CN112760362A

CN112760362A - 一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板及其应用

Info

Publication number: CN112760362A
Application number: CN202110157264.8A
Authority: CN
Inventors: 黄庆; 屈雪梅; 苏宁; 李文满; 李博文; 尚美云
Original assignee: Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
Current assignee: Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112760362B

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板及其应用，所述环形信号扩增模板为两条与靶序列互补的片段通过缺口剂识别序列相互连接形成的闭环寡核苷酸。利用环形信号扩增模板与靶序列识别并杂交时，靶序列在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链，在缺口酶的切割作用下形成一个缺口，继续延伸，置换出合成的新链，扩增的目的片段可用作后续扩增的模板，使靶序列通过“切割‑延伸‑链置换”自主链式循环实现靶分子的指数扩增。本发明的环形信号扩增模板无需要像PCR、LCR等反应所依赖的热循环过程；无需复杂的引物和探针，只需要一条简单的DNA模板链，设计简单，反应速度快，效率高，短时间内可以获得高达10⁷以上的扩增。

Description

一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板及其应用。

背景技术

核酸扩增技术(NAT)被广泛应用于生命科学的各个领域，如遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤疾病、食品安全、法医学。核酸扩增技术的简便性、高效性、特异性、灵敏度、准确度、精确度，以及经济可承受性至关重要。目前，主要有两大类核酸扩增技术，分别是基于温度热循环的变温扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(ligase chainreaction,LCR)，以及温度基本不变的恒温扩增技术。以PCR为代表的变温扩增技术具有检测灵敏度高、特异性好等优势，是目前最精准的基因诊断方法之一。但是，却存在以下缺陷：需要反复的热变性以DNA双链，无法摆脱依赖高质量热循环仪的局限；扩增效率受到多种因素的影响和制约，易出现非特异性扩增；扩增反应时间长，一般需要几个小时。上述技术缺陷使PCR技术难以胜任生命科学领域的一些特殊用途，如现场快速检测或床旁检测(POTC)。

恒温扩增技术是温度基本不变的核酸扩增技术。相对于以PCR为代表的变温扩增技术，恒温扩增技术具有以下主要优势：反应温度单一，对设备的要求程度低；不存在温变化，扩增效率及核酸片段长均优于常规PCR技术；反应时间短，可在1小时，甚至几分钟内实现靶子的有效扩增且灵敏度和特异性与PCR技术相当，甚至更好。上述技术优势使恒温扩增技术在生命科学的各个领域得到了广泛应用，特别适合于在生命科学的各个领域得到了广泛应用，并且特别适合于miRNA的检测。目前，已经发展出了多种核酸恒温扩增技术，其中具有代表性的的技术主要包括：链置换扩增(SDA)、环介导核酸等温扩增技术(LAMP)、滚环扩增(RCA)、依赖于核酸序列的扩增(NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HAD)、转录介导扩增(TMA)、单引物等温扩增(SPIA)、信号介导RNA扩增技术(SMART)、恒温指数扩增(EXPAR)。

VanNessJ等在2003年通过联用缺口内切酶和DNA聚合酶，建立了一种能够以指数形式扩增寡核苷酸片段的恒温扩增技术，该技术被称为EXPAR。相对于已有的恒温扩增技术，该技术具有十分高的扩增效率和检测灵敏度，能够在几分钟内实现靶分子的10⁶扩增，相关专利见WIPO(NO.W02004067726)及美国专利(NO.US 60/443,65229.01.2003)。相关研究者在此基础上，通过技术改良，将该技术进一步用于纳米金、薄层层析快速检测等领域。

EXPAR原型设计及在此基础上发展起来的相关技术中，为了实现指数扩增，缺口内切酶的NERS反义链序列两侧的核苷酸序列基本完全相同，并且，用于扩增寡核苷酸片段的模板是单纯线性核酸分子。此原理存在的主要缺陷在于，只有当靶寡核苷酸与NERS反义链序列的3’-端核苷酸序列互补结合时，才能触发线性或指数扩增。但是，NERS反义链序列两侧的核苷酸序列基本完全相同，因此，NERS反义链序列5’-和3’-端两侧核苷酸序列与靶寡核苷酸互补结合是一种随机事件，这种随机性势必会影响该体系的扩增效率，从而影响整个检测系统的检测灵敏度，最终降低该技术在生物科学领域的实际应用价值。如若将EXPAR中的线形的信号扩增模板设计成环形信号扩增模板并且多段NERS反义链序列便能避免以上缺陷。

此外，包括EXPAR在内的多种恒温扩增技术(如：LAMP、RCA)检测手段主要依靠凝胶电泳或依赖于其它技术手段，如DNA质谱技术。上述技术瓶颈在一定程度上限制了现有恒温扩增技术的应用价值，可见，如何提高靶分子与NERS反义链序列3’-端序列的特异性结合对于极大地拓展现有恒温扩增技术的应用领域具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板，本发明的目的之二在于提供一种环形信号扩增模板在寡核苷酸定性和定量检测中的应用，本发明的目的之三在于提供一种环形信号扩增模板在制备寡核苷酸定性和定量检测试剂盒中的应用，本发明的目的之四在于提供一种利用环形信号扩增模板进行寡核苷酸扩增的方法，本发明的目的之五在于提供一种寡核苷酸的定性和定量检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板，所述环形信号扩增模板为一条闭合的环形寡核苷酸链，所述环形寡核苷酸链含有两条部分或完全与靶序列互补的片段，两条片段通过两条缺口剂识别序列相互连接形成闭合环；具体地，5’端到3’端依次为：

第一区：第一片段；

第二区：缺口剂识别序列正义链；

第三区：第二片段；

第四区：缺口剂识别序列正义链；

第一区的5’-PO₄与第四区3’-OH缩合反应形成环形寡核苷酸链，即环形信号扩增模板。

作为优选的技术方案之一，所述第一区与所述第三区的碱基个数均为8-40个。

作为优选的技术方案之一，所述第一区与所述第三区的序列部分或完全相同，所述第二区与所述第四区的序列部分或完全相同。

作为优选的技术方案之一，所述缺口剂识别序列是为满足缺口酶、限制性内切酶或CRISPR/Cas系统检测需求的片段。

2、环形信号扩增模板在寡核苷酸定性和定量检测中的应用。

3、环形信号扩增模板在制备寡核苷酸定性和定量检测试剂盒中的应用。

4、利用环形信号扩增模板进行寡核苷酸扩增的方法，所述环形信号扩增模板与靶序列识别并杂交时，靶序列在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链，通过缺口剂识别双链切割单链，释放扩增的寡核苷酸，使靶序列通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子的指数扩增。

作为优选的技术方案之一，所述方法为恒温扩增，扩增温度为37～70℃。

5、一种寡核苷酸的定性和定量检测方法，具体步骤如下：

(1)根据靶序列，设计并合成环形信号扩增模板；

(2)构建包含步骤(1)中环形信号扩增模板的实时荧光恒温扩增反应体系，进行实时荧光恒温指数扩增，即可实现对该寡核苷酸的定性和定量检测。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，所述恒温扩增反应体系还包含：有3'-端羟基的靶分子，DNA聚合酶，识别缺口剂识别序列的缺口酶，三磷酸脱氧核苷，非特异性的荧光染料，满足上述DNA聚合酶和缺口酶生物学活性的离子与缓冲体系；所述的DNA聚合酶是具有链替换活性的DNA聚合酶；或者，DNA聚合酶不具有链替换活性，且在所述反应体系中加入具有链置换活性的生物活性分子；DNA聚合酶是RNA依赖性DNA聚合酶；或者，DNA聚合酶是DNA依赖性DNA聚合酶；

所述缺口剂被用于识别和切割延伸聚合过程中形成的双链环形结构的缺口剂识别序列；当环形双链结构中的缺口剂识别序列是缺口内切酶识别序列时，所用缺口剂是识别该缺口内切酶识别序列的缺口内切酶；当环形信号扩增模板的缺口剂识别序列是半修饰限制性内切酶时，所用缺口剂是识别该半修饰RERS的限制性内切酶。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种利用环状信号扩增模板扩增特异单链DNA或者RNA序列的方法。现有技术中的特异单链DNA序列只能在正向和反向线形引物进行扩增。本发明的实质是在恒温37-70℃条件下加入扩增的DNA聚合酶与缺口酶，无需正反向引物，环形信号扩增模板便可针对靶序列进行扩增。这一过程被称为“切割-延伸-链置换”循环，在此过程中，单拷贝的完全延伸的DNA或者RNA链，被环形信号扩增模板识别与特异性结合，延伸形成双链，在缺口酶的切割作用下形成一个缺口，继续延伸，置换出合成的新链，扩增的靶片段可用作后续扩增的模板。特异性环形信号扩增模板可以选择性地成倍扩增具有特定序列的线形单链DNA或RNA。此外，通过使用一个或多个突变引物，可以将一个或多个位点特异性突变碱基引入到闭合环状DNA信号扩增模板中，从而识别不同的突变的DNA或RNA目标序列。各种热稳定性DNA聚合酶和热稳定性缺口酶可用于该扩增。任何线形靶片段，只要与环状DNA信号扩增模板互补无论是正向或反向，都可以用于封闭环形DNA信号扩增模板扩增。该方法在基因突变、克隆、DNA、RNA检测和无细胞DNA扩增等领域都有应用。

本发明只含有一条环形信号扩增模板，无通常的上游引物和下游引物之分，环形信号扩增模板为一个闭环，含有两段靶序列识别区，含有两段缺口酶识别序列区，扩增过程中环形结构无需打开，可创建一种新型的恒温指数扩增技术，提高扩增特异性，极大地扩展现有的恒温指数扩增的应用领域。

环形信号扩增模板是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5'→3'碱基依次为特异性识别寡核苷酸靶分子序列的识别序列区。识别序列区与寡核苷酸靶分子互补，缺口酶识别序列区的序列与核酸靶分子无同源性，不能与靶分子产生非特异性杂交。在扩增过程中，环形信号扩增模板第一区和第三区分别可与靶分子的3'-端延伸产物形成杂交双链，并且，在DNA聚合酶的作用下，环形信号扩增模板的缺口剂识别序列区形成缺口剂识别序列双链DNA分子，从而使缺口剂能够在缺口剂识别序列区的反义链进行切割，并在DNA聚合酶的协同作用下，不断生成新生DNA链。因此，环形信号扩增模板的识别序列区识别寡核苷酸靶分子形成杂交双链后，在DNA聚合酶的作用下寡核苷酸靶分子产生5'→3'方向链延伸，然后，缺口剂在缺口剂识别序列反义链序列处切割，在DNA聚合酶的作用下，分别在缺口处延伸出新生DNA双链，非特异性荧光染料与该新生DNA双链结合，指示寡核苷酸靶分子链浓度，新生的链与原有的寡核苷酸靶分子链相同。

本发明提供了一种环形信号扩增模板介导的实时荧光恒温指数扩增方法，使用非环形结构寡核苷酸信号扩增模板，能够在恒定温度条件下，在具有切割双链核酸分子中一条链的缺口剂和具有链替换活性的DNA聚合酶共同作用下，重复进行“切割-延伸-链置换”过程，以指数形式特异性扩增靶分子且能释放荧光信号。本发明通过靶分子特异性寡核苷酸对应的环形信号扩增模板释放的荧光信号和丰度，可在单个反应管、检测池或检测孔中实现单个靶分子检测，靶分子扩增10⁷倍以上。本发明通过环形信号扩增模板与靶分子瞬时形成核酸双链结构释放出可检测信号进行表征，在理论上可对miRNA等核酸靶分子进行定性和定量检测，具有检测特异强、灵敏度高、重复好、样本用少、耗时短、步骤简单等优势。

本发明的环形信号扩增模板无需要像PCR、LCR等反应所依赖的热循环过程；无需复杂的引物和探针，只需要一条简单的DNA模板链，设计简单，反应速度快，效率高，短时间内可以获得高达10⁷以上的扩增。

附图说明

图1为环形信号扩增模板结构及其序列示意图，其中a为环形信号扩增模板与靶分子特异性结合的结构示意图，b为环形信号扩增模板与靶分子的示例序列；TS：靶向序列；TS*：靶向互补序列；NS(NERS)：缺口内切酶识别序列。

图2为环形信号扩增模板的恒温指数扩增原理示意图。

图3为环形信号扩增模板恒温指数扩增的结果图，其中，a为60℃，反应时间为60min的扩增结果；b为60℃，反应时间为40min的扩增结果，HQ-1067X为环形信号扩增模板(SEQ ID NO.2)，NTC为空白对照。

图4为基于环形信号扩增模板的灵敏度检测结果图。

图5为基于环形信号扩增模板的特异性检测结果图，HQ-1307为模拟分子(SEQ IDNO.1)，HQ-1307a-HQ-1307d为单碱基突变的模拟分子(SEQ ID NO.3～6)；HQ-1067X为环形信号扩增模板(SEQ ID NO.2)；结果显示HQ-1067X环形信号扩增模板只能识别HQ-1307(有扩增曲线)，不能识别其他单碱基突变的模拟分子(无扩增曲线)。

图6为miRNA21模拟分子的基于环形信号扩增模板的特异性检测结果图，miR21为模拟分子(SEQ ID NO.7)，miR21a-miR21d为miR21单碱基突变的模拟分子(SEQ ID NO.9～12)；结果显示miR21的环形信号扩增模板只能识别miR21(有扩增曲线)，不能识别其他单碱基突变的模拟分子(无扩增曲线)。

图7为miRNA29a模拟分子的基于环形信号扩增模板的特异性检测结果图，miR29为miR29的模拟分子(SEQ ID NO.13)，miR29a-miR29d为miR29单碱基突变的模拟分子(SEQ IDNO.15～18)；结果显示miR29的环形信号扩增模板只能识别miR29(有扩增曲线)，不能识别其他单碱基突变的模拟分子(无扩增曲线)。

图8为miRNA10b模拟分子的基于环形信号扩增模板的特异性检测结果图，miR10为miR10b的模拟分子(SEQ ID NO.19)，miR10a-miR10d为miR10单碱基突变的模拟分子(SEQID NO.21～24)；结果显示miR10的环形信号扩增模板只能识别miR10(有扩增曲线)，不能识别其他单碱基突变的模拟分子(无扩增曲线)。

图9为基于HindⅢ识别序列设计的基于环形信号扩增模板的恒温扩增结果图，HQ-1067H为环形信号扩增模板(SEQ ID NO.25)；结果显示以HindⅢ识别序列设计的环形信号扩增模板能识别HQ-1307信号模拟分子(有扩增曲线)，NTC无扩增曲线，无非特异扩增。

(注：图3至图9均为各样本的2次平行试验结果)

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

环形信号扩增模板检测寡核苷酸扩增

(1)环形信号扩增模板的合成与检测

根据miRNA等天然存在且具有3’-OH的小片段核酸分子，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸和环形信号扩增模板，环形信号扩增模板结构及其序列如图1中a、b所示，包括具有可触发其自身延伸3’-OH的miRNA模拟分子(TS，SEQ ID NO.1)，和miRNA模拟分子的环形引物信号扩增模板(SEQ ID NO.2)，5’-端至3’-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与TS互补的第一区寡核苷酸序列；②Nb.BsrDI缺口内切酶正义链序列区5’-GCAATG-3’的第二区核苷酸序列(下划线标注)；③与第一区寡核苷酸序列相同的第三区核苷酸序列；④与第二区核苷酸相同的第四区核苷酸序列(下划线标注)；⑤第一区的5’-PO₄与第四区3’-OH缩合反应形成环形寡核苷酸链即环形信号扩增模板。

SEQ ID NO.1(HQ-1307，5’>3’方向)：CCAGTCGTAGG

SEQ ID NO.2(HQ-1067，5’>3’方向：CCTACGACTGGGCAATGCCTACGACTGGGCAATG

(2)实时荧光恒温扩增反应体系的构建

恒温温扩增反应体系共20μL，包括以下组分：1×NE Buffer 3.1，0.04units/μLNb.BsrDI Nicking Enzyme，0.32units/μL Bst 3.0DNAPolymerase，400μM dNTP(Promega)，1×Evagreen(biotium)，250fm环形引物信号扩增模板(SEQ ID NO.2)，1fm(6×10⁸个拷贝)miRNA模拟分子(SEQ ID NO.1)。分别在60℃，反应时间为60min；60℃，反应时间为40min。

环形信号扩增模板的恒温指数扩增原理如图2所示，通过在线软件DINA Melt分析，Tm值60℃时，该体系中具有3’-OH寡核苷酸，通过与环形信号扩增模板互补序列配对形成亚稳定的DNA双链结构，虽然这种结构是瞬时的，但是这种瞬时的结构足以使其在DNA聚合酶的作用下延伸形成DNA双链，并且依赖于缺口酶识别序列(NERS)的切割位点识别DNA双链切割单链，双链DNA分子形成缺口，在DNA聚合酶链置换活性作用下，置换出新的寡核苷酸链从而触发指数扩增(EXPAR)。当反应体系中产生少量的寡核苷酸分子，可放大信号触发EXPAR。Evagreen与环形信号扩增模板双链DNA分子结合释放出荧光，指示靶分子浓度。

结果图3中a、b所示，a为60℃、60min条件下的扩增曲线，该扩增由线性扩增达到指数扩增，27min达到域值。由于缺口酶非特异性切割和DNA聚合酶热动力学原因可能导致非特异扩增，在55～60min出现非特异扩增，这种非特异扩增起始时间滞后在检测接受范围内，表明该体系能够有效区分特异扩增与非特异扩增。将反应时间调整为40s，得到同样的扩增曲线图，反应时间短，无非特异扩增曲线出现(图3中b)。

(3)寡核苷酸分子灵敏度的检测反应体系构建

扩增反应体系共计20μL，该体系中包括以下组分：1×NE Buffer 3.1，0.04units/μL Nb.BsrDI Nicking Enzyme，0.32units/μLBst 3.0DNA Polymerase，400μM dNTP(Promega)，1×Evagreen(biotium)，250fm(体系终浓度)SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1系列终浓度(1pm 6×10¹¹，1fm 6×10⁸，1am 6×10⁵，1zm 6×10²，0.1zm 60，1ym单个拷贝)。反应条件为：60℃，反应时间为53min，所用设备为ViiA^TM7Real-Time PCR System(ABI)。

结果如图4所示，该体系的反应效率较高，不同浓度间曲线起跳时间差异小，将TS浓度差异设定为5个数量级(1pm 6×10¹¹，1fm 6×10⁸，1am 6×10⁵，1zm 6×10²，1ym单个拷贝)，同时将反应条件设置为60℃，46min，结果表明所有的待测浓度均有扩增曲线，灵敏度可达到1ymol单拷贝。

(4)环形信号扩增模板SEQ ID NO.2特异性检测

根据miRNA等天然存在且具有3’-OH的小片段核酸分子，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸和环形信号扩增模板，其中，SEQ ID NO.1是miRNA模拟分子，具有可触发其自身延伸的3’-OH，SEQ ID NO.2是SEQ ID NO.1环形信号扩增模板，其5’-端至3’-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与TS互补的第一区寡核苷酸序列；②Nb.BsrDI缺口内切酶正义链序列区5’-GCAATG-3’的第二区核苷酸序列(下划线标注)；③与第一区寡核苷酸序列相同的第三区核苷酸序列；④与第二区核苷酸相同的第四区核苷酸序列(下划线标注)；⑤第一区的5’-PO₄与第四区3’-OH缩合反应形成环形寡核苷酸链即环形信号扩增模板。SEQ ID NO.3～6是miRNA单碱基突变的模拟分子，突变的碱基用下划线标注。

SEQ ID NO.3(5’>3’方向)：CCAGTCGTAAG

SEQ ID NO.4(5’>3’方向)：CCGGTCGTAGG

SEQ ID NO.5(5’>3’方向)：CCAATCGTAGG

SEQ ID NO.6(5’>3’方向)：CCAGGCGTAGG

恒温扩增反应体系共计20μL，该体系中包括以下组分：1×NE Buffer 3.1，0.02units/μL Nb.BsrDI Nicking Enzyme，0.32units/μL Bst 3.0DNA Polymerase，400μMdNTP(Promega)，1×Evagreen(biotium)，250fm(体系终浓度)SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3～6均为1fm(6×10⁸个拷贝)。反应条件为：60℃，53min。所用设备为ViiA^TM7Real-Time PCR System(ABI)。

结果如图5所示，当SEQ ID NO.1～2置于单个反应管时靶分子能以指数形式扩增，通过环形信号扩增模板形成DNA双链，释放荧光指示靶分子浓度。当SEQ ID NO.3～6置于单个反应管时，miRNA单碱基突变的模拟分子并不能被SEQ ID NO.2识别并扩增，表明SEQ IDNO.2的特异性非常好。通过在线软件DINAMelt分析，Tm值60℃时，该体系中具有3’-OH寡核苷酸SEQ ID NO.3～6与SEQ ID NO.2处于游离状态，而SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2形成亚稳定的双链DNA结构，从而极大地提高了反应体系的触发扩增特异性。

实施例2

miRNA21模拟分子环形信号扩增模板特异性检测

根据miRNA等天然存在且具有3’-OH的小片段核酸分子，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸和环形信号扩增模板，其中，SEQ ID NO.7是miRNA21模拟分子(TS)，具有可触发其自身延伸的3’-OH，SEQ ID NO.8是SEQ ID NO.7环形信号扩增模板，其5’-端至3’-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与TS互补的第一区寡核苷酸序列；②Nb.BsrDI缺口内切酶正义链序列区5’-GCAATG-3’的第二区核苷酸序列(下划线标注)；③与第一区寡核苷酸序列相同的第三区核苷酸序列；④与第二区核苷酸相同的第四区核苷酸序列(下划线标注)；⑤第一区的5’-PO₄与第四区3’-OH缩合反应形成环形寡核苷酸链即环形信号扩增模板。SEQ IDNO.9～12是miRNA21单碱基突变的模拟分子，突变的碱基用下划线标注。

SEQ ID NO.7(5’>3’方向)：CAGACTGATGTTGA

SEQ ID NO.8(5’>3’方向)：TCAACATCAGTCTG GCAATG TCAACATCAGTCTG GCAATG

SEQ ID NO.9(5’>3’方向)：CAAACTGATGTT GA

SEQ ID NO.10(5’>3’方向)：CAGGCTGATGTTGA

SEQ ID NO.11(5’>3’方向)：CAGACTAATGTTGA

SEQ ID NO.12(5’>3’方向)：CAGACTGATGTTAA

恒温扩增反应体系共计20μL，该体系中包括以下组分：1×NE Buffer 3.1(NEB)，0.6units/μL Nb.BsrDI Nicking Enzyme，0.32units/μL Bst 3.0DNA Polymerase，400μMdNTP(Promega)，1×Evagreen(biotium),250fm(体系终浓度)SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9～12均为1fm(6×10⁸个拷贝)。反应条件为：60℃，53min。所用设备为ViiA^TM7Real-Time PCR System(ABI)。

结果如图6所示，当SEQ ID NO.7～8置于单个反应管时靶分子能以指数形式扩增，通过环形信号扩增模板形成DNA双链，释放荧光指示靶分子浓度。当SEQ ID NO.9～12置于单个反应管时，miRNA单碱基突变的模拟分子并不能被SEQ ID NO.8识别并扩增，表明SEQID NO.8的特异性非常好。通过在线软件DINA Melt分析，Tm值60℃时，该体系中具有3’-OH寡核苷酸SEQ ID NO.9～12与SEQ ID NO.8处于游离状态，而SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8形成亚稳定的双链DNA结构，从而极大地提高了反应体系的触发扩增特异性。

实施例3

miRNA29a模拟分子环形信号扩增模板特异性检测

根据miRNA等天然存在且具有3’-OH的小片段核酸分子，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸和环形信号扩增模板，其中，SEQ ID NO.13是miRNA29a模拟分子(TS)，具有可触发其自身延伸的3’-OH，SEQ ID NO.14是SEQ ID NO.13的环形信号扩增模板，其5’-端至3’-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与TS互补的第一区寡核苷酸序列；②Nb.BsrDI缺口内切酶正义链序列区5’-GCAATG-3’的第二区核苷酸序列(下划线标注)；③与第一区寡核苷酸序列相同的第三区核苷酸序列；④与第二区核苷酸相同的第四区核苷酸序列(下划线标注)；⑤第一区的5’-PO₄与第四区3’-OH缩合反应形成环形寡核苷酸链即环形信号扩增模板。SEQID NO.15～18是miRNA29a单碱基突变的模拟分子，突变的碱基用下划线标注。

SEQ ID NO.13(5’>3’方向)：CTTTTGGTGTTCAG

SEQ ID NO.14(5’>3’方向)：

CTGAACACCAAAAGGCAATGCTGAACACCAAAAGGCAATG

SEQ ID NO.15(5’>3’方向)：CTGTTGGTGTTCAG

SEQ ID NO.16(5’>3’方向)：CTTTTGGTGTACAG

SEQ ID NO.17(5’>3’方向)：CTTTTGGTGTGCAG

SEQ ID NO.18(5’>3’方向)：CTTTTAGTGTTCAG

恒温扩增反应体系共计20μL，该体系中包括以下组分：1×NE Buffer 3.1,0.6units/μL Nb.BsrDI Nicking Enzyme,0.32units/μL Bst 3.0DNA Polymerase,400μMdNTP(Promega),1×Evagreen(biotium),250fm(体系终浓度)SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15～18均为1fm(6×10⁸个拷贝)。反应条件为：60℃，53min。所用设备为ViiA^TM7Real-Time PCR System(ABI)。

结果如图7所示，当SEQ ID NO.13～14置于单个反应管时靶分子能以指数形式扩增，通过环形引物信号扩增模板形成DNA双链，释放荧光指示靶分子浓度。当SEQ ID NO.15～18置于单个反应管时，miRNA单碱基突变的模拟分子并不能被SEQ ID NO.14识别并扩增，表明SEQ ID NO.14的特异性非常好。通过在线软件DINA Melt分析，Tm值60℃时，该体系中具有3’-OH寡核苷酸SEQ ID NO.15～18与SEQ ID NO.14处于游离状态，而SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14形成亚稳定的双链DNA结构，从而极大地提高了反应体系的触发扩增特异性。

实施例4

miRNA10b模拟分子环形信号扩增模板特异性检测

根据miRNA等天然存在且具有3’-OH的小片段寡核苷酸分子，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸和环形信号扩增模板，其中，SEQ ID NO.19是miRNA10b模拟分子，具有可触发其自身延伸的3’-OH，SEQ ID NO.20是SEQ ID NO.19的环形信号扩增模板，其5’-端至3’-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与TS互补的第一区寡核苷酸序列；②Nb.BsrDI缺口内切酶正义链序列区5’-GCAATG-3’的第二区核苷酸序列(下划线标注)；③与第一区寡核苷酸序列相同的第三区核苷酸序列；④与第二区核苷酸相同的第四区核苷酸序列(下划线标注)；⑤第一区的5’-PO₄与第四区3’-OH缩合反应形成环形寡核苷酸链即环形信号扩增模板。SEQID NO.21～24是miRNA10b单碱基突变的模拟分子，突变的碱基用下划线标注。

SEQ ID NO.19(5’>3’方向)：GAACCGAATTTGTG

SEQ ID NO.20(5’>3’方向)：CACAAATTCGGTTCGCAATGCACAAATTCGGTTCGCAATG

SEQ ID NO.21(5’>3’方向)：GAGCCGAATTTGTG

SEQ ID NO.22(5’>3’方向)：GAACCGAAGTTGTG

SEQ ID NO.23(5’>3’方向)：GAACCGAATTTGAG

SEQ ID NO.24(5’>3’方向)：GAACAGAATTTGTG

恒温扩增反应体系共计20μL，该体系中包括以下组分：1×NE Buffer 3.1,0.6units/μL Nb.BsrDI Nicking Enzyme,0.32units/μL Bst 3.0DNA Polymerase,400μMdNTP(Promega),1×Evagreen(biotium),250fm(体系终浓度)SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.21～24均为1fm(6×10⁸个拷贝)。反应条件为：60℃，53min。所用设备为ViiA^TM7Real-Time PCR System(ABI)。

结果如图8所示，当SEQ ID NO.19～20置于单个反应管时靶分子能以指数形式扩增，通过环形信号扩增模板形成DNA双链，释放荧光指示靶分子浓度。当SEQ ID NO.21～24置于单个反应管时，miRNA单碱基突变的模拟分子并不能被SEQ ID NO.20识别并扩增，表明SEQ ID NO.20的特异性非常好。通过在线软件DINAMelt分析，Tm值60℃时，该体系中具有3’-OH寡核苷酸SEQ ID NO.21～24与SEQ ID NO.20处于游离状态，而SEQ ID NO.19与SEQID NO.20形成亚稳定的双链DNA结构，从而极大地提高了反应体系的触发扩增特异性。

实施例5

环形信号扩增模板功能验证

为了进一步证明该发明的优越性，灵活性。采用限制性内切酶HindⅢ的识别序列来设计信号扩增模板，该类酶具有常规限制性内切酶的功能，能够识别并在天然双链核酸分子限制性内切酶的识别序列处同时酶切双链核酸分子的两条链。但是，当双核酸分子中的一条在RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：α巯基-脱氧核苷酸-脱氧核苷酸(α-thiodeoxynucleotide)时，该衍生核苷酸可阻止限制性内切酶切割该核酸分子链，因此，只能切割另一条不含有衍生核苷酸的天然分子链。这种半修饰RESR使限制性内切酶具有与缺口内切酶相似的功能，即识别双链切割单链，因此可用于制备双链核酸分子缺口。同时，使用与限制性内切酶的反应温度(37℃)相同的Klenow DNA聚合酶。

根据miRNA等天然存在且具有3’-OH的小片段核酸分子，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸和环形信号扩增模板，其中，SEQ ID NO.1(TS)是miRNA模拟分子，具有可触发其自身延伸的3’-OH，SEQ ID NO.2是SEQ ID NO.1环形引物信号扩增模板，其5’-端至3’-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与TS互补的第一区寡核苷酸序列；②HindⅢ限制性内切酶识别序列5’-AαSAαSGCTT-3’的第二区核苷酸序列(下划线标注)；③与第一区寡核苷酸序列相同的第三区核苷酸序列；④与第二区核苷酸相同的第四区核苷酸序列(下划线标注)；⑤第一区的5’-PO₄与第四区3’-OH缩合反应形成环形寡核苷酸链即环形信号扩增模板。

SEQ ID NO.25(HQ-1067H,5’>3’方向)：CCTACGACTGG AαSAαS GCTTCCTACGACTGG A αSAαSGCTT

备注：字母AαS代表α巯基-三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP[αS])，半修饰RERS序列为5’-AαSAαSGCTT-3’。

恒温扩增反应体系的构建:恒温扩增反应体系共计20μL，该体系中包括以下组分：1×NE Buffer 2.1，0.5units/μL HindⅢ,0.25units/μL Klenow DNA Polymerase(NEB),400μM dNTP(Promega)，1×Evagreen(biotium)，250fm(体系终浓度)SEQ ID NO.25，1fm(6×10⁸个拷贝)SEQ ID NO.1。反应条件为：37℃，53min，所用设备为ViiA^TM7Real-Time PCRSystem(ABI)。

结果如图9所示，从扩增曲线分析，该扩增由线性扩增达到指数扩增，35min达到域值。无非特异性扩增曲线出现，表明该体系能够有效区分特异扩增与非特异扩增。进一步证明，本发明可通过适当调整缺口酶，聚合酶种类以及反应温度，以达到扩增或检测目的，用途广泛，使用灵活。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军特色医学中心

<120> 一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板及其应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccagtcgtag g 11

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctacgactg ggcaatgcct acgactgggc aatg 34

<210> 3

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccagtcgtaa g 11

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggtcgtag g 11

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaatcgtag g 11

<210> 6

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaggcgtag g 11

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagactgatg ttga 14

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaacatcag tctggcaatg tcaacatcag tctggcaatg 40

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caaactgatg ttga 14

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggctgatg ttga 14

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagactaatg ttga 14

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagactgatg ttaa 14

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttttggtgt tcag 14

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgaacacca aaaggcaatg ctgaacacca aaaggcaatg 40

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgttggtgt tcag 14

<210> 16

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttttggtgt acag 14

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cttttggtgt gcag 14

<210> 18

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cttttagtgt tcag 14

<210> 19

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaaccgaatt tgtg 14

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cacaaattcg gttcgcaatg cacaaattcg gttcgcaatg 40

<210> 21

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gagccgaatt tgtg 14

<210> 22

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaaccgaagt tgtg 14

<210> 23

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaaccgaatt tgag 14

<210> 24

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaacagaatt tgtg 14

Claims

1.一种用于寡核苷酸扩增的环形信号扩增模板，其特征在于，所述环形信号扩增模板为一条闭合的环形寡核苷酸链，其特征在于，所述环形寡核苷酸链含有两条部分或完全与靶序列互补的片段，两条片段通过两条缺口剂识别序列相互连接形成闭合环；具体地，5’端到3’端依次为：

第一区：第一片段；

第二区：缺口剂识别序列正义链；

第三区：第二片段；

第四区：缺口剂识别序列正义链；

2.根据权利要求1所述的环形信号扩增模板，其特征在于，所述第一区与所述第三区的碱基个数均为8-40个。

3.根据权利要求1所述的环形信号扩增模板，其特征在于，所述第一区与所述第三区的序列部分或完全相同，所述第二区与所述第四区的序列部分或完全相同。

4.根据权利要求1所述的环形信号扩增模板，其特征在于，所述缺口剂识别序列是为满足缺口酶、限制性内切酶或CRISPR/Cas系统检测需求的片段。

5.权利要求1所述环形信号扩增模板在寡核苷酸定性和定量检测中的应用。

6.权利要求1所述环形信号扩增模板在制备寡核苷酸定性和定量检测试剂盒中的应用。

7.利用权利要求1～5中任一项所述的环形信号扩增模板进行寡核苷酸扩增的方法，其特征在于，所述环形信号扩增模板与靶序列识别并杂交时，靶序列在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链，通过缺口剂识别双链切割单链，释放扩增的寡核苷酸，使靶序列通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子的指数扩增。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为恒温扩增，扩增温度为37～70℃。

9.一种寡核苷酸的定性和定量检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)根据靶序列，设计并合成环形信号扩增模板；

10.根据权利要求9所述的定性和定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述恒温扩增反应体系还包含：有3'-端羟基的靶分子，DNA聚合酶，识别缺口剂识别序列的缺口酶，三磷酸脱氧核苷，非特异性的荧光染料，满足上述DNA聚合酶和缺口酶生物学活性的离子与缓冲体系；

所述的DNA聚合酶是具有链替换活性的DNA聚合酶；或者，DNA聚合酶不具有链替换活性，且在所述反应体系中加入具有链置换活性的生物活性分子；DNA聚合酶是RNA依赖性DNA聚合酶；或者，DNA聚合酶是DNA依赖性DNA聚合酶；