CN112641755B - 应用微流体技术制备结肠靶向微囊的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了应用微流体技术制备结肠靶向微囊的方法，包括：步骤S1将改性壳聚糖溶于乙酸水溶液中调pH至7.0，将光引发剂、模型蛋白溶于其中制得内相溶液；步骤S2将乙基纤维素溶于二氯甲烷中制得中间相溶液；步骤S3将聚乙烯醇溶于纯水中制得连续相溶液；步骤S4将步骤S1获得的内相溶液包裹在步骤S2获得的中间相溶液的液滴中，所述液滴分散在步骤S3获得的连续相溶液中，一步制备W/O/W乳液；步骤S5用紫外光照射步骤S4获得的乳液使内相固化成球状内核，加热挥尽有机溶剂使中间相固化成囊壳；步骤S6将步骤5固化后的微囊用纯水洗涤，冷冻干燥。该方法制备的微囊具有结肠定位释放的作用，用于蛋白的包埋与口服递送。

Description

应用微流体技术制备结肠靶向微囊的方法

技术领域

本发明涉及结肠靶向微囊的制备，具体涉及一种应用微流体技术以双乳液为模板制备微囊的方法。

背景技术

生物活性蛋白除了可以作为营养物质，还可以预防或减轻某些疾病，具有极大的营养保健价值。但目前在食品和保健领域，生物活性蛋白却难以发挥其有益健康的作用，主要因为蛋白质摄入后在胃肠道消化系统中容易失活降解，并且难以吸收。开发蛋白口服递送系统，以保护其免于降解，并在胃肠道目标区域释放吸收，具有重要意义和市场价值。

微囊化技术是将蛋白质等芯材包裹在高分子材料壁层内而制成微胶囊。囊壳可以保护蛋白的活性不受外界环境的影响与破坏，可以实现对蛋白的控制释放。结肠是吸收蛋白的最佳部位，因为食物在结肠内停留时间长，结肠部位蛋白水解酶浓度远小于其他区段，水含量相对较多，并且结肠壁对大分子穿透阻力小，利于蛋白溶出和吸收。目前市售的结肠靶向材料多为人工合成的高分子材料，主要为时间或pH依赖性材料，活性物质能否在结肠定位释放难以准确控制，一般做药用辅料应用，因为价格与安全问题很少应用于食品领域。

目前食品工业使用的包囊方法主要包括高压均质，高速剪切，喷雾干燥等，首先两步法制备双乳液，然后进行固化。这些方法的共同缺点是：1，无法精确控制微囊结构，机械致乳不能制备均一的单核壳结构的双乳液，无法控制双乳液的核心数，以及核壳的粒径，导致活性化合物的控释性能及其稳定性差。2，制备过程需要提供很大的机械力，制备过程耗时长，对生物活性蛋白极不友好，蛋白易失活分解，稳定性差、包封率低。

微流体技术为微囊的制备和研究提供了一种可连续生产，过程可控可视，无需高强度机械力，能够一步制备均一的W/O/W单芯乳液的新方法。玻璃微流体装置由两根毛细管，一根方管组成，可连续利用流体剪切力制得具有各种精确结构的微囊。基于微流控技术，以双乳液为模板制备结肠定位降解的微囊，用于生物活性蛋白的包埋与口服递送，在营养保健领域具有可行性和商业价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用微流体技术制备结肠靶向微囊的方法，以制得具有核壳结构，粒径均一的微囊用于蛋白质的包埋与口服递送，保护蛋白的结构与活性不受胃肠道环境的影响，并使蛋白在结肠部位释放、吸收。本发明应用改性壳聚糖、乙基纤维素制备酶-时间依赖型结肠递送系统，材料廉价易得，并具有良好的生物相容性。改性壳聚糖能被结肠被特殊酶及正常菌落分解，光固化形成水凝胶微球用于蛋白的包埋。乙基纤维素为水不溶性材料，作为壁材包裹在壳聚糖微球外层，起到缓释与保护作用。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供应用微流体技术制备结肠靶向微囊的方法，包括如下步骤：

步骤S1，将改性壳聚糖溶于乙酸水溶液中，调pH至7.0，然后将光引发剂、模型蛋白溶于其中，制得内相溶液；

步骤S2，将乙基纤维素溶于二氯甲烷中，制得中间相溶液；

步骤S3，将聚乙烯醇溶于纯水中，制得连续相溶液；

步骤S4，将步骤S1获得的内相溶液包裹在步骤S2获得的中间相溶液的液滴中，所述液滴分散在步骤S3获得的连续相溶液中，一步制备W/O/W乳液；

优选的，将W/O/W乳液收集在S3制备得到的连续相溶液中，以防止破乳；

步骤S5，用紫外光照射步骤S4获的W/O/W乳液，使W/O/W乳液中的内相固化成球状内核；挥尽乳液中的有机溶剂，使中间相固化成囊壳，形成包括内核和囊壳的微囊，所述模型蛋白包封在内核中；

步骤S6，将步骤5固化后的微囊用纯水洗涤多次，冷冻干燥，获得所述结肠靶向微囊。

优选地，步骤S1中所述模型蛋白为水溶性小分子多肽或具有二维及以上结构的水溶性蛋白；步骤S1中所述内相溶液中，蛋白含量为1％～20％(w/v)。

优选地，步骤S1中所述改性壳聚糖为甲基丙烯酰胺壳聚糖，所述改性壳聚糖的甲基丙烯酰基取代度为10％～40％；步骤S1中所述内相溶液中，改性壳聚糖含量为1％～2％(w/v)。

优选地，步骤S1中所述光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮；

优选地，步骤S1中所述内相溶液中，光引发剂含量为0.1％(v/v)。

优选地，步骤S2中所述乙基纤维素的粘度为40～100mPa·s；

优选地，步骤S2中所述中间相溶液中乙基纤维素含量为5％～7％。

优选地，步骤S3中所述聚乙烯醇为1788型；

优选地，步骤S3中所述连续相溶液聚乙烯醇含量为1％～9％(w/v)。

优选地，步骤S4中W/O/W乳液的制备是通过玻璃微流体装置制备得到的，所述玻璃微流体装置为自制一步法制备双乳液装置，包括内相毛细管、收集管、方形管和两个进样针头；将内相毛细管尖端插入方形管，收集管尖端从方形管另一端插入，收集管尖端距内相毛细管尖端200～400μm，进样针头分别固定在方形管两端；内相溶液由内相毛细管一端流入方形管，进而流入收集管；中间相溶液通过方形管上位于内相毛细管一侧的进样针头进入方形管，进而流入收集管；连续相溶液通过方形管上位于收集管一侧的进样针头进入方形管，进而流入收集管；优选的，所述内相毛细管外径960μm，内径550μm，尖端口径20～100μm；收集管外径 960μm，内径550μm，尖端口径150～400μm；方形管外径1.4mm，内径1.1mm；优选的，进样针头为18G点胶针头。

优选地，步骤S4中所述三种溶液的流速分别为：内相溶液流入方形管的流速为1～10 μL/min，中间相溶液流入方形管的流速为15～50μL/min，外向溶液流入方形管的流速为100～500 μL/min。

作为一种特殊的实施方式，本申请所采用的一步法制备双乳液装置为使用拉针仪将适宜长度的毛细管烧拉成两根具有尖端的毛细管，使用磨针仪将两根毛细管打磨至尖端口径分别为 20～100μm，150～400μm，作为内相毛细管(尖端口径20～100μm)和乳液收集管(尖端口径 150～400μm)。将方形管固定于载玻片中心位置，将内相毛细管尖端插入方形管约中间位置，内相毛细管另一端伸出载玻片2cm左右，插入不锈钢管作为保护。收集管尖端从方形管另一端插入，距内相毛细管尖端200～400μm，收集管另一端伸出载玻片2cm左右，插入不锈钢管作为保护。使用AB胶固定两根毛细管，然后在方形管两端安装烫制好的进样针头，用AB胶固定并密封，待胶完全固化，玻璃微流体装置搭建完成。整个操作过程在倒置显微镜平台上进行，确保两根毛细管在方形管的中心线上。

优选地，步骤S5中所述紫外光照射条件为：紫外光峰值波长365～370nm，紫外线强度 15000UW/cm²，光照时间5～10min。

优选地，步骤S5中所述挥尽乳液中的有机溶剂的具体操作为，将乳液放置在恒温振荡器中，恒温振荡的温度为37℃，转速50～200r/min，直至挥尽乳液中的有机溶剂。

本发明的第二个目的是提供前述方法制备得到的结肠靶向微囊。

优选的，所述微囊包括内核和囊壳，所述所述微囊粒径为150～300μm，囊壳厚20～100μm。

本发明的第三个目的是提供前述结肠靶向微囊在制备结肠靶向口服蛋白质的药物和/或食品中的应用。

优选地，所述结肠靶向口服蛋白质的药物和/或食品能够在胃部和小肠保护包封的蛋白的结构与活性并在结肠部位特异性释放包封的蛋白。所述蛋白为水溶性小分子多肽或具有二维及以上结构的水溶性蛋白。

本发明的有益效果：

(1)本发明以改性壳聚糖和乙基纤维素作为主要材料，制备具有核壳结构的酶-时间依赖型结肠递送系统。改性壳聚糖和乙基纤维素具有良好的生物相容性和可降解性，且制备简单，材料价廉易得，可以满足食品口服材料的要求，有应用潜力；

(2)改性壳聚糖在pH 4-9之间具有良好水溶性，并且具有原位光固化形成凝胶的能力，比传统离子交联的壳聚糖稳定，比化学交联剂交联的壳聚糖安全，更符合微流控技术一步制备双乳液并同时固化内外层的需求；

(3)改性壳聚糖和乙基纤维素制备的微囊可抵抗胃酸和肠道中的酶，但是能够被结肠菌群产生的酶特异性降解，可保护包埋的蛋白的结构与活性并实现结肠定位释放，能够用于制备结肠靶向口服蛋白质的药物和/或食品；

(4)本发明采用微流体技术，无需高压和高强度机械力，装置简单，制备条件温和，不会对蛋白结构造成影响，并且具有可连续性，可精确设计与控制微囊结构，可一步制备双乳液，具有商业化价值。

附图说明

附图1为本发明微囊制备过程示意图，其中W₁为内相溶液，O为中间相溶液，W₂为连续相溶液；

附图2为本发明玻璃微流体装置实拍图与装置细节图，其中1为内相毛细管，2为收集管， 3为进样针头，4为方管，a内相毛细管尖端内径40-80μm，b收集管尖端内径150-400μm，c 两管间距200-400μm；

附图3为壳聚糖与改性壳聚糖的红外光谱图，其中，CS为壳聚糖，UV-CS为改性壳聚糖。

附图4为改性壳聚糖的氢谱图；

附图5为pH对壳聚糖与改性壳聚糖溶液浊度的影响结果图，其中，CS为壳聚糖，UV-CS 为改性壳聚糖；

附图6为改性壳聚糖的生物相容性结果图；

附图7为微囊制备过程图，其中图7A为乳液的生成过程，图7B为生成的乳液，图7B图中比例尺为0.5mm；

附图8为微囊粒径分布图；

附图9为微囊扫面电镜图，其中图9A为中间相为5％的乙基纤维素制备的微囊，图9A-a 为微囊表面局部放大图，图9B为中间相为7％的乙基纤维素制备的微囊，图9B-b为微囊表面局部放大图，其中图9A和图9B图中比例尺为100μm(0.1mm)，图9A-a和图9B-b图中比例尺为20μm；

附图10为微囊中蛋白分布情况图，其中，图10a为上清液的荧光图，图10b为空白微囊的荧光图，图10c为含极微量荧光蛋白的微囊的荧光图，图10d为含1％荧光蛋白的微囊的荧光图，图中比例尺均为0.2mm；

附图11为微囊稳定性结果图，其中，图11A为微囊在胃肠液中粒径随时间变化的结果图，图11B为微囊在胃肠液中随时间累积释放蛋白的结果图；

附图12为微囊的体外释放结果图，其中图12a为微囊被胃液处理2h后的外观形态图，图 12b为微囊被胃液处理2h后，继续被肠液处理4h后的外观形态图，图12c为微囊被胃液处理 2h后，继续被肠液处理4h后，又继续被结肠液处理6h后的外观形态图；

附图13为蛋白结构表征图，其中，图13( a) 为蛋白的凝胶电泳结果图，图13( b)为蛋白的红外光谱图，图13( c) 为蛋白的荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的内容作进一步解释。给出这些实施例仅为更好地理解本发明，而非限制本发明的范围。

仪器与材料

实验材料：

壳聚糖(脱乙酰度≥95％，粘度100～200mPa·s，上海麦克林生化科技有限公司)；2-甲基丙烯酸酐(95％，萨恩化学技术上海有限公司)；2-羟基-2-甲基苯丙酮(98％，萨恩化学技术上海有限公司)；乙基纤维素(粘度40～100mPa·s，上海源叶生物科技有限公司)；聚乙烯醇 1788型(醇解度87.0～89.0％，上海麦克林生化科技有限公司)；牛血清白蛋白第五组份(BR， 98％)；β-葡萄糖苷酶(10-30U/mg，来自杏仁，上海麦克林生化科技有限公司)；BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)；MTT细胞增殖检测试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)；SDS-PAGE试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；玻璃毛细管(北京中成石英玻璃制品有限责任公司)；方形管(北京中成石英玻璃制品有限责任公司)；18G点胶针头(苏州名宇电子)；AB胶(美国Devcon公司)。

实验仪器

PC-100拉针仪(日本Narishige公司)；EG-401磨针仪(日本Narishige公司)；ICX41显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；2F04M高速相机(合肥富煌君达高科信息技术有限公司)；TYD01-01-CE注射泵(保定雷弗流体科技有限公司)；FDU-1110冷冻干燥机(东京理化器械株式会)；ZD-85恒温振荡器(常州国华电器有限公司)；SL8104紫外灯(深圳市荧鸿科技有限公司)；S-3400N扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)；UV-1800紫外可见光分光光度计(日本shimadzu公司)；FT/IR-4100型傅里叶变换红外光谱仪(日本JASCO公司)。

实施例1：玻璃微流体装置的搭建

玻璃微流体装置为自制一步法制备双乳液装置，包括内相毛细管、收集管、方形管和两个进样针头；使用拉针仪将适宜长度的毛细管(外径960μm，内径550μm)烧拉成两根具有尖端的毛细管，使用磨针仪将两根毛细管打磨至尖端口径分别为20～100μm，150～400μm，作为内相毛细管和乳液收集管。具体的，内相毛细管的尖端口径为60μm，收集管的尖端口径为350 μm，方形管外径1.4mm，内径1.1mm，将方形管固定于载玻片中心位置，将内相毛细管尖端插入方形管中间位置，内相进液毛细管另一端伸出载玻片2cm左右，插入不锈钢管作为保护。收集管尖端从方形管另一端插入，距内相毛细管尖端350μm，收集管另一端伸出载玻片2cm 左右，插入不锈钢管作为保护。使用AB胶固定两根毛细管，然后在方形管两端安装烫制好的进样针头，用AB胶固定并密封，待胶完全固化，玻璃微流体装置搭建完成，如图2所示。整个操作过程在倒置显微镜平台上进行，确保两根毛细管在方形管的中心线上。

实施例2：改性壳聚糖的制备与表征

(1)改性壳聚糖的制备

称取1.0g壳聚糖置于250mL圆底烧瓶中，加入99mL超纯水，磁力搅拌下，加入1mL乙酸，至壳聚糖完全溶解后，加入2-甲基丙烯酸酐溶液1～5mL，60℃，1000r/min反应10h，反应液冷却至室温，用饱和Na₂CO₃水溶液调pH至7.0，反应液装入3.5K纤维素透析袋中，纯水环境下透析72h除去反应液中小分子物质，最后将溶液冷冻干燥获得白色海绵状物质即为改性壳聚糖。

(2)傅立叶红外光谱分析

利用红外光谱分析改性壳聚糖的化学结构，400～4000cm^-1范围内扫描改性和未改性壳聚糖的固体样品，获得其FT-IR光谱。如图3所示：未改性壳聚糖(CS)，1：3400cm-1左右，是壳聚糖形成氢键缔合的-OH伸缩振动吸收峰与-NH的伸缩振动吸收峰重叠而增宽的多重吸收峰。2：2928与3：2974cm^-1左右，是C-H的两个伸缩振动吸收峰。4：1655cm^-1左右，是酰胺Ⅰ吸收峰。5：1602cm^-1左右，是酰胺Ⅱ吸收峰。6-1420cm^-1左右，是＝CH₂弯曲和-CH₃变形吸收峰。7：1376cm^-1左右，是C-H弯曲和-CH₃对称变形振动吸收峰。8：1321cm^-1左右，是酰胺III吸收峰。9：900cm^-1左右，是β-D-构型峰。改性壳聚糖(UV-CS)，由于氨基上的取代反应，分子内氢键被破坏，N–H弯曲振动的变化影响酰胺II的强度，并移动到较低波数，并在946cm^-1附近出现甲基丙烯酸盐C＝C的特定峰。

(3)核磁共振氢谱分析

核磁氢谱分析改性壳聚糖的分子结构，如图4所示：化位移在5.35ppm，5.56ppm处有明显的信号峰，即为乙烯基质子峰(CH₂)，说明壳聚糖的氨基与酸酐发生了N-酰化反应，引入了双键。2.5～4.1ppm处为单糖氨基葡萄糖的环质子峰(CH-CH-CH-CH₂)。甲基丙烯酰基取代度通过氢谱中的2.50～4.1ppm的积分面积与5.35ppm，5.56ppm处的积分面积相比计算得到的，甲基丙烯酰基取代度为10.9～31.8％

(4)pH对壳聚糖、改性壳聚糖溶解度的影响

分别将50mg壳聚糖和改性壳聚糖溶解在5mL 1％(v/v)的乙酸水溶液中制备聚合物溶液，初始pH为4。加入NaOH溶液(0.1mol/L)以逐步提高pH值，并使用UV-1800紫外可见光分光光度计在400nm处测量聚合物分散体的浊度值。如图5所示：壳聚糖仅在微酸条件下溶解，溶液在pH达到6.5之前保持透明，随着pH的进一步增加会导致浊度的急剧增加。改性壳聚糖溶液在pH 4～9范围内溶液一直保持清透状态，浊度无显著变化，说明改性壳聚糖相比壳聚糖，既可以包封在酸性条件下溶解的蛋白，也可包封中性与碱性条件下溶解的蛋白。

(5)改性壳聚糖的生物相容性

将改性壳聚糖溶于1640完全培养液中，配制浓度分别为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg的改性壳聚糖溶液。将培养好的人结肠癌细胞HT29以密度为10000个/孔接种到96孔板中，置于5％CO₂培养箱培养24h。细胞贴壁生长后，吸出培养基，加入100μL不同浓度的改性壳聚糖溶液。空白组加入100μL培养液作为对照，继续培养细胞12h。然后用MTT法检测细胞活力，得到细胞存活率如图6所示：改性壳聚糖对结肠癌细胞HT29不存在生殖抑制作用，具有优异的生物相容性。

实施例3：微囊的制备

(1)三相溶液的配制

将实施例2所得改性壳聚糖溶于1％(v/v)的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制得浓度(w/v) 为1％、1.5％、2％(w/v)的改性壳聚糖水溶液。然后向改性壳聚糖水溶液中滴加1mol/L的 NaOH溶液，调pH至7.0，以牛血清白蛋白作为模型蛋白，将牛血清白蛋白加入改性壳聚糖溶液中搅拌至完全溶解，蛋白浓度(w/v)为1％、5％、10％、15％，再加入2-羟基-2-甲基苯丙酮，浓度为0.1％(v/v)，强力搅拌至分散均匀，静置去除气泡，制得含蛋白和芯材的内相水溶液；将乙基纤维素加入二氯甲烷中，密闭避光静置至乙基纤维素完全溶解，乙基纤维素浓度 (w/v)为1％、3％、5％、7％、10％，制得含壁材的中间相溶液；将聚乙烯醇1788加入纯水中，80℃搅拌至完全溶解，聚乙烯醇浓度(w/v)为1％、3％、5％、7％、9％，制得含表面活性剂的连续相水溶液。

(2)乳液的制备

将内相水溶液吸入5mL的一次性无菌医用注射器中，将中间相溶液吸入10mL无胶塞pp 注射器中，将连续相水溶液吸入20mL一次性无菌医用注射器中，将三相溶液的注射器分别固定于三台精密注射泵上以提供动力，使用聚四氟乙烯软管连接注射器与实施例1所得玻璃微流体装置的进样口。具体的，内相溶液由内相毛细管流入方形管，进而流入收集管；中间相溶液通过方形管上位于内相毛细管一侧的进样针头进入方形管，进而流入收集管；连续相溶液通过方形管上位于收集管一侧的进样针头进入方形管，进而流入收集管；三相溶液以不同流速泵入玻璃微流体装置的方形管中，具体的，内相流速为5μL/min，中间相流速为30μL/min，外相流速为200μL/min。如图7所示：在方形管中，三相溶液交汇，流体相互剪切形成W/O/W 乳液，进而流入收集管。通过调节三相溶液的流速来调节微囊的粒径与囊壳厚度。

(3)乳液的固化

W/O/W乳液收集至装有连续相溶液的圆底烧瓶中，使用紫外光源照射5分钟，内水相固化形成水凝胶微球，然后将圆底烧瓶放入恒温振荡器中，37℃恒温振荡2h，使溶剂二氯甲烷完全挥发，乙基纤维素壁层固化，制得固化好的微囊。将固化好的微囊用纯水洗涤多次以洗去表面的聚乙烯醇。将微囊置于-20℃冰箱中冻实，然后放入冷冻干燥机中真空干燥过夜，制得结肠定位释放蛋白的微囊。

实施例4：微囊的表征

(1)微囊粒径与粒貌的表征

通过显微镜配套CCD相机自带测量软件测量乳液的内核粒径与干燥后微囊的外径。乳液的内核粒径为200μm，干燥后微囊粒径分布如图8所示：微囊粒径约为260μm。制备的微囊尺寸均一，单分散性好，重复性高。

1％、3％的乙基纤维素不能形成完整的囊壳，以渔网状结构附着在内核凝胶微球上，10％的乙基纤维素溶液粘度过大，不易于打入微流体装置中，5％与7％的乙基纤维素可以形成完整的囊壳。通过扫面电子显微镜表征微囊的粒貌，如图9所示：微囊在冻干后均保持了完整球型形态，a：5％乙基纤维素形成的微囊壳表面多孔，b：7％乙基纤维素形成的微囊壳较为致密，表面存在溶剂挥发留下的痕迹。

(2)微囊的包封率与载药量

将1g牛血清白蛋白溶于5mL Na₂CO₃缓冲液(pH＝9.5)中，将30mg异硫氰酸荧光素酯溶于5mL Na₂CO₃缓冲液中(含少量乙醇)，然后将异硫氰酸荧光素酯溶液缓慢滴加到牛血清白蛋白溶溶液中，4℃避光搅拌反应12h，然后将反应液装入3.5K纤维素透析袋中，避光纯水环境下透析，直至纯水不再有颜色。将透析袋中溶液冷冻干燥制得荧光蛋白。将荧光蛋白作为模型蛋白，按照实施例3的方法进行包埋，制得微囊在倒置荧光显微镜下观察(激发波长496nm)，如图10所示：空白微囊没有荧光，包埋荧光蛋白的微囊有强烈荧光(绿色)，并且上清液检测到没有荧光蛋白，说明蛋白被有效包埋在微囊中。

使用BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，建立蛋白浓度标准曲线如下：

以连续相溶液做溶剂：Y＝0.0068X+0.1899 R²＝0.9992

通过检测连续相中蛋白的含量与干燥后的微囊质量，由以下公式计算得到包封效率与载药量。

包封率(EE)计算公式：

载药率(LC)计算公式：

其中，

M：加入蛋白的总质量

m：游离在连续相中的蛋白质量

w：干燥后微球的质量

当乙基纤维素使用浓度为7％时，牛血清白蛋白的浓度从1％增加到15％，载药量从2.3％增加至25.86％，包封率由99.75％下降到74.5％。

(3)微囊的稳定性与体外释放

按照药典标准，制备pH1.2的模拟胃酸溶液(不含酶)，pH6.8的模拟小肠液(不含酶)以及pH7.4的模拟结肠液(β-葡萄糖苷酶5U/mL)，使用BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，建立蛋白浓度标准曲线如下：

a以模拟胃液作为溶剂：

Y＝0.0039X+0.1203 R²＝0.9991

b以模拟小肠液作为溶剂：

Y＝0.0044X+0.1321 R²＝0.9995

c以模拟结肠液作为溶剂：

Y＝0.0058X+0.3404 R²＝0.9992

为研究所制备微囊在胃肠道中是否稳定，将10mg微囊分别分散于20mL模拟胃液，模拟小肠液中，37℃恒温振荡，分别在1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h，检测溶液中牛血清白蛋白含量并检测微囊粒径。如图11所示：A：微囊在模拟胃液和模拟肠液中仅有略微溶胀＜ 10μm；B ：微囊在胃液中12h累积释放量约16％，在肠液中12h累积释放量约23.5％。说明本发明制备的微囊在胃肠液中稳定，能够有效包封模型蛋白。

为研究所制备微囊体外释放情况，将50mg微囊置于模拟胃液中处理2h，然后将其转移至模拟小肠液中处理4h，最后将微囊转移至模拟结肠液中处理12h。将微囊在恒温摇床上 37℃，150rpm连续搅拌，每1小时取样检测。如图12所示：蛋白在胃和小肠液中有少量的释放，在结肠液中蛋白大量释放，18h累积释放量＞70％。微囊在胃肠液中形态保持稳定，在结肠液中发生降解，说明本发明制备的微囊可以实现结肠定位释放包封的蛋白，具有结肠靶向功能。

(4)微囊中蛋白的结构表征

为研究所制备微囊是否能保护蛋白不受胃肠液的影响而失活降解，将微囊置于模拟胃液 (含酶)中处理2h，然后将其转移至模拟小肠液(含酶)中处理4h，分离微囊，用纯水洗涤三次，研磨破碎，置于纯水中，涡旋加速蛋白的释放，得到微囊释放的蛋白溶液。调整蛋白溶液的浓度，利用SDS-PAGE凝胶电泳表征蛋白的分子量，如图13(a)所示：胃肠液处理后微囊中的蛋白分布条带与原料蛋白一致，不存在降解。将微囊释放的蛋白溶液冻干，利用红外光谱分析蛋白的二级结构是否发生改变，如图13(b)所示：胃肠液处理后微囊中的蛋白的红外光谱与原料蛋白谱图一致，二级结构未发生改变。调整蛋白溶液的浓度，利用内源荧光是检测蛋白的三级结构，如图13(c)所示：在280nm激发波长下，胃肠液处理后微囊中的蛋白的荧光谱图与原料蛋白谱图一致，三级结构未发生改变，而直接经过胃酸(不含酶)处理的原料蛋白最大衍射波长发生蓝移，荧光强度减弱明显。说明本发明制备的微囊能够保护包埋的蛋白不受胃肠液的影响而失活降解，具有良好的保护效果。

Claims (17)

1.应用微流体技术制备结肠靶向微囊的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，将改性壳聚糖溶于乙酸水溶液中，调pH至7.0，然后将光引发剂、模型蛋白溶于其中，制得内相溶液；所述改性壳聚糖为甲基丙烯酰胺壳聚糖，所述改性壳聚糖的甲基丙烯酰基取代度为10%~40%；步骤S1中所述内相溶液中，改性壳聚糖含量为1%~2%；

步骤S2，将乙基纤维素溶于二氯甲烷中，制得中间相溶液；

步骤S3，将聚乙烯醇溶于纯水中，制得连续相溶液；

步骤S4，将步骤S1获得的内相溶液包裹在步骤S2获得的中间相溶液的液滴中，所述液滴分散在步骤S3获得的连续相溶液中，一步制备W/O/W乳液；

所述W/O/W乳液的制备是通过玻璃微流体装置制备得到的，所述玻璃微流体装置为自制一步法制备双乳液装置 ，包括内相毛细管、收集管、方形管和两个进样针头；将内相毛细管尖端插入方形管，收集管尖端从方形管另一端插入，收集管尖端距内相毛细管尖端200~400 μm，进样针头分别固定在方形管两端；内相溶液由内相毛细管一端流入方形管，进而流入收集管；中间相溶液通过方形管上位于内相毛细管一侧的进样针头进入方形管，进而流入收集管；连续相溶液通过方形管上位于收集管一侧的进样针头进入方形管，进而流入收集管；

三种溶液的流速分别为：内相溶液流入方形管的流速为1~10 μL/min，中间相溶液流入方形管的流速为15~50 μL/min，连续相溶液流入方形管的流速为100~500 μL/min；

步骤S5，用紫外光照射步骤S4获得的W/O/W乳液，使W/O/W乳液中的内相固化成球状内核；挥尽乳液中的有机溶剂，使中间相固化成囊壳，形成包括内核和囊壳的微囊，所述模型蛋白包封在内核中；

步骤S6，将步骤S5固化后的微囊用纯水洗涤多次，冷冻干燥，获得所述结肠靶向微囊；

所述中间相溶液中乙基纤维素含量为5%~7%；

步骤S3中所述连续相溶液聚乙烯醇含量为1%~9%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中乙酸水溶液中乙酸浓度为0.5~3%。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S1中所述乙酸水溶液中乙酸浓度为1%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中所述光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中所述内相溶液中，光引发剂含量为0.1%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中所述模型蛋白为水溶性小分子多肽或具有二维及以上结构的水溶性蛋白；步骤S1中所述内相溶液中，蛋白含量为1%~20%。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2中所述乙基纤维素的粘度为40~100mPa·s。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3中所述聚乙烯醇为1788型。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述内相毛细管外径960 μm，内径550 μm，尖端口径20~100 μm；收集管外径960 μm，内径550 μm，尖端口径150~400 μm；方形管外径1.4 mm，内径1.1 mm。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：进样针头为18G点胶针头。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4中将W/O/W乳液收集在S3制备得到的连续相溶液中。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5中紫外光照射条件为：紫外光峰值波长365~ 370 nm，紫外线强度15000 μW/cm²，光照时间5~10min。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5中所述挥尽乳液中的有机溶剂的具体操作为，将乳液放置在恒温振荡器中，恒温振荡的温度为37℃，转速50~200 r/min，直至挥尽乳液中的有机溶剂。

14.权利要求1至13中任意一条权利要求所述的方法制备得到的结肠靶向微囊。

15.根据权利要求14所述的结肠靶向微囊，其特征在于，所述结肠靶向微囊粒径为150~300 μm，壳厚20~100 μm。

16.权利要求14所述的结肠靶向微囊在制备结肠靶向口服蛋白质的药物和/或食品中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：所述结肠靶向口服蛋白质的药物和/或食品能够在胃部和小肠保护包封的蛋白的结构与活性并在结肠部位特异性释放包封的蛋白。

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