CN109868272B - 黑金红头鼠线粒体全基因组序列的扩增引物和扩增方法 - Google Patents

Abstract

一种黑金红头鼠线粒体基因组全序列扩增引物和扩增方法，是根据GenBank数据库中收录的黑躯兵鲶(Corydoras rabauti)线粒体全基因组序列设计22对扩增引物，以提取的黑金红头鼠基因组总DNA为模板，分别用该些扩增引物进行PCR扩增，扩增产物电泳后进行测序及序列拼接，获得黑金红头鼠线粒体基因组全序列，为观赏鱼类品种鉴定、资源保护提供了分子生物学信息。

Description

黑金红头鼠线粒体全基因组序列的扩增引物和扩增方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种观赏性鱼类黑金红头鼠线粒体全基因组序列的扩增引物和扩增方法。

背景技术

黑金红头鼠，学名内格罗河兵鲶(Corydoras duplicareus)，隶属辐鳍鱼纲鲶形目美鲶科兵鲶属。原产地是巴西境内Nobua oba北方8公里处的Rio Poranga，是一种优良的观赏性鱼类。本种延续红头鼠群特有的淡雅体色，以及令人一眼即可看出特色差异的隐眼线与背部线条而极具观赏价值。成熟雌性拥有橄榄状的体型，不但腹部线条向左右两侧扩张，同时从侧面观察，更可见到雌鱼随生殖巢逐渐发育，而拥有足以撑起头部与尾端的便便大腹，最大体长在50-55mm之间。其喜好酸性软水，生性较敏感，所以饲养底层宜放置细软的河沙为主，同时在水流与光照控制上，需妥善搭配具有隐蔽性的造景素材，提供一个稳定安静的环境。目前国内引进大量鲶科鱼类作为观赏品种，但大多命名比较混乱，对物种的鉴定不准确。此外，现阶段对黑金红头鼠的研究非常少，特别是在分子生物学方面没有确切数据及分析。因此，对黑金红头鼠线粒体全基因组序列进行扩增和分析，可为鼠鱼的品种鉴定和资源保护提供科学依据。

发明内容

本发明所要解决技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种观赏性鱼类黑金红头鼠线粒体全基因组序列的扩增引物和扩增方法，通过22对特异性引物对黑金红头鼠基因组进行PCR扩增，获得黑金红头鼠线粒体全基因组序列，为观赏鱼类品种鉴定、资源保护提供了分子生物学信息。

为解决述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种黑金红头鼠线粒体基因组全序列的扩增引物，该扩增引物包括22对引物对：

第1对引物对的上游引物F1为：5’–CAGGCATCAGGCACAATCAT–3’，下游引物R1为：5’–CCGGTACACTTACCATGTTACGAC–3’；

第2对引物对的上游引物F2为：5’–GCACGAAGTGGGAAGAAATG–3’，下游引物R2为：5’–GGCCCACTGAAGCGGTAATC–3’；

第3对引物对的上游引物F3为：5’–GCTGGTTGCCTAAGAAGTGG–3’，下游引物R3为：5’–TGGTCGCCCCAACCGAAGAT–3’；

第4对引物对的上游引物F4为：5’–TGATCTGCCCGTGCAGAAGC–3’，下游引物R4为：5’–TGGGTGTGGCGAGAAATAGG–3’；

第5对引物对的上游引物F5为：5’–CGTAGTAGGCCCATTCGGAC–3’，下游引物R5为：5’–TTGGCATTCAGGCACAGCTC–3’；

第6对引物对的上游引物F6为：5’–CCTCGATTCCGCTACGACCA–3’，下游引物R6为：5’–CGAGGTGTGCAATTGATGAG–3’；

第7对引物对的上游引物F7为：5’–AGCCCCATTCGCACTAATCG–3’，下游引物R7为：5’–GCGGGGAAAGTAGATGAATG–3’；

第8对引物对的上游引物F8为：5’–TGAATGCAACCCAGACACTT–3’，下游引物R8为：5’–TAATTCCAGCGGCTAGGACT–3’；

第9对引物对的上游引物F9为：5’–CTCCATCTCGCTGGTGTTTC–3’，下游引物R9为：5’–TAGCGGCGAAGGCTTCTCAT–3’；

第10对引物对的上游引物F10为：5’–CCTTCTTCCCCCAACACTTC–3’，下游引物R10为：5’–TCGGATCGGGGATTCCATTG–3’；

第11对引物对的上游引物F11为：5’–TTAAAGCCATAGGCCATCAA–3’，下游引物R11为：5’–TGGTACTGCAAGGCCTATGT–3’；

第12对引物对的上游引物F12为：5’–CACCCCACTAAACAAGAGCG–3’，下游引物R12为：5’–TCGGTGGCCTTCCATAATGC–3’；

第13对引物对的上游引物F13为：5’–TGGCCCCAACACCAGAACTA–3’，下游引物R13为：5’–TTCCTGAGCCGAAATCAGAG–3’；

第14对引物对的上游引物F14为：5’–CTCCCCGAACCCACCATTAC–3’，下游引物R14为：5’–TTGGTTGCCTCATCGCGTAA–3’；

第15对引物对的上游引物F15为：5’–TCAGCCGCCAACGAACCTAT–3’，下游引物R15为：5’–GTGCCTCGTTGGGTTTTTAG–3’；

第16对引物对的上游引物F16为：5’–GCCAACCTAGCGAATCTAGC–3’，下游引物R16为：5’–GCATCTGCTCGTCCATATCA–3’；

第17对引物对的上游引物F17为：5’–CGCAGACCCCTACATAAACC–3’，下游引物R17为：5’–ATACTGCTGCGAATGAGGTG–3’；

第18对引物对的上游引物F18为：5’–TTGGAAGCCTCGCATTAACC–3’，下游引物R18为：5’–AGCGGTGTGATGGTATTGTG–3’；

第19对引物对的上游引物F19为：5’–CGCACAAATCACCAACACTC–3’，下游引物R19为：5’–GATTACTGTGGCGCCTCAGA–3’；

第20对引物对的上游引物F20为：5’–CCAACGGAGCTTCCTTCTTC–3’，下游引物R20为：5’–TTCTAGTCATCCGGTTGCAG–3’；

第21对引物对的上游引物F21为：5’–ACATGAATCGGCGGAATACC–3’，下游引物R21为：5’–AAGAATGCTCGGCATGGTGG–3’；

第22对引物对的上游引物F22为：5’–GGCATCTGGTTCCTATCTGA–3’，下游引物R22为：5’–GTGGCTGGCACGAATTTTAC–3’。

上述扩增引物是根据GenBank数据库中收录的黑躯兵鲶(Corydoras rabauti)线粒体全基因组序列设计得到。

本发明同时提供一种对黑金红头鼠线粒体基因组全序列扩增的方法，该方法是以提取的黑金红头鼠肌肉组织总DNA为模板，分别用上述的22对引物对进行PCR扩增，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序及序列拼接。

上述提及的PCR的反应体系为50μL，其中：1μL DNA模板、1μL 10μM上游引物、1μL10μM下游引物、1μL 10mM dNTP、5μL 10×不含Mg²⁺的PCR Buffer、5μL 25mM MgCl₂、0.5μL5U/μL Taq酶及35.5μL无核酸酶水。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸8min。

本发明还提供根据上述扩增方法获得的黑金红头鼠线粒体基因组全序列，该线粒体基因组长度为16667bp，全基因组序列包含2个核糖体RNA基因，13个不含内含子的蛋白编码基因，22个转运RNA基因和2个非编码区(控制区和轻链复制起始区)。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体的实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

1.材料与方法

1.1实验材料获取

从湖南省长沙市扬帆观赏鱼市场购买黑金红头鼠，按DNA提取样品处理要求采集鱼背部肌肉，-20℃保存备用。

1.2肌肉基因组DNA提取

按上海生工生物工程有限公司Dzup基因组DNA抽提试剂操作手册要求提取黑金红头鼠线粒体基因组DNA，具体操作步骤如下：

a)取25-50mg的黑金红头鼠肌肉组织加液氮碾磨成粉末，加入到1.5ml的离心管中。加入1ml Dzup，震荡混匀，室温放置5-10min至完全裂解。震荡的时候应充分，要使溶液中无明显的组织团块即可。

b)将上一步获得裂解组织的离心管放入离心机以10000rpm/min室温离心10min，然后将上清液转移到新的1.5ml的离心管中。此步骤主要用来除去不溶的组织碎片和水解的RNA等杂质。

c)加入500ul的无水乙醇，颠倒混匀5-8次，室温放置2-3min，如有沉淀产生，用移液枪头将沉淀的DNA挑取到新的1.5ml离心管中。如无法挑取，8000rpm室温离心5min，弃上清液。

d)加入1ml75％的乙醇，颠倒1-3min，以12000rpm/min离心2min，弃上清液，多次重复，从而使沉淀悬浮起来。

e)开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇挥发。

f)得到的DNA用无菌蒸馏水进行溶解，-20℃保存备用。

1.3引物设计与PCR扩增

1.3.1引物设计

引物设计根据GenBank收录的黑躯兵鲶线粒体基因组全序列(Corydorasrabauti，收录号：AB054128.1)信息设计特异性引物，特异性引物由上海铂尚生物技术公司合成，共22对，具体如下：

第1对引物对的上游引物F1为：5’–CAGGCATCAGGCACAATCAT–3’(如SEQ ID No.1所示)，下游引物R1为：5’–CCGGTACACTTACCATGTTACGAC–3’(如SEQ ID No.2所示)；

第2对引物对的上游引物F2为：5’–GCACGAAGTGGGAAGAAATG–3’(如SEQ ID No.3所示)，下游引物R2为：5’–GGCCCACTGAAGCGGTAATC–3’(如SEQ ID No.4所示)；

第3对引物对的上游引物F3为：5’–GCTGGTTGCCTAAGAAGTGG–3’(如SEQ ID No.5所示)，下游引物R3为：5’–TGGTCGCCCCAACCGAAGAT–3’(如SEQ ID No.6所示)；

第4对引物对的上游引物F4为：5’–TGATCTGCCCGTGCAGAAGC–3’(如SEQ ID No.7所示)，下游引物R4为：5’–TGGGTGTGGCGAGAAATAGG–3’(如SEQ ID No.8所示)；

第5对引物对的上游引物F5为：5’–CGTAGTAGGCCCATTCGGAC–3’(如SEQ ID No.9所示)，下游引物R5为：5’–TTGGCATTCAGGCACAGCTC–3’(如SEQ ID No.10所示)；

第6对引物对的上游引物F6为：5’–CCTCGATTCCGCTACGACCA–3’(如SEQ ID No.11所示)，下游引物R6为：5’–CGAGGTGTGCAATTGATGAG–3’(如SEQ ID No.12所示)；

第7对引物对的上游引物F7为：5’–AGCCCCATTCGCACTAATCG–3’(如SEQ ID No.13所示)，下游引物R7为：5’–GCGGGGAAAGTAGATGAATG–3’(如SEQ ID No.14所示)；

第8对引物对的上游引物F8为：5’–TGAATGCAACCCAGACACTT–3’(如SEQ ID No.15所示)，下游引物R8为：5’–TAATTCCAGCGGCTAGGACT–3’(如SEQ ID No.16所示)；

第9对引物对的上游引物F9为：5’–CTCCATCTCGCTGGTGTTTC–3’(如SEQ ID No.17所示)，下游引物R9为：5’–TAGCGGCGAAGGCTTCTCAT–3’(如SEQ ID No.18所示)；

第10对引物对的上游引物F10为：5’–CCTTCTTCCCCCAACACTTC–3’(如SEQ ID No.19所示)，下游引物R10为：5’–TCGGATCGGGGATTCCATTG–3’(如SEQ ID No.20所示)；

第11对引物对的上游引物F11为：5’–TTAAAGCCATAGGCCATCAA–3’(如SEQ ID No.21所示)，下游引物R11为：5’–TGGTACTGCAAGGCCTATGT–3’(如SEQ ID No.22所示)；

第12对引物对的上游引物F12为：5’–CACCCCACTAAACAAGAGCG–3’(如SEQ ID No.23所示)，下游引物R12为：5’–TCGGTGGCCTTCCATAATGC–3’(如SEQ ID No.24所示)；

第13对引物对的上游引物F13为：5’–TGGCCCCAACACCAGAACTA–3’(如SEQ ID No.25所示)，下游引物R13为：5’–TTCCTGAGCCGAAATCAGAG–3’(如SEQ ID No.26所示)；

第14对引物对的上游引物F14为：5’–CTCCCCGAACCCACCATTAC–3’(如SEQ ID No.27所示)，下游引物R14为：5’–TTGGTTGCCTCATCGCGTAA–3’(如SEQ ID No.28所示)；

第15对引物对的上游引物F15为：5’–TCAGCCGCCAACGAACCTAT–3’(如SEQ ID No.29所示)，下游引物R15为：5’–GTGCCTCGTTGGGTTTTTAG–3’(如SEQ ID No.30所示)；

第16对引物对的上游引物F16为：5’–GCCAACCTAGCGAATCTAGC–3’(如SEQ ID No.31所示)，下游引物R16为：5’–GCATCTGCTCGTCCATATCA–3’(如SEQ ID No.32所示)；

第17对引物对的上游引物F17为：5’–CGCAGACCCCTACATAAACC–3’(如SEQ ID No.33所示)，下游引物R17为：5’–ATACTGCTGCGAATGAGGTG–3’(如SEQ ID No.34所示)；

第18对引物对的上游引物F18为：5’–TTGGAAGCCTCGCATTAACC–3’(如SEQ ID No.35所示)，下游引物R18为：5’–AGCGGTGTGATGGTATTGTG–3’(如SEQ ID No.26所示)；

第19对引物对的上游引物F19为：5’–CGCACAAATCACCAACACTC–3’(如SEQ ID No.37所示)，下游引物R19为：5’–GATTACTGTGGCGCCTCAGA–3’(如SEQ ID No.38所示)；

第20对引物对的上游引物F20为：5’–CCAACGGAGCTTCCTTCTTC–3’(如SEQ ID No.39所示)，下游引物R20为：5’–TTCTAGTCATCCGGTTGCAG–3’(如SEQ ID No.40所示)；

第21对引物对的上游引物F21为：5’–ACATGAATCGGCGGAATACC–3’(如SEQ ID No.41所示)，下游引物R21为：5’–AAGAATGCTCGGCATGGTGG–3’(如SEQ ID No.42所示)；

第22对引物对的上游引物F22为：5’–GGCATCTGGTTCCTATCTGA–3’(如SEQ ID No.43所示)，下游引物R22为：5’–GTGGCTGGCACGAATTTTAC–3’(如SEQ ID No.44所示)。

1.3.2PCR扩增

a)PCR反应体系(总体积50μL)：1μL DNA模板、1μL上游引物(10μM)、1μL下游引物(10μM)、1μL dNTP 10mM、5μL 10×PCR Buffer(不含Mg²⁺)、5μL MgCl₂(25mM)、0.5μL Taq酶(5U/μL)及35.5μL无核酸酶水(nuclease-free Water)。

b)PCR反应程序：95℃预变性3min，然后94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸8min。

c)PCR产物电泳检测：PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，90V电压电泳50min，SYBR Green染色后，凝胶成像系统进行条带分析并拍照保存。

1.4序列测定与拼接

1.4.1序列测定

将上一步电泳检测条带大小符合预期、带型单一的产物送上海铂尚生物技术公司测序，测序引物为片段扩增引物，双向测通。

1.4.2序列拼接与分析

测序所得各片段直接运用Geneious R11软件进行拼接和基因注释，NCBI在线多序列比对。

2.结果

经Geneious R11软件分析可知，黑金红头鼠线粒体全基因组序列长度为16667bp(如SEQ ID No.45所示)。全基因组序列包含2个核糖体RNA基因，13个不含内含子的蛋白编码基因，22个转运RNA基因和2个非编码区(控制区和轻链复制起始区)，与其他大多数鱼类的研究结果相同。

NCBI比对分析黑金红头鼠和黑躯兵鲶线粒体基因组，二者相似性为92％，存在1174个突变位点。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明做任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下，还有其他的变体和改型。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 黑金红头鼠线粒体全基因组序列的扩增引物和扩增方法

<130> 002

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

caggcatcag gcacaatcat 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ccggtacact taccatgtta cgac 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcacgaagtg ggaagaaatg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggcccactga agcggtaatc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gctggttgcc taagaagtgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tggtcgcccc aaccgaagat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tgatctgccc gtgcagaagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tgggtgtggc gagaaatagg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

cgtagtaggc ccattcggac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ttggcattca ggcacagctc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

cctcgattcc gctacgacca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cgaggtgtgc aattgatgag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

agccccattc gcactaatcg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gcggggaaag tagatgaatg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

tgaatgcaac ccagacactt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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taattccagc ggctaggact 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

ctccatctcg ctggtgtttc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tagcggcgaa ggcttctcat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ccttcttccc ccaacacttc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tcggatcggg gattccattg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ttaaagccat aggccatcaa 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

tggtactgca aggcctatgt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

caccccacta aacaagagcg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

tcggtggcct tccataatgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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tggccccaac accagaacta 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ttcctgagcc gaaatcagag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ctccccgaac ccaccattac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ttggttgcct catcgcgtaa 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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tcagccgcca acgaacctat 20

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<213> 人工序列()

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gtgcctcgtt gggtttttag 20

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gccaacctag cgaatctagc 20

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<213> 人工序列()

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gcatctgctc gtccatatca 20

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<213> 人工序列()

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cgcagacccc tacataaacc 20

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atactgctgc gaatgaggtg 20

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ttggaagcct cgcattaacc 20

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<213> 人工序列()

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agcggtgtga tggtattgtg 20

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<213> 人工序列()

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cgcacaaatc accaacactc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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gattactgtg gcgcctcaga 20

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<212> DNA

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ccaacggagc ttccttcttc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ttctagtcat ccggttgcag 20

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<213> 人工序列()

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acatgaatcg gcggaatacc 20

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<213> 人工序列()

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aagaatgctc ggcatggtgg 20

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<212> DNA

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ggcatctggt tcctatctga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

gtggctggca cgaattttac 20

<210> 45

<211> 16667

<212> DNA

<213> Corydoras duplicareus

<400> 45

gctagtgtag cttaaacaaa gcataacact gaaaatgtta agatgaaccc tagaaagttc 60

cacgagcaca aaggtttggt cctgacttta ctatcaactt taacctaatt catacatgca 120

agtatccgca tccctgtgag aatgccctca atccccctac cggggacgag gagcaggcat 180

caggcacaac cattggccca agacgccttg ctttgccaca cccccaaggg aattcagcag 240

tagtaaatat taagccataa gtgaaaactt gacttagtta aggttaaaag agtcggtaaa 300

attcgtgcca gccaccgcgg ttatacgaaa gactctagtt gataaacacg gcgtaaaggg 360

tggttaggac aataataaaa taaagttaaa gacttaccaa gccgtcatac gcccatgaaa 420

gaacgaaaac cacaaacgaa agtaacttta ttacacatcc gaacccacga aagctaagaa 480

acaaactggg attagatacc ccactatgct tagccttaaa ccaagatatg ttttacaaaa 540

ctatccgcca gggtactacg agcatagctt aaaacccaaa ggacttggcg gtgtctcaga 600

cccacctaga ggagcctgtt ctagaaccga taacccccgt taaacctcac cacttcttgt 660

taatcccgcc tatataccgc cgtcgccagc ttaccctatg aaggcaaaac agtaagcaaa 720

atggacaaaa cccaaaacgt caggtcgagg tgtagcgcac gaagtgggaa gaaatgggct 780

acattttcta ttacagaaaa tcacgaatgg tttactgaaa cacacacctg aaggaggatt 840

tagtagtaaa aagcaaatag agagtccttt tgaaccaggc tctgagacac gcacacaccg 900

cccgtcactc tccccctcat aaaatccaaa cgataaataa ttcatcaaaa aatacatcgg 960

ggaggcaagt cgtaacatgg taagtgtacc ggaaggtgca cttggaacaa tcaggatgtg 1020

gctgagatag ttaagcacct cacttacacc gagaaaacat ccatgcaagt tggatcatcc 1080

tgagccataa agctagctta aacacaccaa ctaactaaca acattaataa gtttagaaag 1140

actaaaatca attaatcaaa acatttttcc gtccaagtat atgagataaa aaagacacaa 1200

aaagcaatag ataaagtacc gcaagggaaa gctgaaaaag aaatgaaaca aaccatcaaa 1260

gcacaacaaa gcagagacta aaactcgtac cttttgcatc atgatttagc tagttattct 1320

gagcaaagag tactttagtt caaaaccccg aaactaagtg agctacccca agacagtcta 1380

ttatatagga ccaacccgtc tctgtggcaa aagagtggga agatctttgg gtaggggtga 1440

cagacctacc gaacttagtt atagctggtt gcctaagaaa tggatagaag ttcagcctca 1500

cacccctcaa accaacaact ataatattat gacaacgagc aatatgtgag agttaatcaa 1560

agggggtaca gcccctttga aagaggaaac aacctataca ggaggttaag gattatactt 1620

acaaagatta ctgcttcagt gggcctaaaa gcagccatcc gaatagaaag cgttaaagct 1680

caagcagata aaaatcactt ataccaacat cctaatccaa aacccctaat attattaggc 1740

cgttccatgc cgacatggaa acgatactgc taaaatgagt aataagaagg tatcttttaa 1800

gcccttctcc tagcctaagt gtaaattaga ttggaccaac cactaaaaca tttaacgaac 1860

ccaacacaca agagggaaat gtgaaccaaa aaaacaacaa gaaaacttca cacaacttaa 1920

tcgttaaccc cacaccggaa ggccacaagg aaagactaaa agaaaaggaa ggaactcggc 1980

aaacacaagc ctcgcctgtt taccaaaaac atcgcctccc gcaaaaatca atgtatagga 2040

ggtcctgcct gcccagtgac tatgttaaac ggccgcggta ttttgaccgt gcaaaggtag 2100

cgcaatcact tgtcttttaa atgaagacct gtatgaatgg tggaacgagg gcctaactgt 2160

ctcccttttc aagtcaatga aattgatcta cccgtgcaga agcgggtata taaatacaag 2220

acgagaagac cctttggagc ttaagattaa aaatcaacta tgtcaaatat ttactaaata 2280

aaactaaata gtaactgatc ataatcttcg gttggggcga ccacggaata aaaacaaact 2340

tccacatgga ctgaggacta accttaaaac caagaaagac atttctaagt cacagaattt 2400

ctgaccacac agatccggcg tatgccgatc aatggaccaa gttaccctag ggataacagc 2460

gcaatcccct tttagagttc ctatcgacaa gggggtttac gacctcgatg ttggatcagg 2520

acatcctaat ggtgcagccg ctattaaggg ttcgtttgtt caacgattaa agtcctacgt 2580

gatctgagtt cagaccggag caatccaggt cagtttctat ctgtaatgcc atttatccta 2640

gtacgaaagg accggaaaaa tagggcctat gttaacaaca agccctcatc caatctaatg 2700

aagacaacta aaatagataa aggaaagcac aaatgacaaa tttagataaa attactaagg 2760

tggcagagcc cggtaattgc aaaaggccta agccctttca gccggaggtt caaatcctcc 2820

ccttagttat gataacccta ctcacacata ttattaatcc actagcctac attgtccctg 2880

tactattagc ggtagcattc ctcacactca ttgaacgaaa agtactagga tatatacaac 2940

tacgaaaagg accaaacgta gtaggcccat tcggactcct acaacccatt gccgatgggg 3000

taaaactatt tattaaagaa ccagtacgcc catctacatc ctccccattc cttttcctcg 3060

ccacacccat actagctttc acactagcca taacactatg agcaccaatg ccaattccat 3120

accctgtagt agacctaaac ctcggaattc tatttattct tgcactgtca agtctagcag 3180

tatactccat tttaggctca ggatgagcat caaattcaaa atatgcccta atcggagccc 3240

tacgagccgt agcccaaacc atttcttatg aagtaagcct aggacttatc ctactctcaa 3300

ttatggtatt ctctggtggc tttacccttc aaatatttaa cacagcccaa gaagcaatat 3360

gacttatagt accagcctga ccattagcag caatatgata tatttcaacc ctagcagaaa 3420

ctaaccgagc cccatttgat ctaaccgaag gagaatctga actagtatct ggattcaatg 3480

tagaatacgc aggaggccca ttcgcactat tttttctagc agaatatgcc aacatcctac 3540

taataaatac actatcagcc atcttattct taggcgcctc acatatccca actttaccac 3600

agctaacatc tatcaatatt ataatcaaag ccgcagcctt atcaatacta tttttatgag 3660

tacgagcctc ctacccccga tttcgatatg atcaacttat acacctagta tgaaaaaact 3720

tcctgcccct tactctagcc ctgatcttat gacacgttgc ccttcctatc gcattcacag 3780

gactcccccc tcaactatag cactgtaagg agctgtgcct gaatgccaaa ggaccacttt 3840

gatagagtga cttacggagg ctaaaatcct cccagctcct agaaagaagg gactcgaacc 3900

catatcatag agatcaaaac tctaagtgtt tccactacac cactttctag taagataagc 3960

taaataaagc ttttgggccc ataccccaaa aatgtaggtt aaactccttc tcttactaat 4020

gaatccatac gtactaacaa tttttttatt aagccttggt ttgggcacaa cacttacttt 4080

ttccagctcc cactgactac tagcttgaat aggcttagaa attaatacac tagccatcct 4140

cccacttata gcacaacatc accacccccg agcagtagaa gctacaacaa aatattttct 4200

agcacaagct accgccgcag caaccatcct ctttgcaagc tcaataaacg catgagtgac 4260

aggagaatga aatattaatt atacatcaca tcaagcctcc acaatattaa tcataactgc 4320

cttggccctc aaactagggc tggctccaat acacttctga ttaccctcag ttcttcaagg 4380

actagaccta accacaggac taattatatc cacctgacaa aaactagccc catttgcatt 4440

aatcgtacaa attgcaccat ttaccaaccc aacacttcta atgatactag gactaatctc 4500

aacaatagta ggaggttgag gaggattaaa ccaaacgcaa ctacgaaaaa tattagctta 4560

ctcatcaatt gcacacctag gctgaataat tatcatcctt caactacaac ctaaattaac 4620

gatcttaacc ctgataattt atattattat aacagcaaca gccttcctaa catttaaatt 4680

cctaatgact acaaaaatta gtacactagc cttaacctga tcaaaaaccc caataatcac 4740

cataacaaca atactcacct tactatccct aggaggtcta cccccattaa caggctttat 4800

accaaaatga cttattcttc aagaactaac aaaacaacaa ctcccactta cagccaccat 4860

cattgccctt agcgccctac taagcctata cttctatcta cgcctaacat atgctataac 4920

actaacaatc tctccaaaca caaacaatgc caccatacca tgacgcctga caaacaacca 4980

aataacatta ccactaacca ccttctcaac cataacactt ttactactac caattacccc 5040

aacaattcag gcactcatcc actagagatt taggataaca ttagaccaaa agccttcaaa 5100

gctttaagta ggagtgaaaa tctcctaatc tctgataaga cttgcaggac tttatcccac 5160

atcttctgaa tgcaacccag acactttaat taagctaaag cctttctaga tgagtaggcc 5220

tcgatcctac aaacttttag ttaacagcta aacgcccaaa ccagcgagca ttcatctact 5280

ttccccgcct gcctagtaaa aggcggggaa agccccggca ggcaattagc ctgcatctct 5340

ggatttgcaa tccaacatga tatatacacc acggggctga taagaagagg acttgaacct 5400

ctgtatatgg agctacaatc caccgcctaa ccctcggcca tcctacctgt gacaatcaca 5460

cgctgatttt tctccactaa tcacaaagac attggcaccc tctatctagt atttggtgcc 5520

tgagctggta tagtcggaac cgccttaagc ctattaatcc gagcagagct aaatcaaccc 5580

ggctccctcc taggcgacga tcaaatttac aatgttatcg ttacggcgca cgccttcatc 5640

ataattttct ttatagtaat accaatcata attggtggat tcgggaactg acttgtccct 5700

ctgataatcg gagcaccaga tatggcattt ccacgaataa ataacataag cttctgactt 5760

cttccaccct cattccttct tctcctagca tcctcagggg tagaagccgg ggcaggaact 5820

ggttgaactg tttacccacc acttgcaggg aaccttgctc acgcgggagc ttctgttgat 5880

ttaacaattt tttcccttca tctcgctggt gtttcctcta ttttaggagc aatcaacttc 5940

atcacaacaa ttattaacat gaaaccccct gccatttcac aatatcaaac acccctattc 6000

gtgtgggcag tattgattac cgctgtttta ctcctcctat ccctcccagt cttagccgcc 6060

ggaattacaa tactactcac agatcgtaac ctaaacacca ccttctttga ccccgcagga 6120

ggaggagacc ccatcttgta tcaacactta ttctgattct ttggccaccc agaagtctac 6180

attttaattt taccaggatt cggaataatc tcccacattg tagcctatta cgccggaaaa 6240

aaagaaccat tcggttatat gggaatagta tgagcaataa tggccattgg tctactagga 6300

tttattgtat gagcccatca catgtttacg gtaggcatgg acgtagacac ccgagcatac 6360

tttacatcag caacgataat tattgctatc ccaacagggg ttaaagtatt tagctgatta 6420

gccactctac atggaggctc aattaaatga gaaacgcccc ttctttgagc ccttggtttt 6480

atcttcctat ttaccgtagg aggcctgaca ggaattgtac tatccaactc atcacttgat 6540

attatcctcc acgataccta ttatgtagtt gcccacttcc actacgtatt atcaatagga 6600

gccgtattcg ctatcatagg agcttttgta cactgattcc ctctatttac aggctacacc 6660

ctccacgata cctgaacaaa aattcacttc ggagtcatat ttgcaggcgt aaacattacc 6720

ttcttcccac aacatttcct aggactagcc ggaataccac gtcgttattc agactaccca 6780

gatgcctatg ccctatgaaa cacaatttcc tctatcggat ccctcatgtc cctagtagca 6840

gtcatcatgt tcctatttat cttatgagaa gcctttgccg ctaaacgaga agtattatcc 6900

gtagaactta ccccaacaaa tgctgaatga ctacatggct gccctcctcc gtaccacaca 6960

tttgaagaac cagcattcgt gcaaattcaa ggaatcgaga aaggaaggaa ttgaaccccc 7020

ataaactagt ttcaagccag tcacataacc actctgtcac tttcttttat gagacgctag 7080

taaaattaat tacactgcct tgtcaaggca gaattgtggg ttgaaccccc gcgcatctta 7140

tattatggca cacccatcac aactaggact acaagacgca gcctcgcctg taatagaaga 7200

actcctccac tttcatgatc atgctttaat aattgtattc ttaattagca cattagttct 7260

atacattatt gttgttatgg tttcaacaaa actaaccaac aaatatatct tagactcaca 7320

agaaattgaa attatctgaa ctattttacc agcagtaatt ttagttataa ttgcactacc 7380

atccctacga attttatacc taatagatga agtcaatgac ccccatctca cagttaaagc 7440

tataggccat caatgatact gaagctatga atacactgat tatgaaaatc tagcatttga 7500

ctcctatata gtaccaactc aagacctaac ccccggacaa ttccgactac tagaaacaga 7560

ccatcgaatg gtagtaccag tggaatcccc aatccgagta ttagtatcag ctgaagacgt 7620

acttcactca tgagccgtcc cagccctcgg aattaaaatg gatgctgtcc caggacgctt 7680

aaaccaaaca gcctttattg cctcacgccc tggcatcttc tacggccaat gttctgaaat 7740

ctgcggtgca aaccacagct tcatacctat tgtcgttgaa gccgtccctc tagaacactt 7800

tgaaaactga tcctccctca tacttgaaga cgcctcacta gaaagctaaa acgggactag 7860

cgttagcctt ttaagctaaa aattggtgat tcccaaccac ctccagtgac atgccacaat 7920

taaaccccgc cccctgattc ttcatcttag tattcacatg attaattttc ctaacaatta 7980

tcccatataa aatcttaagc cacactttca caaacgacat aaacccaatt agcactgaaa 8040

atctaaaaac agacacctga aactgaccat ggcactaaac atatttgacc aatttatgag 8100

caccacatat ctaggtattc cactaattac cattgcactt accctcccgt gaattcttat 8160

tccatcccca tcaaaccgct gacaaaacaa tcgcttagtc acccttcaaa actgatttat 8220

taaaaacttc acaagccaac tccttacccc actaaataaa agcggacaca aatgagcatt 8280

aatattagcc tcccttataa tttttatctt atcactaaac atactaggac ttctaccata 8340

cacttttaca ccaacaacac aattatcgct taacataggc cttgcagtac cattttgact 8400

agcaacagta ctaattggat tacgaaatca acccacagca gcattaggac atcttctacc 8460

agaaggcacg cccgtaccat taatccctgt attaattatc atcgaaacca ttagcctatt 8520

tattcgaccc ttggcacttg gagtacgact aacagccaac cttacagcag gacatctgct 8580

tatccaacta atctcaagcg caaccttcgt aatactaccg ataatagcaa cagcagccgt 8640

atttaccgcc actctcctag ttctactcac acttctagaa gtcgcagtag caatgattca 8700

agcctatgta tttgtccttc ttgttagcct gtacttacaa gaaaacatct aattcatcac 8760

ttaagcacta tgacccacca agcacacgca taccacatgg tagacccaag cccatgaccc 8820

cttacaggtg caattgccgc cctactaata acatcaggat tagcaatttg atttcatttc 8880

aacacaacaa ctctcctagc actaggctta gtattacttc tactcaccat atatcaatga 8940

tgacgggaca ttatccgcga aggaaccttt caaggacacc acacccctcc cgtccaaaaa 9000

ggacttcgat atggaataat tttatttatt acatcagaag tattcttctt cttaggattc 9060

ttctgagcct tctaccactc tagccttgcc ccaacaccag aattaggtgg ctgctgaccc 9120

ccaacaggca ttacaacctt agacccattt gaagtcccac tacttaacac agcagtgctc 9180

ctagcctcag gtgtaacagt aacatgagcc caccacagca tcatagaagg ccaccgaaaa 9240

caagcaattc aatctttaac cctaaccatt ctactaggat tctacttcac cgccctacaa 9300

gccatagaat actatgaagc ccctttcaca atcgctgatg gagtttatgg ctccaccttc 9360

tttgtagcca caggcttcca cggattacat gtaattattg gctcaacatt cctagctatt 9420

tgcctacttc gtcaactaca gtaccacttt acatcagaac accactttgg atttgaagca 9480

gctgcctgat attgacactt tgtagacgta gtctgattat tcttatacgt ctcaatttac 9540

tgatgaggat catatctttc tagtattaaa gttagtacga gtgacttcca attactcagt 9600

cttggttaaa acccaaggaa agataatgaa cttaataaca acaatcttca caatctctat 9660

tattttatca ttaattctgg ccctagtatc cttctgattg ccacaaataa acccagatac 9720

agaaaaatta tctccatacg aatgtggatt cgacccacta ggatctgcac gactaccatt 9780

ttctctacga tttttcttag tagccattct atttctacta tttgatctag aaattgcact 9840

cctattaccc ctaccatgag caaaccaact cccagaaccc actattacat tcctatgagc 9900

ttccattatt ctcattttac taacagcagg cctaatttat gaatgaatcc aaggaggcct 9960

agaatgggct gaatagagag ttagtccaaa acaagacctc tgatttcggc tcagaaaacc 10020

gtggtttaaa tccacgactc tcttatgaca ccagtacatt tcagctttac ctcagctttt 10080

ctactagggc tcacaggcct tgcattccac cgaacccacc tcctatccgc ccttttatgc 10140

ctagaaggaa taatgctgtc actatttatt gcactaggct tatgagccct gcaattagag 10200

tccacagctt tttcagccgc ccctctcctc ttgctcacct tttccgcctg tgaagcaagc 10260

gcaggcttag cccttcttat tgccacagcc cgaacacatg gtacagaccg cttacaatcc 10320

ttaaacctac tacaatgcta aaaattttag ttccaaccat catgctatat cccacaattt 10380

gactagcctc cccaaaatga ctttgatcta tctccacaat gcaaagcctc ttaattgcct 10440

tatttagtat ttcttgatta aaatgaccct cagaaacagg ctgatcaacc ctcaatacat 10500

atttaggcac ggacccacta tcaaccccgc tactagtact cacctgctga ctcctaccat 10560

taataattct tgccagccaa aaccatatca aaagtgagcc actaagccgc caacgaacct 10620

acattaccct cctaacatcc ttacaaatat ttcttattat agctttcggg gcaacagaaa 10680

tcataatatt ctatattata ttcgaagcaa ccctgatccc aacactaatt attatcacac 10740

gatgaggcaa tcagacagaa cgactaaatg caggaaccta cttccttttt tataccttag 10800

caggatcact tcctctgctt gtagcactac tactcttaca ccaaaatata ggaacactat 10860

caataattac gctacaatat tcccaaccaa taatacttct ctcatgaagc gataaaattt 10920

gatgattggg atgcttaatc gccttcttag taaaaatacc actatatgga gtccaccttt 10980

gacttccaaa ggcccatgta gaagcaccag tagcaggttc tatagtccta gctgcaattt 11040

tactaaaact cggaggctat ggaataatac gaataataat tatactagat ccactatcta 11100

aggaaatagc atatccattt attatcttag ccttatgagg aattatcata acaggttcaa 11160

tttgtttacg acaaacagac ttaaaatcac tcattgccta ctcgtcagtc agtcacatag 11220

gactagtcgc aggaggaatt ttaatccaaa ctccatgagg ctttaccgga gctattatct 11280

taataatcgc ccatggcctg gtatcatccg cactcttctg tcttgctaac accacatatg 11340

aacgtaccca tagccgaaca atagtcctag cccgaggaat acaactactt cttccactaa 11400

ccgcaacctg atgatttatt gccaacctag caaacctagc cttacctccc ctacctaatc 11460

ttataggaga actactaatt attacagcca tattcaattg atccccatga acgcttatta 11520

tcacaggaac aggtacccta attacagctg cttactcatt atacctattc ctaaaaaccc 11580

agcgaggtac actacctacc cacatcatta atctacaacc ataccacacc cgagaacacc 11640

tacttataac tatacatctc ctcccaatta ttatacttat tacaaaacca gaacttatgt 11700

gaggatgatg atactgtaga tatagtttca actaaaacat tagattgtgg ttctaaaaat 11760

agaggttaaa atccacttat ccaccgagag aggccaaaag cagtaaggac tgctaatcca 11820

tacccccatg gttaaactcc atggctcact cgagctacta aaggataata gctcatccgt 11880

tggtcttagg aaccaaaaac tcttggtgca actccaagta gtagctatga caaaccttgt 11940

aataagttct acacttatcc taatacttac aattttaatc taccccctac tcataactct 12000

cagcccaaat ccacaaaaac caaactgagc caccacccat gtcaaaaccg ccgtaagtac 12060

tgcatttttc attagcttaa tcccactagc catcttctta gaccaaggaa cagaaaacat 12120

tatctcaagt tgacattgaa taaacatcac aacatttgat attaatatta gttttaaatt 12180

tgaccactat tctctcattt tcaccccaat tgccctattc gtcacctgat ctattttaga 12240

cttcgcatca tgatacataa gcgcagatcc atatattaac cggttcttta aatacttact 12300

attgttccta gtagcaatag ttatcctagt tacagccaac aatatattcc aactatttat 12360

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agatgccaat acagcagcta tacaagccgt actatataac cgagtcggag acattgggtt 12480

aatcttatca attgcatgaa tcgcaataaa cataaattca tgagaaattt cacaaatttt 12540

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aggcaaatca gctcaatttg gactacaccc ctgattacca tcagctatag aaggtcccac 12660

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ccgcctccac ccccttatag aaaacaacaa cctagccctt acaatttgcc tttgcttagg 12780

agccctaacc accttattta cagcaacctg tgctttaacc cagaacgaca tcaaaaaaat 12840

tgtagccttc tcaacatcta gtcaactagg cctaataata gtcacaattg gactaaacca 12900

accccaatta gccttcctac atatctgcac ccatgccttc tttaaagcaa tactattcct 12960

atgttctggc tcaattatcc acagccttaa tgacgaacaa gacattcgaa aaataggagg 13020

gctattcaaa ctacttccat ttacctctac ctgcttaaca attggaagcc tcgcattgac 13080

cggcacccca ttcctaaccg gattcttctc aaaagacgca atcattgaag ccctcaacac 13140

ctcttaccta aacgcctgag ccctcacctt aacattaatc gcaacctcat tcacagcagt 13200

atatagtttc cgtgtcatct acttcgtaac aataggcacc ccacgtttct cctctataat 13260

accaattaat gaaaacaacc ccgcagtaat taacccaatc aaacgcctag catgaggaag 13320

cattattgca ggacttatta ttacatcaaa cttccttcca tcaaaaatgc cagttataac 13380

tataccaacc tcccttaaat tagcagcaat tatagtaaca attgctggag ttttaattgc 13440

cctagcacta acaactatga ccgctaaaca attcaaagta atccctgtac ttaacctcca 13500

caatttctca aacatacttg gctactttac ctcaatcatt caccgcctaa tcccccaact 13560

tggcctcacc ctaggaaaaa aagccactaa atttgatcgc caatgaatag aactcggccc 13620

aaaaggaata gtaccaattc acatatccat ctcagcaaaa tttgacaaca tggactcaaa 13680

cataattaaa atttacctaa ccatctacct actaacctca atcataacaa ttatcctact 13740

tacagctatt taaacagccc gcaaagcccc acgacttaaa ccacgagtca cttccaaaac 13800

cacaaacaaa ctcaacaata aaactcacgc acaaattacc aatactcccc caaaagagta 13860

tatcaaagca accccattaa aatccccacg caatataaaa aactccttaa actcatctac 13920

aactaaatag ctcccatatc aacctccata aaaccaccac accgctaccc ccacactaaa 13980

catgtaggca acaacataaa tttttacaga acgaacccct caagtctctg gaaaaggctc 14040

agcagctaat gccgccgaat aagcaaatac aaccagcatc ccacctaaat aaatcaaaaa 14100

caacaaaaga gatagtaatg acccaccatg tcctaccaaa ataccacatc ctacccccgc 14160

agcaataact aaacctaacg cagcaaaata cggcgcagga ttcgaagcaa ccccaatcaa 14220

cccaaccacc aaacccaaca aaaaaagatc aagaaggtat tccataattc ccgcccggat 14280

tttaaccgag acctacgact tgaaaaccca ttgttgtaat tcaactacga gaactaatgg 14340

tcacccgaaa aacccacccg ctactcaaaa tcgttaacga ctccctcatc gacttaccag 14400

ccccctcaaa catctcagca tgatggaact tcggctcctt acttctccta tgtttgatag 14460

tacaaattgt tacaggctta tttctagcaa tacactatac atcagacatc acaagtgcat 14520

tttcatctgt agcccacatc tgccgagatg taaattacgg atgagctatc cgaaatatcc 14580

atgccaacgg agcctccttc ttcttcatct gtatttacct ccacatcgga cgaggtctct 14640

actacggatc ctacctctac aaagaaacat gaaatattgg agtagtccta ctcctcctag 14700

tcataatgac cgcatttgta ggttacgtac taccatgagg ccaaatatca ttctgaggtg 14760

ctacagtaat cacaaacctt ctctccgcaa tcccttacat tggcaatgat cttgtacaat 14820

gaatttgagg cggcttctcc gtagataatg caacactaac acgattcttc acattccact 14880

tcctactacc attcattgta gtagctgcaa ccctaatcca cgccatgttc ctacacgaaa 14940

caggctcaaa caacccaatt ggagtcaact cagatgcaga caaaatttca ttccacccat 15000

acttctcatt caaagacctc ctaggattta ttattttaat aaccctcctt ctatcactag 15060

ccctcttctc acccaatcta ttaggagacc cagacaactt cacccccgcc aacccgctag 15120

taacaccaac tcacatcaaa cccgaatgat atttcctatt tgcctacgcc atcctacgtt 15180

caattccaaa taaactaggc ggagtactag ccctcctctt ctccattcta gtactgatgc 15240

tagtcccaat actccacacc tctaaacaac gaggactcac attccgccca ctcacccaat 15300

tcctattctg agccctagtc gcagacgtat tcatcttgac atgaatcggc ggaatgccag 15360

tagaacaccc atttattatc atcggacaaa tcgcatcagt cttatatttc actcttctac 15420

ttatcctcat acctgcaacc ggatgattag aaaacaaact acttaactga aactgcccta 15480

gtagcttaat tcaaaagcgc cggttttgta atccggagat tgaaggttaa aatccatcct 15540

agtgccagaa aagagagaat ttaactccca cccctaactc ccaaagctag gattctaaac 15600

taaactattt tctgcaatat acagtattgt atgaaacaac ataataaatg tatggcgtgc 15660

acacgcatat agtaccatac atatatgtaa tgttacatgt atatgtacta atacataata 15720

tgtataatat tacatatata tatgtactaa tacataatat gtataatatt acatatatat 15780

atgtactaat acataatatg tataatatta catatatata tgtactaata cataatatgt 15840

ataatattac atatatatat gtactaatac ataatatgta taatattaca tatatatatg 15900

tactagtaca taatatgtat aatattacat acatctatat tacccataca ttatgtaaaa 15960

gtaatttaag tgaactcatc aaaacataaa cttatattct acaaataatt tctttagacc 16020

tgggaaatag atttatcccc ataactgtgc taaaacattt tctatgaaga gtagctaaaa 16080

ttggcccagg aatatatatg tagtaagaga tcaccaacaa tcacaagtta atgcatatta 16140

tccttgaagg gtcagggaca ataaccgtgg gggtttcaca atatgaacta ttactggcat 16200

ctggttccta tctgagaaca taaccgaata attagacaaa tctcacatcg tcaacgacat 16260

ctgattattg gtgtggtaca aaatagcaca aactcaccat gccgagcgtt ctcttatatg 16320

catctggttt ttttaaaagg tctactttca tctggcattg atgaccactt tcaagagtta 16380

acagacaagg tagtattatt tagtaatatc atgagtaaat attcttaatt atttaatgac 16440

atattcttta tatcaccata tatttatttc acgagcatac atactattta ccttcctcat 16500

acctgtataa gatcccccgg ggcgtctata cgcggtaaac ccccctaccc ccaacgccga 16560

gagatgcctg tttaaatctg ttaaacccct aaaccagatt aggctcgacc gacgattaag 16620

caacgagtat aatgtgtcac tatatattgt tgtatataca ctatata 16667

Claims (6)

1.一种黑金红头鼠线粒体基因组全序列的扩增引物，其特征在于，该扩增引物包括22对引物对：

第1对引物对的上游引物F1为：5’–CAGGCATCAGGCACAATCAT–3’，下游引物R1为：5’–CCGGTACACTTACCATGTTACGAC–3’；

第2对引物对的上游引物F2为：5’–GCACGAAGTGGGAAGAAATG–3’，下游引物R2为：5’–GGCCCACTGAAGCGGTAATC–3’；

第3对引物对的上游引物F3为：5’–GCTGGTTGCCTAAGAAGTGG–3’，下游引物R3为：5’–TGGTCGCCCCAACCGAAGAT–3’；

第4对引物对的上游引物F4为：5’–TGATCTGCCCGTGCAGAAGC–3’，下游引物R4为：5’–TGGGTGTGGCGAGAAATAGG–3’；

第5对引物对的上游引物F5为：5’–CGTAGTAGGCCCATTCGGAC–3’，下游引物R5为：5’–TTGGCATTCAGGCACAGCTC–3’；

第6对引物对的上游引物F6为：5’–CCTCGATTCCGCTACGACCA–3’，下游引物R6为：5’–CGAGGTGTGCAATTGATGAG–3’；

第7对引物对的上游引物F7为：5’–AGCCCCATTCGCACTAATCG–3’，下游引物R7为：5’–GCGGGGAAAGTAGATGAATG–3’；

第8对引物对的上游引物F8为：5’–TGAATGCAACCCAGACACTT–3’，下游引物R8为：5’–TAATTCCAGCGGCTAGGACT–3’；

第9对引物对的上游引物F9为：5’–CTCCATCTCGCTGGTGTTTC–3’，下游引物R9为：5’–TAGCGGCGAAGGCTTCTCAT–3’；

第10对引物对的上游引物F10为：5’–CCTTCTTCCCCCAACACTTC–3’，下游引物R10为：5’–TCGGATCGGGGATTCCATTG–3’；

第11对引物对的上游引物F11为：5’–TTAAAGCCATAGGCCATCAA–3’，下游引物R11为：5’–TGGTACTGCAAGGCCTATGT–3’；

第12对引物对的上游引物F12为：5’–CACCCCACTAAACAAGAGCG–3’，下游引物R12为：5’–TCGGTGGCCTTCCATAATGC–3’；

第13对引物对的上游引物F13为：5’–TGGCCCCAACACCAGAACTA–3’，下游引物R13为：5’–TTCCTGAGCCGAAATCAGAG–3’；

第14对引物对的上游引物F14为：5’–CTCCCCGAACCCACCATTAC–3’，下游引物R14为：5’–TTGGTTGCCTCATCGCGTAA–3’；

第15对引物对的上游引物F15为：5’–TCAGCCGCCAACGAACCTAT–3’，下游引物R15为：5’–GTGCCTCGTTGGGTTTTTAG–3’；

第16对引物对的上游引物F16为：5’–GCCAACCTAGCGAATCTAGC–3’，下游引物R16为：5’–GCATCTGCTCGTCCATATCA–3’；

第17对引物对的上游引物F17为：5’–CGCAGACCCCTACATAAACC–3’，下游引物R17为：5’–ATACTGCTGCGAATGAGGTG–3’；

第18对引物对的上游引物F18为：5’–TTGGAAGCCTCGCATTAACC–3’，下游引物R18为：5’–AGCGGTGTGATGGTATTGTG–3’；

第19对引物对的上游引物F19为：5’–CGCACAAATCACCAACACTC–3’，下游引物R19为：5’–GATTACTGTGGCGCCTCAGA–3’；

第20对引物对的上游引物F20为：5’–CCAACGGAGCTTCCTTCTTC–3’，下游引物R20为：5’–TTCTAGTCATCCGGTTGCAG–3’；

第21对引物对的上游引物F21为：5’–ACATGAATCGGCGGAATACC–3’，下游引物R21为：5’–AAGAATGCTCGGCATGGTGG–3’；

第22对引物对的上游引物F22为：5’–GGCATCTGGTTCCTATCTGA–3’，下游引物R22为：5’–GTGGCTGGCACGAATTTTAC–3’。

2.根据权利要求1所述的黑金红头鼠线粒体基因组全序列的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物是根据GenBank数据库中收录的黑躯兵鲶(Corydoras rabauti)线粒体全基因组序列设计得到。

3.一种对黑金红头鼠线粒体基因组全序列扩增的方法，其特征在于，该方法是以提取的黑金红头鼠肌肉组织总DNA为模板，分别用权利要求1所述的22对引物对进行PCR扩增，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序及序列拼接。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为50μL，其中：1μL DNA模板、1μL 10μM上游引物、1μL 10μM下游引物、1μL 10mM dNTP、5μL 10×不含Mg²⁺的PCRBuffer、5μL 25mM MgCl₂、0.5μL 5U/μL Taq酶及35.5μL无核酸酶水。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸8min。

6.根据权利要求3所述方法获得的黑金红头鼠线粒体基因组全序列，其特征在于，该线粒体基因组长度为16667bp，全基因组序列包含2个核糖体RNA基因，13个不含内含子的蛋白编码基因，22个转运RNA基因和2个非编码区即控制区和轻链复制起始区。