CN112301117B - 一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法 - Google Patents

一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112301117B
CN112301117B CN202011140853.7A CN202011140853A CN112301117B CN 112301117 B CN112301117 B CN 112301117B CN 202011140853 A CN202011140853 A CN 202011140853A CN 112301117 B CN112301117 B CN 112301117B
Authority
CN
China
Prior art keywords
screening
target protein
gene
library
throughput sequencing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011140853.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112301117A (zh
Inventor
宋爱萍
余琪
胡月姮
张璐瑶
陈素梅
管志勇
房伟民
陈发棣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN202011140853.7A priority Critical patent/CN112301117B/zh
Publication of CN112301117A publication Critical patent/CN112301117A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112301117B publication Critical patent/CN112301117B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法，该方法将BD‑诱饵与猎物文库共转化Y2H酵母菌株，在YPDplus培养基中30℃培养4h后，弃上清，加入1mL无菌水基悬浮，取100μL悬浮菌液再加入10ml SD/‑Leu/‑Trp/‑His/‑Ade液体培养基中震荡培养24h、72h和80h后分别取样，以这些菌液为模版进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳检测菌液筛选程度，将产物回收之后进行高通量测序、de novo组装后进行基因丰度与差异分析，取差异基因即为该文库中与目的基因互作的蛋白编码基因，从而初步构建目标蛋白的互作网络。该方法同时适用于无参考基因物种目标蛋白互作网络的构建。该方法简化了酵母双杂交筛库的步骤，不受单次筛选克隆数限制，找到单个文库中目标蛋白的所有互作蛋白。

Description

一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法。
技术背景
酵母双杂交是由包括两个彼此分离但功能必须的结构域组成的系统，由Fields和Song在1989年提出，是一种筛选互作蛋白的经典实验。酵母双杂交技术在研究中具有很多的优势，比如，它采用真核细胞作为宿主，最大限度地还原了生理状态下蛋白质之间的相互作用。由于是通过生理代谢过程进行反应，很多难以检测的微弱相互作用可以利用生物学放大显现出来，该方法的灵敏度高。然而传统的酵母双杂交筛库系统仍有不足，比如检测能力的局限、操作筛选过程费工费时、单次操作获得结果质量不稳定以及靶蛋白数量有限，不能获得目标蛋白所有存在互作可能性的蛋白等。
综上所述，酵母双杂交技术对应无参考基因组的植物蛋白功能的研究十分重要，但现有的筛库方法费时费力且检测能力有限，因此亟待探索一种省时省力，不受单次筛选克隆数限制，尽可能找到单个文库中目标蛋白的所有互作蛋白的酵母双杂筛库方法。
发明内容
本发明的内容是提供一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法，该方法大大简化了传统酵母双杂交筛库的步骤，可以不受单次筛选克隆数限制，尽可能找到单个文库中目标蛋白的所有互作蛋白，解决了传统的酵母双杂交费时费力并且受到单次筛选克隆限制，存在遗漏潜在可能互作蛋白的问题。该方法同时适用于无参考基因物种目标蛋白互作网络的构建。
本发明技术方案如下：本发明的第一个目的是提供一种基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，所述方法包括下列步骤：
(1)四缺培养基筛选互作蛋白：BD-诱饵与猎物文库共转化酵母，用YPDplus培养基30℃培养4h后，离心，弃上清，加入无菌水悬浮，获得菌液；
取所获得的菌液，加入SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基(即四缺培养基)中，震荡培养24h、72h、80h后分别取样；
(2)分别以步骤(1)中获得的在24h、72h、80h取样的菌液为模板，以AD-F和AD-R为引物，分别进行MightyAmp(TaKaRa)PCR扩增，获得3个时间段菌液样品的PCR产物；用琼脂糖凝胶电泳检测目标蛋白的富集程度，回收，获得3个时间段PCR回收产物，所述PCR回收产物-20℃储存；
AD-F和AD-R引物如下：
AD-F：5′-TATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′(SEQ ID NO.1)；
AD-R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′(SEQ ID NO.2)
(3)高通量测序：分别构建步骤(2)所得到3个时间段PCR回收产物的测序文库，进行高通量测序，测序模式为PE150，测序量不少于6G，得到原始reads；
(4)获取目标蛋白所属物种的基因集序列和文库基因丰度数据，筛选差异基因，获得目标蛋白的互作蛋白编码基因集：
(4-1)将步骤(3)中3个时间段PCR回收产物的测序文库测序所得的原始reads使用Cutadapt2.10去除接头和3’端的AD-F与5’端的AD-R后，将所有数据合并，进行从头组装，获得目标蛋白所属物种的基因集序列，
(4-2)对步骤(3)中构建的3个时间段测序文库分别进行文库基因丰度检测，筛选出差异基因，所述差异基因为在后一时间点的文库基因丰度高于前一时间点文库基因丰度的基因，获得3组差异基因集，即：
24h-vs-72h组：72h的文库基因丰度高于24h的文库基因丰度的差异基因集，24h-vs-80h组：80h的文库基因丰度高于24h的文库基因丰度的差异基因集，72h-vs-80h组：80h的文库基因丰度高于72h的文库基因丰度的差异基因集；
(4-3)筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集：将筛选得到的3组差异基因集作为初步筛选的目标蛋白的互作蛋白编码基因集，绘制维恩图(在线绘制网站为：https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，获得的3组差异基因集的交集，交集中的基因即为目标蛋白的互作蛋白编码基因集。
进一步的，步骤(1)所述共转化为使用MatchmakerTMGold酵母双杂交系统，所述酵母为Y2H酵母菌株；所述离心条件为2000rpm离心5min；所述振荡培养条件为30℃200rpm震荡培养。
作为一个具体的实施方式，步骤(1)具体操作为：BD-诱饵(5μg)与猎物文库(10μg)共转化酵母后，用3mLYPDplus培养基30℃培养4h后，2000rpm离心5min，弃上清，加入1mL无菌水悬浮，获得菌液；
取所获得的菌液100μL，加入10mL SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基中，30℃200rpm震荡培养24h、72h、80h后分别取样。
进一步的，步骤(2)所述PCR扩增体系为：
Figure GDA0003569480110000031
步骤(2)所述PCR扩增程序为：
Figure GDA0003569480110000032
PCR反应体系为：
进一步的，步骤(2)所述回收为：参照MiniBEST DNA Fragment Purification KitVer.4.0试剂盒(TaKaRa)提供的方法进行PCR产物回收。
进一步的，步骤(3)所述高通量测序采用第二代测序仪Novaseq 6000(Illumina,USA)。
进一步的，步骤(4-1)所述从头组装采用Trinity-v2.4.0软件包，组装参数为--min_glue 2--min_kmer_cov 4。
进一步的，步骤(4-2)所述文库基因丰度检测采用trinity软件包自带程序align_and_estimate_abundance.pl，参数为--est_method RSEM--aln_method bowtie2。
进一步的，步骤(4-2)所述差异基因的筛选采用trinity软件包自带程序run_DE_analysis.pl，参数为--min_reps_min_cpm 1,1--method edgeR--dispersion 0.05。选取|FoldChange|>2，FDR<0.001作为参数筛选差异基因的标准。
本发明的第二个目的是提供前述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法在筛选酵母双杂交文库中的应用。
本发明的第三个目的是提供前述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法在构建目标蛋白互作蛋白网络中的应用。
本发明所述BD-诱饵是将目标蛋白构建在pGBKT7载体上制备得到，所述目标蛋白的种类无限制，所有的BD诱饵均适用于本发明方法。
本发明所述猎物文库是指含有目标蛋白互作蛋白的基因文库。
本发明所述目标蛋白所属物种可以为无参考基因组物种，作为一个具体的实施方式，所述无参考基因组物种为菊花。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
本发明公开了一种基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，该方法大大简化了传统酵母双杂交筛库的步骤，可以不受单次筛选克隆数限制，尽可能找到单个文库中目标蛋白的所有互作蛋白，解决了传统的酵母双杂交费时费力并且受到单次筛选克隆限制，存在遗漏潜在可能互作蛋白的问题。该方法同时适用于无参考基因物种目标蛋白互作网络的构建。
附图说明
图1.筛选培养基分别培养24h(a)、72h(b)、80h(c)后取样进行PCR扩增电泳图
图2.24、72、80h取样菌液中富集基因数统计韦恩图
图3.实施例6中酵母双杂交对筛选结果的进一步验证
图4.本发明基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
实施例1.筛库转化过程
本实施例中，目标蛋白所属物种为菊花。以菊花CmMPK3激酶作为目标蛋白，CmMPK3激酶基因(genbank:MG334203)。将该已知目标蛋白通过常规方法构建在pGBKT7载体上，得到BD-诱饵pGBKT7-CmMPK3，以酵母AD文库为猎物文库；将pGBKT7-CmMPK3(5μg)与酵母AD文库(10μg)共转化使用MatchmakerTMGold酵母双杂交系统(Clontech)将这些质粒共转化Y2H酵母菌株。
实施例2.四缺培养基筛选互作蛋白
将转化后的酵母菌液转移至3mL YPDplus(华越洋PPT12)培养基中30℃培养4h后，2000rpm离心5min，弃上清后，加入1mL无菌水悬浮，获得菌液；取所获得的菌液100μL，加入10mL四缺培养基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基(华越洋*TP0239)30℃200rpm震荡培养24h，72h，80h后分别取样。
实施例3.PCR扩增
分别以24h、72h、80h取样的菌液为模板，以AD-F(SEQ ID NO.1)、AD-R(SEQ IDNO.2)为引物按如下所示的程序进行MightyAmp(TaKaRa)PCR扩增，每个样品有5个重复，分别获得24h、72h、80h 3个时间段菌液样品的PCR产物。
PCR程序：
Figure GDA0003569480110000051
PCR体系为：
Figure GDA0003569480110000052
用琼脂糖凝胶电泳检测3个时间段菌液样品的PCR产物中目标蛋白的富集程度(图1)，图1显示，以5000bp的marker为参考，发现在24h时条带在500bp-5000bp区间分散且无明显单一条带，YPD plus培养时长对结果并无明显影响；而在72h时PCR扩增产物则缩小范围至500bp-2000bp，但无明显单一条带；在80h时，PCR扩增产物进一步富集。分别将3个时间段的5次重复的PCR产物片段合成一个样品后，参照MiniBEST DNA Fragment PurificationKit Ver.4.0试剂盒(TaKaRa)提供的方法回收后，获得3个时间段PCR回收产物，-20℃储存。
实施例4.测序
将实施例3中所得到3个时间段菌液样品PCR回收产物构建测序文库，采用第二代测序仪器Novaseq 6000(Illumina,USA)进行高通量测序，测序模式为PE150，测序量不少于6G，得到原始reads(表1)。
表1.24、72、80h取样菌液PCR产物回收测序结果分析
Figure GDA0003569480110000061
实施例5.生物信息学分析
首先，实施例4获得的原始数据(即表1中的raw reads)使用Cutadapt 2.10去掉接头和3’端的AD-F与5’端的AD-R。将3个测序文库的数据合并进行从头组装，获得目标蛋白所属物种的基因集序列，所用的软件包为Trinity-v2.4.0，组装参数为--min_glue 4--min_kmer_cov 4；由此可获得无参考基因组物种菊花的基因集序列。
实施例4中构建的3个时间段测序文库分别进行文库基因丰度检测，筛选出差异基因，所述差异基因为在后一时间点的文库基因丰度高于前一时间点文库基因丰度的基因，获得3组差异基因集，即：
24h-vs-72h组：72h的文库基因丰度高于24h的文库基因丰度的差异基因集，共包括485个基因；
24h-vs-80h组：80h的文库基因丰度高于24h的文库基因丰度的差异基因集，共包括47个基因；
72h-vs-80h组：80h的文库基因丰度高于72h的文库基因丰度的差异基因集，共包括147个基因；
文库基因丰度检测采用trinity软件包自带程序align_and_estimate_abundance.pl，参数为--est_method RSEM--aln_method bowtie2。Trinity组装结果如表2所示。
表2.24、72、80h取样菌液PCR产物回收Trinity组装结果
Figure GDA0003569480110000071
差异基因的筛选采用trinity软件包自带程序run_DE_analysis.pl，参数为--min_reps_min_cpm 1,1--method edgeR--dispersion 0.05。选取|FoldChange|>2，FDR<0.001作为参数筛选差异基因的标准。
筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集：将筛选得到的3组差异基因集作为初步筛选的目标蛋白的互作蛋白编码基因集，利用维恩图(在线绘制网站为：https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获得的3个差异基因集的交集，交集中的基因即为目标蛋白的互作蛋白编码基因集(图2)。
由图中可知，24h-vs-72h组与24h-vs-80h组有40(4.3％)个相同基因富集，24h-vs-72h组与72h-vs-80h组有12(1.3％)个相同基因富集，24h-vs-80h组与72h-vs-80h组有230(24.6％)个相同基因富集，有12(1.3％)个基因在24h、72h、80h菌液PCR中逐渐富集。说明该12个基因即为目标蛋白的互作蛋白编码基因。该12个基因分别为：SA(SEQ ID NO.23)、RP(SEQ ID NO.24)、SA(SEQ ID NO.25)、GAL4(SEQ ID NO.26)、CYP(SEQ ID NO.27)、CCT(SEQ ID NO.28)、GroESl(SEQ ID NO.29)、SNF7(SEQ ID NO.30)、CYS5(SEQ ID NO.31)、DEAD(SEQ ID NO.32)、PK(SEQ ID NO.33)、NAC(SEQ ID NO.34)。
实施例6.互作蛋白验证
根据实施例5中组装的序列，从实施例5得到12的个基因中随机挑选5个，分别为：CYP、CCT、SNF7、CYS5、PK，设计了5对目标蛋白的互作蛋白编码基因扩增引物(SEQ ID NO.3～12)来扩增完整的开放阅读框架(ORF)序列。
CYP-ORF-F：5′-ATGGAGTCAACTATTACATCTTTTTTTGC-3′(SEQ ID NO.3)
CYP-ORF-R：5′-CTAAAGTTTGTGTAAAATTAAGTGAGCA-3′(SEQ ID NO.4)
CCT-ORF-F：5′-ATGGAACCAAATGAAATATTGAAG-3′(SEQ ID NO.5)
CCT-ORF-R：5′-TTAGCTATGGAAAGCTGCATAATT-3′(SEQ ID NO.6)
SNF7-ORF-F：5′-ATGAAATCCATCAACAACATCTTC-3′(SEQ ID NO.7)
SNF7-ORF-R：5′-TCAAATGCGTCGAAGAGAAG-3′(SEQ ID NO.8)
CYS5-ORF-F：5′-ATGACTCAAAACATTCAGCCC-3′(SEQ ID NO.9)
CYS5-ORF-R：5′-CTAAGCAAGTTTAAAGGAAACTAG-3′(SEQ ID NO.10)
PK-ORF-F：5′-ATGGAAGTTGGAGGTGAAAT-3′(SEQ ID NO.11)
PK-ORF-R：5′-TCATGGGCCACGGGTC-3′(SEQ ID NO.12)
以菊花的cDNA为模版，扩增体系如下：
Figure GDA0003569480110000081
扩增程序如下：
Figure GDA0003569480110000082
上一步PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen)进行回收目标条带，即指上一步扩增得到的5个开放阅读框架(ORF)序列，并将回收的产物分别连接于pMD19-T(Takara)上，挑取阳性克隆测序，送测。以测序成功的含有目标蛋白的互作蛋白编码基因pMD19-T载体为模板，用相应的酶切位点引物(SEQ ID NO.13～22)进行PCR扩增，PCR产物用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen)进行回收。
Figure GDA0003569480110000083
Figure GDA0003569480110000091
回收的产物和pGADT7载体用相应的酶酶切2.5h，然后用片段纯化试剂盒MiniBESTDNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa)回收。用连接酶分别将五个基因片段连接到pGADT7载体上，再将构建的5种载体分别与pGBKT7-CmMPK3共转化至Y2H酵母菌株中，共获得5种转化的Y2H酵母菌株，将阳性克隆接种到选择性SD/-Leu/-Trp培养基上。培养3天后，挑选单克隆并将其悬浮于100μL水中，并将3.5μL悬浮液置于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养基上。2天后观察结果如图3所示，发现从筛选获得的基因中随机挑选的5个基因与目标基因CmMPK3均互作，证明本发明公开的筛库方法的可行性。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tattcgatga tgaagatacc ccaccaaacc c 31
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgaacttgc ggggtttttc agtatctacg att 33
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagtcaa ctattacatc tttttttgc 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaaagtttg tgtaaaatta agtgagca 28
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggaaccaa atgaaatatt gaag 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagctatgg aaagctgcat aatt 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaaatcca tcaacaacat cttc 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaaatgcgt cgaagagaag 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgactcaaa acattcagcc c 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctaagcaagt ttaaaggaaa ctag 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggaagttg gaggtgaaat 20
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcatgggcca cgggtc 16
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccatcgatac atggtacctg cattttttgt gagtt 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgagctcaa gtttgtgtaa aattaagtga gcacc 35
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccatcgatac atggaaccaa atgaaatatt g 31
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgggatcctt agctatggaa agctgc 26
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccatcgatac atgaaatcca tcaacaacat c 31
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgagctcgt caaatgcgtc gaagagaagc 30
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccatcgatac atgactcaaa acattcagc 29
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgagctcgc taagcaagtt taaaggaaac 30
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccatcgatac atggaagttg gaggtgaaat ag 32
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgagctcgt catgggccac gggtcgt 27
<210> 23
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tccttagtct cttcaggttc cctgtagaag aacagatcaa ccataatatc ccacttgtgc 60
ccttggttaa tcacaccacg catctgcaga accatccttg caagaagcca aaacaaacaa 120
ccaatgctgt gctttccctt gttgttggca gggataccga tgtcgacata tctcataggt 180
gagtcggtgt cacagaaagc aatggtggga atggttccaa gagcagcttc cttaatgggc 240
ttccaacttt tttgtacaaa gttttcccct tccaactttt ttgtacaat 289
<210> 24
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaccgctgtt tcacttgtct tgtatataca tgacacacaa aattgaagca cccttagata 60
acagtacata cgaaacaaaa ggttatataa aactaaacaa aatactaaca caagttataa 120
aactacacac actaaaccgc aaaactattt tcactgcagt agaagaactg gctgctttcc 180
tacgttttgg tcactgcaat attcgagcca gcttacataa acatctgcat tcaaacatta 240
aagacgctcg cagttaataa tcataaatga ccgaaaattt aactaaaagc aaagaattaa 300
gataaagggt gtttcagttg gaatttgtga tgctacattc aaagttgcat gcatagcttt 360
aaccatgaca taagctggta acccgtgaaa tccacgcccc aaattaaata ccacattata 420
ctcgtagcaa ccctttaagt tcctgtcttt aagttcacaa aataaaagta ctgtaatatt 480
ttaatggtca ctgttttggt tccttcagaa atcaagtgat agcttttaac tcgaataaac 540
tataaacagt agggacaagt tcgaccaatc tacaatttta ggtatatttt tcctctaaca 600
agtcaaatag gtagatttta acaatattat ttgaagatca gtgttttaaa caaacctcct 660
gcaaagtttt cttagaaaat gtacattatt ctggaaaaca gacgggtttt taaatgatta 720
tttaacacaa actgcttata taattcaaaa atctatcaag aaaaatatgc tgaaactgac 780
tcataccttc aaagtcagtc agttaccagg gcagtctcgt gcccaatgcc ccggttgatt 840
acacttaaag cacatgccag acgcaccagt atttccacct cttgaagcca caccactgtt 900
accatactga cccatctgac caccggttcc aaaattcgag gaaaagttac ctgggttcgc 960
acttgggcag tcttgtgccc aatgccccgg ttgaagacac ttaaagcact caccatttgc 1020
accactattt ccacctactg aacctactga acctacgcca ctgttaaatc ttcccccagc 1080
tccaccatac tgacccgtgg tccccacttg gggaccagat ccataattcg ctgggccgca 1140
caactttttt gtacaaactt gtcatatgag cgtaatctgg tacgtcgtat gggtactcca 1200
tggcggcgct cgccctat 1218
<210> 25
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
actttgtaca aaaaagttgg aagcccatta aggaagctgc tcttggaaac attcccacca 60
ttgctttctg tgacaccgac tcacctatga gatatgtcga catcggtatc cctgccaaca 120
acaagggaaa gcacagcatt ggttgtttgt tttggcttct tgcaaggatg gttctgcaga 180
tgcgtggtgt gattaaccaa gggcacaagt gggatattat ggttgatctg ttcttctaca 240
gggaacctga agagactaag gaaccagagg acgaattggc tgtagctgac tacaaggatt 300
atggtgctgg caaccttgga atggaagact ggtcagccaa tatcactgat gcccaatggg 360
ctggtgatgc tgctgcagta ccaatttcag gtgcacctgt agctgctggt ggctggactg 420
gtgctgaagc tccagtagct ggtggtgctg atggttggga cgttgtggac gcacctgtac 480
caccaactga tgttgctgct gcttcatctg ggtgggaatg aagttaatct ctcttgatcc 540
taatgtttat ttttcatgtt ctatctaaat attgagtagg acgtcctgag agacgagggt 600
aattttgagt ttgtgacagg tttcagtgtt tagatgtttt ttggtattaa gaatctatta 660
tctctgtagc tttattgagg tggatattgt ccaagtttct tttatataaa ttgtggaaca 720
ggcaaaccct ggtttaaatc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacccaac tttcttttac 780
aaa 783
<210> 26
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgaacttgc ggggtttttc agtatctacg attgtgaact tgcggggttt ttcagtatct 60
acgatcgtga acttgcgggg tttttcagta tctacgatag tgaacttgcg gggtttggtg 120
gggtatcttc atcatcgaat aggggtttgg tggggtatct tcatcatcga ataggggttt 180
ggtggggtat cttcatcatc gaataggggt ttg 213
<210> 27
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atggagtcaa ctattacatc tttttttgca cttggagtag catcaatctt catatactta 60
atatatcgaa ttgcaaactg gttatggttc aaaccaaaaa agatggaaaa gtttctaagg 120
aagcaaggcc ttaatggtac aagctacaag ttcatgtatg gagacttgaa agaacttgtt 180
cagatgtcga acgaagctaa gtcgaaaccc atgagtctaa atcatgatat tgctaatcgt 240
gttttggcct tttattataa cgctctcgct actcatggta agacttgttt tacatggctc 300
gacataagac ccgtggtaca gttatcagaa ccaaccatga tacgagaggt tctgaataat 360
tataatcaat atcaaaagca aaggggaggt aatccattga caaagttgtt agttagaggt 420
gtagccgaaa ccgatgctga tcaatgggtt aaacatagaa aaattctaaa tcctgcgttc 480
cattctgaga agctcaagca tatggtacct gcattttttg tgagctgtag tgagatgttg 540
gacaaatggg gagaaacttt aaccaaagaa agctcgggtg aagtggatgt gtggacttat 600
ctttcaacgt tttcagctga tgtaatttca cgtaccgctt ttggtagtag ttatgaggaa 660
ggaagaaaga tttttgaact tcaacgagaa caagctgttt tagttatgaa ggctacacaa 720
tctgtttaca ttccaggttt aagatttttg ccgacaaaga gcaacaagag gatgaaagag 780
attgatcggg aaataaaggc ttctataaag aacattattg ataaacgagt ggttgctatg 840
aaagctagag aaactattaa tgatgacctt ctaggcattc ttttggattc caattacaaa 900
gaaatcaaac aacatggtag taaatacgga ttgagcattg aggatgtcat cgaagaatgc 960
aagctttttt actttgcagg acaggagacc accggaacta tgcttgtttg gactatgatt 1020
ttacttggtc accacacgga ttggcaaaaa cgtgctagag aggaagtatt gcatgtcttc 1080
ggggacaaaa agccagatat tgatgggttg agtcacctaa aagtaataaa cataattttc 1140
aatgaggttc ttagactata tccaccagta atattcctaa gacggatgat acatgaagaa 1200
accaaattag gtaacttaac cttacctgca ggaacacttg ttcagctaaa catattgctt 1260
tcacaccacg acaaagatac atggggtgaa gatgtgcacg agtttaaccc cgaaagattt 1320
tccgaaggtg tgtcaaaggc gaccaaggga caagccacat atctaccatt tggtggtggc 1380
cctcgtatat gcattggcca gaattttgct atgcttgaag ctaaaatggc gctcgctatg 1440
attctacaac gattctcttt tgaggtctca ccatcataca cacatgctcc gcactctata 1500
attactctac aacctcagtt tggtgctcac ttaattttac acaaacttta g 1551
<210> 28
<211> 1692
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atggaaccaa atgaaatatt gaagagtggt ggggagggtt ttattgatcg gagtaaagtc 60
aggattttgc tatgtgataa tgatatgaag agttcggtcg aggtttatga tcttctttct 120
aaatgttcat atcaagtgac tccagtaaga tccccaaggc aagtgattga tgccctgaac 180
gtggaggggc ctgacataga tattattctt tctgaagttg atcttcccat ggctaaaggc 240
ttcaagatgt tgaaatacat tatgagggat aaagatctgc gacggattcc tgtgatcatg 300
atgtctgctc aggatgaggt tgctgttgtt gtcaaatgct tgaggcttgg agcagctgat 360
tatcttgtga aacccttgcg aacgaatgag ctcttgaatt tgtggacaca catgtggagg 420
cgaagacgca tgcttggcct ggctgagaag aacatcctga actgtgaatt cgatccaatg 480
cattcagacc atagtgatgc taataccaac agcaccactc tattttccga ggatgataca 540
gaggaaaagt cacgtaggag ttccaatcca gagatctctt tgtccattcc tcgggaagtt 600
gagagtaatg tgaatatagc tcctggtctt gtgaacacac aatttgttaa tttatcagat 660
gaaccgccgg acgtgccaga aattaatgaa caacaacgag ctgtgtatcc agggaaactt 720
atggttggtc caaagaagag tgaattaagg ataggtcagt cgtcagcttt cttcacatat 780
gttaaatcaa gcatgttcgc tagtactaca cttgggggag acataactat cgaggaagcc 840
cctccccctc aattggacag caaactaagt ttaggtggtg agcgagtgga tagtataacc 900
attaacctta ctaatgaaaa tgctacccag tatgtgcatc tcgaggaaaa aattagtaca 960
tggggtgaac atgttagtga tactcaagtg gatgattgta caccgggtcc ggagaaattt 1020
cataccaata acagtttccc tgattcaatg tcattagaca catcttctac acccccttca 1080
cagccagaat actctccgca aatgaactca aagatttcag aaacgcaaca atcaggaaat 1140
aatcatcatc ctgatgtttc gggttttaat ccatattctg cctatcccta ttaccttcca 1200
ggaccaatga atcatgttat gatgtcaccc tcatcatcaa tgtaccagca gaacatgaat 1260
gtcccacatt gtcctcctca tcacatgccg ggaatgacat cattccctta ctacccagtt 1320
aatctttgct tacctggcca gatgccacct ggcatgcacc cttggctctc gtatggtggt 1380
tcatcttcta ataatgtaaa tgtacctaaa cttgaccgta gagaagcagc cttgctcaag 1440
ttcaggcaga agaggaagga acgctgtttt gacaagaaaa tcaggtatgt taataggaaa 1500
aagttagcag agaggcgacc tcgtgttaga ggacagtttg tgaggaagat taatgggatt 1560
aacgttgatc ttaatgggca acccacttct aatgattttg atgaggatga tgatgacgat 1620
gaggaagagg aatatcaagc tggtagagat tcatcatccc cagaaaacaa ttatgcagct 1680
ttccatagct aa 1692
<210> 29
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgagggaat ttgatttgaa tcaggtggtt catcctgcaa atctagtgtt caagttacct 60
gatcatgtga gcttggaaga aggagccatg tgtgagcctc ttagtgttgg tgtccacgct 120
tgccatcgtg ccaatgtcac cccggatact aaagttttga ttattggagc tggaccgata 180
ggtcttgtaa ctatgctggc tgcccacgca tttggatccc ctaacatcgt gatttctgat 240
gttgataatc acctattatc aattgctaag gaccttggtg cagaactttt caagtctcaa 300
catagatcca gatacaagtt tacacaagaa gatgttgaga aagcatttga aacaagtact 360
cagagcggta acggcattaa ggtaatattt aacctctgta ataatgaggc agaggcaagt 420
gagtga 426
<210> 30
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atccgacccg acaccatgaa atccattaac aacatcttca agaagaagac ttgtcccaaa 60
gatgcactga gggagagcaa gagagacatg gccgtcgcca cacgaggcat tgaacgtgaa 120
atcgcatcct tacaaatgga ggagaggaaa cttgtggcag agattaaaaa aacagctaaa 180
attgggaatg aggctgccac caagatatta gctcgccagc tcgttcgtct tcgacaacaa 240
ataacaaatt tgcaagggag ccgtgcacag atcagaggtg ttgcgacaca cacccaggct 300
ctatatgcca acacctcgat ttcaactggt atgaaaggtg caacaaaagc aatggttgcg 360
atgaataagg aaatggcacc tgcgaaacaa gctaaagtta tcagagagtt ccagaagcag 420
tcatctcagc tggatatgac gattgagatg atgtccgagt ccattgatga aacattagac 480
aaagacgagg ctgaagaaga gacagaggag cttacgaacc aggtgcttga tgagattggt 540
gtaggcgttg catcacagtt gtcttcagca ccaaaaggtc ggatcgggcc caagaaggtt 600
aacaatgctg ctgcccctag ttctgagtta aatgatgttg atgatctcga gaagaggctt 660
gcttctcttc gacgcatttg a 681
<210> 31
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atgactcaaa acattcagcc ccgtaacctt gccatactag cattttttgc aatcctcttc 60
agcggaggtg tttgcgttgc caccactaga caccttagcg acccggtgaa tggagtcggg 120
gcttgggatg ttgaaaaaca ttacttgcaa aagttggggg agtacgcggt gcaagcttac 180
aatcttaaat cacatgatca tcagcatcag ctcacgtttc agaaagtgat cacatgtgac 240
cacctttccg atattaatca taagttgacc attcaggccg cagaccatgg tgtttcgcat 300
acttatgaag cagtggtttg tgacaaacca tggatcaaaa tcaagaaact agtttccttt 360
aaacttgctt ag 372
<210> 32
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atgaatatga gaaatattcg cgctcagagt actgtggctt cggttgtttg ttgtggtctt 60
ttcttagtgt tgggatgtac cagcaaaggg gctattgttg tagctactgc ggaagaggtt 120
ttgaatgtag caggtggtgg tgggaattat ttgagtctgg gtgcagagca ggttaagatg 180
ggaatgaaga agaccaatag gcaatacaaa atgccagact tcgacggcgc tcctactgct 240
gattcagaag gctatagcaa gatggacaat tccatccgat atgccaatga atgtcagact 300
gagaaattca tgtttcacat ccaaaaaact gatgatcttt gtgatcggtt gtctacagaa 360
aaacagaagt tcgctacacg gtaa 384
<210> 33
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atggaagttg gaggtgaaat agatatgaag aaatcagaat catcaagaag tgttggctca 60
tctccaaaga aaagtcaact tgggtcaaag tcaaaggagt tgagtaataa agatagtttt 120
ctaagagcag ataagattga tttcaagagc tgggatgttc agttggataa gcatttgagt 180
agagtttggt caagagatag agaagcatca aataatagta gtgctaaaaa agaagaatgg 240
gaaattgatt tagctaaatt ggatataagg aatgttattg ctcatggtac ttatggtact 300
gtttatagag gtgtttatga tggtcaagat gttgcagtga aggtattgga ctggggagag 360
gatggtcttg ccactgctgc tgagactgca aatcttcgta cttctttccg tcaagaggtt 420
gctgtatggc ataagcttga tcatccaaat gtcaccaagt ttgtcggagc ttcaatgggg 480
acctcagatc taaagattcc atcaaacagt acatcaaatt ccgatcacaa ctctctaccc 540
tcgagggctt gttgtgttgt ggtggagtat cttccaggcg ggacactaaa gaaatatcta 600
atcaggaatt ctagaaagaa actgtctttc aagatcgtta ttcaacttgc gttagatctc 660
tctagaggtt taagttacct tcactccaag aagattgtgc accgtgacgt taagacggaa 720
aatatgctgt tggatctgaa taggacgtta aagattgctg attttggagt tgctcgtgtt 780
gaagctcaaa accccaggga tatgactggt gagacaggaa ctcttggtta catggcgcct 840
gaggttcttg atggaaagcc ttacaaccgg aaatgtgatg tttatagttt tggcatatgc 900
ttatgggaag tatattgttg tgatatgcct tacgctgatc tgagttttgc tgaagtatct 960
tctgcagttg tccgtcagaa tttacgcccc gagatcccca aatgttgccc aagtgcattt 1020
gcaagcatat tgaaaaaatg ttgggacgca aatcccgaca gaagaccgga gatggatgag 1080
gtcgtgaggt tgttagaggc gatagacaca agtaaaggtg gcgggatgat acccgaaggc 1140
caaggcacag gttgtttttg tttcaccacg acccgtggcc catga 1185
<210> 34
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atgtatgttg ctcgctcacc tttcgtcgca gttccagttc cacctcctgt tgtaatttgg 60
gtgtgtgtgg gtgtagaatt gtctagattg aagactagag acttggaatg gtacttcttt 120
agtgtgcttg ataagaaata tgggaatgga tcccgaacga atcgtgctac tgagaagggg 180
tattggaaga ctactggaaa ggaccaaact gtttatttta ggtctgaatt gacagggatg 240
aagaaaactt tggtctatca tagtggtcgg gcaccaaaag gtgagaggac caattgggtt 300
atgcatgagt atagactcat tgataaggag cttgaaagtg ctggagttgt gcaggatgca 360
tttgttctgt gcaggatctt tcacaaaagt ggttctgggc ctaagaatgg cgaaaagtac 420
ggggcaccat taattgagga aaaatgggaa gaggaagagc cgatatttgt tcccaagcag 480
gaagatttta ctgaggaatt gcctgttgat atggattctt atcttgatgc taatgacatt 540
gcgcagatta tgcacagaga catgccaggg caagatggtc ctcggccatt aagcttctat 600
caaggtgata acatcaacta tgctgatgta tctgcggcag tgactaatga ccctcaaaat 660
tccttggtga gtgtgggtga atattcacct caggttgatg aaagtgatgg gtccaagtcg 720
tttggtctcc ctttgcaaac tctattggat cctgtgtctg tcgaccatgg atacattgga 780
gaatcaagca acccaacaaa ttttgacata gattctttaa ttaacgaatc attcttcgat 840
gctgctggtg aatttcatga tgatagctta tactttcaag cgaatgatgt tgtgtgcacg 900
gattctggct tggacatgct caatgagtat gagtacttta atcaaaatat tgacaacttc 960
cagtatagtc ttgattcaac aggagacaag aacattcccc ctgactcatt cttaaatctt 1020
gaggtgaatc tgactgatgg aaccaatcaa gtgagcgacg caagccagcc ctttgaagga 1080
cagaatgact ttgttgcacc ttattcaaag gaggagcatc ctgctcaaca agcaggtaga 1140
aagcgggggt atcaatctca agaaacagct attgcacacc cgtttctcaa aaaggcgagt 1200
tacatgttgg gcaacgttgc tgctccgcct gcatttgctt cagagttccc tacaaaatac 1260
atggctgctg cttctcagcc ttccagttat ggtatgatcc aatttggcaa cgtttccttc 1320
aatggaggtg cagtggacct atcgttgggc aagcacactc aggtcaacat tgttctctca 1380
tttgccttgg gacaaaggga ggtcaattct ttcaatttac atcaagctgg gaaggtcaac 1440
tcaagtgcat ctcgaggttg gttttactgc gcgtttatct ggattttgat gctttctttg 1500
aacttcaaga tcgggagtct ggtatgtcca agggcattta tgagctga 1548

Claims (10)

1.一种基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
（1）四缺培养基筛选互作蛋白：BD-诱饵与猎物文库共转化酵母，用YPDplus培养基30℃培养4h后，离心，弃上清，加入无菌水悬浮，获得菌液；
取所获得的菌液，加入SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基中，震荡培养24 h、72 h、80 h后分别取样；
所述共转化为使用MatchmakerGold酵母双杂交系统，所述酵母为Y2H酵母菌株；
（2）分别以步骤（1）中获得的在24 h、72 h、80 h取样的菌液为模板，以AD-F和AD-R为引物，分别进行MightyAmp PCR扩增，获得3个时间段菌液样品的PCR产物；用琼脂糖凝胶电泳检测目标蛋白的富集程度，回收，获得3个时间段PCR回收产物； AD-F和AD-R引物如下：
AD-F：5′-TATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′（SEQ ID NO.1）； AD-R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′（SEQ ID NO.2）
（3）高通量测序：分别构建步骤（2）所得到3个时间段PCR回收产物的测序文库，进行高通量测序，测序模式为PE150，测序量不少于6G，得到原始reads；
（4）获取目标蛋白所属物种的基因集序列和文库基因丰度数据，筛选差异基因，获得目标蛋白的互作蛋白编码基因集：
（4-1）将步骤（3）中3个时间段PCR回收产物的测序文库测序所得的原始reads去除接头和3’端的AD-F与5’端的AD-R后，将所有数据合并，进行从头组装，获得目标蛋白所属物种的基因集序列；
（4-2）对步骤（3）中构建的3个时间段测序文库分别进行文库基因丰度检测，筛选出差异基因，所述差异基因为在后一时间点的文库基因丰度高于前一时间点文库基因丰度的基因，共获得3组差异基因集；
（4-3）筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集：将筛选得到的3组差异基因集作为初步筛选的目标蛋白的互作蛋白编码基因集，绘制维恩图，获得的3组差异基因集的交集，交集中的基因即为目标蛋白的互作蛋白编码基因集。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于所述离心条件为2000rpm离心5min；震荡培养条件为30℃ 200 rpm震荡培养。
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增体系为：12.5 µL 2X Mighty Amp buffer，1 µL 上游引物AD-F，1 µL 下游引物AD-R，0.25 µL Mighty Amp DNA Polymerase，1µL 三个时间段取样菌液，9.25 µL水；
PCR扩增程序为98℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 3 min，循环35次；68℃ 5min；4℃ ∞。
4.根据权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于，步骤（2）所述回收为：参照MiniBEST DNA Fragment Purification KitVer.4.0试剂盒提供的方法进行PCR产物回收。
5.根据权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于，步骤（3）所述高通量测序采用第二代测序仪Novaseq 6000 。
6.根据权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于，步骤（4-1）所述从头组装采用Trinity-v2.4.0软件包，组装参数为--min_glue 2 --min_kmer_cov 4。
7.根据权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于，步骤（4-2）所述文库基因丰度检测采用trinity软件包自带程序align_and_estimate_abundance.pl，参数为--est_method RSEM --aln_method bowtie2。
8.根据权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法，其特征在于，步骤（4-2）所述差异基因的筛选采用trinity软件包自带程序run_DE_analysis.pl，参数为--min_reps_min_cpm 1,1 --method edgeR --dispersion 0.05，选取|FoldChange|>2，FDR<0.001作为参数筛选差异基因的标准。
9.权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法在筛选酵母双杂交文库中的应用。
10.权利要求1所述的基于高通量测序筛选目标蛋白的互作蛋白编码基因集的方法在构建目标蛋白互作蛋白网络中的应用。
CN202011140853.7A 2020-10-22 2020-10-22 一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法 Active CN112301117B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011140853.7A CN112301117B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011140853.7A CN112301117B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112301117A CN112301117A (zh) 2021-02-02
CN112301117B true CN112301117B (zh) 2022-06-03

Family

ID=74326806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011140853.7A Active CN112301117B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112301117B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114592034A (zh) * 2022-03-08 2022-06-07 北京工商大学 一种紫红曲霉YJX-8 cDNA文库的构建方法及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103774241B (zh) * 2012-10-18 2015-04-08 华中农业大学 一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法
CN110863004A (zh) * 2019-12-06 2020-03-06 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用
CN111394800B (zh) * 2020-03-13 2022-04-08 南京农业大学 一种评估无参物种酵母双杂交文库质量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112301117A (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113699135A (zh) 一种无pam限制的腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白及应用
CN110331146A (zh) 一种调控sgRNA转录的启动子、表达载体，及其基因组编辑系统和应用
CN110195068B (zh) 一种用于鉴定银杏雌雄株的多核苷酸及其应用
US20010046669A1 (en) Genetically filtered shotgun sequencing of complex eukaryotic genomes
CN111235180A (zh) 缩短玉米花期的方法
CN112301117B (zh) 一种基于高通量测序构建目标蛋白互作网络的方法
CN116024670A (zh) 一种柑橘溃疡病诱导转录因子酵母文库、构建方法及其应用
CN109355290B (zh) 一种植物环状rna表达框架及其应用
CN112226425B (zh) 一种亚洲小车蝗胞外蛋白酶erk及其编码基因与应用
CN112979823B (zh) 一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白
CN113265406A (zh) 大豆fdl12基因编辑位点及其应用
CN105154526B (zh) 日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法
KR101111563B1 (ko) 배추 ｂａｃ 클론 유래 ｓｓｒ 마커 및 이를 이용해 작성된 브라시카 라파의 표준 유전자지도
CN115341048B (zh) 一种与苹果属植物根皮苷有无性状相关的分子标记及应用
KR101720582B1 (ko) 엽록체 염기서열을 이용한 Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ과 감자（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）를 포함한 다른 Ｓｏｌａｎｕｍ 종의 구별 마커 및 구별 방법
CN104774860B (zh) 适于转化细胞的构建体、系统及其应用
WO2005021719A2 (en) Libraries of recombinant chimeric proteins
CN112852865A (zh) OaAn-1蛋白、编码基因及其相关生物材料的应用
CN113215187A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法
CN113136397B (zh) 一种提高草原龙胆基因编辑效率的重组载体及其制备方法与应用
CN108753990B (zh) 一种锈斑蟳全基因组微卫星标记及筛选方法与应用
US20040058375A1 (en) Genetically filtered shotgun sequencing of complex eukaryotic genomes
CN112899305B (zh) 一种缩短水稻生育期的方法、蛋白质、核酸分子、生物材料及其应用
CN114672491B (zh) 玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的应用
CN109652561B (zh) 一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant