CN1308135A - 细胞内的基因分析方法 - Google Patents
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本发明为一种细胞内基因分析方法,包括如下步骤:(1)、采用天然或结构修饰的分子信标或将天然或结构修饰的分子信标用不同发色基团进行标记,(2)、采用显微注射将设计的分子信标注入活体细胞或将分子信标加入细胞悬浮液杂交染色,(3)、使分子信标与待测基因进行有效杂交,(4)、采用激光共聚焦显微技术进行分析。操作简便、灵敏、精确,可同时检测多种基因、点突变及缺失,可对不同活细胞内基因表达水平状态进行实时监测,适用范围广。
Description
本发明与用分子信标检测细胞内的基因的方法有关。
细胞内的基因表达状况决定生命活动的本质，对细胞内基因表达水平监测对于了解基因结构功能、疾病发病原因以及理解与生命活动相关的一切现象具有非常重要的意义。目前，还没有一个准确实用的细胞内基因表达水平分析、监测技术。已知的细胞基因分析技术、分析方法有Fisher技术：采用简单的荧光标记分子探针，通过直接渗透进入细胞中，进行简单的基因及定位分析。该方法必须把没有杂交的分子探针洗出来，再进行分析。其技术操作难度大，影响了该技术的实际应用。传统基因分析及诊断方法采用PCR基因扩增技术，由于基因片段极度扩增使检测结果容易出现假性结果即临床诊断的假阳性，且操作过程复杂、周期长。由于在体外进行分析，因此不能代表最真实的基因表达状态。
分子信标是九十年代末期发展起来的新技术，它的发明单位是纽约市公共健康研究所(PHRI)，它主要用于PCR的定量分析。1998年D.L.Sokol等曾报道，将分子信标用于证明互补寡核苷酸与细胞内的mRNA杂交情况。分子信标是在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接一个发色基团(F)、一个淬灭基团(Q)。在自由状态时由于茎杆区的互补序列的杂交结合使探针分子形成发夹状结构，连接两端的(F)与(Q)互相靠近，能量传递效率达100％，荧光几乎被全部淬灭，而当分子信标与靶基因的互补区杂交形成双螺旋结构时，5′-与3′-的茎杆区被拉开，(F)与(Q)距离增大，荧光恢复。具有天然寡核苷酸链的分子信标进入细胞后，很快被细胞内的核酸酶水解破坏。
本发明的目的是提供一种操作简便、灵敏、精确，可同时检测多种基因、点突变及缺失，可对不同活细胞内基因表达水平状态进行实时监测，适用范围广的细胞内基因的检测方法。
本发明是这样实现的：
一种细胞内基因分析方法，包括如下步骤：
1、选择单个活体细胞作为检测对象，
2、选择待测基因，
3、分子信标的设计：采用结构修饰的分子信标以及不同发色基团进行标记，
4、采用显微注射将分子信标注入活体细胞，
5、使分子信标与待测基因进行有效杂交，
6、采用激光共聚焦显微技术进行分析。
本发明的分子信标是在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个发色基团(F)或一个发色基团(F)、一个淬灭基团(Q)，分子信标可采用不同的发色基团。
本发明的发色基团可为目前广泛应用于基因及蛋白质标记的荧光发色基团，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羟基荧光黄或四氯荧光黄或吲哚二羧菁俄勒冈绿488X或得克萨斯红-X或荧光素或罗丹明或得克萨斯红或芘等。
本发明对分子信标的核糖及三磷酸骨架的结构修饰如下：
X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中M+为各种有机及无机阳离子，SH或S-M+，其中，M+为各种有机及无机阳离子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤类及嘧啶类碱基或腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或结构修饰的碱基。
本发明可在同一细胞内显微注射采用不同发色基团的多种分子信标，同时分析多种基因、点突变及缺失。
一种细胞内基因分析方法，包括如下步骤：
1、将组织培养液或新鲜组织进行消化、剪碎、离心得细胞悬液，
2、设计合成分子信标，
3、将分子信标加入细胞悬液杂交染色，
4、将细胞悬液上流式细胞仪分选，
5、对分选液进行单细胞共聚焦分析。
分子信标是在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个发色基团(F)或一个发色基团(F)、一个淬灭基团(Q)，分子信标可采用不同的发色基团。
发色基团可为目前广泛应用于基因及蛋白质标记的荧光发色基团，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羟基荧光黄或四氯荧光黄或吲哚二羧菁俄勒冈绿488X或得克萨斯红-X或荧光素或罗丹明或得克萨斯红或芘等。
对分子信标的核糖及三磷酸骨架的结构修饰如下：
X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中，M+为各种有机及无机阳离子或SH或S-M+，其中M+为各种有机及无机阳离子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤类及嘧啶类碱基或腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或结构修饰的碱基。与已知方法比较本发明有以下特点：
1、采用显微注射将分子信标注入活细胞，直接进行原位杂交，不需将未杂交的样品洗涤出细胞，简化了操作的难度。
2、在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个发色基团(F)或一个发色基团(F)、一个淬灭基团(Q)。在自由状态时由于茎杆区的互补序列的杂交结合使探针分子形成发夹状结构，连接两端的(F)与(F)或(F)与(Q)互相靠近，由于共振能量转移，荧光分子与荧光分子间能量转移，发射光波长发生变化，如芘与芘靠近，发射波长由398nm→490nm，荧光分子与淬灭分子靠近时，能量传递效率达100％，荧光几乎被全部淬灭，而当分子信标与靶基因或DNA或RNA的互补区杂交形成双螺旋结构时，5′-与3′-的茎杆区被拉开，(F)与(F)或(F)与(Q)距离增大，荧光恢复。
3、对脱氧核糖及三磷酸骨架进行结构修饰后，分子信标能耐核酸酶的水解，避免了分子信标进入细胞后被核酸酶水解而自行发出荧光，使检测方法灵敏，背景噪音小，延长了分析时间，可实现活细胞内的基因复制、转录及表达的实时动态分析。
4、采用不同的发色基团同时分析多种基因、点突变及缺失。
5、可在同一细胞内同时进行多种基因、点突变及缺失分析，消除了在不同细胞内分析所带来的误差。
6、可对活细胞内的mRNA进行定性、定量分析，实现对不同活细胞内基因表达水平、状态的实时监测。
7、应用于分子生物学研究、临床诊断及药物筛选。
如下是本发明的附图：
图1为分子信标结构图，自由状态下的发夹型结构。
图2为分子信标工作原理图。
图3、4、5为分子信标的骨架结构图。
图6为细胞内DNA的转录和翻译示意图。
图7分子信标用于基因表达水平及瞬间存在的mRNA的分析流程图。
图8为分子信标用于基因点突变分析流程图。
图9为分子信标用于正常组织细胞和病变组织细胞的检测图。
图10为细胞群染色及分离解析图。
如下是本发明的实施例：
1．分子信标用于基因表达水平及瞬间存在的mRNA的分析
分子信标的合成：
在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个荧光基团(F)或一个荧光基团(F)、一个淬灭基团(Q)。发色基团有荧光素或罗丹明或[5-(2｀-氨乙基)氨基萘烯-1-磺酸]等，荧光淬灭基团有[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸]等。荧光分子与淬灭分子靠近时，能量传递效率达100％，荧光几乎被全部淬灭。而当分子信标与靶基因(DNA及RNA)的互补区杂交形成双螺旋结构时，5′-与3′-的茎杆区被拉开，(F)与(F)或(F)与(Q)距离增大，荧光恢复。
显微注射
细胞高速离心5-40min后，移到载物片上，加入细胞介质确保细胞的存活。将分子信标经显微注射入细胞内。每个细胞显微注射大约2-200pl的分子信标。
记录荧光光谱
用荧光计在不同发光基团的特定激发波长处激发发色基团后，记录发射光光谱，结果能与细胞内存在的DNA或RNA发生杂交的分子信标的发夹结构打开，使荧光发色团和荧光淬灭基团之间的距离加大，产生荧光。而不能发生杂交的分子信标则不产生荧光。
2待测基因点突变分析
分子信标的合成在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个荧光发色基团(F)或一个荧光发色基团(F)、一个淬灭基团(Q)。发色基团有荧光素、罗丹明、[5-(2｀-氨乙基)氨基萘烯-1-磺酸等，荧光淬灭基团有[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸等。荧光分子与淬灭分子靠近时，能量传递效率达100％，荧光几乎被全部淬灭。而当分子信标与靶基因(DNA及RNA)的互补区杂交形成双螺旋结构时，5′-与3′-的茎杆区被拉开，(F)与(F)或(F)与(Q)距离增大，荧光恢复。每个分子信标的探针区中的一个碱基分别用A、T、G、C取代，其余的碱基序列全部相同，并使用四种不同的荧光基团标记四个分子信标，淬灭基团相同。
显微注射
细胞高速离心5-40min后，移到载物片上，加入细胞介质确保细胞的存活。将分子信标经显微注射入细胞内。每个细胞显微注射大约20-200pl的分子信标，
记录荧光光谱
用荧光计在不同发色基团的特定激发波长处激发发色基团后，记录发射光光谱，结果，与细胞内存在的DNA或RNA的碱基序列完全互补发生杂交的分子信标发出的荧光强度最大，而其中有一个碱基不能互补的分子信标由于发色基团和淬灭基团的距离相对较近，荧光强度相对较弱。从而可检测细胞内DNA或RNA的点突变。升高温度，再观察荧光光谱，发现只有完全互补的一条分子信标可观察到荧光光谱，与温度升高前相比，荧光强度更强，而不能完全互补的分子信标的荧光消失。
3．分子信标用于正常组织细胞和病变组织细胞的检测
分子信标的合成：
在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接一个发光基团(F)和一个淬灭基团(Q)。在自由状态时由于茎杆区的互补序列的杂交结合使探针分子形成发夹状结构，连接两端的(F)与(Q)互相靠近，由于共振能量转移，能量传递效率达100％，荧光几乎被全部淬灭，而当分子信标与靶基因(DNA及RNA)的互补区杂交形成双螺旋结构时，5′-与3′-的茎杆区被拉开，(F)与(Q)距离增大，荧光恢复。
显微注射
细胞高速离心5-40min后，载物片上，加入细胞介质确保细胞的存活。将分子信标经显微注射入细胞内。每个细胞显微注射大约10-100pl的分子信标，并在10分钟内完成100-200次的显微注射，载物片于紫外灯光下迅速暴露50秒。
记录荧光光谱
用荧光计激发不同的发色基团后，记录荧光光谱。分子信标由于能与正常细胞完全互补而发出荧光，病变细胞由于不能与分子信标完全互补，发出的荧光强度要弱，而且随着时间的推移，其强度越来越弱，最后直至消失。
4．细胞株：TK-ts13、K562人体leukemia cell内的基因检测：
分子信标的设计：
用荧光素作为5′一荧光发色团，[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸[4-(4′-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸]作为3′-荧光淬灭基团。“主干”结构用互补的5′(GCGAG)和5′(CTCGC)寡核苷酸组成。发夹序列如下：vav互补分子信标序列，5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGA-3′；β-actin互补分子信标序列，5′-CGCGGCGATATCATCACATCCATAAC-3′；vav同序寡核苷酸对照，5′-TCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAAC-3′；β-actin同序寡核苷酸对照，5′-GTTATGGATGATGATATCGCCGCG-3′；vav不匹配寡核苷酸对照，5′-GTTCTTAAGGGTGTCGAACTGGGA-3′；β-actin不匹配寡核苷酸对照，5′-CGCGGCGATACCTACATCCATAAC-3′。其中，所有序列的核苷分为两类，一类完全由天然的脱氧核苷构成，另一类的脱氧核苷的脱氧核糖上2-位的H由OCH3取代，进行结构修饰，使其耐核酸酶的水解。
分子信标的合成：
采用DNA合成仪和市售的亚磷酰胺；dA-CE亚磷酰胺，dG-CE亚磷酰胺，dC-CE亚磷酰胺，T-CE亚磷酰胺，rA 2｀-氧甲基亚磷酰胺，rG 2｀-氧甲基亚磷酰胺，rC 2｀-氧甲基亚磷酰胺，rU 2｀-氧甲基亚磷酰胺，荧光素-CE亚磷酰胺，[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸CPG，合成的分子信标采用高压液相色谱或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
杂交形成的荧光检测：
互补或对照分子信标(最终浓度150-200nM)溶于分子信标缓冲液(100nMTris,HCl,pH8/1mM MgCl2)中，加入过量的互补靶寡脱氧核苷(20-30μM)。用Hitachi/perkin-Elmer MPF4荧光检测器检测荧光，对照组由不互补的2个碱基对，同序发夹序列组成。荧光素的激发波长为494nm，最大发射波长为525nm。用荧光计在494nm处激发后，记录500nm-570nm处的光谱。加入互补靶脱氧核苷序列后测定每个分子信标的荧光强度而分子信标缓冲液作为对照的背景荧光密度忽略不计。结果vav互补分子信标与vav同序寡核苷酸对照、β-actin互补分子信标与β-actin同序寡核苷酸杂交，产生了荧光。对于vav靶寡脱氧核苷/分子信标杂交后产生的荧光强度是背景荧光强度的30倍，而β-actin/分子信标形成双螺旋结构发出的荧光强度是背景荧光强度的15倍。这种荧光强度的差异可能与具体序列及分子内的重叠方式和/或分子信标杂交顺序的性质而造成的。但是对于同一序列的分子信标，由结构修饰的核苷构成的比用天然核苷构成的分子信标发生杂交时发出的荧光强度更强。
电泳分析：
含有互补分子信标/同序寡核苷酸双螺旋体和对照分子信标的样品在浓度为8％的变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行分析，在70V的电子透入样品1.5小时后，凝胶浸入50μg/ml的溴化乙锭溶液中，在紫外光盒中检查，与凝胶上未双螺旋的物质相比，这些形成双螺旋结构的物质的流动性减慢。
DNase反应：
含有未杂交的分子信标的样品在37℃下平衡，然后在DNase Ⅰ缓冲液(400mMTris-HCl pH7.4/100nM；NaCl/60nM；MgCl2/100mM；CaCl2)中加入5μl的DNaseⅠ，用上述的荧光计通过荧光扫描记录溶液中荧光的发射。由天然脱氧核苷酸组成的vav互补分子信标和β-actin互补分子信标分别与vav同序寡核苷酸对照、β-actin同序寡核苷酸杂交，产生了荧光。而vav互补分子信标和β-actin互补分子信标分别由于不能与vav不匹配寡核苷酸对照和β-actin不匹配寡核苷酸对照发生杂交，而没有荧光产生。45分钟后，在核酸酶的作用下，由天然脱氧核苷酸组成的分子信标全部发生水解，所有的由天然脱氧核苷酸组成的分子信标全部发出荧光。但是由经结构修饰的脱氧核苷组成的vav互补分子信标和β-actin互补分子信标分别与vav同序寡核苷酸对照、β-actin同序寡核苷酸杂交，产生了荧光。而vav互补分子信标和β-actin互补分子信标分别由于不能与vav不匹配寡核苷酸对照和β-actin寡核苷酸不匹配对照发生杂交，而没有荧光产生。在45分钟-10小时后，由于经结构修饰的核苷耐核酸酶的水解，这一结果仍没改变。
分子信标的显微注射和双螺旋的形成：
K562 leukemia细胞以300rpm的速度离心10min，移到载物片上。有10％牛肉朊的PRMI1640介质加入环中以确保细胞的存活。每个细胞显微注射大约10-100pl的信标，并在10分钟内完成100-200次显微注射，载物片于紫外光下迅速暴露50秒，捕捉图象，用系列图象分析软件测荧光水平。
共聚焦扫描显微镜：
用带有共聚焦扫描仪的显微镜检测荧光发射，这种显微镜配有宽范围的UV棱镜，能激发351nm波长的光，为了优化UV荧光发射，440-40长范围的过滤器安装于通道1，超过450的过滤器安装于通道2。观察荧光强度。
结论
当分子信标置于靶寡脱氧核苷中时，它们发生杂交，分子信标的发夹结构打开，使荧光发色团和荧光淬灭基团之间的距离加大，产生荧光。而不能发生杂交的分子信标则不产生荧光。由经结构修饰的核苷构成的分子信标的荧光发光强度比天然核苷构成的分子信标的发光强度大。从电泳分析上可发现分子信标与靶寡核苷酸发生杂交形成双螺旋结构后在凝胶上的流动性相对于没形成双螺旋结构的寡核苷酸链的流动性减慢。天然核苷构成的分子信标进入细胞内45分钟后由于被核酸酶水解成片段，使分子信标的荧光发色团和荧光淬灭基团之间的距离加大而全部发出荧光，而经结构修饰的核苷由于耐核酸酶的水解作用，不能发生杂交的分子信标由于发色基团和淬灭基团的距离仍保持很近，不能发出荧光。能发生杂交的分子信标由于发色基团和淬灭基团的距离增加，分子信标的发夹型打开，使荧光发色团和荧光淬灭基团之间的距离加大，产生荧光，从而检测到细胞内的待测基因。
5、细胞群染色及分离解析
细胞悬液：
将组织培养液或新鲜组织进行消化、剪碎、离心。
分子信标的合成：
在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个荧光基团(F)或一个荧光基团(F)、一个淬灭基团(Q)。发色基团有荧光素、罗丹明、[5-(2｀-氨乙基)氨基萘烯-1-磺酸等，荧光淬灭基团有[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸等。荧光分子与淬灭分子靠近时，能量传递效率达100％，荧光几乎被全部淬灭。而当分子信标与靶基因或DNA或RNA的互补区杂交形成双螺旋结构时，5′-与3′-的茎杆区被拉开，(F)与(F)或(F)与(Q)距离增大，荧光恢复。将分子信标加入细胞悬液中进行染色，离心洗涤后上流式细胞液进行分选。
最后进行单细胞激光共聚焦显微技术分析。
Claims (11)
1．一种细胞内基因分析方法，包括如下步骤：(1)、采用天然或结构修饰的分子信标或将天然或结构修饰的分子信标用不同发色基团进行标记，(2)、采用显微注射将设计的分子信标注入活体细胞或将分子信标加入细胞悬浮液杂交染色，(3)、使分子信标与待测基因进行有效杂交，(4)、采用激光共聚焦显微技术进行分析。
2．根据权利要求1所述的方法，包括如下步骤：(1)、选择单个活体细胞作为检测对象，(2)、选择待测基因，(3)、分子信标的设计：采用天然或结构修饰的分子信标或将天然或结构修饰的分子信标用不同发色基团进行标记，(4)、采用显微注射将设计的分子信标注入活体细胞，(5)、使分子信标与待测基因进行有效杂交，(6)、采用激光共聚焦显微技术进行分析。
3．根据权利要求1所述的方法，其特征在于分子信标的设计是将结构修饰的分子信标用不同发色基团进行标记。
4．根据权利要求1或者所述的方法，其特征在于分子信标是在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个发色基团(F)或一个发色基团(F)、一个淬灭基团(Q)，分子信标可采用不同的发色基团。
5．根据权利要求4所述的方法，其特征在于发色基团可为目前广泛应用于基因及蛋白质标记的荧光发色基团，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羟基荧光黄或四氯荧光黄或吲哚二羧菁俄勒冈绿488X或得克萨斯红-X或荧光素或罗丹明或得克萨斯红或芘等。
6．根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于对分子信标的核糖及三磷酸骨架的结构修饰如下：X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中M+为各种有机及无机阳离子，SH或S-M+，其中，M+为各种有机及无机阳离子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤类及嘧啶类碱基或腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或结构修饰的碱基。
7．根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在同一细胞内显微注射采用不同发色基团的多种分子信标，同时分析多种基因、点突变及缺失。
8．根据权利要求1所述的方法，包括如下步骤：1、将组织培养液或新鲜组织进行消化、剪碎、离心得细胞悬液，2、设计合成分子信标，3、将分子信标加入细胞悬液杂交染色，4、将细胞悬液上流式细胞仪分选，5、对分选液进行单细胞共聚焦分析。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于分子信标是在长度为10-30mer寡核苷酸探针的5′-及3′-端分别加上5-10mer序列互补的茎杆区，然后再在5′-及3′-端分别连接两个发色基团(F)或一个发色基团(F)、一个淬灭基团(Q)，分子信标可采用不同的发色基团。
10．根据权利要求8所述的方法，其特征在于发色基团可为目前广泛应用于基因及蛋白质标记的荧光发色基团，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羟基荧光黄或四氯荧光黄或吲哚二羧菁俄勒冈绿488X或得克萨斯红-X或荧光素或罗丹明或得克萨斯红或芘等。
11．根据权利要求8所述的方法，其特征在于对分子信标的三磷酸骨架的结构修饰
X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中，M+为各种有机及无机阳离子或SH或S-M+，其中M+为各种有机及无机阳离子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤类及嘧啶类碱基或腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或结构修饰的碱基。
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| CN 01107109 CN1308135A (zh) | 2001-02-12 | 2001-02-12 | 细胞内的基因分析方法 |
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| CN 01107109 CN1308135A (zh) | 2001-02-12 | 2001-02-12 | 细胞内的基因分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1308135A true CN1308135A (zh) | 2001-08-15 |
Family
ID=4656062
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN 01107109 Pending CN1308135A (zh) | 2001-02-12 | 2001-02-12 | 细胞内的基因分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1308135A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1294279C (zh) * | 2004-04-05 | 2007-01-10 | 周国华 | 采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法 |
| CN100434532C (zh) * | 2002-08-06 | 2008-11-19 | 华南师范大学 | 点突变基因的检测方法及装置 |
| CN100580089C (zh) * | 2002-12-03 | 2010-01-13 | 拜奥默里克斯有限公司 | 在诊断性杂交测试中同时降低序列变异和基线增加的影响的方法、进行这种方法的测试和用于所述测试的探针 |
-
2001
- 2001-02-12 CN CN 01107109 patent/CN1308135A/zh active Pending
Cited By (3)
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| CN100580089C (zh) * | 2002-12-03 | 2010-01-13 | 拜奥默里克斯有限公司 | 在诊断性杂交测试中同时降低序列变异和基线增加的影响的方法、进行这种方法的测试和用于所述测试的探针 |
| CN1294279C (zh) * | 2004-04-05 | 2007-01-10 | 周国华 | 采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法 |
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