CN107421930A - 一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法 - Google Patents

一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法，包括以下步骤：1）配制8×10‑6mol/L的BSA；2）配制不同pH值的Tris‑HCl缓冲溶液:先配制三份0.1mol/L的Tris溶液，每份Tris溶液的体积≥120mL；分别添加6mol/L的盐酸溶液配制得到pH值分别为6.5、7.5、8.5的Tris‑HCl缓冲溶液；3）配制1×10‑2mol/L的La3+标准溶液；4）测试其荧光发射光谱。本发明通过采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用，从而探讨不同浓度La3+与pH值对BSA荧光光谱的影响，La3+对BSA的猝灭类型、结合常数、结合位点数，为稀土金属离子在体内的代谢过程及作用机理提供理论参考。

Description

一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的 方法
技术领域
本发明属于荧光光谱技术领域，具体涉及一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA 的相互作用的方法。
背景技术
血清白蛋白是血浆中含量最为丰富的蛋白质，与其它蛋白质相比，血清白蛋白分子量较小、稳定性较好、溶解性较大、与各种配体都具有较好的亲和性，是各种内源性和外源性物质运输和排出体外的主要载体。近年来，随着稀土在工农业领域的广泛应用，稀土离子通过各种途径进入生物体，与体内血清白蛋白相互作用，影响和改变蛋白质分子固有的结构和功能。
对稀土金属离子与血清白蛋白的相互作用，国内许多学者进行了研究，以期解决稀土金属离子在人体中有无积累，对人体有利还是有害等科学问题。例如，李晓晶等[李晓晶,张善荣,张树功,等.稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白结合作用的研究[J].高等学校化学学报, 1999,20(1):127-131]通过平衡透析法确定Pr3+与牛血清白蛋白(BSA)结合的低亲和位点数大于6，高亲和位点数为2。秦身钧等[秦身钧,申金山,李艳廷,等.稀土金属离子及pH诱导牛血清白蛋白构象变化的同步荧光光谱研究[J].中国稀土学报,2004,22(3):393-397]发现BSA荧光猝灭程度随稀土原子序号的增大而增强。吴锦绣等[吴锦绣,李梅,宋玉民,等.Ce3+与牛血清白蛋白的相互作用的研究[J].过程工程学报,2010,10(6):1126-1131.//吴锦绣,李梅,柳召刚,等.光谱法研究稀土离子钇(Ⅲ)与牛血清白蛋白的相互作用[J].发光学报,2012,33(10):1153-1159]研究了Ce3+和Y3+对BSA的作用，得到Ce3+和Y3+对BSA的荧光猝灭作用是属于生成复合物的静态猝灭。林燕等[林燕,赖晓琦,李蕾.稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白结合作用的荧光光谱分析[J]. 赣南师范学院学报,2001,10(6):45-48.]采用荧光谱测出了Sm3+和Eu3+与BSA结合的配位比分别为2.5:1和2.75:1。邓凡政实验研究了Sm3+和人血清白蛋白(HSA)的相互作用，表明 Sm3+和HSA有很强的结合作用，并且Sm3+对HSA的荧光猝灭是静态猝灭。上述文献可以看出，学者对稀土金属离子与血清白蛋白的结合常数、猝灭作用和类型、配位比等进行了研究，但研究La3+与BSA的相互作用的文献并未见报道。
本发明公开了一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法，从而探讨不同浓度La3+与pH值对BSA荧光光谱的影响，La3+对BSA的猝灭类型、结合常数、结合位点数，为稀土金属离子在体内的代谢过程及作用机理提供理论参考。
发明内容
本发明目的在于提供了一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法。
基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：
一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法，包括以下步骤：
1)配制8×10-6mol/L的BSA；
2)配制不同pH值的Tris-HCl缓冲溶液:先配制三份0.1mol/L的Tris溶液，每份Tris 溶液的体积≥120mL；分别添加6mol/L的盐酸溶液配制得到pH值分别为6.5、7.5、8.5的 Tris-HCl缓冲溶液；
3)配制1×10-2mol/L的La3+标准溶液；
4)测试其荧光发射光谱：取6支10mL刻度比色管，加入2.0mL，8×10-6mol/L的BSA溶液和不同体积的La3+标准溶液，分三组，分别用pH值为6.5、7.5、8.5的Tris-HCl缓冲溶液定容至10mL刻度线处，以150W氙灯为光源，扫描速度60nm/min，激发狭缝10nm，发射狭缝为5nm，固定激发波长为280nm，记录282-500nm范围的荧光发射光谱。
步骤1)中，配制8×10-6mol/L的BSA的具体步骤为：用分析天平准确称量0.052g的BSA固体粉末，加蒸馏水使之完全溶解，然后定容至100mL容量瓶中。
步骤3)中，配制1×10-2mol/L的La3+标准溶液的具体步骤为：用分析天平准确称量0.1629g的La2O3固体粉末，用6mol/L的盐酸溶液在HH-2恒温水浴锅条件下溶解，然后定容转移至100mL容量瓶中。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明通过采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用，从而探讨不同浓度 La3+与pH值对BSA荧光光谱的影响，La3+对BSA的猝灭类型、结合常数、结合位点数，为稀土金属离子在体内的代谢过程及作用机理提供理论参考。
附图说明
图1La3+与BSA的荧光发射光谱(pH＝6.5)；
图2La3+与BSA的荧光发射光谱(PH＝7.5)；
图3La3+与BSA的荧光发射光谱(pH＝8.5)；
图4不同pH值下La3+猝灭BSA的Stern-Volmer曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
实施例1实验部分
1.1仪器与试剂
Cary Eclipse荧光分光光度计，美国瓦里安公司；恒温水浴锅，金坛市杰瑞儿电器有限公司；磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；精密pH计，上海雷磁有限公司；电子分析天平，上海菁海仪器有限公司。
牛血清白蛋白(BSA，分子量65000)，用缓冲溶液配制成8.0×10-6mol·L-1，置1～4℃保存；三氧化二镧(La2O3)为天津市光复精细化工研究所产品，分析纯；Tris(三羟甲基氨基甲烷)，盐酸试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
1.2溶液配制
配制8×10-6mol/L的BSA：用分析天平准确称量0.052g的BSA固体粉末，加蒸馏水使之完全溶解，然后定容至100mL容量瓶中。
配制不同pH值(6.5、7.5、8.5)Tris-HCl缓冲溶液:先配制0.1mol/L的Tris溶液，即用分析天平准确称量3.0285g的Tris固体粉末，加蒸馏水使之完全溶解，然后容至250mL 容量瓶中(Tris称两份，容至两个250mL容量瓶)。取配制好的0.1mol/L的Tris溶液，使其体积为V≥120mL(够用就好，120mL左右，取三份)。然后用精密pH计(带磁力搅拌器) 向其中加6mol/L的盐酸溶液分别配制pH值为6.5、7.5、8.5的Tris-HCl缓冲溶液。
配制1×10-2mol/L的La3+标准溶液：用分析天平准确称量0.1629g的La2O3固体粉末，用6mol/L的盐酸溶液在HH-2恒温水浴锅条件下溶解，然后定容转移至100mL容量瓶中。
1.3实验方法
取6支10mL刻度比色管，加入2.0mL，8×10-6mol/L的BSA溶液和不同体积的La3+标准溶液，分三组，分别用pH值为6.5、7.5、8.5的Tris-HCl缓冲溶液定容至10mL刻度线处。以150W氙灯为光源，扫描速度60nm/min，激发狭缝10nm而发射狭缝为5nm，固定激发波长为280nm，记录282-500nm范围的荧光发射光谱。
2结果与讨论
2.1 La3+浓度及pH值对BSA荧光光谱的影响
BSA可产生内源荧光，是由于BSA中存在3种芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。这3种氨基酸具有不同的结构，荧光强度比为100:9:0.5。因此，在通常情况下，BSA所显示的荧光主要是色氨酸残基产生的。在最佳激发波长280nm激发下，BSA在340nm处有一特征激发峰。
按1.3实验方法设1号比色管为空白对照组(2mLBSA 8mLTris-HCl),2-6号比色管先加入2mLBSA，然后分别加入50μL、100μL、150μL、200μL、250μL的1×10-2mol/L La3+标准溶液，再分别用pH值为6.5、7.5、8.5的Tris-HCl缓冲溶液定容至10mL刻度线处。扫描La3+与BSA相互作用的荧光发射光谱，结果如图1～3所示。
图1中从a到f曲线La3+离子浓度分别为0，0.5×10-4，1.0×10-4，1.5×10-4，2.0×10-4，2.5×10-4mol/L。
图2中从a到f曲线La3+离子浓度分别为0，0.5×10-4，1.0×10-4，1.5×10-4，2.0×10-4， 2.5×10-4mol/L。
图3中从a到f曲线La3+离子浓度分别为0，0.5×10-4，1.0×10-4，1.5×10-4，2.0×10-4， 2.5×10-4mol/L。
由图1～3可以看出，La3+的加入没有改变BSA的最大荧光发射峰的位置。在选定的La3+浓度范围内，La3+对BSA的荧光都产生了猝灭，且其荧光强度随着La3+浓度的增加而降低，说明La3+与BSA发生了相互作用。在相同La3+浓度条件下，BSA的荧光强度随着pH值(6.5～ 8.5)的增加而降低。原因是随着pH值增加和La3+的结合使BSA带上了多余的正电荷，静电斥力促使BSA分子肽链伸展。这降低了色氨酸和酪氨酸残基间的能量传递，导致BSA荧光强度下降。
2.2 La3+对BSA荧光猝灭方式分析
荧光猝灭是指物质分子于溶剂分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起的荧光强度下降的物质，称为荧光猝灭剂。荧光猝灭机制主要有两种，静态猝灭和动态猝灭。静态猝灭是荧光物质和猝灭剂在基态时结合而导致荧光强度降低的过程。动态猝灭是荧光物质和猝灭剂的激发态分子之间相互作用的过程。
基态配合物的生成过程是静态猝灭与动态猝灭之间的不同，该过程通常会导致荧光物质吸收光谱变化。温度升高可降低基态配合物的稳定性,因而减少静态猝灭的程度,而动态猝灭与扩散有关,温度升高将增大扩散系。通常可比较猝灭常数与生物大分子最大扩散控制的碰撞猝灭常数的大小来区分动态猝灭与静态猝灭。生物大分子的荧光寿命约为1×10-8s。各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0×1010L·mol-1S-1,静态猝灭一般大于最大扩散碰撞猝灭常数2.0×1010L·mol-1S-1。
根据Stern-Volmer方程，在Tris-HCl缓冲溶液pH值为6.5，7.5，8.5的情况下测定荧光发射光谱在340nm波长的相对荧光强度为F，以F0/F为纵坐标，以添加的La3+溶液的浓度C 为横坐标作图，得出稀土La3+离子与BSA在不同pH值下的Stern-Volmer猝灭曲线，结果如图4所示。
由图4可知，不同pH值下，BSA的Stern-Volmer曲线均呈现良好的线性关系，并且随着pH值(6.5～8.5)的增大，曲线斜率降低，说明荧光猝灭常数逐渐减小。根据图4和公式(1)，可以得到不同pH值下La3+对BSA的荧光猝灭常数KSV和双分子猝灭过程速率常数Kq，结果如表1所示。
表1不同PH值下La3+对BSA的KSV值和Kq值
由表1可知，La3+对BSA的双分子猝灭过程速率常数Kq远大于猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2.0×1010L·mol-1S-1，这表明该过程是La3+与BSA结合形成复合物所引起的静态猝灭。
2.3 La3+与BSA的结合常数KA和结合位点数n
在静态猝灭中，利用秦身钧推导的公式(2)可求出La3+与BSA相互作用的结合常数KA和结合数n。
lg(F/(F0-F))＝lg(1/KA)+nlg(1/[Q]) (2)
式(2)中：KA为结合常数，n为结合位点数，[Q]为La3+浓度(mol/L)。
根据图1～3中340nm处的荧光强度，结合公式(2)对实验数据进行处理，可求出不同 pH值下La3+与BSA相互作用的结合常数KA和结合位点数n，结果如表2所示。
表2不同PH值下La3+对BSA荧光猝灭的结合常数KA和结合位点数n
由表2可知，pH值在6.5～8.5变化时，结合常数KA的变化范围为2.55×104～9.3×104，结合位点数的变化范围为1.021～1.147，说明pH值的变化对结合常数和结合位点数的影响较小。La3+与BSA的结合位点数略大于1，即存在一个结合点位，说明La3+与BSA有较强的结合能力，形成了较稳定的1∶1的复合物。
3结论
通过不同pH值条件下La3+与BSA相互作用的荧光光谱分析，发现La3+对BSA有很好的荧光猝灭作用，La3+浓度越高，猝灭作用越强，且该猝灭为静态猝灭。随着pH值(6.5～8.5)的增大，猝灭常数KSV和猝灭过程速率常数Kq减小，结合常数KA先增大后减小。La3+与BSA 的结合位点数n≈1，可知La3+与BSA相互作用形成了较稳定的1:1的复合物。

Claims (3)

1.一种采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）配制8×10-6mol/L的BSA；
2）配制不同pH值的Tris-HCl缓冲溶液:先配制三份0.1mol/L的Tris溶液，每份Tris溶液的体积≥120mL；分别添加6mol/L的盐酸溶液配制得到pH值分别为6.5、7.5、8.5的Tris-HCl缓冲溶液；
3）配制1×10-2mol/L的La3+标准溶液；
4）测试其荧光发射光谱：取6支10mL刻度比色管，加入2.0mL，8×10-6 mol/L的BSA溶液和不同体积的La3+标准溶液，分三组，分别用pH值为6.5、7.5、8.5的Tris-HCl缓冲溶液定容至10mL刻度线处，以150W氙灯为光源，扫描速度60nm/min，激发狭缝10nm，发射狭缝为5nm，固定激发波长为280nm，记录282-500nm范围的荧光发射光谱。
2.如权利要求1所述的采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法，其特征在于，步骤1）中，配制8×10-6mol/L的BSA的具体步骤为：用分析天平准确称量0.052g的BSA固体粉末，加蒸馏水使之完全溶解，然后定容至100mL容量瓶中。
3.如权利要求1所述的采用荧光光谱法研究稀土金属La3+与BSA的相互作用的方法，其特征在于，步骤3）中，配制1×10-2mol/L的La3+标准溶液的具体步骤为：用分析天平准确称量0.1629g的La2O3固体粉末，用6mol/L的盐酸溶液在HH-2恒温水浴锅条件下溶解，然后定容转移至100mL容量瓶中。
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