터베이스(Database)를 통해 훈련된 인공신경망(Neural Network)로 한 기계학습기인 질환 판별기를 통해 새로운 환자의 검사 정보를 분석하여 질환을 판별하고 예비진단에 의한 각 질환의 최종 판별을 위한 최소의 중요 검사 항목을 선정하여 제공하는 시스템에 관한 것이다. 기계학습 추론을 통한 질환 진단 기법은 기계학습 기법을 개별적으로 적용하여 구성하고 있다. 상기 환자의 모델을 생성하는 방법은 선형 모델(linear models), 지지 벡터 기계(support vector machines), 신경망(neural networks), 분류 및 회귀 트리(classification and regression trees), 앙상블 학습법(ensemble learning methods), 판별식 분석(discriminant analysis), 근접 네이버 방법(nearest neighbor method), 베이즈 네트워크(Bayesian networks), 독립 성분 분석(independent components analysis) 등이 있다.

본 시스템의 구성 및 실무에서의 응용은 2가지로 나누어서 구성할 수 있는데 진단만을 위한 독립된(stand alone) 형태의 진단시스템과 기존의 병원정보시스템 즉 OCS, PACS, LIS 등과 연계된 통합된 시스템으로 구성할 수 있다. 통합된 시스템과의 연동을 위해서는 HL7, 및 DICOM 규약에 의거하여 시스템을 구성하여야 한다. 본 시스템은 초기모델로 PMS(Patient Monitoring System) 와 연동하여 진단의 정확도를 높게 하였다. 또한 PMS 뿐만 아니라 OCS, EMR, PACS 등 다양한 의료정보시스템과 연동된 시스템으로 개발하여 다양한 질환인자를 포함하고 있는 보다 정확한 진단시스템으로 개발할 수 있다.

본 발명은 상기 생체시료는 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직으로 구성된 군으로 부터 선택되고 상기 생체분자는 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상인 것을 특징으로 하는 분석단일가닥핵산 및 기준물질을 이용한 생체분자 분석방법을 제공한다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩, 및 이들을 이용한 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료에 있는 생체분자 분석방법에 의하면, 병렬고속분석(High Throughput Screening)을 이용한 매우 간단하고 저렴하며 효율적인 방법 및 장치로, 미생물, 세포, 단백질을 포함하는 생체시료에 포함된 생체분자에 대한 프로파일을 생산할 수 있으므로, 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위한 분야에서 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 도구로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 상기 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들 및 기준물질로부터 생체분자 결합단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산을 결정한 단일가닥핵산의 염기서열을 기초하여 상기 제조된 핵산칩으로 분석단일가닥핵산 결정에 사용하고 분석단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산으로 제조한 핵산칩으로 생체시료에서 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 일렬 과정을 보여주는 도면이고,
도 2은 상기 생체분자결합 단일가닥핵산과 정도관리 단일가닥핵산을 이용하여 핵산칩을 제조하여 상기 분석단일가닥핵산을 결정하는 일렬 과정을 보여주는 도면이고,
도 3은 상기 분석 단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 이용하여 생체시료에서 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 핵산칩을 제조하여 생체시료에 있는 생체분자와 상기 분석단일가닥핵산의 결합프로파일을 생성하는 일렬의 과정을 보여주는 도면이고,
도 4는 분석단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산으로 제조한 핵산칩을 사용하여 생체시료에 포함된 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 과정에서 기준물질 I로 정도관리하는 일렬의 과정을 보여주는 도면이고,
도 5는 분석단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산으로 제조한 핵산칩을 사용하여 생체시료에 포함된 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 과정에서 기준물질 II로 정도관리하는 일렬의 과정을 보여주는 도면이고,
도 6은 기준물질에 상응하는 정도관리 단일가닥핵산에 상응하는 스폿을 보여 주는 도면이고,
도 7은 본 발명에 따른 핵산칩으로 생성된 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로 질병을 진단하는 과정을 보여주는 도면이고,
도 8은 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로 심혈관질환을 진단한 결과를 보여주는 도면이고,
도9는 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로 간암을 진단한 결과를 보여주는 도면이고,
도10은 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩을 이용하여 생성된 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로, 간암의 전이를 진단한 결과를 보여주는 도면이고,
도11은 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스에서 심근경색환자의 혈청에 특이적으로 존재하는 단백질의 아미노산서열을 결정하는 과정의 순서를 보여주는 도면이고,
도12는 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스에서 심근경색환자의 혈청에 특이적으로 존재하는 단백질의 아미노산서열을 결정한 도면이고,
도13은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생성한 소세포폐암세포주의 표면생체분자 프로파일을 생산 및 분석하여 확보한 단일가닥핵산이 소세포폐암세포주에 결합한 결과를 보여주는 도면이고,
도14은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용한 대장균 KCTC12006 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium ATCC13311)의 표면생체분자 프로파일을 생산 및 분석하여 확보한 생체분자결합 단일가닥핵산의 특이성을 보여주는 도면이고,
도15는 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 선정된, 대장균에 특이적으로 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산과 나노금입자를 이용하여 대장균이 오염된 음식물에서 오염정도를 측정한 결과를 보여주는 도면이다.

이하, 첨부도면과 실시예를 참조하여 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩의 제조방법, 및 이들을 이용한 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료에 있는 생체분자 분석방법을 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

실시예 1. 무작위 염기서열 단일가닥핵산 제조

아래와 같은 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해 이중가닥의 DNA를 제조한 후, 생체외 전사를 통하여 단일가닥의 RNA 라이브러리(무작위 단일가닥핵산들)를 제조하였다.

00875'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N40 CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3'(여기에서 밑줄 친 염기배열은 핵산 라이브러리의 고정된 부위이며 N40은 각 위치에 A, G, T, C등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.)

PCR에 이용되는 상기 서열번호 1의 FW 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5'말단과 염기결합을 할 수 있고 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위한 프로모터 염기서열을 포함하고 있다.

PCR에 이용되는 서열번호 2의 RE 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 3'말단과 염기결합을 할 수 있다. 그리고 FW와 RE 프라이머는 이후의 클로닝을 위한 각각 EcoRI과 BamHI등의 제한효소 절단 염기서열을 함유할 수도 있다.

생체시료와 반응할 무작위 단일가닥핵산들은 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 라이브러리이며, DNA 핵산라이브러리 전사체 및 PCR 프라이머를 상기와 같이 설계 제작하여 PCR 및 생체외 전사 방법으로 준비하였다.

PCR은 1,000 pmoles 단일가닥핵산 전사체, 2,500 pmoles PCR의 프라이머 쌍(5P7)을 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl(pH 8.3), 3 mM MgCl₂, 0.5 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1 U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)에서 PCR를 수행한 후 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다.

2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 무작위 단일가닥핵산들은 생체외 전사로 합성하고 정제하여 준비하였다. 200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순수도를 검색하였다.

실시예 2. 인간혈청단백질에 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산의 제조

2-1. 생체분자-단일가닥핵산 복합체의 선택

2-1-1. 세척방법

본 발명에서 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료가 인간혈청단백질의 예시이다. 실시예1에서 합성된 무작위 단일가닥핵산들의 10¹⁵염기서열/L의 농도용액을 200 pmol/200의 농도로 선택버퍼(50 mM TrisCl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0.1% NaN₃)에서 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies 사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 준비하였다.

기준물질이 포함된 10㎕의 혈청생체시료를 90㎕의 PBS 용액을 첨가하고 나이트로셀룰로스 막 디스크(nitrocellulose membrane disc)를 넣어 30분간 흔들어 주면서 반응시켰다. 상기에서 준비된 RNA 단일가닥핵산들을 혈청생체시료가 부착된 디스크에 처리하여 30분간 반응시켰다.

인간혈청생체시료(생체분자)와 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산의 선정은, 일차적으로 무작위 염기서열로 이루어진 단일가닥핵산들을 대상으로 하며, 반응 후 다양한 세척버퍼로 세척 과정을 반복하여 일회만의 선택과정으로 인간혈청단백질(생체분자)-단일가닥핵산 복합체들을 확보하였다.

생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 세척버퍼는 0 내지 1 x 세렉스버퍼 또는 0 내지 500 mM EDTA 용액을 사용하였다. 분리된 복합체를 RT-PCR을 수행하여 혈청단백질에 결합하는 RNA(생체분자결합 단일가닥핵산)를 지시하는 DNA 풀을 증폭 제작하였다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 생체분자결합 단일가닥핵산들을 제작할 수도 있다. 상기에서 선택된 복합체를 대상으로 정도관리 단일가닥핵산을 분석할 수도 있다.

2-1-2. 모세관 전기영동

상기에서 합성된 무작위 단일가닥핵산들의 10¹⁵염기서열/L의 농도용액을 200 pmol/200의 농도로 반응용액[100mM Tris-HCl (pH 8.2), 200mM NaCl, 및 10mM MgCl₂]에서 넣고 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 준비하였다.

10㎕의 혈청생체시료를 90㎕의 상기 반응용액을 첨가하여 30분간 반응시켰다. 상기 반응혼합용액을 완충용액 (50mMTris-HCl, pH 8.2)으로 모세관 전기영동을 실시하였다. 본 발명의 모세관 전기영동을 이용한 모든 분석은 fused-silica capillary(Beckman Coulter; 길이 37 cm X 내경 75 m)를 장착한 P/ACE 5000 CE-LIF system(Beckman Coulter)을 사용하여 실시하였다. 시스템에 부착되어 있는 488nm 의 3 mW 아르곤 이온 레이져(Ar-ion)로 형광물질을 여기(excitation)하여 520 nm의 필터로 방출(emission)된 시그널을 LIF system 내의 검출기(detector)를 통해 포집하였다.

분석 및 모세관 처리에 사용되는 모든 용액은 0.2-um 공경(pore size)필터에 여과시켰고 모세관은 1 N NaOH와 증류수를 각각 5분간 흘려주어 세척한 후 사용하였으며 각 전기영동 사이에는 1N NaOH, 증류수, 완충용액으로 2분씩 모세관을 씻어주었다.

여기에 10 kV의 전압을 걸어 전기영동을 실시하고 그 결과를 분석하였다. 모세관 전기영동을 이용하여 생체분자-단일가닥핵산의 복합체 생성을 분석한 그래프로 생체분자-단일가닥핵산 복합체가 특이적으로 생성, 분리됨을 확인하였다.

분리된 복합체를 RT-PCR을 수행하여 혈청단백질에 결합하는 RNA(생체분자결합 단일가닥핵산)를 지시하는 DNA 풀을 증폭 제작하였다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 생체분자결합 단일가닥핵산들을 제작할 수도 있다.

2-1-3. 나이트로셀룰로즈와 나일론의 구조체

상기에서 합성된 무작위 단일가닥핵산들의 10¹⁵염기서열/L의 농도용액을 200 pmol/200의 농도로 반응용액((100mM Tris-HCl at pH 8.2, 200mM NaCl, 및 10mM MgCl₂)에서 넣고 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 준비하였다.

10㎕ 의 혈청생체시료를 90㎕ 의 PBS 용액을 넝은 후, 상기에서 준비된 RNA 단일가닥핵산들을 30분간 반응시켜 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 생성시켰다.

인간혈청생체시료(생체분자)와 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산의 선정은, 상기 반응혼합용액을 나이트로셀룰로스(nitrocellulose)와 나일론(nylon)으로 이루어진 구조체에 처리하여 압력을 하면, 생체분자-단일가닥핵산 복합체는 나이트로셀룰로스 필터상에 있고, 미결합한 단일가닥핵산은 나일론 상에 존재한다. 상기 나이트로셀룰로스 필터를 회수하여, 다양한 세척버퍼로 세척 과정을 반복하여 일회만의 선택과정으로 인간혈청단백질(생체분자)-단일가닥핵산 복합체들을 확보하였다.

생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 세척버퍼는 0 내지 1 x 세렉스버퍼 또는 0 내지 500 mM EDTA 용액을 사용하였다. 분리된 복합체를 RT-PCR을 수행하여 혈청단백질에 결합하는 RNA(생체분자결합 단일가닥핵산)를 지시하는 DNA 풀을 증폭 제작하였다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 생체분자결합 단일가닥핵산들을 제작할 수도 있다.

2-2. 생체분자결합 단일가닥핵산의 제조

확보된 RT-PCR 산물인 DNA를 플라스미드에 클로닝하여 단일클론을 확보하는 과정으로, 생체분자결합-단일가닥핵산들의 제작을 완료하였다. 이들 생체분자에 결합하는 단일가닥핵산들의 염기서열 결정은 플라스미드를 분리하여 수행하였다.

생체분자의 프로파일을 생성하기 위한 본 발명에 따른 핵산칩에 사용할 포착프로브들의 염기서열은 인간혈청단백질(생체분자)과 결합하는 상기 단일가닥핵산들의 염기서열정보를 반영하므로, 이를 위한 핵산의 이차구조를 모델링하는 MFOLD 프로그램을 사용하여 이차구조 및 구조체 자유에너지를 확인한 후, 가장 안정도가 높은 이차구조를 갖는 단일가닥핵산을 선정하여 포착프로브를 디자인하였다.

실시예 3. 정도관리 단일가닥핵산의 제조

기준물질은 http://genomics.msu.edu/plant_specific/에서 확보한 A, B, C, D 및 E 등 5개 종류 식물특이단백질로 구성되어 있다(표 1 참조).

식물특이단백질

종류	Locus	내 용	Accession number
A	At1g65390.1	defense/immunity protein	GO:0003793
B	At5g39310.1	cell elongation	GO:0009826
C	At4g15910.1	Drought-Induced Protein (Di21)	GO:0009414
D	At1g12860.1	Bhlh Protein	GO:0003677
E	At4g02530.1	Chloroplast Thylakoid Lumen Protein	GO:0009543

선정된 5개 식물특이단백질은 대장균 발현시스템을 사용하여 상응하는 단백질을 발현시킨 후, 발현된 단백질을 분리하여 표준 SELEX 방법(Ellington, A.D. and J.W. Szostak. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822; Gold, L., P.Allen, J. Binkley, D. Brown, D. Schneider, S.R. Eddy, C. Tuerk, L. Green, S. Macdougal, and D. Tasset. 1993. RNA: the shape of things to come, pp. 497-510. In: R.F. Gestelend and J.F. Atkins (eds.). The RNA World, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)으로 기준물질에 결합하는 단일가닥핵산을 확보하였다. 이를 정도관리 단일가닥핵산이라고 명명하였으며 이들의 염기서열로 정도관리 단일가닥핵산에 상응하는 포착프로브를 디자인하였다.

실시예 4. 핵산칩의 제조

유리 슬라이드 표면에 고착시킬 포착프로브로서, 실시예 1에서 선정된 염기서열을 가지는 3,000여개의 생체분자결합 단일가닥핵산에 상보적인 염기서열 및 정도관리 단일가닥핵산에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들(올리고뉴클레오티드들)을 유기 합성하여(바이오니아사) 준비하였다.

GAPS(Gamma Amino Propyl Silane)이 코팅된 유리 슬라이드인 UltraGAPSTM Coated Slide(Corning 사)를 사용하여 포착프로브가 일정 규칙으로 고착된 핵산칩을 제작하였다. 핵산칩의 제작은 핀(pin) 방식인 마이크로어레이어 시스템(Microarrayer system, GenPak사)을 사용하였고, 스폿 간격(spot spacing)은 스폿 중심 사이(center-to-center)가 370㎛가 되도록 하였다. 각각의 포착프로브들을 표준용액에 녹여 농도를 조절하였다. 이때 어레이어 안의 습도는 70%로 유지하여 스폿팅(spotting)을 수행하였다. 스폿팅된 슬라이드들은 습도유지챔머(humidified chamber)에서 24 ~ 48 시간 방치한 후, UV crosslinker에서 굽는(baking)과정을 수행하였다. 널리 알려진 방법으로 포착프로브들을 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 슬라이드를 바로 원심분리하여 건조시킨 다음, 빛이 차단된 상태로 보관을 하였다.

실시예 5. 타깃프로브의 제조

실시예1에서 선정되어 핵산칩 제조에 사용된 단일가닥핵산이 삽입된 플라스미드들 및 실시예 3에서 선정된 정도관리 단일가닥핵산이 삽입된 플라스미드들을 동량으로 혼합하여 플라스미드 풀을 준비하였다. 준비된 플라스미드 풀에서 1pg 플라스미드를 전사체로 하여, PCR 반응 용액, 100 pM 5'-프라이머, 100 pM 3'-프라이머, dNTP 혼합물(5mM dATP, 5mM CTP, 5mM dGTP, 5 mM dTTP)에서 표준 PCR 방법으로 94℃에서 30초, 52℃에서 30 초, 72℃에서 20 초 조건으로 30회 사이클을 반복 수행하여 이중가닥핵산을 합성하여 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다.

2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 분자의 단일가닥핵산을 생체외전사로 합성하고 정제하여 준비하였다.

200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃ 에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제하였다.

기준물질들이 각각 다른 양으로 포함된 기준물질I을 PBS용액에 첨가하였다. 기준물질인 A, B, C, D 및 E 등 5개 종류 식물특이단백질로 구성되어 있다(표 1참조). 외래생체분자 A는 0.01pg/ml, 외래생체분자 B는 1.0pg/ml, 외래생체분자 C는 100.0pg/ml, 외래생체분자 D는 10.0ng/ml, 외래생체분자 E는 1.0ug/ml 등으로 표준물질I을 구성하였다.

분석에 사용한 인간혈청은 건강한 사람 및 안정성 협심증인 심혈관질환 환자의 혈청이며 10㎕의 혈청생체시료를 90㎕의 상기 PBS 용액(표준물질 I이 포함된 용액)을 첨가하고 나이트로셀룰루로스 막(nitrocellulose membrane) disc를 넣어 30분간 흔들어 주면서 반응시켜 생체시료를 준비하였다. 앞서 제작된 100 ~ 400 ng의 단일가닥핵산들을 투입하여 30분간 반응시켜 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 생성하였다.

준비된 단일가닥핵산들을 표준물질I이 포함된 혈청생체시료가 부착된 디스크에 처리하여 30분간 반응시켰다. 선택버퍼 또는 50 mM EDTA로 3회 세척하고 단백질-단일가닥핵산이 붙은 디스크를 분리하여 수확하였다.

상기 백질(생체분자)-단일가닥핵산이 붙은 디스크를 RT-PCR 용액에 넣어 역전사를 한 후 Cy-5로 표지된 프라이머(5'-Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3': 서열번호 3)로 증폭반응을 수행하여 Cy-5로 표지된 단일가닥핵산인 분석타깃프로브를 준비하였다. 상기에서 준비된 플라스미드 풀에서 준비된 단일가닥핵산들을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 역전사하고 Cy-3가 표지된 프라이머(5'-Cy3-CGGAAGCGTGCTGG GCC-3')로 증폭반응하여 Cy-3로 표지된 단일가닥핵산인 비교타깃프로브준비하였다. 상기 둘 용액을 동량으로 혼합하여 분석타깃프로브 및 비교타깃프로브를 포함하는 타깃프로브를 제작하였다.

실시예 6. 핵산칩과 타깃프로브용액의 혼성화반응

상기 실시예4에서 준비된 타킷프로브용액을 본 발명의 핵산칩의 포착프로브에 처리하여 60℃에서 4 ~ 12 시간 혼성화하고 42℃에서 0.1 x SSC 용액으로 세척하였다. 이때 혼성화 용액은 1 M 염화나트륨, 0.3 M sodium citrate, 0.5% SDS 또는 100㎍/ml 살몬스펌 DNA, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산을 포함한다.

전혼성화가 끝난 유리 슬라이드에 실시예3에서 준비된 타깃프로브 용액을 처리하여 42℃에서 12시간동안 혼성화(Hybridization)를 수행한 후, 핵산칩을 세척용액으로 세척하였다. 이때, 세척용액의 조성은 예로 들면, 1X SSC + 0.2% SDS, 1X SSC + 0.2% SDS, 0.5X SSC + 0.2% SDS, 0.01X SSC + 0.2% SDS 순의 단계이며 각각 단계마다 42℃에서 30분간 수행하였다.

실시예7. 핵산칩의 스폿 탐색 및 분석

상기 실시예4의 세척이 종료된 후, 유리 슬라이드를 원심분리로 건조한 후, 사용한 형광염료를 여기(excitation)하기 위한 적절한 파장의 레이저(Cy5, 635 nm)를 갖는 레이저 스캐너(laser scanner, GenePix4000, Axon사)를 이용하여 탐색하였다. 형광이미지는 다중-이미지-태그된 이미지 파일(multi image tagged image file, TIFF) 포맷으로 저장한 후, 적절한 화상분석(image analysis) 소프트웨어(GenePix Pro 3.0, Axon사)로 분석하였다.

스폿(spot)당 시그널 강도(signal intensity, 단위: quanta)는 주위 배경의 기본 시그널을 뺀 것을 사용하는데, 여기서 배경 시그널은 특정 스폿의 주위에 있는 4개 스폿의 주변 시그널로 구성된 지역적 배경(local background)을 의미한다. 스폿이 가지고 있는 화소(pixel)의 90% 이상이 배경 시그널 + 2 표준편차(S.D.; standard deviation)를 초과하는 시그널 강도를 보일 때 데이터 분석에 포함시키며, 위 조건을 충족시키지 못하면 데이터에 포함시키지 않는 스폿(bad spot)으로 분류하고, 분석에 포함하지 않는 것이 일반적이다.

표지 효율(Labeling efficient)에 따른 편차(variation)는 내부표준(internal standard, IS)의 시그널을 이용하여 평준화(e.g., Normalized Intensity = Probe Intensity / IS intensity)하며, 단일표지(monolabeling)를 한 경우에는 Cy5 채널의 시그널 강도(signal intensity)로 그 결과를 기록하며 스폿팅(spotting)이 두 배 이상으로 된 경우는 평균값을 사용한다. 타깃 단일가닥핵산의 시그널 강도 (signal intensity, S)는 스폿이 갖는 픽셀(pixel)들에 대해서 각각의 시그널 강도를 구한 다음 이들의 중심값(median)을 사용한다(median value of pixel-by-pixel). 시그널 강도(S)는 내부표준(IS)을 이용해서 표지효율에 따른 편차를 평준화한다.

S'(normalized value) = S (Cy5-reference) x (Cy5-IS).

이상의 방법으로 픽셀 밀도의 분석 결과와 실제 생체시료량 사이의 관계를 규명하여 그 상관관계를 확인할 수 있다. 핵산칩 형광 데이터를 이미지화하고 모든 스폿의 패턴으로 생체시료에서 생체분자 프로파일을 확인하는 방법을 제공할 수 있으며, 스폿들의 패턴을 계층 클러스터링(Hierarchical Clustering) 및 인공신경망(Artificial Neural Network) 등의 방법 등으로 분석하여 사용할 수 있다. 스폿의 형광정도는 포착프로브와 타깃프로브가 생성하는 이중가닥의 성질에 따라 다양하게 나타난다. 스폿을 구성하는 분석타깃프로브 및 비교타깃프로브의 양에 따라 스폿의 형광정도가 결정된다.

먼저, 상기 실시례의 이미지는 도6에 도시된 바와 같으며, 기준물질은 외래생체분자 A, B, C, D 및 E 등 5개 종류 식물특이단백질로 구성되어 있다. 외래생체분자 A는 0.01pg/ml, 외래생체분자 B는 1.0pg/ml, 외래생체분자 C는100.0pg/ml, 외래생체분자 D는 10.0ng/ml, 외래생체분자 E는 1.0ug/ml를 혈청시료에 넣고 분석을 하였다. 기준물질에 상응하는 스폿의 형광정도는 정도관리 비교타깃프로브와 정도관리 분석타킷프로브의 양으로 결정될 것이다. 정도관리 비교타깃프로브의 양은 알고 있음으로 기준물질에 상응하는 스폿의 형광정도는 분석생체시료에 있는 기준물질에서 만들어지는 정도관리 분석타킷프로브의 양에 의해 결정될 것이다. 즉 기준물질에 상응하는 스폿의 형광정도는 분석생체시료에 포함된 기준물질의 양과 관계가 있다. 따라서 이들의 상관관계를 표준곡선으로 작성하여 목적하는 스폿의 형광정도를 이용하여 목적하는 스폿을 정량분석을 할 수 있다.

본 실험에서는 비교타깃프로브는 일정한 양으로 구성되어 있어 스폿의 형광정도는 분석타깃프로브의 양을 나타내고, 분석타깃프로브의 양은 인간혈청단백질-단일가닥핵산 복합체의 양을 표현한다. 또한 상기 복합체의 양은 생체시료에 있는 생체분자의 양을 나타낸다. 따라서 스폿의 형광정도로부터 스폿에 상응하는 생체분자를 포함하는 생체시료에서 특정 생체분자의 양을 확인할 수 있다. 결국 생성된 스폿의 형광정도를 분석하여 핵산칩의 모든 스폿들의 패턴을 확인함으로써 인간혈청에서 혈청단백질의 프로파일을 확인할 수 있게 된다.

즉, 생성되는 스폿들이 파랑-노랑-빨강색의 칼라 스펙트럼은 보이는 것은 포착프로브에 결합한 Cy-3이 표지된 경쟁적 저해제와 Cy-5가 표지된 타깃프로브의 비율이 다양하여 나타나는 현상이며 특정 스폿의 컬러스펙트럼의 정도는 인간혈청을 구성하는 특정한 혈청생체시료에 존재하는 특정한 생체분자(단백질)의 양을 표현함으로 핵산칩 상의 모든 스폿들의 컬러스펙트럼을 보여주는 이미지는 특정한 생체시료에서 생체분자 프로파일에 해당한다.

즉, 본 발명의 생체분자 분석방법에서는 특정 스폿에서 포착프로브와 결합하여 이중가닥을 생성하는 타깃프로브는 Cy-3가 표지된 비교타킷프로브와 Cy-5가 표지된 분석타깃프로브로 구성되어 있고, 전자는 일정한 양으로 존재하나 후자는 인간혈청에서 상응하는 생체분자에 비례하여 존재한다. 이에 따라 특정한 스폿은 후자가 상대적으로 소량으로 존재하면 파란색, 비슷하게 존재하면 노란색, 그리고 과량으로 존재하면 빨간색이 된다.

핵산칩 상에서 스폿의 분석으로 이중가닥 내 분석타깃프로브 수에 따라 형광정도가 상이하며 이는 생체분자의 수와 상관관계가 있다. 따라서 본 발명의 핵산칩을 구성하는 모든 스폿의 컬러스펙트럼을 반영하는 이미지는 미지의 생체분자를 포함하는 생체시료의 생체분자 프로파일이다.

이상의 테스트 결과는 도6과 같으며, 도시된 바와 같이 포착프로브가 부착된 유리 슬라이드에서 혈청단백질에 결합하는 단일가닥핵산에 기초한 포착프로브가 부착된 부위인 스폿은 다양한 형광정도, 파랑-노랑-빨강색의 칼라 스펙트럼을 생성한다.

실시예8. 심혈관환자의 혈청단백질 분석의 반응

도6의 결과로부터 인간혈청단백질에 결합하는 타깃 단일가닥핵산에 기초한 핵산칩을 이용하여 인간혈청에서 혈청단백질의 프로파일을 확인할 수 있으며 또한 건강한 사람(A) 및 안정성 협심증 심혈관질환자(B)의 혈청내 생체분자의 프로파일이 상이함을 확인할 수 있다.

도7는 환자의 혈액생체시료에서부터 본 발명의 핵산칩을 이용하여 생산된 프로파일을 질환군별로 구성된 데이터베이스화 하는 과정에 대한 순서를 흐름도로 보여준 도면이다. 도8는 생산된 프로파일을 질환군별로 구성된 데이터베이스 및 인공신경망을 이용한 프로그램으로 특정한 사람의 혈청에 대해 생체분자 프로파일을 생산하여 질병을 진단하는 흐름도이다.

도8에 도시한 바와 같이, 많은 생체시료에서 생산되는 프로파일로 구축된 데이터베이스를 생물정보학기술로 분석하여 유용한 정보를 확보할 수 있다. 건강한 사람, 안정성 협심증, 불안정성 협심증 및 심근경색 등의 심혈관환자의 혈청프로파일 데이터베이스를 이용하여 Lee 2-1(99)라는 사람의 혈청생체시료를 검사한 결과는 도9과 같으며 72.5% 10 fold cross validation으로 건강한 사람으로 예측할 수 있다.

심혈관질환 진단용 데이터베이스 구축에 사용된 혈청생체시료의 임상적인 자료는 아래의 표2이며, 건강한 사람37명, 안정성 협심증 36명, 불안정성협심증 27명 및 심근경색환자 27명 등 총 127명이다.

심혈관질환자의 임상정보

	건강한 사람	안정성 협심증	불안정성 협심증	심근경색
성별
남성	35	35	27	27
여성	2	1	1	0
나이
40~49	1	0	1	0
50~59	13	17	15	17
60~69	22	18	11	10
70~79	1	1	1	0
합 계	37	36	28	27

건강한 사람과 간암의 혈청프로파일 데이터베이스를 이용하여 KIM라는 사람의 혈청생체시료를 검사한 결과는 도10과 같으며 93.0% 10 fold cross validation으로 간암환자로 예측할 수 있다.

추가적으로 전이 유무를 검사하기 위한 건강한 사람, 비전이 간암 및 전이 간암의 혈청단백질 프로파일 데이터베이스를 이용하여 KIM라는 사람의 혈청생체시료를 검사한 결과는 도8과 같으며 76.0% 10 fold cross validation으로 비전이 간암환자로 예측할 수 있다.

간암 진단용 데이터베이스 구축에 사용된 혈청생체시료의 임상적인 자료는 표3이며, 건강한 사람 19명, 비전이 간암환자 72명 및 전이성 간암환자 11명으로 간암환자는 83명이고 생체시료의 총수는 102례이다.

표 3건강한 사람과 간암의 혈청프로파일 데이터베이스를 이용하여 KIM라는 사람의 혈청생체시료를 검사한 결과는 도10과 같으며 93.0% 10 fold cross validation으로 간암환자로 예측할 수 있다.

간암의 임상정보

	건강한 사람	비전이 간암	전이 간암
성별
남성	17	67	11
여성	2	5	0
나이
40~49	14	60	7
50~59	5	7	3
60~69	0	5	1
합 계	19	72	11

건강한 사람과 심근경색환자의 혈청프로파일을 비교하여 심근경색환자에 특이적으로 존재하는 스폿을 결정하고 이에 상응하는 단일가닥핵산에 바이오틴(biotin)을 부착시키고 스트렙타비딘(streptavidin)과 반응시킨 후, 혈청생체시료와 반응시켜 복합체를 분리한 다음 전기 영동하여 생성되는 밴드를 분리하여 생체분자를 동정하는 과정의 순서에 대한 흐름도는 도11이다. 선정된 단일가닥핵산에 결합하는 단백질을 분리하여 MALDI-TOF-TOF 기기로 단백질의 아미노산서열을 결정한 도면은 도12이다.

상기의 방법으로 생체시료를 구성하는 생체분자와 결합하는 단일가닥핵산을 기초한 단일가닥핵산이 부착된 본 발명의 핵산칩를 이용하여 특정한 생체시료에서 생체분자의 프로파일을 탐색 및 분석하였다.

또한, 의학적으로 유용한 생체시료의 생체분자를 생산하여 데이터베이스를 제작한 다음 특정한 사람의 혈청프로파일을 생산하고 인공신경망알고리즘을 이용하여 제작한 프로그램으로 심혈관질환의 유무 및 그 종류, 간암발명의 유무 및 전이정도를 검사하였다.

질환군별로 구성된 데이터베이스를 비교분석하여 유용한 스폿을 결정하고 이에 상응하는 단일가닥핵산을 조제하여 상응하는 단백질을 분리하여 동정하였다.

실시예 9. 세포주의 표면생체분자의 프로파일 생성 및 응용

9-1. 핵산칩 제작

본 발명에서 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료가 세포주의 예시이다.

상기 실시예 2 내지 실시예 4의 방법으로 생체시료인 비소세포폐암 세포주의 표면생체분자의 프로파일을 생산하는 본 발명의 핵산칩을 제작하였다. 준비한 무작위 단일가닥핵산들을 폐암세포주에 반응시킨 후 세척버퍼를 사용하여 세포주(생체분자)-단일가닥핵산 복합체를 세척하여 비결합 단일가닥핵산 및 결합정도에 따라 단일가닥핵산을 해리시킨 다음 5,000xg로 원심분리하는 과정을 반복적으로 처리한 후, 세포주-단일가닥핵산 복합체를 원심분리방법으로 분리하여 비소세포폐암세포주의 표면생체분자와 결합하는 단일가닥핵산들을 제작하였다.

상기 제작된 단일가닥핵산들로부터 클론을 선정하여 염기서열을 결정하고 분석하여 1,000여개의 단일가닥핵산을 선정하였다. 실시예2의 방법으로 선정된 1,000여개의 단일가닥핵산의 상보적인 염기서열로 이루어진 포착프로브를 합성하고 고체 지지체 위에 부착시켜 본 발명의 핵산칩을 제작하였다.

9-2. 세포주의 표면생체분자 프로파일 생성

상기 실시예 4의 방법으로 제작된 핵산칩을 이용하여 소세포폐암세포주(SCLC)의 표면분자의 프로파일을 생산하였다. 소세포폐암세포주와 단일가닥핵산 풀을 반응시킨 다음, 세포주(생체시료)의 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 세척 및 분리하였다. 상기 복합체에 결합된 단일가닥핵산을 실시예3의 방법으로 증폭 및 표지하였다. 포착프로브와 표지된 타깃프로브를 실시예4의 방법으로 반응시켰다. 상기 타깃프로브에 표지된 물질의 측정은 실시예5의 방법으로 수행하였으며 비소세포폐암세포주의 표면 생체분자의 프로파일을 확인하였다.

생산된 프로파일로 소세포폐암세포주(SCLC)에 강력하게 결합할 것으로 추정되는 단일가닥핵산을 선정하여 FITC가 부착된 단일가닥핵산을 합성하여 소세포폐암세포주, 비소세포폐암제포주(NSCLC), 혈암세포주(MRC-5 및 THP-1)와 반응시킨 다음 형광 촬영한 이미지는 도13과 같다.

이와 같이 본 발명의 핵산칩을 이용하여 생산된 소세포폐암세포주 프로파일을 분석하여 선정한 단일가닥핵산이 소세포폐암세포주와 결합함을 확인할 수 있었다.

실시예 10. 대장균의 표면 생체분자의 프로파일 생성 및 응용

10-1. 핵산칩 제작

생체시료인 대장균 KCTC12006와 상기 실시예 2 내지 실시예 4의 방법으로 본 발명의 핵산칩를 제작하였다. 준비한 단일가닥핵산들과 대장균을 반응시킨 후 세척버퍼를 사용하여 대장균(생체분자)-단일가닥핵산 복합체를 세척하여 비결합 단일가닥핵산 및 결합정도에 따라 단일가닥핵산을 해리시킨 다음 5,000xg로 원심분리하는 과정을 반복적으로 처리한 후, 대장균-단일가닥핵산 복합체를 원심분리방법으로 분리하여 대장균의 표면생체분자와 결합하는 단일가닥핵산들을 제작하였다.

상기 제작된 단일가닥핵산들로부터 클론을 선정하여 염기서열을 결정하고 분석하여 1,000여개의 단일가닥핵산을 선정하였다. 선정된 1,000여개의 단일가닥핵산의 상보적인 염기서열로 포착프로브들)을 합성하고 고체 지지체 위에 부착시켜 본 발명에 따른 핵산칩을 제작하였다.

10-2. 대장균의 표면생체분자 프로파일 생성

본 발명에서 둘 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 생체시료가 세균의 예시이다.

상기 실시예6의 방법으로 제작된 핵산칩을 이용하여 대장균 KCTC12006의 표면분자의 프로파일을 생산하였다.

대장균과 단일가닥핵산 풀을 반응시킨 다음 대장균-타깃단일가닥핵산 복합체를 세척 및 분리하였다. 상기 복합체에 결합된 단일가닥핵산을 실시예3의 방법으로 증폭 및 표지하였다. 포착프로브와 표지된 타깃프로브를 실시예4의 방법으로 반응시켰다. 상기 타깃 단일가닥핵산에 표지된 물질의 측정은 실시예 5의 방법으로 수행하였으며, 대장균의 표면 생체분자의 프로파일을 확인하였다.

대장균 KCTC12006의 표면 생체분자 프로파일을 생산하는 동일한 방법으로 살모넬라 균(Salmonella typhimurium ATCC13311)의 표면생체분자 프로파일을 생산하여 데이터베이스를 구축한 다음 계층 클러스터링 방법에 기초하여 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산을 선정하였다. 상기 단일가닥핵산의 특이성을 SPR 장비(BIAcore 사)로 측정한 결과는 도14와 같았으며, 선정된 단일가닥핵산이 살모넬라균에 비해 대장균에 특이적으로 결합하고 있음을 확인하였다.

대장균에 결합하는 단일가닥핵산 및 나노금 입자를 이용하여 대장균을 측정하는 방법(예, 대한민국 특허출원번호 10-2006-0072480 참조)으로 상기에서 선정된 단일가닥핵산을 이용하여 용액에 대장균의 유무 및 음식물에 대장균의 오염정도를 측정한 결과는 도15과 같았다. 음식물을 세척한 셀렉스 버퍼에 단일가닥핵산을 반응시키고 나노금입자를 넣은 다음 NaCl 용액을 첨가하며 대장균이 없는 용액은 투명한 무색에 가까운 파란색이며 대장균이 오염된 용액은 빨강색으로 변화되며 그 정도는 오염된 대장균수에 비례함을 확인하였다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 기준물질 및 핵산칩의 제조방법 및 생체분자 분석방법에 의하면, 둘 또는 그 이상의 생체분자들로 구성된 생체시료에 있는 생체분자들의 병렬고속분석(High Throughput Screening)을 내부정도관리를 하면서 매우 간단하고 저렴하며 효율적으로 할 수 있어 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위한 분야에서 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 도구로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

무작위 염기서열로 구성된 무작위 단일가닥핵산으로 구성된 핵산라이브러리에서 둘 또는 그 이상의 생체분자들로 구성된 생체시료에 있는 생체분자에 결합하는 결합단일가닥핵산 및 분석단일가닥핵산을 선정하기 위한 정도관리 기준물질을 사용하고 정도관리 단일가닥핵산을 핵산분석방법으로 분석하여 내부정도관리하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제1항에 있어서, 상기 정도관리 기준물질은 분석하고자하는 상기 생체시료에 포함되지 않는 생체분자를 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제2항에 있어서,
상기 생체시료에 포함되지 않는 생체분자를 결정하며 결정된 외래생체 분자들로부터 정도관리 단일가닥핵산을 제조하는 단계;
상기 생체시료에 있는 생체분자들로부터 상기 결합단일가닥핵산들을 제조하는 단계; 및
상기 정도관리 단일가닥핵산 및 상기 결합단일가닥핵산의 염기서열을 사용하여 구성되고 합성된 포착프로브가 고착된 지지체를 제조하는 단계;
를 포함하는 방법으로 제조되고,
상기 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 상기 분석단일가닥핵산을 선정하기 위한, 상기 생체시료, 상기 기준물질, 상기 결합단일가닥핵산, 상기 정도관리 단일가닥핵산 및 상기 핵산칩을 사용하여 상기 생체분자들과 상기 결합단일가닥핵산들의 결합프로파일을 생성하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법
제3항에 있어서, 상기 결합단일가닥핵산들을 제조하는 방법은,
상기 생체시료에 있는 생체분자들 및 상기 기준물질로 구성된 시료에 상기 무작위 염기서열을 가진 단일가닥핵산들을 반응시켜 얻은 반응용액에 있는 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 단계;
상기 복합체들로부터 단일가닥핵산들을 분리하여 증폭하여 단일가닥핵산 DNA를 제조하는 단계; 및
상기 단일가닥핵산 DNA들을 클로닝 벡터에 삽입하여 단일클론을 확보하고 상기 단일가닥핵산의 염기서열을 결정함으로써 상기 결합단일가닥핵산을 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제4항에 있어서, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 방법은,
상기 반응용액에 있는 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 세척하고, 상기 생체분자들과 상기 단일가닥핵산들의 결합력의 크기에 기초하여 일정 결합력 이상의 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제4항에 있어서, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 선택하는 방법은 상기 반응용액을 모세관 전기영동하여 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제4항에 있어서, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 선택하는 방법은 상기 반응용액을 나이트로셀룰로스 및 나일론으로 구성된 구조체에 처리하여 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제4항에 있어서, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 선택 및 증폭을 반복적으로 다수회 실행하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제3항에 있어서, 상기 포착프로브가 고착하는 지지체는 유리슬라이드, 바이오센서의 감지표면, 비드, 나노입자 등을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제3항에 있어서, 상기 포착프로브는 상기 결합단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열들과 이들의 상보적인 염기서열들 중에 선택되는 적어도 하나의 염기서열로 구성하여 합성하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제3항에 있어서, 상기 생체시료에 있는 생체분자와 상기 결합단일가닥핵산의 결합프로파일을 생성하는 방법은,
상기 기준물질, 상기 생체시료, 상기 정도관리 단일가닥핵산 및 상기 결합단일가닥핵산으로부터 표지물질이 있는 분석타깃프로브를 제조하는 단계;
상기 포착프로브에 상응하는 상기 결합단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 혼합 및 증폭하여 표지물질이 있는 비교타깃프로브를 제조하는 단계;
상기 분석타깃프로브와 상기 비교타깃프로브들을 혼합하여 타깃프로브를 제조하는 단계; 및
상기 타깃프로브들과 상기 지지체의 상기 포착프로브들을 혼성화 반응을 시켜 결합프로파일을 획득하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제11항에 있어서, 상기 분석타깃프로브를 제조하는 방법은,
상기 기준물질들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질I를 상기 생체시료에 첨가한 분석시료를 준비하는 단계;
상기 분석시료와 상기 결합단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산으로 구성된 단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체 및 기준물질-단일가닥핵산 복합체를 분리하는 단계; 및
상기 복합체들에서 단일가닥핵산들을 분리, 증폭 및 표지하여 분석타깃프로브를 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제11항에 있어서, 상기 분석타깃프로브를 제조하는 방법은,
상기 생체시료와 상기 결합단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체로부터 단일가닥핵산을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 단일가닥핵산에 정도관리 단일가닥핵산들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질II를 혼합하여 증폭 및 표지로 상기 분석타깃프로브를 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
제3항에 있어서, 상기 생체분자들의 생물학적 의미 분석을 위한 분석단일가닥핵산의 선별은 상기 포착프로브들의 기여도에 기초하여, 상기 생체분자의 생물학적 의미를 분석할 수 있는 범위 내에서, 상기 포착프로브들을 선별함으로써, 상기 지지체에 고착하는 상기 포착프로브들의 개수를 감소시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석단일가닥핵산 선정 방법.
상기 결합단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열을 사용하여 합성된 포착프로브가 지지체에 고착된 구성으로 되어 있고, 상기 분석단일가닥핵산을 선정하기 위한, 결합단일가닥핵산 및 정도관리 단일가닥핵산의 결합정보를 생성하는 것을 특징으로 하는 핵산칩.
상기 분석단일가닥핵산을 사용하여 상기 생체시료에 있는 생체분자 분석을 위한 상기 정도관리 기준물질을 사용하고 상기 정도관리 단일가닥핵산을 핵산분석방법으로 분석하여 내부정도관리하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석 방법.
제16항에 있어서, 상기 분석단일가닥핵산을 사용하여 상기 생체시료에 있는 생체분자 분석을 핵산분석방법으로 하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석 방법.
제16항에 있어서, 상기 정도관리 기준물질은 분석하고자하는 상기 생체시료에 포함되지 않는 생체분자를 특징으로 하는, 생체분자 분석 방법.
제17항에 있어서,
상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열을 사용하여 합성된 상기 포착프로브를 지지체에 고착하는 단계;
상기 기준물질, 상기 생체시료, 상기 정도관리 단일가닥핵산, 및 상기 분석단일가닥핵산으로부터 표지물질이 있는 타깃프로브를 제조하는 단계;
상기 타깃프로브를 상기 지지체의 상기 포착프로브에 혼성화 반응시켜 결합정보를 획득하는 단계; 및
상기 획득된 결합정보와 이미 확보되어 있는 결합정보 데이터를 비교하여 상기 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석방법.
제19항에 있어서, 상기 타깃프로브를 준비하는 방법은,
상기 기준물질, 상기 생체시료, 상기 정도관리 단일가닥핵산, 및 상기 분석단일가닥핵산으로부터 표지물질이 있는 분석타깃프로브를 제조하는 단계;
상기 포착프로브에 상응하는 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 혼합, 증폭하여 표지물질이 있는 비교타깃프로브를 제조하는 단계; 및
상기 분석타깃프로브 및 상기 비교타깃프로브로 구성된 타깃프로브를 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석방법.
제18항에 있어서, 상기 포착프로브들이 고착하는 지지체는 유리슬라이드, 바이오센서의 감지표면, 비드, 나노입자 등을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석방법.
제19항에 있어서, 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산의 염기서열에 완전하게 상보적 결합을 하는 염기서열로 구성된 상기 포착프로브를 특징으로 하는, 생체분자 분석방법.
제19항에 있어서, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체와 상기 기준물질-단일가닥핵산 복합체에서 분리된 분석단일가닥핵산을 표지 및 증폭하기 위한, 표지물질이 있는 프라이머와 상기 복합체에 포함된 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산의 특정염기서열을 포함하는 영역과 이들을 각각 지시하는 염기서열 영역이 있는 태그로 구성된 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는, 생체분자분석방법.
제22항에 있어서, 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산을 지시하는 태그의 염기서열에 완전하게 상보적 결합을 하는 염기서열로 구성된 상기 포착프로브를 특징으로 하는, 생체분자 분석방법.
제19항에 있어서, 상기 분석타깃프로브를 제조하는 방법은,
상기 기준물질들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질I를 상기 생체시료에 첨가한 분석시료를 준비하는 단계;
상기 준비한 분석시료와 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 정도관리 단일가닥핵산으로 구성된 단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체 및 기준물질-단일가닥핵산 복합체를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 복합체에 있는 상기 분석단일가닥핵산을 분리, 증폭 및 표지하여 분석타깃프로브를 준비하는 단계;
를 특징으로 하는, 생체분자분석방법.
제19항에 있어서, 상기 분석타깃프로브를 준비하는 방법은,
상기 생체시료와 상기 분석단일가닥핵산들을 반응시켜 생성된 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 생체분자-단일가닥핵산 복합체에서 분리된 분석단일가닥핵산에 정도관리 단일가닥핵산들이 각각 다른 양으로 구성된 기준물질II를 혼합, 증폭 및 표지하여 상기 표지된 분석타깃프로브를 제조하는 단계;
를 특징으로 하는, 생체분자 분석방법.
실험구 상기 생체시료에 있는 생체분자들에 상기 분석단일가닥핵산을 반응시켜 제조되는 분석타깃프로브와 대조구 상기 생체시료에 있는 생체분자들에 상기 분석단일가닥핵산을 반응시켜 제조되는 비교타깃프로브를 혼합하여 제조된 타깃프로브로 상기 핵산칩을 분석하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석방법.
제19항에 있어서, 상기 표지물질은 비오틴(Biotin), Cy2, GFP, YO-PRO-1, YOYO-1, Calcein, FITC, FlourX, ALEXA 488, Rhodamine 110, ABI 5-FAM, Oregon Green 500, Oregon green 488, RiboGreen, Rhodamine Green, Rhodamine 123, Magnesium Green, Calcium Green, TO-PRO-1, TOTO-1, ABI JOE, BODIPY 530/550, Dil, BODIPY TMR, BODIPY558/568, BODIPY564/570, Alexa 546, TRITC, Magnesium Orange, Phycoerythrin R & B, Rhodamine Phalloidin, Calcium Orange, Pyronin Y, Rhodamine B, ABI TAMRA, Rhodamine Red, Cy3.5, ABI ROX, Calcium Crimson, Alexa 594, Texas Red, Nile Red, YO-PRO-3, YOYO-3, R-phycocyanin, C-phycocyanin, TOPRO-3, TOTO-3, DiD DilC(5), Thiadicarbocyainie, Cy5.5, Cy5 또는 Cy3에서 선택되는 형광색소를 사용하는 것을 특징으로 하는, 생체분자의 분석방법 및 분석장치.
상기 분석단일가닥핵산들 및 상기 정도관리단일가닥핵산들의 염기서열들을 사용하여 제조된 포착프로브가 지지체에 고착된 구성으로 되어 있고, 상기 생체시료에 있는 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 상기 생체분자들과 상기 분석단일가닥핵산들의 결합정보를 생성하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는 핵산칩.
상기 생체시료에 포함되지 않는 외래분자들로 구성되어 있고, 상기 분석단일가닥핵산으로 상기 생체시료에 있는 생체분자의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 분석과정의 정도관리 및 생체시료에 포함된 생체분자들의 정량분석을 하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는 기준물질.
상기 생체시료에 있는 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 상기 분석단일가닥핵산 및 상기 기준물질을 사용하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석 키트.
상기 분석단일가닥핵산 및 상기 기준물질을 이용한 생체분자 분석방법을 통해 실시하는 것을 특징으로 하고, 상기 생체시료에 있는 생체분자들을 준비하는 시료처리장치, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 제조하고 이를 증폭하는 모듈 및 상기 증폭된 산물을 분석하는 모듈로 구성된 증폭장치를 포함하는 생체분자 분석하는 시스템을 특징으로 하는, 생체분자 분석장치.
제19항에 있어서, 상기 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보 데이터를 이용한 생물적인 의미 분석을 위한 구성은,
환자군의 상기 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보와 대조군의 상기 생체분자와 분석단일가닥핵산의 결합정보 데이터를 입력 받고 데이터베이스를 구축하는 모듈;
상기 입력된 결합정보 데이터를 이용하여 분석 시스템에서 전 처리를 수행하는 모듈;
상기 전 처리된 결과를 가지고 환자의 모델을 생성하는 모듈;
상기 생성된 모델을 로딩하여 내원한 환자에 적용하여 블라인드 테스트(Blind test)인 진단을 수행하는 모듈; 및
교차검정을 통해 시스템의 성능을 평가하는 모듈;
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석방법 및 장치.
제33항에 있어서, 상기 환자의 모델을 생성하는 방법은, 선형 모델(linear models), 지지 벡터 기계(support vector machines), 신경망(neural networks), 분류 및 회귀 트리(classification and regression trees), 앙상블 학습법(ensemble learning methods), 판별식 분석(discriminant analysis), 근접 네이버 방법(nearest neighbor method), 베이즈 네트워크(Bayesian networks), 독립 성분 분석(independent components analysis)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체분자 분석방법 및 장치.
상기 생체시료는 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직으로 구성된 군으로 부터 선택되고 상기 생체분자는 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 기준물질 및 핵산칩의 제조방법 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 분석장치.