CN102626602B - 一种以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其工艺步骤：(1)配制分散相和连续相流体；(2)分别将分散相和连续相流体注入微流体装置的不同进液口，形成单分散的油包水单乳；(3)方法1：对苯二甲醛的量在连续相流体中的浓度为0.0005～0.002g/ml时，将单分散的油包水单乳通过输出管引入收集容器，使其在收集容器中静置8～24h，即形成壳聚糖核壳微囊；方法2：当对苯二甲醛的量在连续相流体中的浓度为0.002～0.005g/ml时，将单分散的油包水单乳通过输出管引入盛有大豆油的收集容器，在大豆油中于常压、室温静置交联30min～1h，即形成壳聚糖微囊；(4)壳聚糖微囊用异丙醇洗涤除去外部油相，再用去离子水洗涤除去异丙醇。
Description
技术领域
本发明属于壳聚糖微囊制备领域，特别涉及一种利用微流控装置制备单分散性的油包水乳液，并以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法。
背景技术
壳聚糖(Chitosan，CS)由天然甲壳素(Chitin)部分脱乙酰化而得到，是由2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键聚合形成的唯一聚阳离子型生物多糖。壳聚糖具有很多优良的生物相容性、生物可降解性、无细胞毒性和优良的成膜性等。且壳聚糖分子链上富有可质子化的氨基，当环境的pH发生变化时，基于壳聚糖的水凝胶会随之发生体积相变或溶解，从而可以调节固载在凝胶基质中的药物分子的释放和用于一些酶活性或细胞的定向筛选。壳聚糖的上述性质在感应环境pH变化的智能化药物载体研究和酶或细胞的高通量筛选方面具有良好的应用前景。
常用的壳聚糖微囊制备方法有静电层状组装法、凝聚法、喷雾干燥法和壳聚糖涂层法等。这些传统方法操作步骤比较繁琐，且制备出的壳聚糖微囊普遍存在粒径分布不均匀、机械强度差以及有毒溶剂残留等缺点，限制了壳聚糖微囊的应用。近年来，膜乳化-交联技术的迅速发展，为单分散乳液的制备提供了有效的解决方法，但膜乳化技术操作复杂，如制备微囊时需要两步交联和去除内核等操作，且膜乳化技术制得的壳聚糖微囊的单分散性都在10％以上，限制了微囊的一些应用，如通过流式细胞仪检测微囊内的细胞存活率较大颗的微囊就难以通过。
微流控技术是指利用尺寸为数十到数百微米的通道对微小体积流体进行操控的技术。微流控技术的发展为制备各种粒径的单分散乳液提供了简单有效的方法。目前以微流控技术制备的乳液为模板合成微囊的方法主要集中在以复乳为模板(如制备油包水包油乳液，内相油相中的交联剂扩散至溶有壳聚糖的水相进行交联成囊)，此种方法不仅需要较为复杂的两级微流控装置，且制备复乳需要非常精确的控制，及制备的复乳尺寸较大，一般在200μm以上。
发明内容
本发明的目的是提供一种以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，此种方法不仅工艺简单，成囊条件温和，节省原料，而且可获得粒径更小的微囊。
本发明所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，工艺步骤如下：
(1)配制分散相和连续相流体
分散相流体的配制：以水溶性壳聚糖、羟乙基纤维素和去离子水为原料，在常压、室温(室内自然温度)下将水溶性壳聚糖、羟乙基纤维素加入去离子水中搅拌均匀形成混合液，当水溶性壳聚糖和羟乙基纤维素溶解后用氢氧化钠水溶液调节所述混合液的pH值至6.0～6.7，即形成分散相流体，水溶性壳聚糖的量以分散相流体中其浓度达到0.02～0.04g/ml为限，羟乙基纤维素的量以分散相流体中其浓度达到0.005～0.01g/ml为限；
连续相流体的配制：以对苯二甲醛、聚甘油蓖麻醇三酯、大豆油为原料，在常压、室温(室内自然温度)下将对苯二甲醛和聚甘油蓖麻醇三酯加入大豆油中搅拌均匀形成混合液，当对苯二甲醛和聚甘油蓖麻醇三酯溶解后，即形成连续相流体，对苯二甲醛的量以连续相流体中其浓度达到0.0005～0.005g/ml为限，聚甘油蓖麻醇三酯的量以连续相流体中其浓度达到0.01～0.04g/ml为限；
(2)制备油包水乳液
将步骤(1)配制的分散相流体、连续相流体分别由与注射泵连接的注射器注入微流体装置的不同进液口，在所述微流体装置中形成单分散的油包水乳液，所述分散相流体的流量QA＝50～500μL/h，所述连续相流体的流量QB＝500～2500μL/h；
(3)收集乳液并形成微囊
方法1：将步骤(2)形成的油包水乳液通过与微流体装置连接的输出管引入收集容器，在常压、室温静置交联8～24h，即形成壳聚糖微囊；
或方法2：将步骤(2)形成的油包水乳液通过与微流体装置连接的输出管引入盛有大豆油的收集容器，在大豆油中于常压、室温(室内自然温度)静置交联30min～1h，即形成壳聚糖微囊；
(4)洗涤
将步骤(3)形成的壳聚糖微囊用异丙醇洗涤除去外部油相，再用去离子水洗涤除去异丙醇。
上述方法中，当用步骤(3)中的方法1形成壳聚糖微囊时，对苯二甲醛的量在连续相流体中的浓度优选0.0005～0.002g/ml；当用步骤(3)中的方法2形成壳聚糖微囊时，对苯二甲醛的量在连续相流体中的浓度优选0.002～0.005g/ml。
上述方法中，配制分散相时，优选脱乙酰度为85％、重均分子量Mw≤5000g/mol的水溶性壳聚糖。
上述方法中，与微流体装置连接的输出管的长度优选10～50cm。
使用本发明所述方法，可得到粒径小于50μm的壳聚糖微囊。
本发明所述方法可使用各种类型的微流体装置，优选使用下述结构的简易微流体装置：
所述简易微流体装置，包括载玻片、下盖玻片、上盖玻片、注射针头；下盖玻片的数量至少为三片，各下盖玻片相隔一间距固定在载玻片上形成相互贯通的微流通道，上盖玻片覆盖所述下盖玻片形成的微流通道并固定在下盖玻片上，微流通道的进液口至少为两个，微流通道的出液口为一个；注射针头的数量与微流通道进液口的数量相同，分别固定在微流通道的进液口处，微流通道的出液口处固定有输出管。
上述微流体装置，可用不同数量的下盖玻片形成多种形式的相互贯通的微流通道。例如，可将四片下盖玻片相隔一间距固定在载玻片上，形成相互贯通的“扩展喷嘴形”微流通道(见图3)。
上述微流体装置，构建步骤如下：
1、盖玻片构型：根据微流通道的设计形状，用玻璃刀把玻片划成下盖玻片、上盖玻片所需形状，然后用细砂纸把下盖玻片、上盖玻片边缘打磨光滑，下盖玻片的尺寸通常为：18×18mm、20×20mm和24×24mm，厚度为：120～170μm；
2、清洗载玻片和盖玻片：首先用去离子水对载玻片和已构型的盖玻片进行清洗，然后将载玻片和盖玻片放入食人鱼溶液(98％H2SO4和30％H2O2按7；3的体积比配制)中，在常压、室温浸泡至少30min，以除去表面的污渍便于粘胶水；
3、粘接下盖玻片和上盖玻片：用紫外光固化胶(UV胶)将经食人鱼溶液处理后的下盖玻片按微流通道的设计尺寸和形状粘接到一片载玻片上，并置于照紫外灯下照射2min使UV胶固化，然后将一片上盖玻片涂覆UV胶后覆盖所述下盖玻片形成的微流通道并放置在下盖玻片上，继后用紫外灯下照射2min使UV胶固化；
4、粘接针头和输出管：用环氧树脂胶水将注射针头和输出管分别粘接在微流通道的进口处和出口处。
本发明所述方法通过微流控技术制备出单分散的油包水(W/O)乳液，当乳液形成后，油相中的对苯二甲醛扩散至乳液的油水界面和壳聚糖发生由外向内的交联反应形成席夫碱结构，最终将壳聚糖水相固化形成微囊(见图1)。由于壳聚糖和对苯二甲醛形成的席夫碱结构在酸性条件下会被破坏，所以本发明制备出的壳聚糖微囊在酸性条件下会发生分解，这种特性可以广泛的用于细胞或酶的筛选以及pH响应型的靶向送药系统。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述壳聚糖微囊的制备方法以单乳为模板，不仅工艺简单，生产效率较高，而且可节约试剂的用量，有利于工业化生产。
2、本发明所述壳聚糖微囊的制备方法，未使用任何有毒原料和试剂，因而对操作者不会造成损害，有利于环境保护。
3、本发明所述方法制备的壳聚糖微囊不仅具有很好的单分散性和球形度，而且尺寸较小(＜50μm)，在智能化药物载体研究和酶或细胞的高通量筛选方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明所述方法中壳聚糖微囊形成的交联示意图；
图2是本发明所述方法中使用的简易微流体装置的结构示意图；
图3是图2所述简易微流体装置的一种微流通道的示意图，该微流通道为“扩展喷嘴形”微流通道；
图4是简易微流体装置与注射泵、注射器和收集容器的一种组合示意图，注射针头的数量为三个，配套的注射泵、注射器均为三个；
图5是实施例1中油包水乳液的形成图，其中，(a)图为实验1中连续相流体的流量QB＝1000μL/h、分散相流体的流量QA＝500μL/h时的油包水乳液形成图，(b)图为实验2中连续相流体的流量QB＝1000μL/h、分散相流体的流量QA＝200μL/h时的油包水乳液形成图，(c)图为实验3中连续相流体的流量QB＝1000μL/h、分散相流体的流量QA＝50μL/h时的油包水乳液形成图，标尺为100μm；
图6是实施例1中的实验1所制备的油包水乳液的光学照片，制备油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h，连续相流体的流量QB＝1000μL/h，标尺为50μm；
图7是图6所示油包水乳液的粒径分布曲线；
图8是实施例1中的实验1所制备的壳聚糖微囊照片(形成油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)，其中，照片a)为油包水乳液交联后得到的壳聚糖微囊的光学照片，照片b)为所述壳聚糖微囊风干后的扫描电镜照片；
图9是实施例1中的实验1所制备的壳聚糖微囊风干后的激光共聚焦照片(形成油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)，从左向右依次为传输通道a)、荧光通道b)、叠加通道c)和对应的荧光强度曲线d)，标尺为50μm；
图10是实施例1中的实验2所制备的壳聚糖微囊照片(形成的油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)，其中，照片a)为油包水乳液交联后得到的壳聚糖微囊的光学照片，照片b)所述壳聚糖微囊风干后的扫描电镜照片；
图11是实施例1中的实验2所制备的壳聚糖微囊在水中的激光共聚焦照片(形成油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)，从左向右依次为传输通道a)、荧光通道b)、叠加通道c)，标尺为25μm；
图12是实施例1中的实验3所制备的壳聚糖微囊照片(形成的油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)，其中，照片a)为油包水乳液交联后得到的壳聚糖微囊的光学照片，照片b)所述壳聚糖微囊风干后的扫描电镜照片；
图13是实施例1中的实验3所制备的壳聚糖微囊风干后的激光共聚焦照片(形成油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)，从左向右依次为传输通道a)、荧光通道b)、叠加通道c)，标尺为25μm；
图14、图15、16、和图17是在激光共聚焦显微镜下观测的实施例2中油包水乳液的交联成囊过程(形成油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝500μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)，从图14至图17，其中，a)图表示交联程度逐渐增大，微囊囊壁逐渐增厚；b)图为交联过程相对应的荧光强度曲线；
图18是实施例3中的实验1所制备的壳聚糖微囊的光学照片(形成油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)；
图19是实施例3中的实验2所制备的壳聚糖微囊的光学照片(形成油包水乳液时，分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h)；
图20是实施例1所制备的壳聚糖微囊在滴加pH＝3的缓冲溶液后的溶解过程的荧光图片，标尺为50μm；
图21是实施例1所制备的壳聚糖微囊在滴加pH＝4的缓冲溶液后的溶解过程的荧光图片，标尺为50μm。
图中，1-大豆油、2-对苯二甲醛、3-壳聚糖、4-去离子水、5-油中微囊、6-水中微囊、7-载玻片、8-第一下盖玻片、9-环氧树脂胶、10-注射针头、11-第二下盖玻片、12-上盖玻片、13-第三下盖玻片、14-输出管、15-第四下盖玻片、16-第一微流通道、17-第二微流通道、18-第三微流通道、19-第四微流通道、20-注射泵、21-分散相注射器、22-连续相注射器、23-连接管、24-微流体装置、25-乳液、26-收集容器。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例对本发明所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法做进一步说明。
实施例1
本实施例中，以单乳为模板制备壳聚糖微囊的工艺步骤如下：
(1)配制分散相和连续相流体
分散相流体的配制：以水溶性壳聚糖(脱乙酰度为85％、Mw≤5000g/mol)、羟乙基纤维素(Mw＝500000g/mol)和去离子水为原料，在常压、室温(28℃)下将水溶性壳聚糖、羟乙基纤维素加入去离子水中并搅拌均匀形成混合液，当水溶性壳聚糖和羟乙基纤维素溶解后用浓度1mol/L的氢氧化钠水溶液调节所述混合液的pH值至6.0，即形成分散相流体，水溶性壳聚糖的量以分散相流体中其浓度达到0.02g/ml为限，羟乙基纤维素的量以分散相流体中其浓度达到0.01g/ml为限；
连续相流体的配制：以对苯二甲醛、聚甘油蓖麻醇三酯(PGPR90)、大豆油为原料，配制PGPR90在连续相流体中的浓度为0.04g/ml、对苯二甲醛在连续相流体中的浓度分别为0.0005g/ml、0.001g/ml和0.002g/ml的三种连续相流体；在常压、室温(28℃)下将对苯二甲醛和PGPR90加入大豆油中并搅拌均匀形成混合液，当对苯二甲醛和PGPR90溶解后，即形成连续相流体；
(2)制备油包水乳液
本实施例中，制备油包水乳液使用简易微流体装置，其结构如图2所示，包括载玻片7、下盖玻片、上盖玻片12、注射针头10；下盖玻片的数量为四片，由第一下盖玻片8、第二下盖玻片11、第三下盖玻片13和第四盖玻片15组成，各下盖玻片相隔一间距通过紫外光固化胶固定在载玻片7上形成四条相互贯通的“扩展喷嘴形”微流通道(见图3)，上盖玻片12覆盖所述下盖玻片形成的微流通道并通过紫外光固化胶固定在各下盖玻片上(见图3)；所述“扩展喷嘴形”微流通道的进液口为三个，分别设置在第一微流通道16上、第二微流通道17上、第三微流通道18上，所述“扩展喷嘴形”微流通道的出液口为一个，设置在第四微流通道19上，注射针头10的数量为三个，分别通过环氧树脂胶9固定在微流通道的三个进液口处，在所述微流通道的出液口处通过环氧树脂胶9固定有聚乙烯制作的输出管14。所述载玻片7的厚度为1.2mm，所述下盖玻片、上盖玻片的厚度为120～170μm，微流通道尺寸：第一微流通道16的水平投影为矩形，宽度为110μm，第二微流通道17的水平投影为矩形，宽度为150μm，第三微流通道18的水平投影为矩形，宽度为150μm，第四微流通道19的水平投影为梯形，与其它微流通道的汇交处宽度为50μm，微流通道的高度近似为下盖玻片的厚度，约为150μm。
本实施例中，对上述结构的微流体装置配备了三个注射泵20、一个分散相注射器21和两个连续相注射器22，分散相注射器21、连续相注射器22分别安装在三个注射泵上，通过连接管23将分散相注射器21、连续相注射器22分别与三个注射针头连接，形成如图4所示的组合体。
使用体积浓度10％的三甲基氯硅烷的正己烷溶液将上述微流体装置中的微流通道改性为疏水性通道
将步骤(1)配制的分散相流体、连续相流体由与注射泵20连接的注射器21、注射器22分别注入所述微流体装置24的不同注射针头10，在微流体装置中形成单分散的油包水乳液。
实验1：分散相流体中，水溶性壳聚糖的浓度为0.02g/ml，羟乙基纤维素的浓度为0.01g/ml；连续相流体中，PGPR90的浓度为0.04g/ml、对苯二甲醛的浓度为0.0005g/ml；分散相流体的流量调节范围为QA＝50～500μL/h，连续相流体的流量调节范围为QB＝500～2500μL/h；当分散相流体的流量QA＝500μL/h、200μL/h、50μL/h，连续相流体的流量QB＝1000μL/h时，乳液的形成过程分别如图5(a)、图5(b)和图5(c)所示；
实验2：分散相流体中，水溶性壳聚糖的浓度为0.02g/ml，羟乙基纤维素的浓度为0.01g/ml；连续相流体中，PGPR90的浓度为0.04g/ml、对苯二甲醛的浓度为0.001g/ml；分散相流体的流量调节范围为QA＝50～500μL/h，连续相流体的流量调节范围为QB＝500～2500μL/h；
实验3：分散相流体中，水溶性壳聚糖的浓度为0.02g/ml，羟乙基纤维素的浓度为0.01g/ml；连续相流体中，PGPR90的浓度为0.04g/ml、对苯二甲醛的浓度为0.002g/ml；分散相流体的流量调节范围为QA＝50～500μL/h，连续相流体的流量调节范围为QB＝500～2500μL/h；
(5)收集乳液并形成微囊
将实验1形成的油包水乳液通过输出管14引入收集容器26，在常压、室温(28℃)静置交联12h，即形成壳聚糖微囊，输出管14的长度为50cm，内径为1.2mm；
将实验2形成的油包水乳液通过输出管14引入收集容器26，在常压、室温(28℃)静置交联8h，即形成壳聚糖微囊，输出管14与实验1相同；
将实验3形成的油包水乳液通过输出管14引入收集容器26，在常压、室温(28℃)静置交联24h，即形成壳聚糖微囊，输出管14与实验1相同；
(6)洗涤
将步骤(4)形成的壳聚糖微囊用异丙醇反复洗涤以除去外部油相，然后将除去外部油相的壳聚糖微囊浸泡于去离子水中置换异丙醇，置换异丙醇的时间为24小时，其间，每两个时更换一次去离子水。
本实施例中，在实验1所述条件下，当分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h时：所形成的油包水乳液的光学照片如图6示，乳液的平均粒径为44μm，变异系数(CV)为4.63％，具有良好的单分散性，如图7所示；所制备的壳聚糖微囊在水中的光学照片如图8a)所示，明显呈现出核壳型微囊的结构；所制备的壳聚糖微囊风干后的扫描电镜照片如图8b)示，呈饼状，整体贴附在玻璃片上；所制备的壳聚糖微囊风干后的激光共聚焦照片如图9所示，微囊内部荧光强度弱于壁面。
在实验2所述条件下，当分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h时：所制备的壳聚糖微囊在水中的光学照片如图10a)所示，明显呈现出核壳型微囊的结构；所制备的壳聚糖微囊风干后的扫描电镜照片如图10b)所示，微囊呈饼状，整体贴附在玻璃片上；所制备的壳聚糖微囊风干后的激光共聚焦照片如图11所示，呈现中空微囊结构。
在实验3所述条件下，当分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h时：所制备的壳聚糖微囊在水中的光学照片如图12a)所示，呈现圆球状结构；所制备的壳聚糖微囊风干后的扫描电镜照片如图12b)所示，微囊中间下陷，可知其不是实心结构；所制备的壳聚糖微囊风干后的激光共聚焦照片如图13所示，可看出微囊内部大部分已发生交联。
实施例2
本实施例中，以单乳为模板制备壳聚糖微囊的工艺步骤如下：
(1)配制分散相和连续相流体
分散相流体的配制：以水溶性壳聚糖(脱乙酰度为85％、Mw≤5000g/mol)、羟乙基纤维素(Mw＝500000g/mol)和去离子水为原料，在常压、室温(20℃)下将水溶性壳聚糖、羟乙基纤维素加入去离子水中并搅拌均匀形成混合液，当水溶性壳聚糖和羟乙基纤维素溶解后用浓度1mol/L的氢氧化钠水溶液调节所述混合液的pH值至6.6，即形成分散相流体，水溶性壳聚糖的量以分散相流体中其浓度达到0.04g/ml为限，羟乙基纤维素的量以分散相流体中其浓度达到0.005g/ml为限；
连续相流体的配制：以对苯二甲醛、聚甘油蓖麻醇三酯(PGPR90)、大豆油为原料，在常压、室温(20℃)下将对苯二甲醛和PGPR90加入大豆油中并搅拌均匀形成混合液，当对苯二甲醛和PGPR90溶解后，即形成连续相流体，所述GPR90在连续相流体中的浓度为0.04g/ml，所述对苯二甲醛在连续相流体中的浓度为0.005g/ml；
(3)制备油包水乳液
本实施例中使用的微流体装置和微流通道改性方法与实施例1相同。对微流体装置配备了三个注射泵20、一个分散相注射器21和两个连续相注射器22，分散相注射器21、连续相注射器22分别安装在三个注射泵上，通过连接管23将分散相注射器21、连续相注射器22分别与三个注射针头连接，形成如图4所示的组合体；
将步骤(2)配制的分散相流体、连续相流体由与注射泵20连接的注射器21、注射器22分别注入所述微流体装置24的不同注射针头10，在微流体装置中形成单分散的油包水乳液，所述分散相流体的流量QA＝500μL/h，连续相流体的流量QB＝1000μL/h；
(4)收集乳液并观测微囊的形成过程
将步骤(3)形成的油包水乳液通过与微流体装置连接的输出管14直接引到干净的载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察所述乳液的交联过程，其交联过程和相应的荧光强度曲线如图14、图15、图16和图17所示，荧光层厚度从外向内逐渐增厚，说明交联反应从外向内逐渐进行。
实施例3
本实施例中，以单乳为模板制备壳聚糖微囊的工艺步骤如下：
(1)配制分散相和连续相流体
分散相流体的配制：以水溶性壳聚糖(脱乙酰度为85％、Mw≤5000g/mol)、羟乙基纤维素(Mw＝500000g/mol)和去离子水为原料，在常压、室温(25℃)下将水溶性壳聚糖、羟乙基纤维素加入去离子水中并搅拌均匀形成混合液，当水溶性壳聚糖和羟乙基纤维素溶解后用浓度1mol/L的氢氧化钠水溶液调节所述混合液的pH值至6.7，即形成分散相流体，水溶性壳聚糖的量以分散相流体中其浓度达到0.04g/ml为限，羟乙基纤维素的量以分散相流体中其浓度达到0.005g/ml为限；
连续相流体的配制：以对苯二甲醛、聚甘油蓖麻醇三酯(PGPR90)、大豆油为原料，配制GPR90在连续相流体中的浓度为0.01g/ml、对苯二甲醛在连续相流体中的浓度分别为0.002g/ml和0.005g/ml的两种连续相流体；在常压、室温(25℃)下将对苯二甲醛和PGPR90加入大豆油中并搅拌均匀形成混合液，当对苯二甲醛和PGPR90溶解后，即形成连续相流体；
(3)制备油包水乳液
本实施例中使用的微流体装置和微流通道改性方法与实施例1相同。对微流体装置配备了三个注射泵20、一个分散相注射器21和两个连续相注射器22，分散相注射器21、连续相注射器22分别安装在三个注射泵上，通过连接管23将分散相注射器21、连续相注射器22分别与三个注射针头连接，形成如图4所示的组合体。
将步骤(2)配制的分散相流体、连续相流体由与注射泵20连接的注射器21、注射器22分别注入所述微流体装置24的不同注射针头10，在微流体装置中形成单分散的油包水乳液。
实验1：分散相流体中，水溶性壳聚糖的浓度为0.04g/ml，羟乙基纤维素的浓度为0.005g/ml；连续相流体中，PGPR90的浓度为0.01g/ml、对苯二甲醛的浓度为0.002g/ml；分散相流体的流量调节范围为QA＝50～500μL/h，连续相流体的流量调节范围为QB＝500～2500μL/h；
实验2：分散相流体中，水溶性壳聚糖的浓度为0.04g/ml，羟乙基纤维素的浓度为0.005g/ml；连续相流体中，PGPR90的浓度为0.01g/ml、对苯二甲醛的浓度为0.005g/ml；分散相流体的流量调节范围为QA＝50～500μL/h，连续相流体的流量调节范围为QB＝500～2500μL/h；
(4)收集乳液并形成微囊
将实验1形成的油包水乳液通过与微流体装置连接的输出管14引入盛有50ml大豆油的收集容器20，在常压、室温(25℃)静置交联1h，即形成壳聚糖微囊，输出管14的长度为10cm，内径为1.2mm；
将实验2形成的油包水乳液通过与微流体装置连接的输出管14引入盛有50ml大豆油的收集容器20，在常压、室温(25℃)静置交联30min，即形成壳聚糖微囊，输出管14与实验1相同；
(5)洗涤
将步骤(4)形成的壳聚糖微囊用异丙醇反复洗涤以除去外部油相，然后将除去外部油相的壳聚糖微囊浸泡于去离子水中置换异丙醇，置换异丙醇的时间为30小时，其间，每两个时更换一次去离子水。
本实施例中，在实验1所述条件下，当分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h时，所制备的壳聚糖微囊在大豆油中的光学照片如图18所示；在实验2所述条件下，当分散相流体的流量QA＝100μL/h、连续相流体的流量QB＝1000μL/h时，所制备的壳聚糖微囊在大豆油中的光学照片如图19所示。
实施例4
利用激光共聚焦显微镜观察实施例1所制备的壳聚糖微囊在pH＝3和pH＝4的缓冲溶液中的溶解过程，所述缓冲溶液为柠檬酸和磷酸氢二钠的混合水溶液。
制备壳聚糖微囊的工艺参数：壳聚糖在分散相流体中的浓度为0.02g/ml，对苯二甲醛在连续相流体中的浓度为0.001g/ml，分散相流体的流量QA＝100μL/h，连续相流体的流量QB＝1000μL/h。
向含有壳聚糖微囊的样品槽中滴加过量pH＝3的缓冲溶液后的溶解过程如图20所示，从图20可以看出，壳聚糖微囊先溶胀，1分钟左右时壳聚糖微囊基本消失。
向含有壳聚糖微囊的样品槽中滴加过量pH＝4的缓冲溶液后的溶解过程如图21所示，从图21可以看出，壳聚糖微囊先溶胀后溶解，溶解过程变慢至20分钟。
上述结果表明，本发明所述方法制备的壳聚糖微囊在酸性条件下会发生分解，具有pH响应性。
Claims (10)
1.一种以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于工艺步骤如下：
（1）配制分散相和连续相流体
分散相流体的配制：以水溶性壳聚糖、羟乙基纤维素和去离子水为原料，在常压、室温下将水溶性壳聚糖、羟乙基纤维素加入去离子水中搅拌均匀形成混合液，当水溶性壳聚糖和羟乙基纤维素溶解后用氢氧化钠水溶液调节所述混合液的pH值至6.0～6.7，即形成分散相流体，水溶性壳聚糖的量是在分散相流体中其浓度达到0.02～0.04g/mL，羟乙基纤维素的量是在分散相流体中其浓度达到0.005～0.01g/mL；
连续相流体的配制：以对苯二甲醛、聚甘油蓖麻醇三酯、大豆油为原料，在常压、室温下将对苯二甲醛和聚甘油蓖麻醇三酯加入大豆油中搅拌均匀形成混合液，当对苯二甲醛和聚甘油蓖麻醇三酯溶解后，即形成连续相流体，对苯二甲醛的量是在连续相流体中其浓度达到0.0005～0.005g/mL，聚甘油蓖麻醇三酯的量是连续相流体中其浓度达到0.01～0.04g/mL；
（2）制备油包水乳液
将步骤（1）配制的分散相流体、连续相流体分别由与注射泵连接的注射器注入微流体装置的不同进液口，在所述微流体装置中形成单分散的油包水乳液，所述分散相流体的流量QA=50～500μL/h，所述连续相流体的流量QB=500～2500μL/h；
（3）收集乳液并形成微囊
方法1：将步骤（2）形成的油包水乳液通过与微流体装置连接的输出管引入收集容器，在常压、室温静置交联8～24h，即形成壳聚糖微囊；
或方法2：将步骤（2）形成的油包水乳液通过与微流体装置连接的输出管引入盛有大豆油的收集容器，在大豆油中于常压、室温静置交联30min～1h，即形成壳聚糖微囊；
（4）洗涤
将步骤（3）形成的壳聚糖微囊用异丙醇洗涤除去外部油相，再用去离子水洗涤除去异丙醇。
2.根据权利要求1所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于当用步骤（3）中的方法1形成壳聚糖微囊时，对苯二甲醛的量在连续相流体中的浓度为0.0005～0.002g/mL。
3.根据权利要求1所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于当用步骤（3）中的方法2形成壳聚糖微囊时，对苯二甲醛的量在连续相流体中的浓度为0.002～0.005g/mL。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于配制分散相时，所述水溶性壳聚糖的脱乙酰度为85%、重均分子量Mw≤5000g/mol。
5.根据权利要求1至3中任一权利要求所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于与微流体装置连接的输出管的长度为10～50cm。
6.根据权利要求4所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于与微流体装置连接的输出管的长度为10～50cm。
7.根据权利要求1至3中任一权利要求所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于所制备的壳聚糖微囊的粒径小于50μm。
8.根据权利要求4所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于所制备的壳聚糖微囊的粒径小于50μm。
9.根据权利要求5所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于所制备的壳聚糖微囊的粒径小于50μm。
10.根据权利要求6所述以单乳为模板制备壳聚糖微囊的方法，其特征在于所制备的壳聚糖微囊的粒径小于50μm。
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