CN108003354B - 一种响应细胞内酸性与氧化还原环境的聚合物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种响应细胞内酸性与氧化还原环境的聚合物，即一种聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖聚合物，为高分子物质，其中疏水性的聚甲基丙烯酸衍生物分子量为4.1kDa～18.8kDa，壳寡糖分子量为5～20kDa，脱乙酰度为70％～100％。壳聚糖与聚甲基丙烯酸衍生物通过与3,3’‑二硫代二丙酸发生酰胺反应，得到聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖。该聚合物形成的纳米粒结构稳定，被动靶向肿瘤作用强，体内稳定性高。由于该结构中含有大量的叔胺基团和氧化还原环境响应的二硫键，该纳米粒具备肿瘤细胞内溶酶体快速逃逸与胞浆内快速释放药物的能力，提高抗肿瘤药物在肿瘤治疗中的疗效。

Description

一种响应细胞内酸性与氧化还原环境的聚合物及其制备与 应用
技术领域
本发明属药剂学领域，涉及一种响应细胞内酸性与氧化还原环境的聚合物，尤其涉及一种聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖和制备方法，以及所合成的响应细胞内酸性与氧化还原环境聚合物的应用。
背景技术
肿瘤仍然是威胁人类生活质量的最重要的疾病之一。尽管化疗、放疗等治疗方法可以延长病人的存活期，但是小分子抗肿瘤药物体内分布缺乏特异性，容易损伤人体正常器官，比如现有的盐酸阿霉素注射液，容易产生严重的心肌退行性病变，骨髓抑制等副作用，限制了临床应用。
包封化疗药物的纳米给药系统，可以通过增强渗透与截留效应，被动扩散至肿瘤组织，提高抗肿瘤药效。尽管纳米制剂提高了病人的生存期，但临床治疗结果并没有如临床前实验结果那样乐观。因此，研究者开始研究多功能的智能载体，期望在增加抗肿瘤疗效的同时，降低对人体的毒副作用。胞内胞外环境的差异性如酸性，通常被用来选择性地释放抗肿瘤药物。但是溶酶体过程时间较短，导致酸性环境响应性载体不能实现设定的药物释放功能，且转运至溶酶体中的抗肿瘤药物或基因药物被酶降解，降低肿瘤治疗效果。其他功能型载体，如响应氧化还原环境，活性氧和酶等的载体，由于缺乏溶酶体快速逃逸的功能，并不能有效的被递送至靶部位发挥设定的功能。为此，一些特定化学基团如氨基，可以被细胞内吞过程中动态变化的酸性环境诱导产生质子海绵效应，实现溶酶体逃逸。但即使溶酶体逃逸成功，药物与材料之间较强的相互作用，会阻碍药物在特定的细胞器等部位有效释放，缓慢释放的药物对细胞产生的慢性毒性会诱导肿瘤细胞产生获得性耐药。因此，根据药物胞内转运过程特点，首先解决溶酶体逃逸障碍，再实现快速触发药物释放的思路在药物递送系统设计中至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种响应细胞内酸性与氧化还原环境的聚合物即聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖，其代表性的结构通式为：
Figure GDA0002575350180000021
其中：
a为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖中氨基没有被取代的糖单环数量，范围为30～110，
b为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖中甲基丙烯酸衍生物的单体数量，范围为15～80，
c为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖中N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐的单体数量，范围为0.9～4.8，其中b:c范围为16.7～33.3。
本发明中壳聚糖的分子量5～20kDa，壳聚糖的脱乙酰度为70％-100％；甲基丙烯酸衍生物聚合物分子量为4.1kDa～18.8kDa。
本发明的第二个目的是提供聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)甲基丙烯酸衍生物单体的合成
将甲基丙烯酸，三乙胺，4-二甲氨基吡啶和碳二亚胺溶解于二氯甲烷进行基团活化，随后加入N，N-二异丙基乙二胺，氮气保护下，40℃～60℃反应6～12小时，产物趁热过三氧化二铝柱子，萃取，旋蒸得到甲基丙烯酸衍生物单体，-20℃保存，其中N，N-二异丙基乙二胺：甲基丙烯酸最优摩尔比为1.0：1～2.0：1；
(2)聚甲基丙烯酸衍生物合成
将合成的甲基丙烯酸衍生物单体，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和偶氮二异丁腈溶解于二甲亚砜，氮气保护下，60℃～80℃共聚反应2～0.5小时，终止反应，冰乙酸乙酯萃取，离心得到聚甲基丙烯酸衍生物，其中甲基丙烯酸衍生物单体：N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐：偶氮二异丁腈最优摩尔比为50：3：0.5～100：3：0.5；
(3)聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖的合成
首先，将3,3’-二硫代二丙酸、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺置于西林瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，调节反应液pH至3.0～5.0，60℃反应2小时；
于此同时，另外取西林瓶，将聚甲基丙烯酸衍生物和三乙胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺，60℃搅拌2小时脱去聚甲基丙烯酸衍生物上盐酸盐；
将上述两个西林瓶中的反应液混合，并调整反应液至pH 3.0～5.0，60℃～80℃反应48～72小时。加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，60℃搅拌活化2小时。将溶解于纯水中的壳聚糖加入上述反应液，60℃继续反应48～72小时。将反应液置透析袋中，在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖产物。其中聚甲基丙烯酸衍生物与壳聚糖最优质量比范围为8：1～2：1。
聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖的合成路线：
Figure GDA0002575350180000031
Figure GDA0002575350180000032
Figure GDA0002575350180000033
本发明的第三个目的是提供聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖在制备肿瘤细胞内溶酶体逃逸与快速释放的抗肿瘤药物中的应用。研究结果表明聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖可以在乳腺癌肿瘤细胞中实现快速的溶酶体逃逸和氧化还原响应性释放抗肿瘤药物。
本发明提供一种在内吞过程中可以优先实现溶酶体逃逸，避免抗肿瘤药物被溶酶体中的酶降解。随后响应胞浆中氧化还原环境的聚合物。该聚合物主要由三部分构成，疏水性部分为含有大量叔胺和仲胺集团的聚甲基丙烯酸衍生物，亲水性部分是具有较好的生物相容性、生物可降解性、安全性的壳聚糖。亲疏水部分通过可以响应氧化还原环境的化学键连接。该聚合物在水性介质中可以自聚集形成胶束，通过分子间作用力包封疏水性的抗肿瘤药物阿霉素，形成纳米粒。该纳米粒通过增强渗透与滞留效应，提高抗肿瘤药物在肿瘤部位的分布。分布到肿瘤部位后，纳米粒被内吞后首先在大量胺基质子化后，通过质子海绵效应实现溶酶体逃逸，转运至胞浆中。随后，细胞内的氧化还原环境破坏纳米粒结构的完整性，实现抗肿瘤药物释放快速释放，最终提高患者的治疗药效。
本发明通过化学合成的方式，将具备溶酶体逃逸和胞浆内抗肿瘤药物释放两个功能在一个纳米粒上实现，合成得到的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖纳米粒提高了抗肿瘤药物在肿瘤部位的分布，并且增加了细胞内靶点的药物浓度，可提高抗肿瘤药物的肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为壳聚糖，3,3’-二硫代二丙酸，聚甲基丙烯酸衍生物和聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖的核磁共振图谱。
图2为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖和聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束的粒径分布和透射电镜图片。
图3为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束在不同释放介质中阿霉素的释放曲线。
图4为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖在乳腺癌细胞上溶酶体逃逸结果。
图5为流式细胞仪检测聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束在乳腺癌细胞内释放。
图6为细胞水平聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束抗肿瘤药效。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
取N,N-二异丙基乙二胺6.4mL，三乙胺16mL，甲基丙烯酸3mL，1.9g 4-二甲氨基吡啶，3.0g碳二亚胺，溶解于30mL二氯甲烷，氮气保护下，40℃反应12小时。产物趁热过三氧化二铝柱子，用水萃取，旋蒸后，得到甲基丙烯酸衍生物单体，放置-20℃保存。
取甲基丙烯酸衍生物单体500mg，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐50mg，偶氮二异丁腈8.8mg，溶解于3mL二甲亚砜中，氮气保护下，60℃共聚反应0.5小时。终止反应，冰乙酸乙酯萃取，离心得到聚甲基丙烯酸衍生物。通过凝胶渗透色谱法(PLgel MIXED-C columns，particle size:5μm；dimensions:7.5mm×300mm)，根据标准曲线计算得到聚甲基丙烯酸衍生物分子量为4040Da。
首先，将16mg 3,3’-二硫代二丙酸，58mg碳二亚胺，30mg N-羟基琥珀酰亚胺置于西林瓶中，溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺，调节反应液pH至3.0～5.0，60℃反应2小时。
与此同时，另外取西林瓶，将100mg甲基丙烯酸衍生物聚合物，2mL三乙胺，溶解于2mLN，N-二甲基甲酰胺，60℃搅拌2小时脱去聚甲基丙烯酸衍生物上盐酸盐。
将上述两个西林瓶中的反应液混合，并调整反应液至偏pH 3.0～5.0。60℃反应72小时。
随后，在上述反应液中加入58mg碳二亚胺，30mg N-羟基琥珀酰亚胺，60℃搅拌2小时。将溶解于纯水中的8mg壳聚糖(Mw＝5kDa)加入上述反应液，60℃继续反应72小时。将反应液置透析袋中，在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖产物。
实施例2
取N,N-二异丙基乙二胺6.4mL，三乙胺16mL，甲基丙烯酸4.5mL，1.9g 4-二甲氨基吡啶，3.0g碳二亚胺，溶解于30mL二氯甲烷，氮气保护下，40℃反应12小时。产物趁热过三氧化二铝柱子，用水萃取，旋蒸后，得到甲基丙烯酸衍生物单体，放置-20℃保存。
取甲基丙烯酸衍生物单体500mg，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐50mg，偶氮二异丁腈8.8mg，溶解于3mL二甲亚砜中，氮气保护下，60℃共聚反应1小时。终止反应，冰乙酸乙酯萃取，离心得到聚甲基丙烯酸衍生物。通过凝胶渗透色谱法(PLgel MIXED-C columns，particlesize:5μm；dimensions:7.5mm×300mm)，根据标准曲线计算得到聚甲基丙烯酸衍生物分子量为6500Da。
首先，将16mg 3,3’-二硫代二丙酸，58mg碳二亚胺，30mg N-羟基琥珀酰亚胺置于西林瓶中，溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺，调节反应液pH至3.0～5.0，60℃反应2小时。
与此同时，另外取西林瓶，将100mg甲基丙烯酸衍生物聚合物，2mL三乙胺，溶解于2mLN，N-二甲基甲酰胺，60℃搅拌2小时脱去聚甲基丙烯酸衍生物上盐酸盐。
将上述两个西林瓶中的反应液混合，并调整反应液至偏pH 3.0～5.0。60℃反应72小时。
随后，在上述反应液中加入58mg碳二亚胺，30mg N-羟基琥珀酰亚胺，60℃搅拌2小时。将溶解于纯水中的16mg壳聚糖(Mw＝5kDa)加入上述反应液，60℃继续反应72小时。将反应液置透析袋中，在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖产物。
精密称量4mg聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖溶解于2mL纯水中，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，加入2mg/mL阿霉素二甲亚砜溶液200μL。磁力搅拌2小时后，置于透析袋透析2天，获得聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束。微粒粒度分析仪测定聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖和聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束粒径分别为139.7±15.0nm和117.0±11.5nm，多分散系数分别为0.13±0.06和0.11±0.06。
实施例3
取N,N-二异丙基乙二胺6.4mL，三乙胺16mL，甲基丙烯酸6.0mL，1.9g 4-二甲氨基吡啶，3.0g碳二亚胺，溶解于30mL二氯甲烷，氮气保护下，40℃反应12小时。产物趁热过三氧化二铝柱子，用水萃取，旋蒸后，得到甲基丙烯酸衍生物单体，放置-20℃保存。
取甲基丙烯酸衍生物单体1g，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐50mg，偶氮二异丁腈8.8mg，溶解于3mL二甲亚砜中，氮气保护下，60℃共聚反应2.5小时。终止反应，冰乙酸乙酯萃取，离心得到聚甲基丙烯酸衍生物。通过凝胶渗透色谱法(PLgel MIXED-C columns，particle size:5μm；dimensions:7.5mm×300mm)，根据标准曲线计算得到聚甲基丙烯酸衍生物分子量为18.8kDa。
首先，将16mg 3,3’-二硫代二丙酸，58mg碳二亚胺，30mg N-羟基琥珀酰亚胺置于西林瓶中，溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺，调节反应液pH至3.0～5.0，60℃反应2小时。
与此同时，另外取西林瓶，将100mg甲基丙烯酸衍生物聚合物，2mL三乙胺，溶解于2mLN，N-二甲基甲酰胺，60℃搅拌2小时脱去聚甲基丙烯酸衍生物上盐酸盐。
将上述两个西林瓶中的反应液混合，并调整反应液至偏pH 3.0～5.0。60℃反应72小时。
随后，在上述反应液中加入58mg碳二亚胺，30mg N-羟基琥珀酰亚胺，60℃搅拌2小时。将溶解于纯水中的8mg壳聚糖(Mw＝5kDa)加入上述反应液，60℃继续反应72小时。将反应液置透析袋中，在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖产物。
核磁共振光谱法测定壳聚糖，3,3’-二硫代二丙酸，甲基丙烯酸衍生物聚合物和聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖。称取壳聚糖和聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖各5mg，分别用0.5mLD2O溶解，另取3,3’-二硫代二丙酸和甲基丙烯酸衍生物聚合物各5mg，溶于0.5mL二甲亚砜-d6，用核磁共振1H-NMR测定，结果参见图1。
称取聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖4mg，溶解于2mL蒸馏水，得到2mg/mL的溶液。探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)得到未载药的纳米粒。另精密称量4mg聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖溶解于2mL纯水中，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，加入2mg/mL阿霉素二甲亚砜溶液200μL。磁力搅拌2小时后，置于透析袋透析2天，得到聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束。微粒粒度与表面电位分析仪测定聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖和聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束水合粒径与透射电镜图片见图2，分别为70.3±2.5nm和59.4±1.2nm，电位分别为-44.11±1.07和-34.52±0.15多分散系数分别为0.27±0.08和0.21±0.04。
利用荧光分光光度法测定聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束中阿霉素的含量，阿霉素溶于二甲基亚砜，二甲亚砜稀释配成不同浓度的溶液，制备标准曲线。一定量聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束溶于二甲亚砜中，测定荧光值，通过标准曲线计算载体的载药量和包封率分别为8.38％和91.50％。
聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束体外释放行为的考察：
分别取阿霉素浓度为30μg/mL聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束1mL，放入透析袋(MW＝3500Da)中，将透析袋放入30mL不同的释放介质中，在37℃的摇床中振荡。于不同时间点取样，取样后15000转/分离心20分钟，取上清液，连续取样72小时。荧光分光光度法测定样品中的药物浓度(EX＝505nm，EM＝565nm，狭缝＝5nm)，释放曲线见图3。
称取4mg聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖，加入2mL水，探头超声30次，取2mg/mL异硫氰酸荧光素200μL，室温避光搅拌12小时。将反应液置透析袋中，透析1天，离心，得到异硫氰酸荧光素标记的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖。在24孔细胞培养板中，每孔加入1mL含1×105个MCF-7细胞，置37℃、5％CO2孵箱培养12小时，待细胞完全贴壁后，每孔加入100μL异硫氰酸荧光素标记的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖，分别孵育30分钟，1小时和4小时，加入溶酶体染料和核染，用等渗的磷酸盐缓冲液清洗三次，用4％的多聚甲醛固定细胞，激光共聚焦观察聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖在细胞溶酶体中的逃逸过程。结果如图4所示，聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖30分钟时已经有部分发生逃逸，4小时时大部分聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖已经从溶酶体中逃逸成功。
称取4mg聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖，加入2mL水，探头超声30次，取2mg/mL异硫氰酸荧光素200μL，室温避光搅拌12小时。将反应液置透析袋中，透析1天，离心，得到异硫氰酸荧光素标记的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖。取200μL2mg/mL的亲脂性染料DiI加入异硫氰酸荧光素标记的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖，搅拌2小时后，放入透析袋中，透析一天，5000转/分钟离心10分钟，除去未溶解的沉淀，得到异硫氰酸荧光素标记的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖包封DiI的纳米粒。
在24孔细胞培养板中，每孔加入1mL含1×105个MCF-7细胞，置37℃、5％CO2孵箱培养12小时，待细胞完全贴壁后，每孔加入100μL异硫氰酸荧光素标记的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖包封DiI的纳米粒，分别孵育2小时，4小时，8小时，10小时和24小时，用等渗的磷酸盐缓冲液清洗三次，用0.25％胰酶将细胞消化下来，离心获得细胞沉淀，以0.5mL缓冲液重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素和DiI的荧光值。检测结果如图5所示，异硫氰酸荧光素标记的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖包封DiI的纳米粒在短时间内便快速释放出荧光物质，表明聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖可以在肿瘤细胞内快速释放抗肿瘤药物。
聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖和聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束的抗肿瘤药效：
本发明以肿瘤细胞抑制率，评价聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束细胞存活率，试验采用四唑盐比色法测定。以乳腺癌细胞MCF-7细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入200μL含2×103个MCF-7细胞的培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养12小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的阿霉素溶液、聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔；孵育48小时后，每孔加入5mg/mL噻唑兰溶液20μL，继续孵育4小时后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜200μL，用酶联检测仪测定570nm处吸光度，按下式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％
阿霉素、聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖载药胶束对MCF-7细胞的毒性如图6。

Claims (7)

1.一种聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖，其特征在于，其代表性的结构通式为：
Figure 133245DEST_PATH_IMAGE002
其中：
a为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖中氨基没有被取代的单糖数量，范围为30~110，
b为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖中甲基丙烯酸衍生物的单体数量，范围为15~80，
c为聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖中N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐的单体数量，范围为0.9~4.8，其中b:c范围为16.7~33.3。
2.根据权利要求1所述的一种聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖，其特征在于，所述壳聚糖的分子量5～20kDa，壳聚糖的脱乙酰度为70％-100％，甲基丙烯酸衍生物聚合物分子量为4.1kDa~18.8kDa。
3.权利要求1所述的聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）甲基丙烯酸衍生物单体的合成
将甲基丙烯酸，三乙胺，4-二甲氨基吡啶和碳二亚胺溶解于二氯甲烷进行基团活化，随后加入N，N-二异丙基乙二胺，氮气保护下，40℃~60℃反应6~12小时，产物趁热过三氧化二铝柱子，萃取，旋蒸得到甲基丙烯酸衍生物单体，-20℃保存；
（2）聚甲基丙烯酸衍生物合成
将合成的甲基丙烯酸衍生物单体，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和偶氮二异丁腈溶解于二甲亚砜，氮气保护下，60℃~80℃共聚反应2~0.5小时，终止反应，冰乙酸乙酯萃取，离心得到聚甲基丙烯酸衍生物；
（3）聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖的合成
首先，将3,3’-二硫代二丙酸、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺置于西林瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，调节反应液pH至3.0~5.0，60℃反应2小时；
另外取西林瓶，将聚甲基丙烯酸衍生物和三乙胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺，60℃搅拌2小时脱去聚甲基丙烯酸衍生物上盐酸盐；
将上述两个西林瓶中的反应液混合，并调整反应液至pH 3.0~5.0，60℃~80℃反应48~72小时，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，60℃搅拌活化2小时，将溶解于纯水中的壳聚糖加入上述反应液，60℃继续反应48~72小时，将反应液置透析袋中，在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖产物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，其中N，N-二异丙基乙二胺：甲基丙烯酸的摩尔比为1.0：1~2.0：1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，其中甲基丙烯酸衍生物单体：N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐：偶氮二异丁腈的摩尔比为50：3：0.5~100：3：0.5。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中聚甲基丙烯酸衍生物与壳聚糖质量比范围为8：1~2：1。
7.根据权利要求1所述的一种聚甲基丙烯酸衍生物偶合壳聚糖在制备肿瘤细胞内溶酶体逃逸与快速释放的抗肿瘤药物中的应用。
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