CN101955940A - 抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区的基因序列 - Google Patents
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Abstract
一种用于基因工程技术领域的抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区及轻链可变区基因VH和VL的基因序列。应用RT-PCR技术，从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株2F4中，扩增了该mAb的重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL的基因片段，并进行了克隆和序列测定，其中，VH基因全长为369bp，编码123个氨基酸；VL基因全长为339bp，编码113个氨基酸，通过国际联机检索及Kabat库分析，二者均符合小鼠IgG V区基因的特征，含有4个框架区(FR)，3个抗原互补决定区(CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。本发明可以通过制备该基因的蛋白作为抗原，用于研究mAb基因工程疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区的基因序列。
背景技术
溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)是引起牙鲆、鳗鲡等许多名贵经济鱼类致病的病菌之一，严重威胁着我国水产养殖业的发展。可给渔业和养殖业带来巨大的经济损失。传统防治溶藻弧菌感染的方法主要采用抗生素和减毒、灭活疫苗。抗生素的长期使用可使鱼类产生耐药性，而且残留的抗生素可通过食物链对人类造成危害。减毒疫苗的安全性难以掌握；而用物理、化学方法制备的灭活疫苗，抗原活性可能遭到破坏，且残存的杂质还可能引起鱼的炎症反应而死亡。
发明内容
本发明的目的是提供抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的基因序列，其可作为抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体(mAb)抗原，为mAb基因工程疫苗的构建奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：针对溶藻弧菌保护性抗原表位制备的抗独特型mAb具有良好的免疫原性和安全性，为此，我们应 用RT-PCR技术，从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株2F4中，扩增了该mAb的重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL的基因片段，并进行了克隆和序列测定。其中，VH基因全长为369bp，编码123个氨基酸；VL基因全长为339bp，编码113个氨基酸，通过国际联机检索及Kabat库分析，二者均符合小鼠IgG V区基因的特征，含有4个框架区(FR)，3个抗原互补决定区(CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。
所测抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因VH的核苷酸序列为：
抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因VH的氨基酸序列为：
所测抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因VL的核苷酸序列为：
所测抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因VL的氨基酸序列为：
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步描述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照料常规条件，例如基因的RT-PCR扩增或试剂盒按照制造厂商所建议的条件使用。
抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因VH及轻链可变区基因VL的克隆及序列测定：
一、基因VH和VL的RT-PCR扩增
1、材料和方法
1.1材料分泌抗溶藻弧菌独特型mAb杂交瘤细胞株2F4为本室建立；RPMI1640为Gibco BRL公司产品；RNA抽提试剂TRIzolTMReagents购自Life technology公司；RT-PCR试剂盒为美国invitrogen公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自上海华舜生物工程公司；PMD18-T vector为Takara产品。
1.2方法
1.2.1抗溶藻弧菌独特型mAbVH和VL基因的扩增收获6×107分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体杂交瘤细胞，用TRIZOL，氯仿和异丙醇抽提RNA后以无水乙醇沉淀，取10μLRNA为模板，以OligodT为随机引物，反转录合成cDNA。根据Kabat库设计PCR引物。引物的序列如下：
VH Back为：5′-CGGCCGAGGTGC(A)AGCTGC(A，G)A(T)GC(G)AGTCTGG(A)GG-3′；
VH For为：5′-TCCACCTGTCGACACGGTGACTGAGGTTCC-3′；
VL Back为：5′-GACATCCAGATGACACAGAC-3′；
VL For为：5′-ACGTTTC(TK)AG(T)C(T)TC CAG(A)CTT G(T)G-3′。
在50μL反应体系中，加入VHBack和VHFor引物进行PCR，反应参数为：94℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 60s，72℃ 60s，共30次循环。在50μL反应体系中，加入VL Back和VL For引物进行PCR，反应参数为：94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 60s，72℃ 60s，共30次循环；PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.2扩增产物的鉴定和序列测定将琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物与PMD18-T载体连接，并转化感受态细菌E.coli.DH-5α，在含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。挑取单个菌落扩大培养后，小量提取质粒DNA，并以PCR法进行鉴定。采用双脱氧终止法进行序列测定，测序引物为T载体上M13-T7固有引物。
二、基因VH和VL的扩增产物鉴定和序列分析
1、RT-PCR扩增产物的鉴定
图1为VH和VL基因琼脂糖凝胶电泳图，其中，A图为VH基因琼脂糖凝胶电泳图，图中1为DL-2000 DNA marker、2为VH gene；B图为VL基因琼脂糖凝胶电泳图，图中1为DL-2000 DNA marker、2为VL gene。
用RT-PCR扩增抗溶藻弧菌独特型mAbVH和VL基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定表明，VH基因的PCR产物出现大小为370bp左右的带(图1A)；VL基因的PCR产物出现大小为350bp左右的带(图1B)，二者均同预期结果相吻合。
2、基因VH和VL的克隆及序列分析
2.1VH基因的克隆及序列分析将PCR产物经纯化后，克隆入T-Vector中进行引物测序，将序列输入计算机分析显示，该序列基因的长度为369bp，编码123个氨基酸，具有小鼠IgG VH基因的特征；即含有4个FR、3个CDR和两个抗体特征性的半胱氨酸。
基因VH的核苷酸序列为：
基因VH的氨基酸序列为：
2.2VL基因的克隆及序列分析将PCR产物经纯化后，克隆入T-Vector中测序，将序列输入计算机分析显示，该序列基因的长度为339bp，编码113个氨基酸，具有小鼠IgGVL基因的特征，即含有4个FR、3个CDR和两个抗体特征性的半胱氨酸。
基因VL的核苷酸序列为：
基因VL的氨基酸序列为：
本发明具有实质性特点和显著进步，抗独特型抗体具有“内影像”的作用，可模拟抗原诱导机体产生特异性抗体或细胞免疫应答，目前，所测的抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区基因VH和VL是分泌抗 溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株2F4中重要的两个基因片断，本发明应用RT-PCR技术，从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株中克隆了VH和VL基因，所用引物是根据互补于小鼠IgG V区的FR1和C区设计的，所获抗溶藻弧菌mAb 2F4VH基因共编码123个氨基酸，其序列中无终止密码子，为一个开放阅读框；具有小鼠IgGVH基因的特征，含有4个FR和3个CDR，为V-D-J重排，并具有维持抗体V区空间结构所必须的2个特征性的半胱氨酸，分别位于序列的第23位和第97位氨基酸。VL基因共编码112个氨基酸，含有维持抗体V区空间结构所必须的2个特征性的半胱氨酸，分别位于序列的第23位和第93位氨基酸，同样具有4个框架区和3个CDR，符合小鼠IgGVL基因的特征。通过上述实施例实验分析显示，我们实验中首次克隆出的VH和VL基因序列可以通过制备该基因的蛋白作为抗原(GenBank accession No：DQ011530和DQ011531)，用于研究mAb基因工程疫苗。
Claims (6)
1.一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因VH的基因序列，其特征在于：从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆抗溶藻弧菌独特型mAbVH基因，并将其重组入PMD18-T vector中进行测序分析，该基因全长为369bp，编码123个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因VH的基因序列，其特征在于：VH的核苷酸序列为：
3.根据权利要求1所述的一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体重链可变区基因VH的基因序列，其特征在于：VH的氨基酸序列为：
4.一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因VL的基因序列，其特征在于：从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆抗溶藻弧菌独特型mAbVL基因，并将其重组入PMD18-T vector中进行测序分析，该基因全长为339bp，编码113个氨基酸。
5.根据权利要求4所述的一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因VL的基因序列，其特征在于：VL的核苷酸序列为：
6.根据权利要求4所述的一种抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因VL的基因序列，其特征在于：VL的氨基酸序列为：
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2010
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