CN113143867A - 一种cmcs-dsp-ipi549抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法 - Google Patents

一种cmcs-dsp-ipi549抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CMCS‑DSP‑IPI549抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法，将免疫疗法的抗肿瘤药物IPI‑549与含有二硫键可在肿瘤微环境中响应GSH而断裂的3,3’‑二硫代二丙酸双(N‑羟基琥珀酰亚胺酯)(DSP)合成DSP‑IPI549中间体后，再将其键合到安全无毒、生物相容性高的水溶性高分子可降解材料羧甲基壳聚糖(CMCS)上，得到CMCS‑DSP‑IPI549两亲性前药，通过超声破碎和透析自组装得到一种CMCS‑DSP‑IPI549抗肿瘤纳米传递系统。本发明针对肿瘤细胞或组织自身所具有的独特性质，制备得到了一种刺激响应型两亲性高分子聚合物纳米粒，靶向传递并控制释放出免疫治疗机制的抗肿瘤药物，极大的提高治疗效果并降低药物对机体的毒副作用，为临床上通过免疫治疗这种新型的治疗手段提供新的方法学和理论依据。

Description

一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术的技术领域，尤其涉及一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法。
背景技术
肿瘤是世界范围内影响公共卫生健康的杀手之一，具有极高的发病率和死亡率且易复发和转移。截止至2018年的最新调查中，全球恶性肿瘤新发病例约 1 808万例，死亡病例约956万例。最近，有效的免疫疗法已经进入临床实验，并成为治疗肿瘤的前沿技术。肿瘤免疫治疗是通过机体自身产生刺激来增强免疫细胞的活动或阻断肿瘤细胞产生的信号，以抑制肿瘤细胞生长。对正常细胞及组织不造成损伤，还可以产生免疫记忆，从而具有持久的抗肿瘤疗效来防止肿瘤的复发和转移。
磷酸肌醇-3-激酶(PI3Ks)属于一个信号转导的脂质激酶家族，介导癌细胞和免疫反应中的关键细胞功能。其主要作用是催化磷酸肌醇环的磷酸化，然后作为激活的位点发出信号，参与调节多种生物过程，包括细胞生长、存活、分化、增殖和迁移。IPI-549是一种有效的选择性PI3Kγ抑制剂，IC50为16nM。文献报道其对MDSC的免疫抑制有较好的改善作用。在临床前研究中，IPI-549 对巨噬细胞重编程从而抑制PI3K-γ，从免疫抑制的M2表型变为免疫激活的M1 表型，与传统免疫疗法相比，IPI-549通过抑制肿瘤微环境中的免疫抑制性巨噬细胞而更具有靶向性。
近年来，由于纳米材料独特的理化性质，已被广泛应用于肿瘤治疗等方面的研究。由于纳米材料粒径较小，比较容易进入细胞内甚至进入细胞核中，对细胞的显微结构产生影响。结合抗肿瘤药的纳米材料能特异性地抑制肿瘤细胞的增殖，同时对正常细胞并没有明显的抑制作用，这对抗肿瘤药物有巨大的研究价值和应用潜力。
羧甲基壳聚糖(CMCS)是将壳聚糖(CS)羧基化得到的一种水溶性高分子多糖，是一种优良的生物可降解材料。相较于CS，CMCS由于引入了-COOH，降低了-NH2的电荷密度，从而导致细胞毒性降低，具有更好的生物相容性。 CMCS可通过离子交联法形成纳米粒，将药物包裹于纳米粒中可显著提高药物稳定性；CMCS含有大量的-COOH与-NH2活性官能团，可以与疏水性的药物偶联，形成两亲性高分子前药，或进行靶向修饰，提高药物对肿瘤组织的靶向、浓集作用。
利用抗肿瘤药物与高分子载体之间的活性官能团制得高分子前药，通过不同的化学键进行修饰，改变其在肿瘤微环境中的释药过程。谷胱甘肽(GSH) 是一种含巯基的天然活性肽，肿瘤细胞内GSH浓度是正常细胞的4倍多，二硫键在低浓度的还原物质环境中能够保持键的稳定，而在高浓度还原物质的作用下发生键的断裂。3,3’-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DSP)含有两个活性的N-琥珀酰亚胺酯与一个二硫键，既可作为连接高分子载体和肿瘤药物的连接臂，又可响应GSH，使纳米传递系统在肿瘤组织或细胞内靶向释放药物，避免载药系统在体循环中解体导致药物泄露。
将免疫治疗药物IPI-549与含有二硫键的DSP反应生成的DSP-IPI549中间体，键合到无毒、可生物降解的CMCS上，得到CMCS-DSP-IPI549前药，通过超声破碎和透析自组装获得一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统，改善肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，提高生物利用度并增加靶向性和滞留时间，开发刺激响应型的免疫治疗能同时阻断多个靶点，发挥更好的治疗作用，这不仅是对抗肿瘤特异性的最佳策略，同时也对提高免疫治疗肿瘤治愈率有着非凡的意义。
发明内容
基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于提供一种 CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法。该方法制备的核壳型纳米粒具有显著的肿瘤靶向性和良好的免疫治疗性，可以改善肿瘤微环境中免疫细胞的作用机制，长效、缓释地对肿瘤细胞进行不间断的攻击。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，包含如下步骤：
(1)DSP-IPI549中间体的合成：
将DSP溶解于DMSO中，搅拌至完全溶解，得到DSP溶液；将IPI-549溶解于DMSO溶液中，得到IPI-549溶液；将IPI-549溶液缓缓滴入DSP溶液中，室温下避光磁力搅拌反应24h，用DMSO和去离子水的混合溶液和水透析，冷冻干燥后得DSP-IPI549冻干粉末；
(2)CMCS-DSP-IPI549前药的合成：
将DSP-IPI549冻干粉末溶解于DMSO中，得到DSP-IPI549溶液；将CMCS 溶解于去离子水中，调节pH值为7.4，超声5min，得CMCS溶液；将DSP-IPI549 溶液缓慢滴入CMCS溶液中，室温下避光磁力搅拌反应24h，以DMSO和去离子水的混合溶液和去离子水透析，冷冻干燥后得CMCS-DSP-IPI549高分子前药冻干粉末；
(3)一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备
将CMCS-DSP-IPI549高分子前药分散于去离子水中，然后将其超声破碎，即得CMCS-DSP-IPI549纳米粒溶液，于去离子水中透析，冷冻干燥，即得 CMCS-DSP-IPI549纳米粒冻干粉末。
作为上述技术方案的优选，本发明提供的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，所述透析时使用的透析袋在步骤(1)中的截留分子量为500Da，其余步骤使用的透析袋截留分子量均为3 500Da。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(1)中，DSP和IPI-549的摩尔比为 1：1；所述DSP溶液浓度范围为1mg/mL至1000mg/mL；所述IPI-549溶液的浓度范围1mg/mL至1000mg/mL；DMSO和去离子水的混合溶液中DMSO与水的质量比为1:9。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)中，CMCS和DSP-IPI549的质量比为1:1.3～3.3；DSP-IPI549溶液浓度范围3.3mg/mL至3300mg/mL；CMCS 溶液的浓度范围0.01mg/mL至1000mg/mL；DMSO和去离子水的混合溶液DMSO与水的质量比为7:3至3:7。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)中，CMCS的摩尔质量为1×104及羧甲基取代度为85％。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(3)中的超声破碎过程使用超声波细胞粉碎机，探头在低于25℃的低温下超声3.0s，间歇2.0s，功率为90w的脉冲方式工作10min。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(3)中得到的CMCS-DSP-IPI549纳米粒用动态光散射仪(DLS)测得的粒径大小范围为122-295nm。采用紫外光度法测得载药量为10.17％～13.63％。
一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统，所述CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统是由IPI-549和3,3’-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DSP)反应合成DSP-IPI549中间体后，再接枝到羧甲基壳聚糖(CMCS)上得到CMCS-DSP-IPI549前药，然后经过超声破碎和透析自组装得到的。
作为上述技术方案的优选，本发明提供的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，所述CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统是由如上所述的任一方法制备而成。
本发明所述的传递系统实现刺激响应型给药缓控释体系，增强药物靶向性、提高了药物的稳定性，可以在肿瘤局部维持长效释放药物，提高了抗肿瘤药物的生物利用度，增强了疗效和滞留时间，降低了耐药性以及药物的毒副作用和不良反应，为临床上通过免疫治疗这种新型的治疗手段提供新的方法学和理论依据。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：1.实现刺激响应型的免疫治疗法给药缓控释体系，通过自组装形成的两亲性高分子纳米粒可以提高IPI-549的水溶性、提高了药物的稳定性，同时在血液循环中不释放药物避免引起机体不良反应，在肿瘤局部维持长效释放药物，为临床上通过免疫治疗这种新型的治疗手段提供新的方法学和理论依据。
2.通过免疫调节改善肿瘤微环境，将肿瘤巨噬细胞中的免疫抑制M2表型变为免疫激活M1表型，CMCS-DSP-IPI549纳米粒对肿瘤细胞或组织具有靶向性，对正常细胞几乎无杀伤力。
3.具有二硫键在肿瘤微环境下断裂的CMCS-DSP-IPI549纳米粒，可以更一步地增加了PI3K-γ抑制剂IPI-549的靶向性。
4.CMCS-DSP-IPI549纳米粒通过二硫键形成体循环稳定性和智能释药性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1制备的CMCS-DSP-IPI549前药的氢谱谱图，其中 CMCS(a),DSP(b),IPI-549(c),CMCS-DSP-IPI549(d)；
图2为本发明实施例1制备的DSP-IPI549中间体的红外图谱，其中 IPI-549(a),DSP(b),DSP-IPI549(c)；
图3为本发明实施例1制备的CMCS-DSP-IPI549前药的红外图谱，其中 DSP-IPI549(c),CMCS(d),CMCS-DSP-IPI549(e)；
图4为本发明实施例1制备的CMCS-DSP-IPI549纳米粒的透射电镜图；
图5为本发明实施例1制备的CMCS-DSP-IPI549纳米粒在不同浓度GSH 的释放曲线(267nm,IPI-549)。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。
实施例1：
(1)DSP-IPI549中间体的合成：
精密称取DSP 20mg溶解于4.2mL DMSO溶液中，搅拌至完全溶解。另精密称取IPI-549 27mg溶解于5.6mL的DMSO溶液中，再缓缓滴入上述DSP溶液中，室温下避光磁力搅拌反应24h，转移至透析袋(截留分子量为500Da)，以1:9的DMSO和去离子水的混合溶液透析48h，再用去离子水透析24h。冷冻干燥后得DSP-IPI549冻干粉末。
(2)CMCS-DSP-IPI549前药的合成：
精密称取DSP-IPI549冻干粉末20mg溶解于7mL DMSO中，精密称取 CMCS 6mg，溶解于70mL去离子水中，调节pH值为7.4，超声5min，得CMCS 溶液。将DSP-IPI549溶液缓慢滴入CMCS溶液中，室温下避光磁力搅拌反应 24h，转移至透析袋中(截留分子量为3500Da)，以7:3/5:5/3:7的DMSO和去离子水的混合溶液分别透析12h，再用去离子水透析24h。冷冻干燥后得冻干粉末，将此冻干粉末溶解于40mL的DMSO溶液中，并进行超声10min，再过滤，以除去溶于DMSO的反应物，重复操作3次。滤饼溶解于去离子水中，于透析袋中用纯水透析24h，冷冻干燥，得CMCS-DSP-IPI549冻干粉末。
(3)一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备
称取10mg CMCS-DSP-IPI549高分子前药分散于10mL去离子水中，将其转移到超声波细胞粉碎机，探头在低温下超声3.0s，间歇2.0s，功率为90w的脉冲方式工作10min，即得CMCS-DSP-IPI549纳米粒溶液，装入透析袋(截留分子量为3500Da)于去离子水中透析4h，冷冻干燥，可得CMCS-DSP-IPI549 纳米粒冻干粉末。
本实施例中制得的CMCS-DSP-IPI549前药，其中DSP-IPI549和CMCS的质量比为3.3:1，载药量为13.63％。
实施例2：
本实施例与实施例1的区别在于：本实施例在(3)中称取精密称取 DSP-IPI549冻干粉末13.2mg溶解于7mL DMSO中，精密称取CMCS 6mg，溶解于70mL去离子水中，其他制备原料组成以及一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备过程同实施例1。
本实施例中制得的CMCS-DSP-IPI549前药，其中DSP-IPI549和CMCS的质量比为2.2:1，载药量为11.87％。
实施例3：
本实施例与实施例1的区别在于：本实施例在(3)中称取精密称取 DSP-IPI549冻干粉末7.8mg溶解于7mL DMSO中，精密称取CMCS 6mg，溶解于70mL去离子水中，其他制备原料组成以及一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备过程同实施例1。
本实施例中制得的CMCS-DSP-IPI549前药，其中DSP-IPI549和CMCS的质量比为1.3:1，载药量为10.17％。
纳米粒的表征实验：
为了证明实施例1中CMCS-DSP-IPI549的成功合成，我们采用核磁和红外表征该化合物的结构(见图1、图2和图3)。图1为(a)CMCS；(b)DSP；(c)IPI549； (d)CMCS-DSP-IPI549的1H-NMR核磁图谱；其中2.57及3.85ppm的质子峰信号是CMCS(a)上的糖环特征峰；3.03和3.11ppm的信号峰为是DSP(b)中的 NHS集团上的氢；7.35-7.66ppm处的多重质子峰信号是IPI549(c)的特征酮环上的质子。在CMCS-DSP-IPI549核磁图(d)中，7.19-7.31ppm处的多重峰为IPI549 的特征峰，3.42-3.52ppm是CMCS上的糖环特征峰；表明了CMCS-DSP-IPI549 高分子前药的成功合成。图2依次为(a)IPI549；(b)DSP；(c)DSP-IPI549的红外图谱。将c与a、b进行比较，出现了IPI549中的C≡C(ν)和苯环中的-OH(ν)，即波数分别为2208cm-1和3435cm-1、3332cm-1。另外，1739cm-1和1213cm-1、1041 cm-1对应为DSP中特有的酯键上的C＝O(ν)和C-O(ν)。与此同时，671cm-1(R-NH2, δ)的消失更进一步证明了成功制备了DSP-IPI549中间体。图3依次为(c) DSP-IPI549；(d)CMCS；(e)CMCS-DSP-IPI549的红外图谱。将e与c、d进行比较，e中有C≡C(ν)的特征吸收峰2208cm-1和糖环中C-O-C(νas)的特征吸收峰1069 cm-1，而1596cm-1处的酰胺Ⅱ峰的出现和1069cm-1处的吸收峰加深，说明产物中有酰胺键的形成，这些表明DSP-IPI549成功键合到CMCS上。
为了证明实施例1中制备的CMCS-DSP-IPI549能在水溶液中自组装形成核壳纳米粒，我们采用透射电镜进行了表征(见图4)，结果显示 CMCS-DSP-IPI549纳米粒呈圆球状，形态规整，分布较均匀；采用动态光散射仪表征这个纳米粒的平均粒径分别为192.5±2.74nm。
为了证明实施例1中制备的CMCS-DSP-IPI549纳米传递系统具有GSH响应性，我们根据正常细胞及肿瘤细胞中GSH的浓度设立了4个浓度梯度，制作了的CMCS-DSP-IPI549纳米传递系统在267nm(IPI-549)处的释放曲线(见图 5)。如图5所示，IPI549的累积释放率随着GSH浓度和释放时间的增加而增加，两者呈正相关关系，IPI549在微摩尔级别的GSH溶液中释放量很低，当GSH 溶液为100μM和2μM时，84h内IPI549的释放量也不足13％。而在高浓度 (mM水平)的GSH溶液中，IPI549的累积释放率明显增加。在人体正常生理环境(PBSpH7.4)中，IPI549的释放量几乎为0。由此，我们可以得到如下预测，该高分子前药构成的纳米颗粒能够在正常生理环境和低浓度的GSH环境中保持稳定，从而保持血液循环中结构的稳定；然而，当进入肿瘤细胞后，受到高浓度GSH的刺激，智能释放IPI549。
本发明公开了一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法，将免疫疗法的抗肿瘤药物IPI-549与含有二硫键可在肿瘤微环境中响应GSH而断裂的3,3’-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DSP)合成DSP-IPI549中间体后，再将其键合到安全无毒、生物相容性高的水溶性高分子可降解材料羧甲基壳聚糖(CMCS)上，得到CMCS-DSP-IPI549两亲性前药，通过超声破碎和透析自组装得到一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统。本发明针对肿瘤细胞或组织自身所具有的独特性质，制备得到了一种刺激响应型两亲性高分子聚合物纳米粒，靶向传递并控制释放出免疫治疗机制的抗肿瘤药物，极大的提高治疗效果并降低药物对机体的毒副作用，为临床上通过免疫治疗这种新型的治疗手段提供新的方法学和理论依据
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)DSP-IPI549中间体的合成：
将DSP溶解于DMSO中，搅拌至完全溶解，得到DSP溶液；将IPI-549溶解于DMSO溶液中，得到IPI-549溶液；将IPI-549溶液缓缓滴入DSP溶液中，室温下避光磁力搅拌反应24h，用DMSO和去离子水的混合溶液和水透析，冷冻干燥后得DSP-IPI549冻干粉末；
(2)CMCS-DSP-IPI549前药的合成：
将DSP-IPI549冻干粉末溶解于DMSO中，得到DSP-IPI549溶液；将CMCS溶解于去离子水中，调节pH值为7.4，超声5min，得CMCS溶液；将DSP-IPI549溶液缓慢滴入CMCS溶液中，室温下避光磁力搅拌反应24h，以DMSO和去离子水的混合溶液和去离子水透析，冷冻干燥后得CMCS-DSP-IPI549高分子前药冻干粉末；
(3)一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备
将CMCS-DSP-IPI549高分子前药分散于去离子水中，然后将其超声破碎，即得CMCS-DSP-IPI549纳米粒溶液，于去离子水中透析，冷冻干燥，即得CMCS-DSP-IPI549纳米粒冻干粉末。
2.如权利要求1所述的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，其特征在于：所述透析时使用的透析袋在步骤(1)中的截留分子量为500Da，其余步骤使用的透析袋截留分子量均为3 500Da。
3.如权利要求1所述的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，DSP和IPI-549的摩尔比为1：1；所述DSP溶液浓度范围为1mg/mL至1000mg/mL；所述IPI-549溶液的浓度范围1mg/mL至1000mg/mL；DMSO和去离子水的混合溶液中DMSO与水的质量比为1:9。
4.如权利要求1所述的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，CMCS和DSP-IPI549的质量比为1:1.3～3.3；DSP-IPI549溶液浓度范围3.3mg/mL至3300mg/mL；CMCS溶液的浓度范围0.01mg/mL至1000mg/mL；DMSO和去离子水的混合溶液DMSO与水的质量比为7:3至3:7。
5.如权利要求1所述的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，CMCS的摩尔质量为1×104及羧甲基取代度为85％。
6.如权利要求1所述的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的超声破碎过程使用超声波细胞粉碎机，探头在低于25℃的低温下超声3.0s，间歇2.0s，功率为90w的脉冲方式工作10min。
7.如权利要求1所述的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中得到的CMCS-DSP-IPI549纳米粒的粒径为122-295nm；CMCS-DSP-IPI549纳米粒的载药量为10.17％～13.63％。
8.一种CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统，其特征在于：所述CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统是由IPI-549和3,3’-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应合成DSP-IPI549中间体后，再接枝到羧甲基壳聚糖上得到CMCS-DSP-IPI549前药，然后经过超声破碎和透析自组装得到的。
9.如权利要求8所述的CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统，其特征在于：所述CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统是由如权利要求1-6所述的任一方法制备而成。
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