KR20080108652A

KR20080108652A - 미지의 생체분자와 단일가닥핵산의 결합 프로파일을생성하기 위한 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을이용한 미지의 생체분자 분석방법

Info

Publication number: KR20080108652A
Application number: KR1020070056473A
Authority: KR
Inventors: 김성천
Original assignee: 김성천
Priority date: 2007-06-11
Filing date: 2007-06-11
Publication date: 2008-12-16
Also published as: KR100923048B1

Abstract

본 발명은 미지의 생체분자와 단일가닥핵산의 결합 프로파일을 생성하기 위한 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법에 관한 것이다, 본 발명의 핵산칩은 생체시료에 포함된 미지 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 것이 사용된다. 본 발명의 핵산칩은, 미지의 생체분자들이 포함된 생체시료와 무작위 염기서열을 가진 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 상기 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 단계, 및 결정된 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들 및/또는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들로 구성된 포착 단일가닥핵산을 합성하여 상기 포착 단일가닥핵산을 기판에 고착하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된다.

Description

미지의 생체분자와 단일가닥핵산의 결합 프로파일을 생성하기 위한 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법{Nucleic Acid Chip for Obtaining Bind Profile of Single Strand Nucleic Acid and Unknown Biomolecule, Manufacturing Method Thereof, and Analysis Method of Unknown Biomolecule Using Nucleic Acid Chip}

도1은 본 발명의 핵산칩의 제조방법에 관련된 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 과정을 보여주는 개략도,

도2는 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 미지의 생체분자들과 단일가닥핵산들의 결합 프로파일을 생성하는 과정을 보여주는 개략도,

도3은 본 발명에 따른 핵산칩을 적용하여 생성한 건강한 사람(A)과 안정성 협심증 심혈관환자(B) 혈청의 프로파일,

도4는 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 환자의 혈청시료로부터 생산된 프로파일을 질환군별로 데이터베이스를 구축하는 과정의 순서를 보여주는 개략도,

도5는 본 발명에 따른 핵산칩으로 생성된 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로 질병을 진단하는 과정을 보여주는 도면,

도6은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로 심혈관질환을 진단한 결과를 보여주는 도면,

도7은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로 간암을 진단한 결과를 보여주는 도면,

도8은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생성된 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스 및 인공신경망 알고리즘을 이용한 프로그램으로, 간암의 전이를 진단한 결과를 보여주는 도면,

도9는 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스에서 심근경색환자의 혈청에 특이적으로 존재하는 단백질의 아미노산서열을 결정하는 과정의 순서를 보여주는 도면,

도10은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생성한 인간혈청단백질 프로파일의 데이터베이스에서 심근경색환자의 혈청에 특이적으로 존재하는 단백질의 아미노산서열을 결정한 도면,

도11은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 생성한 폐암세포주 NCI-H1299의 표면생체분자 프로파일을 생산 및 분석하여 확보한 단일가닥핵산이 폐암세포주에 결합한 결과를 보여주는 도면,

도12는 본 발명에 따른 핵산칩을 이용한 대장균 KCTC12006 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium ATCC13311)의 표면생체분자 프로파일을 생산 및 분석하여 확보한 생체분자결합 단일가닥핵산의 특이성을 보여주는 도면,

도13은 본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 선정된, 대장균에 특이적으로 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산과 나노금입자를 이용하여 대장균이 오염된 음식물에서 오염정도를 측정한 결과를 보여주는 도면.

(기술분야)

본 발명은 미지의 생체분자와 단일가닥핵산의 결합 프로파일을 생성하기 위한 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법에 관한 것이다.

(배경기술)

생체시료를 구성하는 미지의 생체분자를 포함한 수많은 생체분자(단백질 및 탄소화물)들의 프로파일을 생산하는 기술은, 물리학, 생화학 및 생물정보학의 발달로 널리 개발되었으나, 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다.

미지의 생체분자를 포함하는 생체시료에서 이들 생체분자들의 양적인 상태를 종합화한 정보, 즉 생체분자의 프로파일(profile)을 생산하는 방법은, 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 목표를 이루기 위한 하나의 수단이지만, 미생물, 세포, 조직 등에 유용하게 사용할 수 있어 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다.

핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체이며 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘 (사이토신, 티미딘, 우라실)이다. 핵산은 단일가닥 혹은 이중가닥으로 존재하고, 단일가닥핵산은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오티드들 간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 입체구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.

일반적으로 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)과 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소적 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다.

핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.

핵산이 단백질을 포함하는 분자에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들이 선별되고 있다.

특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법은 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 선별된 핵산을 소위 압타머(aptamer)라 한다(Tuerk C. and Gold L.; Science, 249, pp505-510, 1990).

이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질이나 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와 매우 높은 친화력으로 결 합할 수 있는 핵산들(압타머들)이 선별되고 있다.

그러나, 기존의 SELEX를 통한 핵산선별방법은 특정물질(예, 단백질)에 특이적으로 결합하는 핵산을 선별하기에 앞서, 우선적으로 해당 단백질(특정물질)을 대량으로 생산하고 정제한 다음에, 생산된 단백질에 단일가닥핵산 라이브러리를 반응시키고 선택과 증폭을 반복하여 결합력이 강력한 핵산(압타머)을 선정하는 방법으로서, 핵산을 선별하기 위해 우선 특정물질을 확보하는 것이 필수적이었다. 따라서 종래의 SELEX를 통한 핵산 선별방법은, 생체시료에 포함된 수많은 미지의 생체분자들 집단에 의미를 가지는 집단으로서의 핵산들을 선별하고 이용하는 것에 관한 기술 사상은 전혀 인식하고 있지 아니하였다.

생체시료인 조직, 세포덩어리, 세포 및 미생물 등을 구성하는 미지분자를 포함한 생체분자들의 프로파일은, 물리, 화학적인 성질을 이용하여 여러 가지 방법으로 만들어지고 있으며, 일반적으로 생체분자의 분자량 혹은 pI 값 등을 이용하여 전기영동을 하여 생체시료에서 생체분자의 양적인 상태인 생체분자의 프로파일을 확인하고 있다.

또한 프로파일을 분석하여 유용한 생체분자를 결정하고 이를 분리한 후, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) 등으로 이들의 구성성분을 확인하는 방법 등이 수행되고 있다. 최근에는 SELDI-TOF-MS (Surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)에 의해 단백질 프로파일에 대한 많은 연구가 진행되고 있다(Adam et al., Cancer Research, 62, 3609-3614. 2002; Li et al., Clinical Chemistry, 48, 1296-1304. 2002; and Petricoin et al., The Lancet, 359,572-577. 2002).

또한 최근에는 단백체에 대한 병렬고속분석(High Throughput Screening) 기법으로 단백질칩(Protein chip) 혹은 압타머칩(Aptamer chip)(Smith et al., Mol Cell Protomics, 11-18. 2003; and McCauley et al., Anal Biochem, 319(2), 244-250. 2003)이 개발되어 사용되고 있다.

단백질칩은 항체의 배열 상태를 알고 있기 때문에 특정물질의 구분 및 정량에 대한 탐색 및 분석이 가능하다. 단백질칩의 제작 방법에는 항체를 마이크로어레이어(Microarrayer)를 이용하여 스폿팅(spotting)하여 고정하는 방법이 있다. 단백질칩 감지기술은 단백질칩이 하나의 칩으로 가능한 많은 정보를 제공하기 위해 좁은 면적에 고밀도로 여러 항체들이 집적되어 있는 상태에서 발생하는 매우 약한 신호를 감지할 수 있어야 한다. 또한 단백질에 대한 생체정보가 늘어남에 따라 그 집적도가 더욱 높아질 추세로 발달하고 있어 이를 정량적으로 빠르고 정확하게 검출하는 새로운 방법이 요구되고 있다.

현재까지 검출방법은 주로 레이저 유발 형광법(laser induced fluorescence)이 많이 쓰이고 있으며 전기화학적 검출 방법 등이 개발되고 있다. 상기와 같이 다양한 과정을 통해 단백질칩을 이용한 생체시료에서특정 단백질들의 프로파일을 생산 및 분석하는 방법들이 개발되어 있지만 고가의 기기 및 시약을 사용하고 있으며 복잡한 과정을 수행해야 하는 등의 문제가 있으며 또한 항체를 제작할 수 있는 분자에 대해서만 제작이 가능한 한계가 있다.

압타머칩은 단백질칩에 항체를 사용하는 것 대신 압타머(핵산)를 사용하는 것이 상이하고 이외 다른 요소들은 매우 유사하다.

상기와 같이 단백질칩 및 압타머칩을 이용한 생체시료에서 생체분자의 양적인 상태 즉, 프로파일을 생산하는 방법들이 개발되어 있지만, 고가의 기기 및 시약을 사용하고 있으며 복잡한 과정을 수행해야 하는 등의 문제가 있다. 특히 지금까지의 단백질칩이나 압타머칩은 항체 혹은 압타머를 제작할 수 있는 이미 알려진 단백질에 대해서만 제한적으로 제작이 가능한 한계가 있다.

생체시료는 수백만 개의 단백질로 구성되어 있다고 알려지고 있으나, 현재 알려진 단백질의 수는 수 만개에 불과한 실정이므로, 생체시료에서 미지의 단백질들과 같은 미지의 생체분자의 양적상태, 즉 프로파일을 생산하는 기술의 필요성은 매우 높다.

생체시료의 생체분자를 총체적으로 분석하는 연구는, 의학적으로 질병에 관련된 생체분자의 프로파일을 분석함으로써, 질병을 진단할 수 있는 생체분자, 치료성적을 분석할 수 있는 생체분자, 질병 발병 및 진행에 중요한 역할을 하는 생체분자, 질병에 대한 감수성 관련된 생체분자, 및 신약개발의 표적분자를 구명하는 것에 사용할 있을 것이다.

본 발명의 목적은, 생체시료에 포함된 미지의 생체분자들과 단일가닥핵산들의 결합 프로필을 생성할 수 있는 핵산칩을 제공함으로써, 핵산칩을 이용하여 생성한 결합 프로필로부터 미지의 생체분자들이 관련된 질병 정보를 포함한 각종 생물학적 의미를 분석할 수 있도록 하고자 하는 것이다.

본 발명에 따라, 단일가닥핵산들과 미지 생체분자들의 결합 프로파일을 생성하는 것에 사용되는 핵산칩과 그 제조방법, 및 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법이 제공되며, 본 발명에 따른 핵산칩은 생체시료에 포함된 미지 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위해 사용된다.

본 발명에 따른 핵산칩의 제조방법은, 미지의 생체분자들이 포함된 생체시료와 무작위 염기서열을 가진 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 상기 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 제1 단계, 및 결정된 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들 및/또는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들로 구성된 포착 단일가닥핵산을 합성하여 기판에 고착하는 제2 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 핵산칩은, 생체시료에 포함된 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들 및/또는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들로 구성된 포착 단일가닥핵산들이 기판에 고착되어 있는 구성으로 되어 있다.

본 발명에 따른 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법은, 상기 본 발명에 따른 핵산칩을 준비하는 단계; 상기 핵산칩의 상기 포착 단일가닥핵산들과 동일한 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들과 상기 생체시료의 상기 미지 생체분자들을 반응시켜 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들을 형성하고 상기 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들을 분리하는 단계; 분리된 상기 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들로부터 상기 타깃단일가닥핵산들을 분리, 증폭 및 표지하는 단계; 표지된 상기 타깃 단일가닥핵산들을 상기 핵산칩의 상기 포착 단일가닥핵산들과 반응시켜 상기 표지를 통해 결합 프로파일을 획득하는 단계; 및 획득된 상기 프로파일과 이미 확보되어 있는 프로파일 데이터를 비교하여 상기 미지의 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 단계; 를 포함한다.

본 발명에 따른, 핵산칩 및 이를 이용한 미지의 생체분자 분석방법의 기본적인 원리는, 미지의 생체분자들에 결합하는 단일가닥핵산들에 상보적인 단일가닥핵산들(포착 단일가닥핵산들)을 핵산칩에 고착하고, 테스트 대상이 되는 미지의 생체분자들과 이에 결합되는 단일가닥핵산들을 반응시켜 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들 형성한 후, 상기 복합체로부터 분리된 타깃 단일가닥핵산들과 핵산칩의 포착 단일가닥핵산들의 상보적인 결합의 프로필을 획득하여 그 특성을 분석함으로써, 결과적으로 미지의 생체분자들의 단일가닥핵산에 대한 결합 프로필 특성을 분석하는 것이므로, 핵산칩의 포착 단일가닥핵산들로서 미지의 생체분자들에 결합하는 단일가닥핵산들에 상보적으로 결합하는 단일가닥핵산들을 고착하면 되지만, 미지의 생체분자를 분석할 때, 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들로부터 분리한 타깃 단일가닥핵산을 증폭하는 과정에서 미지의 생체분자에 결합하는 타깃 단일가닥핵산에 상보적인 단일가닥핵산들도 타깃 단일가닥핵산의 프로필 정보와 동일 유사한 정보를 내포한 상태로 생성되므로, 본 발명에 따른 핵산칩의 포착 단일가닥핵산으로서 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들을 사용하여도 동일한 목적을 달성할 수 있으며, 나아가서 생체분자결합 단일가닥핵산들과 생 체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들을 동시에 사용하여도 동일한 목적을 달성할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산칩을 이용하여 미지의 생체분자를 분석하게 되면, 관련 프로파일 데이터들이 축적되고, 이로부터 미지의 생체분자의 생물학적 의미의 분석에 기여를 하는 특이적인 단일가닥핵산이 자연스럽게 밝혀지게 되며, 이로써 미지의 생체분자를 분석하는 것에 의미를 가지는 단일가닥핵산들을 발굴할 수 있게 된다.

본 발명에 따른 핵산칩이 적용될 수 있는 상기 생체시료로서는, 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직 등이 포함되며, 본 발명에 따른 핵산칩에 의해 그 생물학적 의미가 분석될 수 있는 생체분자로서는 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 생체분자가 포함된다.

본 발명에 따른 핵산칩의 제조방법의 상기 제 1단계는, 미지의 생체분자들이 포함된 생체시료와, 무작위 염기서열을 가진 단일가닥핵산들(이하, '무작위 단일가닥핵산들'이라 한다)을 반응시켜 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들(이하, '생체분자결합 단일가닥핵산들'이라 한다)을 결정하는 단계이다.

바람직하게, 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 단계는, 상기 생체시료의 상기 미지의 생체분자들에 상기 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 제조하는 단계; 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 세척하고, 상기 생체분자들과 상기 단일가닥핵산들의 결합력의 크기에 기초하 여 일정 결합력 이상의 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 단계; 선택된 상기 복합체들로부터 상기 단일가닥핵산들을 분리하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 상기 단일가닥핵산들을 클로닝 벡터에 삽입하여 단일클론을 확보하여 상기 단일가닥핵산들의 염기서열을 결정함으로써 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 단계; 를 포함한다.

상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 선택 및 증폭은 반복적으로 다수회 실행할 수 있으나, 미지의 생체분자를 포함하는 생체시료는 수많은 생체분자로 구성되어 있고 이들의 양적인 차이가 매우 다양하므로, 미지의 생체분자에 결합하는 단일가닥핵산들의 선택과 증폭을 반복적으로 수행하는 환형적인 방법보다는 선택과 증폭을 일회 수행하고 세척과정을 강화하는 선형적인 방법으로 제작하는 것이 더 바람직할 수 있다.

상기 무작위 염기서열을 가지는 무작위 단일가닥핵산들은, 아래와 같은 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이중가닥의 DNA를 제조한 후, 생체외 전사(in vitro transcription)를 통하여 RNA 무작위 단일가닥핵산으로 제조할 수 있다.

5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N₄₀ CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3'(여기에서 밑줄 친 염기배열은 핵산 라이브러리의 고정된 부위이고, N₄₀은 각 위치에 A, G, T, C등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.)

PCR(Polymerase Chain Reaction)에 이용되는 FW 프라이머(5'-GGGGGA ATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG- 3': 서열번호 1)는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5'말단과 염기결합을 할 수 있고 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위한 프로모터 염기서열을 포함하고 있다.

PCR의 RE 프라이머(5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3': 서열번호 2)는 위의 염기배열의 밑줄친 염기들의 3'말단과 염기결합을 할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 핵산칩 제조방법에서 생체분자결합 단일가닥핵산들은 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 단일가닥핵산들이며, 생체외 전사로 합성하고 정제하여 준비한다.

합성된 무작위 단일가닥핵산들은 예를 들어 10¹⁵ 염기서열/1㎖의 농도로 생체시료에 처리하여 생체분자와 30분간 반응시킬 수 있다.

상기 생체분자결합 단일가닥핵산들은 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)하여 얻은 산물을 클로닝 벡터에 삽입하여 대장균 클론을 확보하고 그 염기서열을 결정할 수 있다.

이때 반응온도는 SELEX 수행온도보다 낮은 온도에서 수행하는 것이 이상적이며, 바람직하게는 20 내지 37℃의 온도에서 반응을 수행한다.

보편적으로 단백질 및 단일가닥핵산들을 과량으로 처리하여 생체분자와 결합하는 단일가닥핵산들의 비특이적인 결합을 방지하며, 바람직하게는 효모 tRNA(yeast tRNA), 살몬스펌 DNA(salmon sperm DNA) 또는 인간 태반 DNA(human placental DNA)를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산칩의 제조방법의 상기 제 2단계는, 제1 단계에서 결정된 생체분자결합 단일가닥핵산들 및/또는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들로 구성된 포착 단일가닥핵산들을 합성하여, 합성된 포착 단일가닥핵산들을 기판 위에 고착시켜 본 발명의 핵산칩을 제작하는 단계이다.

포착 단일가닥핵산은 혼성화 정도에 매우 큰 영향을 미치는 핵심요소이므로, 그 염기서열 구성의 결정은 매우 중요하다. 본 발명의 핵산칩에 고착되는 각각의 포착 단일가닥핵산은 특징적인 염기로 구성되며, 포착 단일가닥핵산들과 타깃 단일가닥핵산들의 결합체들은 적절한 Tm 값을 유지해야 한다. 이에 따라 결합체의 혼성화 정도는 형광이 표지된 타깃 단일가닥핵산들에 의해 오염되지 않은 자신의 시그널 값을 유지할 수 있도록 해야 한다.

따라서 포착 단일가닥핵산들의 염기서열은, 상기 제1 단계에서 무작위 단일가닥핵산들로부터 선별된 생체분자결합 단일가닥핵산들의 염기서열을 기초하여 결정된다. 바람직하게 포착 단일가닥핵산들은 내지 60bp의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 단일가닥핵산들이다.

또한, 본 발명의 핵산칩의 제작방법에서의 기판은, 유리, 실리콘 등의 무기물이나 아크릴계나 PET(polyethylene terephtalate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene) 등의 고분자 물질로 제작된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유리로 제작된 슬라이드 글라스이다. 이때, 기판은 아민기 또는 알데히드기 등으로 코팅된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어 GAPS(Gamma Amino Propyl Silane)이 코팅된 유리 슬라이드인 UltraGAPSTM Coated Slide(Corning 사)를 사용하여 상기 포착 단일가닥핵산들을 일정 규칙으로 배열 고착시켜 핵산칩을 제작한다.

본 발명에 따른 핵산칩의 제조는, 마이크로어레이어 시스템(Microarrayer system)을 사용할 수 있고, 각각의 포착 단일가닥핵산을 완충액에 녹여 농도를 조절하고, 이때 어레이어 안의 습도는 70 내지 80%로 유지하여 스폿팅(spotting)을 수행한다. 스폿팅된 슬라이드들은 습도유지챔버(humidified chamber)에서 방치한 후, UV crosslinker 에서 굽는(baking)과정을 수행한다.

이와 같이 본 발명에 따른 핵산칩은, 관련 기술분야에 널리 알려진 방법으로 포착 단일가닥핵산들을 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 슬라이드를 바로 원심 분리하여 건조시킨 다음, 사용 전까지 빛이 차단된 상태로 보관을 한다.

기존에 공지된 다양한 방법(M. schena; DNA microarray; a practical approach, Oxford, 1999)으로 포착 단일가닥핵산들이 규칙적으로 핵산칩을 제작할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산칩은, 동일 유사한 정도의 정밀도로 미지 생채분자의 생물학적 의미를 분석할 수만 있다면, 핵산칩에 고착하는 포착 단일가닥핵산의 수를 작게 하는 것이 핵산칩의 제작비용 및 분석의 효율성 측면에서 바람직하다.

이와 같은 이유로, 미지 생체분자의 생물학적 의미 분석에 대한 각각의 포착 단일가닥핵산들의 기여도를 분석하고, 미지 생체분자의 생물학적 의미를 분석할 수 있는 범위 내에서, 분석된 기여도에 기초하여 포착 단일가닥핵산들을 선별함으로 써, 본 발명의 핵산칩에 고착하는 포착 단일가닥핵산들의 수를 감소시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 첨부도면과 실시예를 참조하여 본 발명에 따른 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법을 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

실시예1. 인간혈청단백질에 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산의 제조

도1에 도시된 바와 같이, 아래와 같은 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해 이중가닥의 DNA를 제조한 후, 생체외 전사를 통하여 단일가닥의 RNA 라이브러리(무작위 단일가닥핵산들)를 제조하였다.

5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N₄₀ CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3'(여기에서 밑줄 친 염기배열은 핵산 라이브러리의 고정된 부위이며 N₄₀은 각 위치에 A, G, T, C등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.)

PCR에 이용되는 상기 서열번호 1의 FW 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5'말단과 염기결합을 할 수 있고 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위한 프로모터 염기서열을 포함하고 있다.

PCR에 이용되는 서열번호 2의 RE 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기 들의 3'말단과 염기결합을 할 수 있다. 그리고 FW와 RE 프라이머는 이후의 클로닝을 위해 각각 EcoRI과 BamHI등의 제한효소 절단 염기서열을 함유하고 있다.

생체시료와 반응할 무작위 단일가닥핵산들은 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 라이브러리이며, DNA 핵산라이브러리 전사체 및 PCR 프라이머를 상기와 같이 설계 제작하여 PCR 및 생체외 전사 방법으로 준비하였다.

PCR은 1,000 pmoles 단일가닥핵산 전사체, 2,500 pmoles PCR의 프라이머 쌍(5P7)을 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.3), 3 mM MgCl₂, 0.5 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1 U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)에서 PCR를 수행한 후 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다.

2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 무작위 단일가닥핵산들은 생체외 전사로 합성하고 정제하여 준비하였다. 200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순수도를 검색하였다.

상기에서 합성된 무작위 단일가닥핵산들의 10¹⁵ 염기서열/1㎖의 농도용액을 200 pmol/200㎕의 농도로 선택버퍼(50 mM Tris·Cl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0.1% NaN₃)에서 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 준비하였다.

10 ㎕의 혈청시료를 90 ㎕의 PBS 용액을 첨가하고 나이트로셀룰로스 막 디스크(nitrocellulose membrane disc)를 넣어 30분간 흔들어 주면서 반응시켰다. 상기에서 준비된 RNA 단일가닥핵산들을 혈청시료가 부착된 디스크에 처리하여 30분간 반응시켰다.

인간혈청시료(생체분자)와 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산의 선정은, 일차적으로 인간혈청시료에 결합력을 보이는 단일가닥핵산들을 대상으로 하며, 반응 후 다양한 세척버퍼로 세척 과정을 반복하여 일회만의 선택과정으로 인간혈청단백질(생체분자)-단일가닥핵산 복합체들을 확보하였다.

생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 세척버퍼는 0 내지 1 x 세렉스버퍼 또는 0 내지 500 mM EDTA 용액을 사용하였다. 분리된 복합체를 RT-PCR을 수행하여 혈청단백질에 결합하는 RNA(생체분자결합 단일가닥핵산)를 지시하는 DNA 풀을 증폭 제작하였다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 생체분자결합 단일가닥핵산들을 제작할 수도 있다.

확보된 RT-PCR 산물인 DNA를 플라스미드에 클로닝하여 단일클론을 확보하는 과정으로, 생체분자결합-단일가닥핵산들의 제작을 완료하였다. 이들 생체분자에 결 합하는 단일가닥핵산들의 염기서열은 표준방법으로 플라스미드를 분리하여 수행하였다.

생체분자의 프로파일을 생성하기 위한 본 발명에 따른 핵산칩에 사용할 포착 단일가닥핵산들의 염기서열은 인간혈청단백질(생체분자)과 결합하는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들의 염기서열 및/또는 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적으로 결합하는 단일가닥핵산들의 염기서열이므로, 이를 위해 핵산의 이차구조를 모델링하는 MFOLD 프로그램을 사용하여 이차구조 및 구조체 자유에너지를 확인한 후, 가장 안정도가 높은 이차구조를 갖는 생체분자결합 단일가닥핵산을 선정하였다.

실시예2. 핵산칩의 제조

유리 슬라이드 표면에 고착시킬 포착 단일가닥핵산으로서, 실시예 1에서 선정된 염기서열을 가지는 3,000여개의 생체분자결합 단일가닥핵산에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들(올리고뉴클레오티드들)을 유기 합성하여(바이오니아사) 준비하였다.

GAPS(Gamma Amino Propyl Silane)이 코팅된 유리 슬라이드인 UltraGAPSTM Coated Slide(Corning 사)를 사용하여 포착 단일가닥핵산이 일정 규칙으로 고착된 핵산칩을 제작하였다. 핵산칩의 제작은 핀(pin) 방식인 마이크로어레이어 시스템(Microarrayer system, GenPak사)을 사용하였고, 스폿 간격(spot spacing)은 스폿 중심 사이(center-to-center)가 370㎛가 되도록 하였다. 각각의 포착 단일가닥핵산들을 표준용액에 녹여 농도를 조절하였다. 이때 어레이어 안의 습도는 70%로 유지하여 스폿팅(spotting)을 수행하였다. 스폿팅된 슬라이드들은 습도유지챔머(humidified chamber)에서 24 ~ 48 시간 방치한 후, UV crosslinker에서 굽는(baking)과정을 수행하였다. 널리 알려진 방법으로 포착 단일가닥핵산들을 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 슬라이드를 바로 원심 분리하여 건조시킨 다음, 빛이 차단된 상태로 보관을 하였다.

실시예3. 인간혈청(생체분자)-타깃 단일가닥핵산 복합체의 제조 및 타깃 단일가닥핵산의 제조

실시예1에서 선정되어 핵산칩 제조에 사용된 생체분자결합 단일가닥핵산이 삽입된 플라스미드들을 동량으로 혼합하여 미지의 생체분자를 포함하는 생체분자와 결합하는 단일가닥핵산 풀의 전사체를 준비하기 위한 플라스미드 풀을 준비하였다. 인간혈청단백질과 결합하는 단일가닥핵산 풀은 상기 플라스미드 풀 및 PCR 프라이머를 설계 제작하여 PCR 및 생체외 전사 방법으로 준비하였다.

준비된 플라스미드 풀에서 1 pg 플라스미드를 전사체로 하여, PCR 반응 용액, 100 pM 5'-프라이머, 100 pM 3'-프라이머, dNTP 혼합물(5mM dATP, 5mM CTP, 5mM dGTP, 5 mM dTTP)에서 표준 PCR 방법으로 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 20 초 조건으로 30회 사이클을 반복 수행하여 이중가닥핵산을 합성하여 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다.

2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 분자의 타깃 단일가닥핵산을 생체외 전사로 합성하고 정제하여 준비하였다.

200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제하였다.

분석에 사용한 인간혈청은 건강한 사람 및 안정성 협심증인 심혈관질환 환자의 혈청이며 10 ㎕의 혈청시료를 90 ㎕의 PBS 용액을 첨가하고 나이트로셀룰루로스 막(Nitrocellulose membrane) disc를 넣어 30분간 흔들어 주면서 반응시켜 시료를 준비하였다. 앞서 제작된 100 ~ 400 ng의 타깃 단일가닥핵산들을 투입하여 30분간 반응시켜 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체를 형성하였다.

준비된 단일가닥핵산들을 혈청시료가 부착된 디스크에 처리하여 30분간 반응시켰다. 선택버퍼 혹은 50 mM EDTA로 3회 세척하고 반응산물을 분리하여 수확하였다.

혈청단백질(생체분자)-타깃 단일가닥핵산이 붙은 디스크를 RT-PCR 용액에 처리하여 RT-PCR을 수행하면서 Cy-5로 표지된 프라이머(5'-Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3': 서열번호 3)를 준비하였다. 상기에서 준비된 플라스미드 풀에서 준비된 타깃 단일가닥핵산들을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 RT-PCR하여 Cy-3가 표지된 프라이머(5'-Cy3-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3')를 제작하여 준비하였다. 상기 두 용액을 동량으로 혼합하여 타깃 단일가닥핵산들을 제작하였다.

실시예4. 핵산칩과 타깃 단일가닥핵산들의 반응

도2에 도시된 바와 같이, 상기 실시예3에서 준비된 타깃 단일가닥핵산들을 본 발명의 핵산칩의 포착 단일가닥핵산에 처리하여 60℃에서 4 ~ 12 시간 혼성화하고 42℃에서 0.1 x SSC 용액으로 세척하였다. 이때 혼성화 용액은 1 M 염화나트륨, 0.3 M sodium citrate, 0.5% SDS 또는 100㎍/㎖ 살몬스펌 DNA, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산을 포함한다.

전혼성화가 끝난 유리 슬라이드에 실시예3에서 준비된 용액을 처리하여 42℃에서 12시간동안 혼성화(Hybridization)를 수행한 후, 핵산칩을 세척용액으로 세척하였다. 이때, 세척용액의 조성은 예로 들면, 1X SSC + 0.2% SDS, 1X SSC + 0.2% SDS, 0.5X SSC + 0.2% SDS, 0.01X SSC + 0.2% SDS 순의 단계이며 각각 단계마다 42℃에서 30분간 수행하였다.

실시예5. 핵산칩의 스폿 탐색 및 분석

상기 실시예4의 세척이 종료된 후, 유리 슬라이드를 원심분리로 건조한 후, 사용한 형광염료를 여기(excitation)하기 위한 적절한 파장의 레이저(Cy5, 635 nm)를 갖는 레이저 스캐너(laser scanner, GenePix4000, Axon사)를 이용하여 탐색하였다. 형광이미지는 다중-이미지-태그된 이미지 파일(multi-image-tagged image file, TIFF) 포맷으로 저장한 후, 적절한 화상분석(image analysis) 소프트웨어(GenePix Pro 3.0, Axon사)로 분석하였다.

스폿(spot)당 시그널 강도(signal intensity, 단위: quanta)는 주위배경의 기본 시그널을 뺀 것을 사용하는데, 여기서 배경 시그널은 특정 스폿의 주위에 있는 4개 스폿의 주변 시그널로 구성된 지역적 배경(local background)을 의미한다. 스폿이 가지고 있는 화소(pixel)의 90% 이상이 배경 시그널 + 2 표준편차(S.D.; standard deviation)를 초과하는 시그널 강도를 보일 때 데이터 분석에 포함시키며, 위 조건을 충족시키지 못하면 데이터에 포함시키지 않는 스폿(bad spot)으로 분류하고, 분석에 포함하지 않는 것이 일반적이다.

표지 효율(Labeling efficient)에 따른 편차(variation)는 내부표준(internal standard, IS)의 시그널을 이용하여 평준화(e.g., Normalized Intensity = Probe Intensity / IS intensity)하며, 단일표지(monolabeling)를 한 경우에는 Cy5 채널의 시그널 강도(signal intensity)로 그 결과를 기록하며 스폿팅(spotting)이 두 배 이상으로 된 경우는 평균값을 사용한다. 타깃 단일가닥핵산의 시그널 강도 (signal intensity, S)는 스폿이 갖는 픽셀(pixel)들에 대해서 각각의 시그널 강도를 구한 다음 이들의 중심값(median)을 사용한다(median value of pixel-by-pixel). 시그널 강도(S)는 내부표준(IS)을 이용해서 표지효율에 따른 편차를 평준화한다.

S'(normalized value) = S (Cy5-reference) ㅧ (Cy5-IS).

이상의 방법으로 픽셀 밀도의 분석 결과와 실제 시료량 사이의 관계를 규명하여 그 상관관계를 확인할 수 있다. 핵산칩 형광 데이터를 이미지화하고 모든 스폿의 패턴으로 생체시료에서 생체분자 프로파일을 확인하는 방법을 제공할 수 있으며, 스폿들의 패턴을 계층 클러스터링(Hierarchical Clustering) 및 인공신경 망(Artificial Neural Network) 등의 방법 등으로 분석하여 사용할 수 있다.

스폿의 형광정도는 포착 단일가닥핵산과 타깃 단일가닥핵산이 형성하는 이중가닥의 성질에 따라 다양하게 나타난다. 인간혈청단백질-(타깃)단일가닥핵산 복합체의 결합정도 및 양은 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결정된다.

인간혈청단백질-타깃 단일가닥핵산 복합체에서 기원하는 타깃 단일가닥핵산과 핵산칩에 부착된 포착 단일가닥핵산의 염기서열은 타깃 단일가닥핵산-포착 단일가닥핵산의 이중가닥 안정성에, 그리고 핵산칩 상의 타깃 단일가닥핵산의 양은 형광정도에 영향을 준다.

즉, 형광정도는 타깃 단일가닥핵산의 양을 나타내고, 타깃 단일가닥핵산의 양은 인간혈청단백질-타깃 단일가닥핵산 복합체의 양을 표현한다. 또한 상기 복합체의 양은 생체시료에 있는 생체분자의 양을 나타낸다. 따라서 스폿의 형광정도로부터 스폿에 상응하는 미지의 생체분자를 포함하는 생체시료에서 특정 생체분자의 양을 확인할 수 있다. 결국 형성된 스폿의 형광정도를 분석하여 핵산칩의 모든 스폿들의 패턴을 확인함으로써 인간혈청에서 혈청단백질의 프로파일을 확인할 수 있게 된다.

즉, 형성되는 스폿들이 파랑-노랑-빨강색의 칼라 스펙트럼은 보이는 것은 포착 단일가닥핵산에 결합한 Cy-3이 표지된 타깃 단일가닥핵산과 Cy-5가 표지된 타깃단일가닥핵산의 비율이 다양하여 나타나는 현상이며 특정 스폿의 컬러스펙트럼의 정도는 인간혈청을 구성하는 특정한 혈청시료에 존재하는 특정한 생체분자(단백질)의 양을 표현함으로 핵산칩 상의 모든 스폿들의 컬러스펙트럼을 보여주는 이미지는 특정한 생체시료에서 생체분자 프로파일에 해당한다.

즉, 본 발명의 생체분자 분석방법에서는 특정 스폿에서 포착 단일가닥핵산과 결합하여 이중가닥을 형성하는 타깃 단일가닥핵산은 Cy-3가 표지된 타깃 단일가닥핵산과 Cy-5가 표지된 타깃 단일가닥핵산으로 구성되어 있고, 전자는 일정한 양으로 존재하나 후자는 인간혈청에서 상응하는 생체분자에 비례하여 존재한다. 이에 따라 특정한 스폿은 후자가 상대적으로 소량으로 존재하면 파란색, 비슷하게 존재하면 노란색, 그리고 과량으로 존재하면 빨간색이 된다.

핵산칩 상에서 스폿의 분석으로 이중가닥 내 타깃 단일가닥핵산 수에 따라 형광정도가 상이하며 이는 생체분자의 수와 상관관계가 있다. 따라서 본 발명의 핵산칩을 구성하는 모든 스폿의 컬러스펙트럼을 반영하는 이미지는 미지의 생체분자를 포함하는 생체시료의 생체분자 프로파일이다.

이상의 테스트 결과는 도3과 같으며, 도시된 바와 같이 포착 단일가닥핵산이 부착된 유리 슬라이드에서 혈청단백질에 결합하는 타깃 단일가닥핵산에 기초한 포착 단일가닥핵산이 부착된 부위인 스폿은 다양한 형광정도, 파랑-노랑-빨강색의 칼라 스펙트럼을 형성한다.

도3의 결과로부터 인간혈청단백질에 결합하는 타깃 단일가닥핵산에 기초한 핵산칩을 이용하여 인간혈청에서 혈청단백질의 프로파일을 확인할 수 있으며 또한 건강한 사람(A) 및 안정성 협심증 심혈관질환자(B)의 혈청내 생체분자의 프로파일이 상이함을 확인할 수 있다.

도4는 환자의 혈액시료에서부터 본 발명의 핵산칩을 이용하여 생산된 프로파 일을 질환군별로 구성된 데이터베이스화 하는 과정에 대한 순서를 흐름도로 보여준 도면이다. 도5는 생산된 프로파일을 질환군별로 구성된 데이터베이스 및 인공신경망을 이용한 프로그램으로 특정한 사람의 혈청에 대해 생체분자 프로파일을 생산하여 질병을 진단하는 흐름도이다.

도4에 도시한 바와 같이, 많은 생체시료에서 생산되는 프로파일로 구축된 데이터베이스를 생물정보학기술로 분석하여 유용한 정보를 확보할 수 있다.

건강한 사람, 안정성 협심증, 불안정성 협심증 및 심근경색 등의 심혈관환자의 혈청프로파일 데이터베이스를 이용하여 Lee 2-1(99)라는 사람의 혈청시료를 검사한 결과는 도6과 같으며 72.5% 10 fold cross validation으로 건강한 사람으로 예측할 수 있다.

심혈관질환 진단용 데이터베이스 구축에 사용된 혈청시료의 임상적인 자료는 아래의 표1이며, 건강한 사람 37명, 안정성 협심증 36명, 불안정성 협심증 27명 및 심근경색환자 27명 등 총 127명이다.

심혈관질환자의 임상정보

	건강한 사람	안정성 심협증	불안정한 심협증	심근경색
성별
남성	35	35	27	27
여성	2	1	1	0
나이
40-49	1	0	1	0
50-59	13	17	15	17
60-69	22	18	11	10
70-79	1	1	1	0
합계	37	36	28	27

건강한 사람과 간암의 혈청프로파일 데이터베이스를 이용하여 KIM라는 사람의 혈청시료를 검사한 결과는 도7과 같으며 93.0% 10 fold cross validation으로 간암환자로 예측할 수 있다.

추가적으로 전이 유무를 검사하기 위해 건강한 사람, 비전이 간암 및 전이 간암의 혈청단백질 프로파일 데이터베이스를 이용하여 KIM라는 사람의 혈청시료를 검사한 결과는 도8과 같으며 76.0% 10 fold cross validation으로 비전이 간암환자로 예측할 수 있다.

간암 진단용 데이터베이스 구축에 사용된 혈청시료의 임상적인 자료는 표2이며, 건강한 사람 19명, 비전이 간암환자 72명 및 전이성 간암환자 11명으로 간암환자는 83명이고 시료의 총수는 102례이다.

간암의 임상정보

	건강한 사람	비전이 간암	전이 간암
성별
남성	17	67	10
여성	2	5	0
나이
40-49	14	60	7
50-59	5	7	3
60-69	0	5	1
합계	19	72	11

건강한 사람과 심근경색환자의 혈청프로파일을 비교하여 심근경색환자에 특이적으로 존재하는 스폿을 결정하고 이에 상응하는 단일가닥핵산에 바이오틴(biotin)을 부착시키고 스트렙타비딘(streptavidin)과 반응시킨 후, 혈청시료와 반응시켜 복합체를 분리한 다음 전기 영동하여 형성되는 밴드를 분리하여 생체분자를 동정하는 과정의 순서에 대한 흐름도는 도9이다. 선정된 단일가닥핵산에 결합하는 단백질을 분리하여 MALDI-TOF-TOF 기기로 단백질의 아미노산서열을 결정한 도면은 도10이다.

상기의 방법으로 생체시료를 구성하는 생체분자와 결합하는 단일가닥핵산을 기초한 단일가닥핵산이 부착된 본 발명의 핵산칩를 이용하여 특정한 생체시료에서 생체분자의 프로파일을 탐색 및 분석하였다.

또한, 의학적으로 유용한 생체시료의 생체분자를 생산하여 데이터베이스를 제작한 다음 특정한 사람의 혈청프로파일을 생산하고 인공신경망알고리즘을 이용하여 제작한 프로그램으로 심혈관질환의 유무 및 그 종류, 간암발명의 유무 및 전이정도를 검사하였다.

질환군별로 구성된 데이터베이스를 비교분석하여 유용한 스폿을 결정하고 이에 상응하는 단일가닥핵산을 조제하여 상응하는 단백질을 분리하여 동정하였다.

실시예 6. 세포주의 표면 생체분자의 프로파일 생성 및 응용

6-1. 핵산칩 제작

상기 실시예1 및 2의 방법으로 생체시료인 폐암세포주 NCI-H1299의 표면생체분자의 프로파일을 생산하는 본 발명의 핵산칩을 제작하였다. 준비한 무작위 단일가닥핵산들을 폐암세포주에 반응시킨 후 세척버퍼를 사용하여 세포주(생체분자)-단일가닥핵산 복합체를 세척하여 비결합 단일가닥핵산 및 결합정도에 따라 단일가닥핵산을 해리시킨 다음 5,000xg로 원심분리하는 과정을 반복적으로 처리한 후, 세포주-단일가닥핵산 복합체를 원심분리방법으로 분리하여 폐암세포주의 표면생체분자와 결합하는 단일가닥핵산들을 제작하였다.

상기 제작된 단일가닥핵산들로부터 클론을 선정하여 염기서열을 결정하고 분석하여 1,000여개의 생체분자결합 단일가닥핵산을 선정하였다. 실시예2의 방법으로 선정된 1,000여개의 생체분자결합 단일가닥핵산의 상보적인 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드(포착 단일가닥핵산)를 합성하고 고체 기판 위에 부착시켜 본 발명의 핵산칩을 제작하였다.

6-2. 세포주의 표면생체분자 프로파일 생성

상기 실시예6-1의 방법으로 제작된 핵산칩을 이용하여 폐암세포주 NCI-H1299의 표면분자의 프로파일을 생산하였다. 폐암세포주와 단일가닥핵산 풀을 반응시킨 다음, 세포주(생체시료)의 생체분자-단일가닥핵산 복합체를 세척 및 분리하였다. 상기 복합체에 결합된 단일가닥핵산을 실시예3의 방법으로 증폭 및 표지하였다. 포착 단일가닥핵산과 표지된 타깃 단일가닥핵산을 실시예4의 방법으로 반응시켰다. 상기 타깃 단일가닥핵산에 표지된 물질의 측정은 실시예5의 방법으로 수행하였으며 폐암세포주의 표면 생체분자의 프로파일을 확인하였다.

생산된 프로파일로 폐암세포주에 강력하게 결합할 것으로 추정되는 단일가닥핵산을 선정하여 FITC가 부착된 단일가닥핵산을 합성하여 폐암세포주와 반응시킨 다음 형광 촬영한 이미지는 도11과 같다.

이와 같이 본 발명의 핵산칩을 이용하여 생산된 폐암세포주 프로파일을 분석하여 선정한 단일가닥핵산이 폐암세포주와 결합함을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 대장균의 표면 생체분자의 프로파일 생성 및 응용

7-1. 핵산칩 제작

생체시료인 대장균 KCTC12006와 상기 실시예1 및 2의 방법으로 본 발명의 핵산칩를 제작하였다.

준비한 단일가닥핵산들과 대장균을 반응시킨 후 세척버퍼를 사용하여 대장균(생체분자)-단일가닥핵산 복합체를 세척하여 비결합 단일가닥핵산 및 결합정도에 따라 단일가닥핵산을 해리시킨 다음 5,000xg로 원심분리하는 과정을 반복적으로 처리한 후, 대장균-단일가닥핵산 복합체를 원심분리방법으로 분리하여 대장균의 표면생체분자와 결합하는 단일가닥핵산들을 제작하였다.

상기 제작된 단일가닥핵산들로부터 클론을 선정하여 염기서열을 결정하고 분석하여 1,000여개의 생체분자결합 단일가닥핵산을 선정하였다. 선정된 1,000여개의 생체분자결합 단일가닥핵산의 상보적인 염기서열로 올리고뉴클레오티드들(포착 단일가닥핵산들)을 합성하고 고체 기판 위에 부착시켜 본 발명에 따른 핵산칩을 제작하였다.

7-2. 대장균의 표면생체분자 프로파일 생성

상기 실시예7-1의 방법으로 제작된 핵산칩을 이용하여 대장균KCTC12006의 표면분자의 프로파일을 생산하였다. 대장균과 단일가닥핵산 풀을 반응시킨 다음 대장균-타깃 단일가닥핵산 복합체를 세척 및 분리하였다. 상기 복합체에 결합된 타깃 단일가닥핵산을 실시예3의 방법으로 증폭 및 표지하였다. 포착 단일가닥핵산과 표지된 타깃 단일가닥핵산을 실시예4의 방법으로 반응시켰다. 상기 타깃 단일가닥핵산에 표지된 물질의 측정은 실시예 5의 방법으로 수행하였으며, 대장균의 표면 생체분자의 프로파일을 확인하였다.

대장균 KCTC12006의 표면 생체분자 프로파일을 생산하는 동일한 방법으로 살모넬라 균(Salmonella typhimurium ATCC13311)의 표면생체분자 프로파일을 생산하여 데이터베이스를 구축한 다음 계층 클러스터링 방법에 기초하여 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산을 선정하였다. 단일가닥핵산의 특이성을 SPR 장비(BIAcore 사)로 측정한 결과는 도12와 같았으며, 선정된 단일가닥핵산이 살모넬라균에 비해 대장균에 특이적으로 결합하고 있음을 확인하였다.

대장균에 결합하는 단일가닥핵산 및 나노금 입자를 이용하여 대장균을 측정하는 방법(예, 대한민국 특허출원번호 10-2006-0072480 참조)으로 상기에서 선정된 단일가닥핵산을 이용하여 용액에 대장균의 유무 및 음식물에 대장균의 오염정도를 측정한 결과는 도13과 같았다. 음식물을 세척한 셀렉스 버퍼에 단일가닥핵산을 반응시키고 나노금입자를 넣은 다음 NaCl 용액을 첨가하며 대장균이 없는 용액은 투명한 무색에 가까운 파란색이며 대장균이 오염된 용액은 빨강색으로 변화되며 그 정도는 오염된 대장균수에 비례함을 확인하였다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 핵산칩 및 이를 이용한 미지의 생체분자 분석방법에 의하면, 병렬고속분석(High Throughput Screening)을 이용한 매우 간단하 고 저렴하며 효율적인 방법으로, 미생물, 세포, 단백질을 포함하는 생체시료에 포함된 미지의 생체분자에 대한 프로파일을 생산할 수 있으므로, 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위한 분야에서 미지의 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 도구로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한 본 발명에 따른 핵산칩 및 이를 이용한 생체분자 분석방법에 의하면, 미지의 생체분자의 생물학적 의미를 분석하는 과정에서, 미지의 생체분자의 생물학적 작용을 파악하고 그 구조를 결정하고 구명할 수 있을 뿐만 아니라, 생체분자에 특이적으로 결합하는 특정 단일가닥핵산들을 선별할 수 있고, 선별된 단일가닥핵산을 이용한 보다 정교한 생체분자의 작용을 파악하는 도구로서 이용할 수 있는 환경을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 핵산칩을 이용한 생체분자 분석방법에 의하면, 의학적으로 질병에 관련된 생체분자의 프로파일을 분석함으로써, 질병을 진단할 수 있는 생체분자, 치료성적을 분석할 수 있는 생체분자, 질병 발병 및 진행에 중요한 역할을 하는 생체분자, 질병에 대한 감수성 관련된 생체분자, 및 신약개발의 표적분자 등을 매우 저렴하고 간편한 방법으로 효율적으로 규명할 수 있다.

<110> GENOPROT CO., LTD. KIM, Sung-chun <120> Nucleic Acid Chip for Obtaining Bind Profile of Single Strand Nucleic Acid and Unknown Biomolecule, Manufacturing Method Thereof, and Analysis Method of Unknown Biomolecule Using Nucleic Acid Chip <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gggggaattc taatacgact cactataggg agagcggaag cgtgctggg 49 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ggggggatcc atcgacctct gggttatg 28 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cggaagcgtg ctgggcc 17

Claims

미지의 생체분자들이 포함된 생체시료와 무작위 염기서열을 가진 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 상기 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 단계, 및 결정된 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들 및/또는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들로 구성된 포착 단일가닥핵산을 합성하여 상기 포착 단일가닥핵산을 기판에 고착하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되고;

생체시료에 포함된 미지 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 단일가닥핵산들과 미지 생체분자들의 결합 프로파일을 생성하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는, 핵산칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 단계는,

상기 생체시료의 상기 미지 생체분자들에 상기 무작위 단일가닥핵산들을 반응시켜 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 제조하는 단계;

상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 세척하고, 상기 생체분자들과 상기 단일가닥핵산들의 결합력의 크기에 기초하여 일정 결합력 이상의 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들을 선택하는 단계;

선택된 상기 복합체들로부터 상기 단일가닥핵산들을 분리하여 증폭하는 단계; 및

상기 증폭된 상기 단일가닥핵산들을 클로닝 벡터에 삽입하여 단일클론을 확보하여 상기 단일가닥핵산들의 염기서열을 결정함으로써 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들을 결정하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산칩의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 선택 및 증폭을 반복적으로 다수회 실행하는 것을 특징으로 하는, 핵산칩의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미지 생체분자의 생물학적 의미 분석에 대한 상기 포착 단일가닥핵산들의 기여도에 기초하여, 상기 미지 생체분자의 생물학적 의미를 분석할 수 있는 범위 내에서, 상기 포착 단일가닥핵산들을 선별함으로써, 상기 핵산칩에 고착하는 상기 포착 단일가닥핵산들의 개수를 감소시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산칩의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체시료는 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직으로 구성된 군으로부터 선택되고; 상기 생체분자는 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 핵산칩의 제조방법.
생체시료에 포함된 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들 및/또는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들로 구성된 포착 단일가닥핵산들이 기판에 고착되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체시료에 포함된 미지의 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하기 위한, 생체분자들과 단일가닥핵산들의 결합 프로파일을 생성하는 것에 사용되는 핵산칩.
생체시료에 포함된 미지의 생체분자들과 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산들 및/또는 상기 생체분자결합 단일가닥핵산들에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들로 구성된 포착 단일가닥핵산들이 기판에 고착되어 있는 핵산칩을 준비하는 단계;

상기 핵산칩의 상기 포착 단일가닥핵산들과 동일한 염기서열을 가지는 단일가닥핵산들과 상기 생체시료의 상기 미지 생체분자들을 반응시켜 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들을 형성하고 상기 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들을 분리하는 단계;

분리된 상기 생체분자-타깃 단일가닥핵산 복합체들로부터 상기 타깃 단일가닥핵산들을 분리, 증폭 및 표지하는 단계;

표지된 상기 타깃 단일가닥핵산들을 상기 핵산칩의 상기 포착 단일가닥핵산들과 반응시켜 상기 표지를 통해 결합 프로파일을 획득하는 단계; 및

획득된 상기 프로파일과 이미 확보되어 있는 프로파일 데이터를 비교하여 상기 미지의 생체분자들의 생물학적 의미를 분석하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법.
제7항의 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법을 통해 얻어진 축적된 분석결과로부터, 상기 미지의 생체분자의 생물학적 의미의 분석에 기여하는 특이적인 단일가닥핵산을 결정하는 방법.