CN101443458A

CN101443458A - 扩增dna片段

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Publication number: CN101443458A
Application number: CNA2007800172203A
Authority: CN
Inventors: 彼得·L·莫洛伊; 基思·兰德
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2009-05-27
Anticipated expiration: 2027-03-28
Also published as: DE602007011237D1; ES2357746T3; CN101443458B; JP2009531035A; US20100233683A1; JP5336350B2; AU2007231546A1; US8501403B2; EP2004852A4; ATE491809T1; AU2007231546B2; EP2004852B1; WO2007109850A1; EP2004852A1

Abstract

本发明提供了检测核酸分子的方法，所述核酸分子在邻近3’末端处具有靶序列。本发明还提供了区分在邻近3’末端处具有靶序列的核酸分子与在分子内嵌入相同靶序列的核酸分子的方法。

Description

扩增DNA片段

发明领域

本发明涉及区分在邻近3’末端处具有特定序列的核酸分子与在分子内嵌入相同序列或不含该序列的核酸分子。本发明还涉及区分在邻近3’末端处具有不同序列的核酸分子。本发明具体涉及在共有相同靶序列的未裂解DNA的存在下选择性扩增裂解DNA的方法。

发明背景

聚合酶链反应(PCR)基于双链DNA变性、接着寡核苷酸引物与DNA模板退火并通过DNA聚合酶进行引物延伸这三个步骤的重复循环(参见例如Mullis et al美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159)。PCR所用寡核苷酸引物被设计成与DNA的互补链退火，且所处的位置能使一个引物经DNA聚合酶-催化的延伸产物可用作另一个引物的模板链。PCR扩增法导致分离的DNA呈现出指数增加，所述DNA的长度受寡核苷酸引物的5’末端限制。

在其标准应用中，选定的引物与靶基因组内的序列匹配，并侧翼于待扩增的DNA区域。此外，大量的PCR变异形式已被描述，其中接头与DNA片段的末端相连接，然后接头中的序列被用于引发DNA扩增。连接-介导PCR先被用于DNA足迹法和测序反应，其中通过DNaseI消化或化学裂解(Mueller and Wold，1989 and Pfeifer et al.1989)产生DNA末端，并延伸至通过限制性消化形成的末端(Steigerwald et al.1990)。通过联合使用针对特定靶区域的引物与靶向添加的接头的引物即可获得特异性。技术的变异形式具有下述的一系列用途：基因组测序和DNA甲基化分析、染色体步查、鉴定染色体整合或重组位点、研究突变断裂点和mRNA末端。连接-介导PCR也可用于完整基因组的扩增，其中扩增的是具有连接末端的整个分子群体(Schumaker et al.，2006)。

尽管连接-介导PCR具有广泛的用途，但目前仍需要改良的基于PCR的方法学，所述方法学能选择性扩增具有3’末端的DNA，并具有简单方便、特异性强的优点。

发明简述

本发明提供了区分在邻近3’末端处具有特定序列的核酸分子与在分子内嵌入相同靶序列或不含该序列的核酸分子的方法。3’末端可以源自例如限制性酶裂解或其它特异性的酶解或化学裂解，或者，3’末端也可以是PCR产生的扩增子的游离末端，以及诸如染色体、病毒或噬菌体之类的天然DNA的游离末端，或者，3’末端也可以由RNA模板逆转录而产生，或通过任何其它能产生具有3’末端的核酸的方法而产生。

根据本发明的一个实施方案，本文也将其称为“末端-特异性PCR”或ES-PCR，位于核酸分子3’末端邻近处的核苷酸序列被用于引发扩增反应，所述反应仅当这些序列邻近于3’末端时才会发生，而当这些序列嵌入核酸分子内部时则不会发生。

为了达到区分的目的，所使用的寡核苷酸(下文的“模板寡核苷酸”)应具有与靶序列互补的3’部分，以及当寡核苷酸与核酸退火时能形成5’尾的5’部分。当模板寡核苷酸与位于3’末端邻近处的靶序列退火时，在适当的聚合酶存在下，通过游离3’末端的延伸可以复制5’尾。当模板寡核苷酸与嵌入核酸分子内的靶序列退火时，由于缺乏游离的3’末端，不会发生5’尾的复制。由于其5’尾被用作位于3’末端邻近处的靶序列3’延伸的模板，因此本文将目前所述的寡核苷酸称为模板寡核苷酸。

当靶序列邻近于3’末端时，5’尾的复制导致靶向的核酸分子的3’末端添加了新序列，它可用于在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子随后的选择性扩增。

例如，当3’末端是限制性酶裂解产物时，将会发生越过未裂解的DNA而仅选择性地扩增裂解的DNA。

在一个实施方案中，模板寡核苷酸掺入了使寡核苷酸的3’延伸延迟的修饰，与此同时，其5’尾通过靶序列延伸而进行的复制无阻碍地继续进行。因此，可以选择模板寡核苷酸3’区域的核酸序列，以使在所用条件下，与靶序列的杂交不稳定，进而，在5’尾不复制的情况下，模板寡核苷酸与嵌入核酸分子内的靶序列的杂交受到抑制。同模板寡核苷酸与嵌入核酸分子内的靶序列的退火(5’尾不会复制)相比，5’尾的复制增强了模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列的退火。

模板寡核苷酸增强的退火反过来会提高模板寡核苷酸3’延伸发生的效率，籍此，联合另一个在反方向上引发的模板寡核苷酸，或与靶向核酸分子内别处的序列互补的反向引物，使靶序列的扩增得以进行，从而特异性检测或扩增所需的分子，即在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子。

靶向核酸分子3’末端(通过寡核苷酸5’尾的复制)新掺入的序列也可用于扩增靶向核酸分子。

因此，在本发明的一个实施方案中，使样品与模板寡核苷酸一起保温，所述寡核苷酸的3’部分含有与邻近于靶向核酸分子3’末端的靶序列基本上互补的序列，其5’部分形成5’尾。模板寡核苷酸掺入了使自其3’末端起的延伸延迟的修饰。在适当聚合酶的存在下，模板寡核苷酸的5’尾通过自3’末端起的靶序列延伸而被复制。靶序列的3’延伸导致以下结果：同其与嵌入核酸分子内的靶序列的退火相比，模板寡核苷酸的退火有所增强，因此，当模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列退火时，可促进其3’延伸。随后，模板寡核苷酸自身或新掺入的序列(本文称之为“第三寡核苷酸”)可单独使用，或与靶向分子内的序列联合使用，从而特异性检测或扩增所需的靶序列，即邻近于3’末端的序列。

本发明的方法与连接-介导PCR的不同之处在于：本发明无需连接步骤，序列特异性直接掺入靶向核酸3’末端的模板寡核苷酸。

因此，本发明的一个方面提供了在含有非邻近于3’末端而是嵌入分子内部的靶序列的分子存在时，从样品中选择性扩增在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(a)3’区域，其与邻近于核酸分子3’末端的靶序列基本上互补；

(b)5’尾，其含有核酸序列，使得当模板寡核苷酸与位于3’末端邻近处或嵌入核酸分子内部的靶序列退火时，能形成游离的5’尾，5’尾为靶序列的3’末端延伸提供了模板，所述靶序列中掺入与模板寡核苷酸5’尾互补的序列，导致在靶序列中添加与5’尾互补的序列；和

(c)3’区域的修饰，所述修饰延迟了所述模板寡核苷酸的3’延伸；

(ii)使样品与第二寡核苷酸，以及任选与第三寡核苷酸接触，所述第二寡核苷酸用于在与模板寡核苷酸相反的方向上引发，所述第三寡核苷酸与模板寡核苷酸的5’尾共享核苷酸序列；和

(iii)进行样品的扩增，其中

(a)在模板寡核苷酸的3’延伸延迟的情况下，通过自靶序列3’末端起的延伸，复制了模板寡核苷酸的5’尾，使得同模板寡核苷酸与非邻近于3’末端的靶序列的退火相比，模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列的退火被稳定化；和

(b)与和非邻近于3’末端的靶序列退火的模板寡核苷酸的延伸相比，随之而来的模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列的稳定化退火增强了模板寡核苷酸的3’延伸效率；和

(c)使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸与第二寡核苷酸的联合进行扩增，导致在含有嵌入分子内部的靶序列的核酸分子存在时，选择性扩增邻近于3’末端的靶序列。

核酸分子可以是DNA(包括cDNA)或RNA，或者可以是含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或天然核苷酸类似物之组合的分子。

根据本发明的方法，可以在共有相同靶序列的未裂解DNA核酸分子的存在下选择性扩增裂解的核酸分子，其中裂解导致靶序列邻近于3’末端。

因此，本发明另一方面提供了在含有嵌入分子内部的靶序列的未裂解分子存在时，从样品中选择性扩增由于分子的裂解而在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(b)5’尾，其含有核酸序列，使得当模板寡核苷酸与裂解或未裂解的核酸分子退火时，能形成游离的5’尾，5’尾为靶序列的3’末端延伸提供了模板，所述靶序列中掺入与模板寡核苷酸5’尾互补的序列，导致在靶序列中添加与5’尾互补的序列；和

(c)3’区域的修饰，所述修饰延迟了模板寡核苷酸的3’延伸；

(iii)进行样品的扩增，其中

(a)在模板寡核苷酸的3’延伸延迟的情况下，通过自靶序列3’末端起的延伸，复制了模板寡核苷酸的5’尾，使得同模板寡核苷酸与未裂解的核酸分子中非邻近于3’末端的靶序列的退火相比，模板寡核苷酸与由于核酸分子的裂解而邻近于3’末端的靶序列的退火被稳定化；和

(b)与和未裂解的核酸分子退火的模板寡核苷酸的延伸相比，随之而来的模板寡核苷酸与裂解的核酸分子的稳定化退火增强了模板寡核苷酸的3’延伸效率；和

(c)使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸与第二寡核苷酸的联合进行扩增，导致选择性扩增邻近于3’末端的靶序列而不是嵌入核酸分子内部的靶序列，导致选择性扩增裂解的核酸分子而不是未裂解的核酸分子。

在一个实施方案中，裂解和未裂解的核酸分子是DNA分子。

除了区分具有邻近于3’末端的靶序列的核酸分子与具有嵌入分子内部的靶序列的核酸分子外，模板寡核苷酸还可区分不同之处在于邻近于3’末端的序列的核酸分子，即区分3’末端。这是因为模板寡核苷酸的3’区域含有特异于靶序列的核苷酸序列，通常的情况是序列-特异性的寡核苷酸引物。因此，即可从样品的多个3’末端中选定邻近于3’末端的靶序列。值得注意的是，由于模板寡核苷酸与核酸分子退火时形成了5’尾，模板寡核苷酸与邻近于3’末端的核酸序列之间的错配会阻碍5’尾的复制，靶DNA序列3’末端的延伸也同样会受到阻碍。可使用这样的排列来设计模板寡核苷酸，该寡核苷酸不仅能区分邻近于3’末端的靶序列和嵌入分子内部的靶序列(经由5’尾)，还能区分邻近于3’末端的序列有差别的3’末端。

因此，本发明的另一方面提供了在混合3’末端群体的存在下，从样品中选择性扩增在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(a)3’区域，其与邻近于3’末端的靶序列基本上互补；

(b)5’尾，其含有核酸序列，使得当模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列退火时，能形成游离的5’尾，5’尾为靶序列的3’末端延伸提供了模板，所述靶序列中掺入与模板寡核苷酸5’尾互补的序列，导致在靶序列中添加与5’尾互补的序列；和

(c)3’区域的修饰，所述修饰延迟了所述寡核苷酸的3’延伸；

(iii)进行样品的扩增，其中

(a)在模板寡核苷酸的3’延伸延迟的情况下，通过自靶序列3’末端起的延伸，复制了模板寡核苷酸的5’尾，使得同模板寡核苷酸与邻近于3’末端的非互补序列的退火相比，模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列的特异性退火被稳定化；和

(b)与和邻近于3’末端的非互补序列退火的模板寡核苷酸的延伸相比，随之而来的模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列的稳定化退火增强了模板寡核苷酸的3’延伸效率；和

(c)使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸与第二寡核苷酸的联合进行扩增，导致在混合3’末端群体的存在下选择性扩增邻近于3’末端的靶序列。

在一个实施方案中，核酸分子是DNA分子。

模板寡核苷酸的3’区域内可包括经修饰的碱基，当在核酸分子的3’末端处杂交时，该修饰会阻断核酸分子的3’延伸。

优选地，延迟模板寡核苷酸3’延伸的3’修饰包括掺入3’末端核苷酸错配、在模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域处缺失或插入、它们的组合、或任何其它能导致模板寡核苷酸3’延伸延迟的修饰。

通过靶序列3’末端延伸而进行的5’尾复制导致在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子的选择性扩增。当5’尾不复制时，由于模板寡核苷酸3’区域的修饰延迟或阻碍了3’延伸，使模板寡核苷酸的退火不稳定，退火的模板寡核苷酸的3’延伸要么不发生，要么就以不显著的速率发生。因此，5’尾的复制会增强退火，从而提高模板寡核苷酸3’延伸的效率。

通过阻断模板寡核苷酸的3’延伸，也可选择性扩增邻近于3’末端的靶序列。当模板寡核苷酸的3’延伸被阻断时，将另一个与模板寡核苷酸的5’尾共享序列的第三寡核苷酸用于扩增反应，以使热循环扩增得以进行下去。因此，由于延伸被阻断，但更重要的是由于未发生5’尾复制，与嵌入核酸分子内部的靶序列退火的模板寡核苷酸的3’延伸不会发生，结果，使用第三寡核苷酸的核酸扩增不会扩增出位于核酸分子内部的靶序列。

另一种会发生模板寡核苷酸的3’延伸，但仍可以实现本发明的选择性扩增的不同方法包括使用在靶序列内被修饰的模板寡核苷酸，以防止通过扩增沿着寡核苷酸的反方向进行复制。防止复制的修饰包括在模板寡核苷酸的3’区域插入能通过试验中所用的特定聚合酶阻碍或阻断寡核苷酸复制的一个或多个碱基类似物或一个或多个脱碱基位点，或它们的任意组合。结果，模板寡核苷酸的延伸产物在随后的PCR循环中不能被复制。例如，如果在DNA扩增中使用Taq DNA聚合酶，用RNA核苷酸，如2-O-甲基RNA核苷酸取代DNA核苷酸仍可以使模板寡核苷酸与靶序列杂交。然而，由于存在经修饰的核苷酸，沿着模板寡核苷酸的反方向进行的复制会被阻断或失效。不完整的拷贝不会参与下一步的扩增循环。为了使热循环进行下去，可利用与模板寡核苷酸的5’尾共享序列的第三寡核苷酸，因此，仅仅会扩增出在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子，所述3’末端是被延伸的与5’尾互补的3’末端。

因此，本发明的另一方面提供了在含有非邻近于3’末端而是嵌入分子内部的靶序列的分子存在时，从样品中选择性扩增在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(c)3’区域的修饰，所述修饰阻断了所述模板寡核苷酸的3’延伸，或在模板寡核苷酸的杂交区域具有修饰，所述修饰允许3’延伸，但阻碍或阻断了所述寡核苷酸3’区域中所述寡核苷酸的复制；

(ii)使样品与第二寡核苷酸接触，所述第二寡核苷酸用于在与模板寡核苷酸相反的方向上引发；

(iii)使DNA样品与第三寡核苷酸接触，所述第三寡核苷酸与模板寡核苷酸的5’尾共享核苷酸序列，并且可以使3’延伸不受阻碍地进行下去；和

(iv)进行样品的扩增，其中

(a)在模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的3’延伸虽未被阻断但随后由其导致的复制受阻碍或被阻断的情况下，当模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列退火，而不是当模板寡核苷酸与嵌入核酸分子内部的靶序列退火时，模板寡核苷酸与样品中的核酸分子退火之后，模板寡核苷酸的5’尾发生复制；和

(b)用第二和第三寡核苷酸进行扩增，利用复制的5’尾选择性扩增邻近于3’末端的靶序列，由于5’尾不复制，模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的复制被阻断，嵌入核酸分子内部的靶序列的扩增无法进行下去。

因此，本发明另一方面提供了在含有嵌入分子内部的靶序列的未裂解核酸分子存在时，从样品中选择性扩增由于分子的裂解而在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使DNA样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(iii)使样品与第三寡核苷酸接触，所述第三寡核苷酸与模板寡核苷酸的5’尾共享核苷酸序列，并且可以使3’延伸不受阻碍地进行下去；和

(iv)进行样品的扩增，其中

(a)在模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的3’延伸虽未被阻断但随后由其导致的复制受阻碍或被阻断的情况下，在模板寡核苷酸与因核酸分子的裂解而产生的3’末端邻近处的靶序列退火之后，而不是当模板寡核苷酸与嵌入未裂解的核酸分子内部的靶序列退火时，模板寡核苷酸的5’尾发生复制；和

(b)用第二和第三寡核苷酸进行扩增，利用复制的5’尾序列选择性扩增邻近于3’末端的靶序列，由于5’尾不复制，模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的复制被阻断，嵌入未裂解分子内部的靶序列的扩增无法进行下去，导致选择性扩增裂解的核酸分子而不是未裂解的核酸分子。

因此，本发明的另一方面提供了在具有不同3’末端的混合分子群体的存在下，从样品中选择性扩增在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(a)3’区域，其与邻近于3’末端的靶序列基本上互补；

(b)5’尾，其含有核酸序列，使得当模板寡核苷酸与位于3’末端邻近处的靶序列退火时，能形成游离的5’尾，5’尾为靶序列的3’末端延伸提供了模板，所述靶序列中掺入与模板寡核苷酸5’尾互补的序列，导致在靶序列中添加与5’尾互补的序列；和

(c)3’区域的修饰，所述修饰阻断了模板寡核苷酸的3’延伸，或在模板寡核苷酸的杂交区域具有修饰，所述修饰允许3’延伸，但阻碍或阻断了所述寡核苷酸3’区域中所述寡核苷酸的复制；

(iv)进行样品的扩增，其中

(a)在模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的3’延伸虽未被阻断但随后由其导致的复制受阻碍或被阻断的情况下，当模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列退火，而不是当模板寡核苷酸与邻近于3’末端的非互补序列退火时，模板寡核苷酸与靶序列的特异性退火之后，模板寡核苷酸的5’尾发生复制；和

(b)用第二和第三寡核苷酸进行扩增，利用复制的5’尾序列选择性扩增邻近于3’末端的靶序列，由于5’尾不复制，模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的复制被阻断，邻近于3’末端的非互补序列的扩增无法进行下去，导致在混合3’末端群体的存在下选择性扩增出邻近于3’末端的靶序列。

在一个实施方案中，核酸分子是DNA分子。

模板寡核苷酸可在其3’区域内包括经修饰的碱基，当在核酸分子的3’末端处杂交时，该修饰可阻断该分子的3’延伸。

优选地，能阻断模板寡核苷酸的3’延伸的3’修饰包括在3’末端掺入一个或多个不可延伸的组成成分或核苷酸类似物，例如单个3’末端不可延伸的碱基或碱基类似物，3’末端不可延伸的碱基与模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域的核苷酸错配的组合，或在模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域掺入脱碱基位点。更优选不可延伸的碱基选自2’，3’双脱氧核苷酸、3’C3，C18或其它长度的间隔区、3’磷酸化核苷酸、“肽核酸”碱基、“锁定核酸”(LNA)碱基、核苷酸胺衍生物、用尿嘧啶DNA糖基化酶处理过的尿嘧啶、RNA或2’O-甲基RNA残基、或其组合。

本领域技术人员应理解：根据所用聚合酶的特性，也可使用其它阻断延伸的方法。例如，当需要使用校正聚合酶时，可联合使用硫代磷酸碱基和核苷酸错配来阻断延伸。

优选第二寡核苷酸是另一个模板寡核苷酸，即具有模板寡核苷酸的特征，或是非-模板寡核苷酸，例如，在模板寡核苷酸的3’延伸仅被延迟而不被阻断的情况下，由与模板寡核苷酸延伸产物互补的核苷酸序列的单个区域组成，或在模板寡核苷酸的3’延伸被阻断的情况下，由与第三寡核苷酸延伸产物互补的核苷酸序列的单个区域组成。

在优选实施方案中，通过ES-PCR扩增的DNA分子的3’末端是由序列-特异性限制性内切核酸酶裂解产生的。更优选限制性内切核酸酶是序列-特异性甲基化敏感型限制性酶，所述酶可允许根据本发明的方法选择性扩增未被甲基化的DNA而不是甲基化的DNA，或者反之，这取决于使用的限制性酶是受DNA甲基化抑制的酶，如HpaII，HhaI，BstuI，NotI，SmaI和SacII，还是选择性切割甲基化DNA的酶，如GlaI和BisI。按照此方式，本发明的方法可以检测两个DNA样品之间甲基化状态的差异，从而提供一种用于检测患病组织的方法，所述组织中甲基化的改变与患病状况有关。例如，既涉及到DNA的脱甲基化，也涉及到其它特异性DNA序列的过度甲基化的甲基化状态的改变与细胞向癌症状态转化有关。因此，另一方面，本发明提供了一种试剂盒，用于从含有裂解和未裂解DNA的DNA样品中选择性扩增裂解的DNA，根据本发明，该试剂盒含有(i)模板寡核苷酸，(ii)第二寡核苷酸，和(iii)第三寡核苷酸。

在另一个优选的实施方案中，选择DNA的裂解位点以区分限制性位点的存在或缺乏，从而检测出DNA样品之间的序列差异，如检测出单核苷酸多态性或突变。因此，本发明的方法可以进行基因型分型，其目的是进行基因指纹分析，或诊断与基因组序列改变有关的遗传病，或检测可能是癌细胞标志的特异性突变。

根据本发明的另一个实施方案，可以检测简单核苷酸重复，包括单核苷酸重复的不稳定性，如一个或多个碱基对的缺失。可以利用单核苷酸重复附近限制性酶识别序列的存在来区分缺失变体的存在，所述限制性酶在距其识别序列外侧特定距离处具有裂解位点，本文称之为“侧翼切割者(flanking cutter)”。如果该限制性位点不是方便地位于单核苷酸重复附近，可通过例如第一轮PCR导入该限制性位点。当裂解位点和识别序列之间出现碱基对缺失时，未发生缺失的重复DNA的消化产物3’末端的核苷酸序列与发生缺失的重复DNA的消化产物3’末端核苷酸序列会有所不同。这是因为一个或多个碱基对的缺失会导致裂解位点3’方向上的移位，必然导致裂解位点序列的改变。因此，可使用与缺失变体特异性退火的模板寡核苷酸设计来检测该变体。

例如，可在模板寡核苷酸中掺入一段互补的单核苷酸重复，该重复与消化缺失变体所得的DNA片段中的单核苷酸重复相匹配，其中所述变体的重复序列中缺失了至少一个碱基对。模板寡核苷酸的重复序列可与邻近于消化片段3’末端的互补重复序列退火，但仅允许缺失变体消化片段进行3’延伸。这是因为由未缺失的重复DNA产生的片段必然具有不同于缺失变体所产生片段的核苷酸序列，导致模板寡核苷酸与消化片段3’末端之间的一个或多个错配，从而防止未缺失重复DNA的消化片段进行3’延伸。该模板寡核苷酸设计不仅不会改变其选择性扩增邻近于3’末端的靶DNA而不是嵌入DNA分子内部的相同靶序列的能力，还表现出另外的能力，即区分具有某种3’末端的DNA的能力。

无论限制性位点位于重复序列内部还是重复序列下游，重复序列长度的变化会导致限制性酶裂解位点的改变，导致所产生片段的序列不同于未经缺失的重复DNA所产生的片段。

检测单核苷酸重复的不稳定性，如一个或多个重复的缺失提供了一种方法，该方法可用于测定肿瘤细胞微卫星中出现的微卫星不稳定性。本领域技术人员应理解本发明的此特定技术方案同样适用于检测二核苷酸或其它重复，如三核苷酸和四核苷酸重复的不稳定性，所述重复中按上文所述适当安置(或导入)了限制性酶识别位点。

利用侧翼切割者的本发明的实施方案也可用于检测核酸分子中碱基对的插入。

当碱基对插入导致产生核酸变体时，5’方向会发生裂解位点的移位，从而导致与不存在插入相比，因裂解产生的3’末端的邻近处具有不同序列。本领域技术人员清楚地知道可使用侧翼切割者检测任何核酸分子中的缺失或插入，侧翼切割者的使用不限于检测单核苷酸重复序列中的缺失，同样可用于因一个或多个碱基对的缺失或插入而产生的任何核酸分子。

因此，本发明的另一方面提供了检测样品中的核酸分子是否存在缺失或插入的方法，其中缺失或插入发生在限制性酶识别位点与其位于识别位点外侧特定距离处的裂解位点之间，所述方法包括

(i)用限制性酶消化样品，所述限制性酶在距其识别序列外侧特定距离处具有裂解位点，和

(ii)测定通过裂解产生的3’末端邻近处的核苷酸序列，其中3’末端邻近处的核苷酸序列取决于是否存在缺失或插入，其中当存在缺失或插入时，分别在3’或5’方向上出现裂解位点的移位。

通过ES-PCR或通过其它选择性扩增方法，可测定因侧翼切割者的裂解而产生的3’末端邻近处的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，可使用本发明的方法测定和定量RNA转录物变体。复制成cDNA的mRNA根据其相应的5’mRNA序列将会含有具有一系列不同3’末端的cDNA群体。在已知外显子序列的情况下，根据第一个外显子的序列同一性可制备出模板寡核苷酸，在可变剪接的mRNA之间，所述寡核苷酸有所区别。

仅当模板寡核苷酸与3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子退火时，本发明模板寡核苷酸的5’尾为靶序列3’末端的延伸提供模板。与模板寡核苷酸5’尾互补的靶序列3’末端的延伸导致在靶序列中添加了与5’尾互补的序列。因此，在允许模板寡核苷酸与靶序列退火，以及与模板寡核苷酸5’尾互补的靶序列进行3’延伸的反应条件下，样品中原先在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子现在在靶序列的5’方向上还包括与模板寡核苷酸5’尾互补的其它序列。可使用与5’尾互补的该序列检测样品中原先存在的在3’末端邻近处具有靶序列的分子。

因此，本发明另一方面提供了检测样品中在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(ii)提供允许模板寡核苷酸与样品退火的反应条件，其中模板寡核苷酸与3’末端邻近处靶序列的退火能使与5’尾互补的靶序列进行随后的3’延伸；

(iii)在所述寡核苷酸的3’延伸被延迟或阻断的情况下，提供允许与5’尾互补的靶序列进行3’延伸的反应条件；和

(iv)通过下述方法检测在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子

(1)检测因3’末端邻近处靶序列的3’延伸而产生的与模板寡核苷酸5’尾互补的核酸序列；或

(2)利用因3’末端邻近处靶序列的3’延伸而产生的与模板寡核苷酸5’尾互补的核酸序列来复制在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子。

通过任何已知的检测已知序列核酸分子的方法，可以检测与模板寡核苷酸5’尾互补的核酸序列，所述方法例如用放射性标记或荧光标记的核苷三磷酸，如α³²P-dCTP或Cy5-dCTP或生物素化的核苷三磷酸直接标记与5’尾互补的靶序列的3’延伸反应产物，或通过杂交用序列特异性探针捕获掺入的互补序列，或直接捕获与模板寡核苷酸5’尾互补的核酸序列。

可通过多种方法将与模板寡核苷酸5’尾互补的核酸序列用于复制在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子。例如，可使用与掺入序列互补的引物来引发沿着靶序列反方向延伸的合成。或者，模板寡核苷酸的5’尾可为诸如T7RNA聚合酶的聚合酶提供启动和起始位点，使得5’尾互补序列的添加为通过聚合酶沿着靶序列进行的复制提供模板。通过任何已知的检测已知序列核酸分子的方法，如上文上述的包括杂交和PCR的方法，可以检测被复制的在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子。

本领域技术人员非常清楚由RNA复制的cDNA是适用于本发明的核酸。

除非另有说明，整个说明书中的术语“含有”、“包含”、“包括”应被理解成暗指包括提到的一个或一组步骤或成分，但并不排除任何一个或一组其它步骤或成分。

本文所用冠词“一个”指的是一个或一个以上(即至少一个)冠词语法上的宾语。例如，“一个成分”指的是一个成分或一个以上的成分。

附图简述

图1：以图解的方式概述了选择性扩增裂解DNA而不是未裂解DNA的末端-特异性PCR的原理。

图2：经BstIU-裂解的DNA和未裂解DNA(人21号染色体21q22.3.带上的串联重复序列)上21qTFMLHC/T和21qTRC的引物位点，对应于根据本发明实施方案的具有3’末端核苷酸错配的末端-特异性寡核苷酸引物，以及在反方向上引发的第二寡核苷酸引物。

图3：显示出下述物质Ct值的扩增曲线和表格(i)完全甲基化的DNA(CpGenome^TM，Chemicon International，Inc.)和K562甲基化不足的DNA(hypomethylated DNA)；(ii)分别得自匹配的正常组织样品和结肠直肠肿瘤组织样品29/99和30/99的DNA；(iii)分别得自匹配的正常组织样品和结肠直肠肿瘤组织样品34/03和35/03的DNA。

图4A：皆为末端-特异性模板寡核苷酸的正向引物21qTFMLHC/T和反向引物21qTRM13的引物位点，所述位点位于人21号染色体21q22.3.带上的串联重复序列中。

图4B：显示出Ct值的表格和SYBR Green扩增曲线，所述曲线表明：在检测到完全甲基化的K562 DNA之前，早就能检测到甲基化不足的K562DNA。在先于仅含完全甲基化DNA的样品7个循环之前，即可清楚地检测到0.1％ K562 DNA样品水平(一个基因组当量)。

图5A：具有3’末端核苷酸错配的末端-特异性模板寡核苷酸MycRM1和反向引物MycFC1的引物位点，所述位点位于在HpaII位点处被靶向的Myc基因内，已发现结肠直肠癌中的HpaII位点甲基化不足(Sharrard et al.1992)。

图5B：Ct值表格和扩增曲线，所述曲线表明：与完全甲基化的DNACpGenome^TM相比，检测到K562 DNA中甲基化不足的myc DNA；与其匹配的正常样品34/03相比，检测到结肠直肠肿瘤组织35/03中HpaII位点处减少的甲基化。

图6A：靶向LINE逆转录转座因子的5’(启动子)区域的引物位点，其对应于用作正向和反向扩增引物的插入模板寡核苷酸，以及HEX-标记的LPAHex探针的核苷酸序列。

图6B：用SYBR Green或HEX-标记的探针检测到的、由实质上甲基化不足的K562 DNA或完全甲基化DNA扩增得到的扩增曲线和显示出Ct值的表格。

图7A：根据本发明的实施方案，用通过磷酸基团阻断3’延伸的模板寡核苷酸(对应于在反方向上引发的第二寡核苷酸引物)和在正方向上引发的JOELUX引物靶向Alu元件共有序列中第一个BstUI位点的引物位点。

图7B：由实质上甲基化不足的K562 DNA或甲基化CpGenome DNA扩增得到的扩增曲线和显示出Ct值的表格。

图8A：通过hMLH1基因CpG岛内的GlaI位点靶向甲基化DNA的引物位点。模板寡核苷酸的3’末端掺入了3个错配，当用尿嘧啶DNA糖基化酶消化时，其中两个错配转变成脱碱基位点，对应于根据本发明实施方案的MLHRev3反向引物和正向LUX引物。

图8B：由甲基化CpGenome DNA或非甲基化DNA扩增得到的扩增曲线和显示出Ct值的表格。

图9A：检测BRAF基因中的点突变。根据突变位点T→A颠换的存在(靶序列中的下划线部分)，第一轮PCR引物BRFMX可用于导入XbaI限制性位点。

图9B：检测BRAF基因中的点突变。ES-PCR引物BRFU与外部重叠JOELUX引物和反向引物BRF2联合使用。

图9C：显示出结肠直肠癌细胞系WiDr中突变BRAF基因的选择性扩增的扩增曲线。

图10A(i)：邻近于Bbr7I限制性位点的单核苷酸重复的限制性酶裂解产物。

图10A(ii)和10A(iii)：裂解分子下方的那条链使用末端转移酶的延伸产物，以及与延伸产物退火的引物。

图10A(iv)：与图10A(i)所示的短和长分子经裂解后下方的那条链进行ES-PCR退火的模板寡核苷酸。

图10B(i)：在邻近于MmeI限制性位点处具有9或10个重复的A的分子。

图10B(ii)：用MmeI裂解图10B(i)所示分子的产物。

图10B(iii)：显示出源自具有9个A的分子(图10B(i))的图10B(ii)所示分子裂解末端特异性连接的接头连接。

图10B(iv)：与“9”和“10”分子经裂解后下方的那条链进行ES-PCR退火的模板寡核苷酸。

图11A(i)：显示出MboII位点位置和反向引物序列的NR22微卫星区域。

图11A(ii)和11A(iii)：在用MboII消化后，用于扩增NR22微卫星中不同长度的单核苷酸重复的两个模板寡核苷酸F1NR22-0和J5NR22-4的序列。

图11B(i)和11B(ii)：显示出血液DNA和NR-22微卫星内携有缺失的HCT116细胞DNA的扩增结果的扩增曲线。

图12A：图解显示了用限制性酶进行的消化，所述酶在距其识别序列外侧特定距离处具有裂解位点，由于识别序列和裂解位点之间插入了4bp，裂解位点发生了移位。仅当识别序列和裂解位点之间存在插入时，才会发生经消化DNA的3’延伸，这是因为模板寡核苷酸中存在2’O-甲基核苷酸(下划线)，当2’O-甲基核苷酸与经消化DNA的3’末端杂交时，会阻断经消化DNA的3’延伸。当DNA中具有插入时，裂解位点发生了移位，使得模板寡核苷酸的2’O-甲基核苷酸不再与3’末端杂交。

图12B：用于ES-PCR选择性扩增1bp或4bp插入突变的寡核苷酸。模板寡核苷酸利用2’O-甲基核苷酸阻断经裂解靶DNA3’末端的3’延伸。

图12C：显示出包括1bp或4bp插入的DNA，而不是不具有插入的DNA，即“正常”DNA的选择性扩增的扩增曲线。

图13A和13B：以“未裂解”和“裂解”DNA表示的受试DNA序列，在一系列评价模板寡核苷酸修饰(图13B)对ES-PCR的影响的ES-PCR实验中使用的、在其3’末端通过磷酸阻断延伸的参照模板寡核苷酸AluPhB，以及第二和第三寡核苷酸。

图13C：显示出使用图13B给出的不同模板寡核苷酸得到的ES-PCR结果的扩增曲线。

定义

本发明上下文中所用的术语“样品”指的是任何含有核酸分子(一般为DNA和/或RNA)的生物样品。样品可以是组织、细胞或其提取物，或者可以是核酸分子的纯化样品。术语“样品”的使用并未暗示邻近于核酸分子3’末端或嵌入核酸分子内部的靶序列的存在。为了选择性扩增邻近于3’末端的靶序列，不需要样品中存在嵌入核酸分子内部的靶序列。因此，使用模板寡核苷酸来扩增在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子，而不用管样品中是否也存在嵌入核酸分子内部的靶序列。

本发明上下文中所用的术语“靶序列”指的是本发明的模板寡核苷酸与之特异性退火的核酸序列，所述退火凭借的是模板寡核苷酸的3’区域具有与靶序列基本上互补的核苷酸序列。当所处位置邻近于3’末端时，靶序列就是通过ES-PCR选择性扩增的典型核酸分子。

本发明上下文中所用的术语“邻近于3’末端”指的是紧接核酸分子3’末端的5’侧并向3’末端的5’侧延伸的核苷酸区域，一般包括末端核苷酸。自具有3’末端的核酸分子的末端核苷酸起始的“邻近于3’末端的”区域在长度上对应于与靶序列互补的模板寡核苷酸的3’区域。

本发明上下文中所用的术语“嵌入核酸分子内部”指的是所处位置不是上述的3’末端邻近处，而是从3’末端往3’末端的5’侧移位了至少一个核苷酸。因此，嵌入核酸分子内部的靶序列可位于核酸分子内距离3’末端一个或多个核苷酸的位置。

本发明上下文中所用的术语“靶向的分子”或“靶向的核酸分子”指的是在邻近于3’末端处具有靶序列，因此可通过本发明的方法选择性扩增的核酸分子。

本发明上下文中所用的术语“裂解的核酸分子”欲指已被限制性内切核酸酶或任何其它能产生具有3’末端的核酸的酶消化的分子，其包括已被限制性内切核酸酶或其它能产生3’末端的酶消化的DNA。

本发明上下文中所用的术语“模板寡核苷酸”指的是含有5’区域的核酸寡核苷酸，当其3’区域与核酸退火时可形成5’尾，并使得与其退火的位于核酸分子3’末端邻近处的靶序列能进行3’延伸。在本发明的某些实施方案中，由于发生了寡核苷酸的3’延伸，模板寡核苷酸被掺入PCR扩增子。此时，模板寡核苷酸被用作正向引物。

在其它实施方案中，由于寡核苷酸的3’延伸被阻断，或由于寡核苷酸3’区域的复制被阻断，模板寡核苷酸未被掺入PCR扩增子。在这些设置中，另一个与模板寡核苷酸5’尾共享序列的“第三”寡核苷酸被用作正向引物。

本发明的模板寡核苷酸可含有为了延迟或阻断3’延伸、或为了阻断寡核苷酸的复制可被掺入寡核苷酸的非-DNA核苷酸，如RNA核苷酸、核苷酸类似物或其它非-核酸分子。本领域技术人员应懂得：任何延迟或阻断寡核苷酸3’延伸或阻断寡核苷酸复制的方法都可用于本发明的模板寡核苷酸，只要选定的方法不会阻止靶序列的3’延伸即可。

本发明上下文中所用的术语“基本上互补”指的是核酸之间的互补性，所述互补性使得足够的杂交能够发生，从而根据本发明选择性扩增具有位于3’末端邻近处，而不是嵌入核酸分子内部的靶序列的核酸分子。因此，不是寡核苷酸中的所有碱基都需要与其欲杂交的分子区域互补，寡核苷酸仅需要含有足够多的互补碱基，使得寡核苷酸能识别其“靶”分子并与之杂交即可。因此，术语“基本上杂交”包含掺入了一个或多个错配、缺失、插入、缺失和插入的组合或任何其它不会阻止核酸特异性退火的序列修饰的核酸。

本发明上下文中所用的术语“延迟的3’延伸”指的是模板寡核苷酸3’延伸的进行受阻但未被阻断，使得与不存在延迟3’延伸的修饰时相比，寡核苷酸3’延伸发生的效率降低。因此，在此设置中，模板寡核苷酸将被用作扩增反应中的正向引物。

本发明上下文中所用的术语“阻断的3’延伸”指的是模板寡核苷酸的3’延伸实际上不存在，使得扩增反应不会进行，或以不可使用的速率进行，除非在反应中加入另一个“第三”寡核苷酸，该寡核苷酸与模板寡核苷酸的5’尾共享序列，由此会发生3’延伸。

本发明上下文中所用的术语“扩增”指的是制备一个或多个拷贝的靶向分子，包括但不限于通过聚合酶链反应(PCR)扩增核酸分子。PCR指的是DNA的指数扩增，除此之外，也可指DNA的线性非指数扩增，本领域技术人员应能意识到任何形式的扩增都适用于本发明。

本发明上下文中所用的术语“侧翼切割者”指的是限制性内切核酸酶，该酶在距其识别序列特定距离处裂解核酸。

发明详述

图1显示了本发明具体体现的末端-特异性PCR或ES-PCR的原理。ES-PCR取决于使用至少一种寡核苷酸，本文称之为模板寡核苷酸，它的延伸在某种程度上部分或完全地被阻断。模板寡核苷酸被设计成与通过例如限制性消化产生的核酸分子的3’末端重叠。模板寡核苷酸的3’部分与邻近于核酸分子裂解末端的特定序列基本上匹配，而5’部分含有通过模板寡核苷酸与核酸分子退火可形成尾的核酸序列。

通过模板寡核苷酸与裂解的核酸分子退火，模板寡核苷酸的延伸被延迟或阻断，但靶向分子的3’末端能被延伸，以复制模板寡核苷酸的5’尾。嵌入核酸分子内部的靶序列由于例如未被限制性酶在所需的限制性位点裂解，因此虽可与模板寡核苷酸退火，然而，因在退火位点缺乏3’末端，不会发生靶序列的3’延伸，进而也不能复制模板寡核苷酸的5’尾。重要的是，通过与模板寡核苷酸5’尾互补的游离3’末端的延伸而添加到靶序列中的核苷酸序列随后被用于扩增靶向的核酸分子。添加的序列也允许进行ES-PCR修饰，例如，掺入诸如生物素化核苷酸的标记物，所述标记物可用于选择性捕获含有延伸的3’序列的分子。本文示范使用了两种不同类型的模板寡核苷酸，然而，本领域技术人员清楚地知道本发明的方法可使用任何掺入模板寡核苷酸的3’末端，导致延伸被延迟或阻断的设计特征。

通常，本发明分析的核酸分子含有DNA。然而，本领域技术人员容易意识到本发明的方法也适用于其它核酸分子，如RNA，前提是要提供适当的试剂，例如适于扩增或复制RNA的RNA聚合酶或逆转录酶。本领域技术人员也容易意识到通过复制模板寡核苷酸5’区域而形成的掺入的尾可被直接检测，或用于通过非热循环的其它方法来复制靶核酸序列。

在一个实施方案中，模板寡核苷酸能与靶序列微弱退火，但它被设计成由于其3’末端具有精心设计的与靶序列的错配，使得模板寡核苷酸的3’延伸非常微弱。然而，如果模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列退火，使用模板寡核苷酸作为模板，可使核酸，如基因组DNA进行3’延伸。随后，模板寡核苷酸与靶向核酸分子之间杂交区域长度的增加使得模板寡核苷酸的杂交稳定化，大大增强了其目前引发和在靶核酸分子上延伸的效率。一旦错配的模板寡核苷酸掺入扩增子，PCR会有效地继续进行，因为原先错配的模板寡核苷酸现在与其靶序列完全匹配。在一个实施例中，通过联合模板寡核苷酸的短3’区域和模板寡核苷酸上的末端错配，未裂解DNA上的引发受到限制。除了末端错配外，还可以使用其它方法来限制模板寡核苷酸的引发。

在本发明利用末端错配的实施方案中，除非模板寡核苷酸5’尾的复制已经发生，否则延伸是无效的。可使用任何其它能减弱或延迟模板寡核苷酸延伸的修饰来进行ES-PCR，例如在模板寡核苷酸中掺入精心设计的短缺失或插入。

在本发明的另一个实施方案中，可用不可延伸的碱基使模板寡核苷酸在其3’末端终止，或模板寡核苷酸可包括阻止3’延伸的修饰。对于末端完全被阻断的ES-PCR寡核苷酸而言，反应还需要另一个第三寡核苷酸，以最终延伸靶向的核酸分子。所述第三寡核苷酸由模板寡核苷酸5’尾的核酸序列组成，或者可与靶序列重叠以包括一些靶-特异性序列。如果用于扩增的第三寡核苷酸引物仅由模板寡核苷酸5’尾的序列组成，就可以使用一套基因或片段-特异性的，但含有共有延伸的模板寡核苷酸多重扩增不同的核酸分子。在此实施方案中，可使用任何阻断延伸的方法，包括但不限于C3间隔区，用双脱氧核苷酸终止，磷酸化，使用胺、脱碱基位点、尿嘧啶(与尿嘧啶DNA糖基化酶一起保温)和/或2’O-甲基RNA残基。当使用不能被DNA聚合酶复制的DNA类似物时，不论模板寡核苷酸3’延伸是否进行，都可进行ES-PCR。另一种可用于本发明的变异方法是联合使用被阻断和错配的模板寡核苷酸。

模板寡核苷酸可在其3’区域内包括修饰的碱基，所述碱基当与核酸分子3’末端杂交时，会阻断该分子的3’延伸。这样就可以选择性扩增在其3’末端邻近处具有靶序列的靶DNA，所述靶DNA的3’末端不与模板寡核苷酸经修饰的碱基杂交，因此其3’延伸不会被阻断。

模板寡核苷酸可含有与靶序列互补的核苷酸序列，所述核苷酸序列跨越一个以上可能会发生核酸分子3’末端杂交的位置。因此，根据模板寡核苷酸上3’末端的杂交位置，所得的模板寡核苷酸5’尾可包括也可不包括与靶向核酸分子互补的序列。阻断杂交核酸分子3’末端的3’延伸的经修饰碱基可定位于模板寡核苷酸中一个或多个可能的位置，所述位置为以非-靶向核酸分子3’末端杂交为代表的3’末端杂交位置，以使核酸分子3’延伸的发生仅从不同于靶向核酸分子3’末端的杂交位置开始。

至于其它扩增方法，诸如退火时间、延伸时间和温度的条件取决于特异性的序列并需要分别进行优化。本发明人发现两个或多个对PCR反应有用的阶段，在设计ES-PCR时有更大的灵活性。一般说来，第一阶段一般使用较低的杂交温度和较长的保温时间，因为预期在通常较短(低Tm)的模板寡核苷酸部分上引发靶会相对无效。对于错配和插入/缺失模板寡核苷酸而言，第一阶段一般会延长保温时间，从而在通过靶序列的3’延伸而使结合稳定化之后，能进行最终的延伸。最初的5个循环之后，PCR有望主要由在其整个长度上与其靶匹配的寡核苷酸驱动，因此，第二阶段使用较高的温度(通常保温时间较短)。第二阶段可使用较短的变性时间(有时使用较低的温度-这些实施例中未显示)，因为目前在反应中占优势的PCR产物比在第一阶段显得重要的不同DNA分子更容易变性。变性时间较短的好处在于Taq DNA聚合酶较不易失活。

然而，ES-PCR不需要使用两个阶段。通过使用模板寡核苷酸，特别是完全被阻断的模板引物中较长的互补区域，可开发出一-阶段PCR。

在ES-PCR之前，可在分开的反应中进行样品的限制性酶消化，也可在单个消化-扩增反应混合物中进行所述消化，随后立即进行PCR。

至于在待扩增的DNA末端添加共有序列的其它方法(Elnifro，EM et al.2000；Wittwer，CT et al.2001)，可以容易地使ES-PCR适合于多重PCR。

通过本领域技术人员众所周知的标准方法可检测到ES-PCR产物，所述方法包括但不限于凝胶电泳，使用非-特异性DNA结合染料，如SYBRGreen实时监测，序列特异性荧光探针或与微阵列杂交。

为了易于理解本发明并将其具体实施，下文将通过非-限制性的实施例描述特别优选的实施方案。

实施例1：使用单个错配的模板寡核苷酸选择裂解的DNA

靶向的区域是人染色体21的带21q22.3上存在的串联重复(共有序列大小为74个碱基对，GCGTGGCTGTCTCCACTGAGTCCCGGGCACGGGTCAGGCTAACCGCGGGAGGAATTTAATCTAGAGTTTAACTT)。在人基因组(2004年5月装配)中，重复区域的基因组大小是2218个碱基对，chr21： 46536826-46539043。使用限制性酶BstuI在下划线的CGCG位点切割基因组DNA。BstUI的切割因胞嘧啶甲基化而被阻断，因此，仅有未甲基化的DNA才能形成限制性末端。

在本实施例中，模板寡核苷酸也用作“正向”引物，并具有与靶基因组DNA的3’末端错配。所用序列和引物示于图2。正向的错配引物和模板寡核苷酸是21qTFMLHC/T，5’CACTCCCACTCGGGAGGAATTTAATCTAGC3’，反向的完全匹配的引物是21qTRC，5’ACCCGTGCCCGGGACTCA3’。下划线的碱基是与最初的靶序列不匹配的碱基。

在25微升20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，2.7mM MgCl₂，0.2mMdCTP，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，0.4mM dUTP，200nM引物，1/125,000稀释的

Green I(Molecular Probes目录号S7563)，20nM荧光素校准染料(BioRad)，1单位BstUI(New England Biolabs)和0.5单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为60℃ 5分钟，95℃ 2分钟，然后95℃ 15秒-65℃ 3分钟共5个循环，然后95℃ 5秒-65℃ 30秒共40个循环。在最初的60℃保温5分钟时进行BstUI消化。前5个循环中较长的延伸时间能使靶DNA在靶/引物退火不稳定的条件下延伸。

存在荧光素的原因是反应有时在BioRad Icycler中运行，该仪器的校准需要痕量的荧光素(有时也可以是其它染料)。预期低水平的荧光素对结果不会产生显著的影响。

用于扩增的DNA是所有CpG位点都被酶促甲基化的CpGenome DNA(Chemicon)，得自人慢性髓性白血病细胞系K562的DNA以及两对匹配的结肠直肠肿瘤DNA和邻近的正常直肠DNA。图3的第一部分显示了完全甲基化的DNA以及在很多重复序列处基本上甲基化不足的K562 DNA的扩增曲线。对于未甲基化的DNA而言，扩增具有高度选择性，因为K562的扩增领先于完全甲基化的CpGenome DNA约13个循环。图3B和3C显示的两个例子为结肠直肠癌DNA和分离自邻近的正常组织的DNA。在这两个例子中，癌症DNA较早的扩增(早2.5至3个循环)表示其相对于正常组织而言甲基化不足。

实施例2：正向和反向寡核苷酸都是具有3’末端错配的模板寡核苷酸

使用正向和反向错配模板寡核苷酸为引物扩增得自染色体21q的相同重复序列。PCR条件与实施例1中的相同，不同之处在于包括100nM探针21qTRHEX 5’HEX-CCGTGCCCGGGACTCAGTGG BH1(得自Sigma)，反向引物是21qTRM13，5’CCCTCACACTCGGTTAGCCTGACT.3′。下划线的碱基是与最初的靶序列不匹配的碱基。

使用Corbett RotorGene 3000，以下述程序进行实时PCR：60℃ 5分钟，95℃ 2分钟，然后95℃ 15秒-65℃ 3分钟共3个循环，然后95℃ 5秒-65℃ 15秒共60个循环。通过在TEX(10mM Tris HCl pH8，0.1mM EDTA，0.01％ Triton X100)中稀释制备出3ng/uL人基因组DNA，其中含有不同比例的K562 DNA(已知其CpG甲基化的水平降低)和CpGenome DNA(人工甲基化DNA)。在每个25μL反应中加入1μL DNA混合物。

SYBR Green结果示于图4。在此实验中，通过使用特异性探针获得的额外的特异性未带来什么好处，结果类似于SYBR Green结果，因此未在图中显示。

检测到K562 DNA的扩增领先于完全甲基化的DNA 20个循环以上，在领先于仅含有完全甲基化DNA的样品7个循环时，清楚检测到0.1％K562DNA样品水平(3pg，一个基因组当量)。

实施例3：靶向c-myc(单拷贝基因)内的HpaII位点

在本实施例中，人基因组HG17 Build中的c-myc基因序列GAGCGCCAGAGGAGGAACGAGCTAAAACGGAGCTTTTTTGCCCTGCGTGACCAGATCCCGGAGTTGGAAAA，chr8：128,822,153-128,822,223内的HDaII位点(下划线)被靶向。Sharrard et al 1992发现结肠直肠癌中的HpaII位点甲基化不足。图5A显示了该区域的序列和模板寡核苷酸(MycRM1)以及引物MycFC1。

在分开的反应中用HpaII切割DNA样品。于37℃在New EnglandBiolabs缓冲液1(10mM Bis Tris丙烷-盐酸(Propane-HCl)，10mM MgCl₂，1mM DTT(pH 7.0，25℃))+100ug/ml BSA中消化2小时。在30μL的体积中用5个单位的HpaII切割30ng DNA。70℃热处理20分钟后，加入24μL TEX(10mM Tris pH7.4，0.1mM EDTA，0.01％ Triton X100)和6μL 50mM EDTA，使最终的镁离子和EDTA浓度相等，最终的DNA浓度为0.5ng/μL。将2μL这些样品用于每个PCR。

在25微升20mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，2.7mM MgCl₂，0.2％甘油，0.2mM dCTP，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，0.4mM dUTP，200nM引物，1/125,000稀释的

Green I(Molecular Probes目录号S7563)，20nM荧光素校准染料(BioRad)和0.5单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为95℃ 2分钟，然后95℃ 15秒-65℃ 3分钟共5个循环，然后95℃ 5秒-65℃ 30秒共45个循环。

与完全甲基化的CpGenome DNA相比，在K562 DNA中，错配引物MycRM1能检测到甲基化不足的myc DNA。与其匹配的正常样品34/03相比，在结肠直肠癌肿瘤样品35/03中，错配引物MycRM1还可检测到HpaII位点降低的甲基化。(参见图5B)。

实施例4：插入模板寡核苷酸

本实施例显示出无需使用引物中的3’末端错配，使用距离3’末端几个核苷酸处安置的插入即可达到选择的目的。这种“插入模板寡核苷酸”特别适于在延伸点序列可能有所不同的重复序列中存在靶向限制性位点的情况。

当重复序列类别有很大的序列不均一性时，针对共有序列设计的错配引物实际上与大量突变序列完全匹配。这会导致突变体的选择性富集，并会降低ES-PCR的选择效力。针对这种情况，我们研究出改良的方法，所述方法包括设计出引物，与重复类别的共有序列相比，所述引物具有短的插入或缺失。很少有或没有突变序列会在相同位置具有相同序列、相同长度的缺失或插入，这一点已被详细阐述。尽管一些3’碱基(在所示情况下为6个)与靶匹配，但缺失(或所示情况中的插入)会阻止3’末端适当定位，因此会延迟延伸。

在本实施例中，LINE逆转录转座元件5’(启动子)区内的两个HpaII位点被靶向。通过使用图6A中所示的两个插入模板寡核苷酸/引物即可选择出在两个HpaII位点处已被切割的序列。

检测用DraI(识别位点TTTAAA，不是甲基化敏感型)和HpaII(CCGG，甲基化-敏感型)处理过的5ng DNA。在25微升20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，2.7mM MgCl₂，400mM甜菜碱，0.2mM dCTP，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，0.4mM dUTP，10nM MLHJ65选择性引物，200nM插入引物，50nMHEX-标记的LPAHex探针，1/125,000稀释的

Green I(MolecularProbes目录号S7563)，20nM荧光素校准染料(BioRad)和0.5单位PlatinumTaq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为95℃ 2分钟，然后95℃ 15秒，60℃ 20秒，65℃ 3分钟共5个循环，然后95℃ 15秒，65℃ 30秒共50个循环。

从图6B中可以看出，基本上甲基化不足的K562 DNA的扩增领先于完全甲基化的DNA约14个循环。

实施例5：3’阻断的模板寡核苷酸

使用图7A所示的模板寡核苷酸和引物靶向Alu元件共有序列中的第一个BstUI位点。因被其3’末端的磷酸基团所阻断，模板寡核苷酸BAFMLJ15不能被延伸。方框内的寡核苷酸部分具有与JOELUX“第三”寡核苷酸相同的序列，并最终能将JOELUX掺入PCR产物。JOELUX携有在3’末端附近结合的JOE荧光组成成分，当存在于双链DNA中时其荧光会增加。

在25微升20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，2.7mM MgCl₂，0.2mMdCTP，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，0.4mM dUTP，40nM AluRev21，10nMBAFMLJ15，60nM JOELUX引物，1/125,000稀释的

Green I(Molecular Probes目录号S7563)，20nM荧光素校准染料(BioRad)，1单位BstUI(New England Biolabs)和1单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为37℃ 5分钟，95℃ 2分钟，然后95℃ 1分钟-60℃ 40秒共5个循环，然后95℃ 15秒-68℃ 20秒共45个循环。

使用被单个磷酸-阻断的模板引物，相对于甲基化CpGenome DNA的扩增而言，基本上甲基化不足的K562DNA的扩增被延迟6个PCR循环以上。

实施例6：使用ES-PCR选择甲基化DNA

被靶向的区域是hMLH1基因CpG岛(hg17freeze中的chr3：37009233-37010360)内的GlaI位点(图8A)。根据Sibenzyme公司的出版物(http://science. sibenzyme.com/article8_article_11_1.phtml)，仅当内部的C被甲基化时，GlaI才能切割序列GCGC。仅当其识别位点中的所有4个C都被甲基化时，才能观察到GlaI的完整活性。因此，GlaI仅对CGCGCG位点处完全甲基化的DNA表现出完整活性。已发现该位点位于hMLH1基因的CpG岛内的chr3：37,009,348-37,009,353。

完全甲基化的DNA‘CpGenome’得自Chemicon。该DNA的所有CpG位点已被酶促甲基化，使用GlaI处理该DNA。从血液中分离未甲基化的DNA并用限制性酶HhaI处理以用作对照。该酶识别相同的位点，但仅当该位点未被甲基化时才会切割。(注：此位置有两个HhaI位点彼此相邻。)用于选择切割末端的模板寡核苷酸是MLHJ65。该寡核苷酸具有5’延伸，允许掺入JOE-标记的LUX引物JOELUX。其3’末端还具有3个错配，当用尿嘧啶DNA糖基化酶消化时，其中两个错配转变为脱碱基位点。未经修饰的引物MLHRev3被用作反向引物(参见图8A)。

于37℃，在50μL 1×SE缓冲液Y(33mM Tris-乙酸(acetate)，66mM醋酸钾，10mM醋酸镁，1mM二硫苏糖醇pH 7.9，25℃)+100μg/ml牛血清白蛋白中，用16单位GlaI将1μg完全甲基化的DNA(得自Chemicon)处理2小时。此反应中也包括20单位第二种限制性酶DraI。该酶识别序列TTTAAA，因此无论甲基化状态如何都会切割DNA。热灭活(70℃15分钟)之后，加入140μL TEX(10mM Tris HCl，0.1mM EDTA，0.01％ Triton X-100)和10μL 50mM EDTA，使最终的DNA浓度为5ng/μL。用相同方法处理未切割的对照，不同之处在于加入50％甘油替代限制性酶。按相同方法制备用HhaI切割的血液DNA，不同之处在于使用的是New England Biolabs缓冲液3(50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，100mM NaCl，1mM DTT(pH 7.9，25℃)和20单位HhaI。

检测5ng经切割或未切割的DNA。在25微升20mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，4mM MgCl₂，800mM甜菜碱，0.2mM dNTP，10nM MLHJ65选择性引物，200nM MLHRev3反向引物，40nM JOELUX荧光LUX引物，

Green I(Molecular Probes目录号S7563)，20nM荧光素校准染料(BioRad)，0.02单位尿嘧啶DNA糖基化酶(New England Biolabs)和0.5单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为95℃ 90秒，然后95℃ 30秒，60℃ 10秒，72℃ 30秒共5个循环，然后95℃ 1秒，60℃ 10秒，72℃ 30秒共55个循环。同时进行三份相同的检测。

已用GlaI切割的甲基化DNA的扩增领先于未经切割的甲基化DNA平均6个循环。已用HhaI切割的对照非甲基化DNA的扩增领先于未经切割的DNA平均8.4个循环。数据表明：与未经切割的DNA相比，在DNA被切割，产生特异性末端的两种情形下，扩增显著优先。经HhaI-切割的DNA较早的扩增与HhaI和GlaI酶不同的切割效率有关。

实施例7：检测BRAF基因中的点突变

在结肠直肠癌中，BRAF基因中的突变是共同的，几乎总是涉及由T至A的颠换导致的V600E突变(Chan et al.2003)。在两步法中使用ES-PCR以区分分别得自血液和结肠直肠癌细胞系WiDr的DNA中的突变和正常序列。在第一轮PCR中，使用含有两个错配的引物BRFMX(图9A(i)；下划线的为错配)5’CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTCTAG3’导入XbaI限制性位点，所述位点取决于突变位点A碱基的存在(图9A(ii)；下划线的为突变位点)。

在PCR中，同时使用引物BRFMX与反向引物BRFR1以扩增靶区域。图9A(iii)显示了所得扩增DNA的序列，下划线的是XbaI位点。

在第二轮中，联合使用ES-PCR引物BRFU和外部重叠JOELUX引物以及反向引物BRFR2(图9B)。图9B中未显示被复制的上方那条链，因为XbaI提供了4个碱基的突出端，当其被复制时会提供与选择性寡核苷酸BRFU的多个错配，因此不应被包括在反应中。用XbaI切割和变性之后，对于BRAF-A而言，下方的那条链以3’至5’的方向被描述。通过3个末端碱基错配(下划线)抑制BRFU寡核苷酸的延伸；此实验中未使用尿嘧啶DNA糖基化酶，因此BRFU的延伸仅被3个末端错配抑制(图9B)。

于37℃，在NEB2缓冲液+BSA中，用5单位XbaI将2μL1/100稀释的各种第一轮产物消化2小时。将1μL各种经消化的产物用于ESPCR。在25微升20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，4mM MgCl₂，0.2mM dNTP，10nM BRFU选择性寡核苷酸，100nM BRFR2反向引物，40nM JOELUX荧光LUX引物，

Green I(Molecular Probes目录号S7563)，20nM荧光素校准染料(BioRad)和0.5单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为95℃ 90秒，然后95℃ 30秒，50℃40秒，65℃ 10秒共5个循环，然后95℃ 5秒，65℃ 15秒共40个循环。同时进行三份相同的检测。

图9C显示了通过JOE荧光测定的扩增。在得自WiDr的样品中观察到的较早的扩增表明：可以使用ES-PCR来检测突变。

实施例8：在产生3’末端邻近处序列不同的核酸分子时使用在其识别序列外侧裂解DNA的限制性酶

多种限制性酶(II型，III型和IV型)在距其识别位点外侧特定距离处裂解DNA，本文称之为“侧翼切割者”。因此，不同位点之间由侧翼切割者产生的3’末端也有所不同，所述3’末端取决于酶识别位点的侧翼序列。如果在识别位点和裂解位点之间有碱基的插入或缺失，则所述酶也会在给定的裂解位点产生不同的末端。在裂解位点邻近处产生不同的序列为使用ES-PCR或其它选择性扩增法选择性扩增缺失或插入形式提供了基础。以前，检测缺失或插入的方法依赖于限制性酶消化之后DNA片段长度的变化。本发明描述的方法利用的是限制性酶片段核酸序列的差异，产生所述差异的原因是限制性酶识别序列和其裂解位点之间存在缺失或插入，导致在距其识别序列特定距离处裂解的限制性酶裂解位点发生移位。

8.1 测定短的同聚物序列(run)中的缺失或插入

8.1.1.通过使用ES-PCR(图10A(iv))(参见下文8.1.1.1节)或通过使用特异性引物，然后使用末端转移酶延伸3’末端(图10A(ii)和10A(iii))，可以检测邻近于Bbr7I限制性位点(GAAGAC(7/11))(图10A(i))的短的A同聚物序列中的缺失或插入。图10A(iii)中所示的引物与较短的原始DNA分子的产物相匹配，它将能有效引发，而它与较长分子的产物形成3个碱基的错配，将不能引发。然后可使用来自序列内部的适当反向引物扩增较短分子的产物。

8.1.1.1 通过ES-PCR扩增。短分子(“短序列”，图10A(i))被裂解的下方那条链将在模板寡核苷酸上有效引发，所述模板寡核苷酸的3’区域具有互补的核酸序列，并具有被胺阻断的3’末端。因靶向分子的3’延伸而新掺入的末端序列可与在ES-PCR过程中用于扩增的内部第二寡核苷酸联合使用。与之形成对照的是，长分子(“长序列”，图10A(i))的裂解末端具有3个碱基的错配，因此不会在模板寡核苷酸上引发，对扩增没有反应。

8.2.图10B显示出第二个例子。大多数在其识别序列外侧具有切割位点的酶裂解后给出错列的末端，所述末端可用作接头连接和随后PCR的底物。在本实施例中，MmeI位点(TCCGAC(20/18))邻近于短的单核苷酸序列(图10B(i))。对上方的链而言，切割位点距识别位点20个碱基，对下方的链而言为18个碱基。图中显示了具有10或9个T的序列变体。图10B(ii)显示了用MmeI切割时产生的末端。为了选择性扩增“9”分子，如图10B(iii)所示，可连接如图所示具有CA3’延伸的接头。通过PCR可检测该分子，其中正向引物具有图10B(iii)所示的序列，同时，反向引物源自待扩增的区域。可替换的“10”分子给出很难连接的错配末端，其扩增可通过与引物错配进一步地折衷解决。

8.2.1通过ES-PCR扩增。或者，可使用图10C所示模板寡核苷酸进行ES-PCR来区分产生的3’末端。“9”分子与模板寡核苷酸的3’区域精确匹配，因此可在模板寡核苷酸上引发，而“10”分子在其3’末端产生错配，籍此阻止与模板寡核苷酸5’尾互补的3’延伸，因而在反应中不能被扩增。

在很多情况下，对于在其识别序列外侧切割的限制性酶而言，内源性位点的位置并不合适。此时，可以使用引物导入突变以产生侧翼于感兴趣区域的位点，从而导入适当的位点，并且按两步法分析所得的PCR产物。或者，如果有另一个位置很近的限制性位点，通过用第一种酶切割并与含有所需酶位点的衔接子连接，即可导入新的位点。在图10B的例子中，所示序列得自TGFRB2基因内的位点，其中一段10个A的序列中的单碱基缺失在结肠直肠癌中是共有的。通过在侧翼EcoRII位点切割并与含有MmeI位点的衔接子连接，可在理论上导入MmeI位点。

微卫星序列提供了临床相关性的例子，其中通常需要通过检测较短的缺失形式的存在来检测短的简单重复的不稳定性(实施例8.3.)。

如实施例8.4所示，也可检测插入的存在。

8.3：检测微卫星NR22中的缺失

微卫星NR-22由Suraweera et al(2002)描述。MboII限制性位点紧挨微卫星的单核苷酸重复(图11A(i))。在上方的那条链上，MboII在距其识别位点GAAGA(自其识别序列末端算起)8个核苷酸处切割，在下方的那条链上，所述距离为7个核苷酸。邻近于所得新末端的序列取决于单核苷酸重复的长度。在图11A(ii)和11A(iii)中，为了简化的目的，只显示了下方的那条链。在实践中，也应考虑上方的那条链，因为它在PCR过程中被复制，给出新的可延伸的3’末端。图中给出的例子长度为22(正常)、20、18和16个碱基对。(得自结肠直肠癌细胞系HCT116的该区域的克隆和测序给出长度为16bp和18bp的NR-22单核苷酸重复。)

图11A(ii)和11A(iii)分别显示了两个模板寡核苷酸，它们与得自长度不等的(16至22个碱基)单核苷酸重复的MboII-切割DNA(下方的链)一起排列。3’末端错配的存在以及用尿嘧啶DNA糖基化酶裂解含U的寡核苷酸之后产生的脱碱基位点阻止或减弱了模板寡核苷酸在基因组DNA上的延伸。图11A(ii)显示了对照模板寡核苷酸04FNR22-0。切割不同长度重复的产物都能在F1NR22-0上引发，随后通过LUX引物FAMLUX1扩增延伸产物。较短重复的扩增效率较低，因为其杂交区域长度较短。第二模板寡核苷酸J5NR22-4经设计可选择性地仅从较短的重复序列开始扩增。长度为20或22个碱基的重复序列经MboII切割的DNA3’末端的下划线碱基与模板寡核苷酸形成错配，会阻止其延伸。与之形成对照的是，得自16或18个碱基的较短重复的末端可有效引发，导致随后通过JOELUX5引物扩增并通过JOE荧光检测。

简单地说，NR-22微卫星的正常长度有望在PCR中仅给出FAM荧光，而NR-22的缺失，如4bp或6bp将同时给出FAM和JOE荧光。

在25微升20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，4mM MgCl₂，0.2mMdNTP，2nM F1NR22-0，10nM J5NR22-4，80nM NR22R1，80nM JOELUX5荧光LUX引物，20nM FAMLUX1荧光LUX引物，0.04单位尿嘧啶DNA糖基化酶(New England Biolabs)，0.5单位MboII限制性内切核酸酶(NewEngland Biolabs)，0.5单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为37℃ 5分钟，95℃ 90秒，然后95℃ 10秒，60℃ 40秒，70℃ 10秒共5个循环，然后95℃ 5秒，70℃ 15秒共60个循环。监测JOE和FAM荧光。同时进行两份相同的检测。在反应中加入5ng分离自细胞系HCT116或正常受试者血液的DNA。

从图11B中可以看出，对于FAM荧光而言(图11B(i))，血液DNA的扩增领先于在微卫星NR-22内携有缺失的HCT116细胞DNA。在反应结束时，血液DNA的FAM荧光也较高。这表明该测定法可发展为不再需要实时PCR仪器的终点测定法。对于HCT116而言，FAM和JOE反应都会发生，因为此细胞系中的缺失使得两种模板寡核苷酸都能在反应中复制。然而，特异于携有缺失的DNA的模板寡核苷酸以较高浓度被使用，因此偏向JOE反应。由于反向引物NR22R1仅以80nM的浓度被使用，因此两个反应有望互相竞争，从而可以解释两个输入DNA之间最终FAM信号的差异。对JOE信号而言(图11B(ii))，只有得自HCT116的缺失DNA给出MboII-切割链，该链能在J5NR22-4模板寡核苷酸上引发，其中J5NR22-4携有允许JOELUX5掺入的尾。

8.4：检测插入

在图12A中，为了简单起见仅显示了DNA片段下方的那条链(但是应记住限制性酶通常切割双链DNA)。图中显示了限制性酶识别位点(未按比例)的位置。在其识别位点外侧切割的限制性酶例子是AcuI，当考虑到“下方”链时，该酶在距其识别位点末端14个核苷酸处切割。

模板寡核苷酸被设计成在与切割末端杂交之后，通过一个或多个2’O-甲基核苷酸的存在来降低或阻断模板寡核苷酸的延伸。其它阻断延伸的方法是本领域技术人员众所周知的，例如在模板寡核苷酸中使用脱碱基位点或使用错配(如本文所述)。此时由于切割DNA的3’末端不与DNA核苷酸杂交而与2’O-甲基核苷酸杂交，因此延伸被阻止。

图12A的下方显示了插入突变的例子。在外侧切割者，如AcuI的识别位点及其切割位点之间插入4个碱基对会将切割位置向左移动4个碱基对。当所得切割DNA与含2’O-甲基的模板寡核苷酸杂交时，所得复合物具有一段4个DNA-DNA匹配的核苷酸，因此允许经切割的3’末端延伸。

通过利用合成的寡核苷酸获得显示该方法效力的数据，所述寡核苷酸模拟不同的经切割下方链，所述链通过切割“正常”DNA或含有1bp或4bp插入的DNA而产生(图12B)。

最后，通过两个外侧引物JOELUX和CommR5驱动PCR。JOELUX是用JOE标记的LUX引物。其匹配模板寡核苷酸的15个核苷酸，因此在模板寡核苷酸被复制后即可被掺入。CommR5具有与受试寡核苷酸共有的11个核苷酸，在JOELUX复制受试寡核苷酸之后即可被掺入。

在25微升20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，4mM MgCl₂，0.2mMdNTP，10nM模板寡核苷酸，40nM JOELUX荧光LUX引物，200nMCommR5，10⁸受试寡核苷酸，0.04单位尿嘧啶DNA糖基化酶(New EnglandBiolabs)，0.5单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将CorbettRotorGene 3000的运行设置为37℃ 5分钟，95℃ 90秒，然后95℃ 30秒，55℃ 40秒，65℃ 15秒共5个循环，然后95℃ 5秒，65℃ 15秒共55个循环。检测JOE荧光。同时进行三份相同的检测。37℃保温5分钟是为了用尿嘧啶DNA糖基化酶进行消化。

从图12C可以看出：对应于用外侧切割者切割后的“正常”DNA下方链的10⁸受试寡核苷酸的扩增(连续的线)仅在循环30次后才变得明显。对应于插入1个碱基对(点线)或4个碱基对(虚线)的受试寡核苷酸的扩增领先约10个循环，这表明可使用该实验设置选择性扩增插入突变体的DNA。

实施例9：模板寡核苷酸设计

使用模型系统评价模板寡核苷酸的修饰对本发明方法的用处。制备两个受试DNA并将其用作靶。被称为“经切割的”靶DNA对应于已用限制性酶BstUI切割的Alu元件的下方链。Alu元件在BstUI位点处的成功切割仅当该位点未被甲基化时才会发生。在此实验中由于利用了靶寡核苷酸“模拟”而未使用限制性酶。第二个靶DNA被称为“未经切割的”，它是在不同于BstUI切割位点的位置处被切割或打断的片段的模拟物，其具有5个T的延伸。图13A中以3’至5’的方向显示了这两个靶寡核苷酸。AluRev是反向引物。它与其靶序列完全匹配，也以3’至5’的方向表示。

AluPhB和一系列相关寡核苷酸被用作模板寡核苷酸(图13A)。它们以5’至3’的方向表示。3’末端磷酸而不是正常OH基团的存在阻止了AluPhB延伸。AluPhB具有5’尾(下划线的，图13A)，一旦其通过邻近于3’末端的靶序列的延伸而被复制，即可掺入经JOE标记的外侧引物JOELUX。由于引物掺入PCR产物，因此可通过JOE荧光监测PCR扩增。

在25微升20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，4mM MgCl₂，0.2mMdNTP，10nM模板寡核苷酸(AluPhB或其它)，40nM AluRev，40nM JOELUX荧光LUX引物，0.04单位尿嘧啶DNA糖基化酶(New England Biolabs)，0.5单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中进行PCR。将Corbett RotorGene 3000的运行设置为37℃ 5分钟，95℃ 2分钟，然后95℃ 10秒，60℃ 40秒，70℃5秒共5个循环，然后95℃ 1秒，65℃ 15秒共40个循环。检测JOE荧光。同时进行两份相同的检测。37℃保温5分钟只是为了使循环条件与其它在PCR前需要限制性酶消化的实验相同。这会使不同实验结果的比较更加直观。在反应中加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)以消化含有U核苷酸的模板寡核苷酸。在每个反应中加入10⁷经切割或10¹⁰未经切割的靶DNA。

参照模板寡核苷酸AluPhB具有23个碱基长的与“经切割的”靶序列杂交的区域，通过其3’末端的磷酸可阻断其延伸。图13C(i)显示了10⁷“经切割的”分子的扩增，其量比“未经切割的”分子高1000倍。如果没有选择性，我们预期“经切割的”分子的扩增会延迟约10个循环。在相等循环数时的扩增显示出约1000倍的选择性。通过延伸模板寡核苷酸(例如果3’磷酸被除去或如果模板寡核苷酸带有切口)或通过在模板寡核苷酸上错误引发“未经切割的”分子，在本实施例中是通过AluPhB上的错误引发，都可限制选择性的程度。已研发出另一种可替代的模板寡核苷酸，由于某些掺入的特征，其显示出改良的选择性。

可替代的模板寡核苷酸系列的不同之处在于被设计用于阻止模板寡核苷酸延伸的3’修饰。所示修饰包括掺入C7胺或C3间隔区或3个碱基的末端错配(AluUUG，其中两个U在UDG处理后会形成脱碱基位点)和/或如果存在自适当引发位点上游起的异常引发时可阻断延伸的内部修饰。这些修饰包括AluMeAm和AluMeMult中的2’O-甲基修饰碱基(以黑体小写字母表示)，包括脱碱基位点(AluAbSp中的X)或通过用UDG处理会转变为脱碱基位点的尿嘧啶碱基(图13B)。

在模板寡核苷酸中掺入阻断延伸的修饰基本上可抑制“未经切割的”分子的扩增，导致1000倍或更高的选择性。比较AluMeAm和AluMeMult，结果显示出更多数目经修饰碱基的选择性，但所述碱基的存在也可能会降低正确引发的效率。

AluHL序列的5’和3’末端可形成发夹结构，3’末端与“经切割的”靶分子具有多个会阻止其引发的错配。发夹结构可能会防止模板寡核苷酸的错误引发和模板寡核苷酸上“未经切割的”核酸分子的错误引发。

这些实验表明可使用不同方法阻止模板寡核苷酸延伸，降低或阻止模板寡核苷酸杂交部分复制的修饰可增加ES-PCR的特异性。

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Claims

1.在含有非邻近于3’末端而是嵌入分子内部的靶序列的分子存在时，从样品中选择性扩增在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(iii)进行样品的扩增，其中

(b)其中与和非邻近于3’末端的靶序列退火的模板寡核苷酸的延伸相比，随之而来的模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列的稳定化退火增强了模板寡核苷酸的3’延伸效率；和

(c)其中使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸与第二寡核苷酸的联合进行扩增，导致在含有嵌入分子内部的靶序列的核酸分子存在时，选择性扩增邻近于3’末端的靶序列。

2.在含有嵌入分子内部的靶序列的未裂解分子存在时，从样品中选择性扩增由于分子的裂解而在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(iii)进行样品的扩增，其中

(b)其中与和未裂解的核酸分子退火的模板寡核苷酸的延伸相比，随之而来的模板寡核苷酸与裂解的核酸分子的稳定化退火增强了模板寡核苷酸的3’延伸效率；和

(c)其中使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸与第二寡核苷酸的联合进行扩增，导致选择性扩增邻近于3’末端的靶序列而不是嵌入核酸分子内部的靶序列，导致选择性扩增裂解的核酸分子而不是未裂解的核酸分子。

3.在具有不同3’末端的混合分子群体的存在下，从样品中选择性扩增在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(a)3’区域，其与邻近于3’末端的靶序列基本上互补；

(iii)进行样品的扩增，其中

(b)其中与和邻近于3’末端的非互补序列退火的模板寡核苷酸的延伸相比，随之而来的模板寡核苷酸与邻近于3’末端的靶序列的稳定化退火增强了模板寡核苷酸的3’延伸效率；和

(c)其中使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸与第二寡核苷酸的联合进行扩增，导致在混合3’末端群体的存在下选择性扩增邻近于3’末端的靶序列。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中模板寡核苷酸3’区域能延迟寡核苷酸3’延伸的修饰选自

(i)掺入3’末端核苷酸错配，

(ii)在模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域掺入一个或多个核苷酸错配，

(iii)在模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域掺入缺失，

(iv)在模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域掺入插入，和

(v)修饰(i)-(iv)的任意组合。

5.根据权利要求4的方法，其中模板寡核苷酸3’区域的修饰是掺入3’末端核苷酸错配。

6.根据权利要求4的方法，其中模板寡核苷酸3’区域的修饰是在模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域掺入插入。

7.在含有非邻近于3’末端而是嵌入分子内部的靶序列的分子存在时，从样品中选择性扩增在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(c)3’区域的修饰，所述修饰阻断了所述模板寡核苷酸的3’延伸，或在模板寡核苷酸的杂交区域具有修饰，所述修饰允许3’延伸，但阻碍或阻断了所述寡核苷酸3’区域中的复制；

(iv)进行样品的扩增，其中

(b)其中用第二和第三寡核苷酸进行扩增，利用复制的5’尾选择性扩增邻近于3’末端的靶序列，由于5’尾不复制，模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的复制被阻断，嵌入核酸分子内部的靶序列的扩增无法进行下去。

8.在含有嵌入分子内部的靶序列的未裂解核酸分子存在时，从样品中选择性扩增由于分子的裂解而在邻近于3’末端处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使DNA样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(iv)进行样品的扩增，其中

(b)其中用第二和第三寡核苷酸进行扩增，利用复制的5’尾序列选择性扩增邻近于3’末端的靶序列，由于5’尾不复制，模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的复制被阻断，嵌入未裂解分子内部的靶序列的扩增无法进行下去，导致选择性扩增裂解的核酸分子而不是未裂解的核酸分子。

9.在3’末端混合群体的存在下，从样品中选择性扩增在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括

(i)使样品与模板寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有

(a)3’区域，其与邻近于3’末端的靶序列基本上互补；

(c)3’区域的修饰，所述修饰阻断了模板寡核苷酸的3’延伸，或在模板寡核苷酸的杂交区域具有修饰，所述修饰允许3’延伸，但阻碍或阻断了所述寡核苷酸3’区域中的复制；

(iv)进行样品的扩增，其中

(b)其中用第二和第三寡核苷酸进行扩增，利用复制的5’尾序列选择性扩增邻近于3’末端的靶序列，由于5’尾不复制，模板寡核苷酸的3’延伸被阻断，或模板寡核苷酸的复制被阻断，邻近于3’末端的非互补序列的扩增无法进行下去，导致在混合3’末端群体的存在下选择性扩增出邻近于3’末端的靶序列。

10.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中模板寡核苷酸3’区域能阻断模板寡核苷酸3’延伸的修饰选自

(i)在其3’末端掺入一个或多个不可延伸的组成成分或核苷酸类似物，

(ii)掺入3’末端不可延伸的组成成分或核苷酸类似物与模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域中的一个或多个核苷酸错配的组合，

(iii)在模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域掺入一个或多个脱碱基位点，和

(iv)掺入一个或多个脱碱基位点与模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域中的一个或多个核苷酸错配的组合。

11.根据权利要求10的方法，其中一个或多个不可延伸的组成成分或核苷酸类似物选自

(i)2’，3’双脱氧核苷酸，

(ii)3’C3，C18或其它长度的间隔区，

(iii)3’磷酸化核苷酸，

(iv)肽核酸碱基，

(v)胺接头，

(vi)一个或多个用尿嘧啶DNA糖基化酶处理过的尿嘧啶，

(vii)RNA，

(viii)一个或多个2’O-甲基RNA残基，和

(ix)(i)-(viii)的任意组合。

12.根据权利要求11的方法，其中不可延伸的碱基是胺接头。

13.根据权利要求11的方法，其中不可延伸的碱基是C3间隔区。

14.根据权利要求11的方法，其中不可延伸的碱基是一个或多个用尿嘧啶DNA糖基化酶处理过的尿嘧啶。

15.根据权利要求11的方法，其中不可延伸的碱基是一个或多个2’O-甲基RNA残基。

16.根据权利要求10的方法，其中不可延伸的碱基是模板寡核苷酸靠近3’末端的3’区域的一个或多个脱碱基位点。

17.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中允许3’延伸，但阻碍或阻断了所述寡核苷酸3’区域的复制的3’区域修饰选自

(i)在模板寡核苷酸的3’区域内插入一个或多个碱基类似物，

(ii)插入一个或多个RNA核苷酸，

(iii)插入一个或多个脱碱基位点，和

(iv)(i)-(iii)的任意组合。

18.根据权利要求17的方法，其中修饰是插入一个或多个碱基类似物。

19.根据权利要求17的方法，其中修饰是插入一个或多个脱碱基位点。

20.根据权利要求9的方法，其中样品中包括靶向核酸分子3’末端的核酸分子3’末端是用侧翼切割者限制性内切核酸酶消化样品产生的。

21.根据权利要求20的方法，其中3’区域阻断所述模板寡核苷酸3’延伸的修饰是在其3’末端掺入一个或多个碱基类似物、一个或多个脱碱基位点或其任意组合。

22.根据权利要求20或21的方法，其中模板寡核苷酸的3’区域还掺入了阻断靶序列3’延伸的修饰。

23.根据权利要求22的方法，其中修饰是在模板寡核苷酸的3’区域掺入一个或多个碱基类似物。

24.根据权利要求23的方法，其中模板寡核苷酸掺入了3’末端核苷酸错配，一个或多个脱碱基位点并掺入了一个或多个碱基类似物。

25.根据权利要求1-24中任一项的方法，其中第二寡核苷酸是另一个模板寡核苷酸。

26.用于从含有裂解和未裂解DNA的DNA样品中选择性扩增裂解的DNA的试剂盒，所述试剂盒含有根据权利要求1-25中任一项的方法限定的(i)模板寡核苷酸，(ii)第二寡核苷酸，和(iii)第三寡核苷酸。

27.根据权利要求1-26中任一项的方法，其中核酸分子含有DNA。

28.根据权利要求2或权利要求8的方法，其中核酸分子的裂解是由序列-特异性的限制性内切核酸酶造成的。

29.根据权利要求28的方法，其中限制性内切核酸酶是序列-特异性的甲基化敏感型限制性内切核酸酶。

30.根据权利要求29的方法，其中甲基化敏感型限制性内切核酸酶受DNA甲基化的抑制。

31.根据权利要求30的方法，其中甲基化敏感型限制性内切核酸酶选自HpaII，HhaI，BstuI，NotI，SmaI和SacII。

32.根据权利要求29的方法，其中甲基化敏感型限制性内切核酸酶裂解甲基化的DNA。

33.根据权利要求32的方法，其中甲基化敏感型限制性内切核酸酶选自GlaI和BisI。

34.根据权利要求28的方法，其中选择限制性内切核酸酶以区分样品中的核酸分子内存在还是缺乏限制性位点。

35.根据权利要求2或8的方法检测单核苷酸多态性或突变的方法。

36.根据权利要求3或9的方法检测单核苷酸重复中的不稳定性的方法。

37.根据权利要求20-24中任一项的方法检测单核苷酸重复中的不稳定性的方法。

38.根据权利要求24的方法检测单核苷酸重复中的不稳定性的方法。

39.根据权利要求29至33中任一项的方法检测含有核酸分子的样品的甲基化状态的方法。

40.检测样品中的核酸分子是否存在缺失或插入的方法，其中缺失或插入发生在限制性酶识别位点与其位于识别位点外侧特定距离处的裂解位点之间，所述方法包括

41.根据权利要求40的方法，其中步骤(ii)是通过根据权利要求3或权利要求9的方法获得的。