CN108739537B - 一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法，步骤包括：1)利用设计的特异性引物PCR扩增筛选所收集的核心育种群体亲本，根据电泳图谱获得仍是灰黑体色的隐性突变亲本；2)将筛选出的性腺成熟的雌、雄灰黑体色的隐性突变亲本配对繁殖构建F1代家系个体，得到的F1代个体出现体色分离，粉白体色个体约占25％；3)将得到的F1代粉白体色个体按照家系分开独立饲养在池塘中，培育4年至性腺成熟；4)从F1代家系挑选生长最快的粉白个体双列杂交，构建F2代全同胞家系，所获得的F2代个体全部为粉白体色。本发明所述方法为开展粉白体色斑点叉尾鮰家系选育奠定了基础，为粉白体色斑点叉尾鮰的品种选育提供了很好的材料。
Description
技术领域
本发明属于水产育种领域，具体涉及一种粉白体色斑点叉尾鮰家系种方法。
背景技术
斑点叉尾鮰(Ictalures punctatus)原产于美国，1984年引入我国试养，在短短的三十几年时间里得到了快速发展，相继突破了养殖、繁殖、饲料、加工出口等环节技术难关，形成了从苗种繁育、养殖、加工、市场营销完整的产业链条，产量也从最初的几千吨猛增并稳定在20万吨以上，成为我国出口美国的主要品种之一。
粉白体色斑点叉尾鮰实则为白化的斑点叉尾鮰个体。白化病是由于动物眼睛和皮肤中的黑色素细胞缺乏或黑色素生成发生障碍导致的一种体色异常病。在各种脊椎动物，包括哺乳动物、两栖类、鱼类和鸟类中都发现了白化个体。由于缺乏保护色，容易被天敌捕食，因此白化个体在自然环境中生存能力较低，野生白化个体比较少见。之前的研究表明，鱼类的白化大都由不同基因的隐性突变导致。如，Oca2基因的隐性突变导致斑马鱼和洞穴鱼类的白化，Mc1r基因的隐性突变导致洞穴鱼类的白化。在多世代的养殖繁育后，养殖斑点叉尾鮰出现了部分体色分化，可以获得部分体色粉白的个体。而国内市场对于粉白斑点叉尾鮰个体认可度较高，其市场价格也一直高于正常黑色的个体。目前，国内市场对于粉白体色斑点叉尾鮰存在一定的需求，家系育种也可以避免近交衰退的出现，因此，大规模生产粉白体色斑点叉尾鮰家系苗种是非常必要的。
发明内容
本发明提供了一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法，为获得粉白体色斑点叉尾鮰家系苗种提供了操作基础。
一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法，包含以下步骤：
(1)利用设计的扩增斑点叉尾鮰HSP4基因的特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2PCR扩增筛选所收集的核心育种群体亲本，对扩增产物进行电泳或者测序，根据电泳或测序结果获得仍是灰黑体色的隐性突变亲本；其中：对扩增产物进行直接电泳，根据电泳图谱结果，进行判定：白化个体有99bp的碱基缺失，只有一条150bp条带；正常个体HSP4基因没有变化，只有一条249bp条带；隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99bp，导致同时存在150bp和249bp一大一小两条带；对扩增产物纯化后，直接测序，根据测序结果，进行判定：白化个体有99bp的碱基缺失，序列长度为150bp，正常个体序列长度为249bp，隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99bp，导致峰形图存在重叠峰；
(2)将上一步筛选出的性腺成熟的雌、雄灰黑体色的隐性突变亲本配对繁殖构建F1代家系个体，得到的F1带个体出现体色分离，粉白体色个体约占25％；
(3)将上步骤得到的粉白体色个体按照家系分开独立饲养在池塘中，培育4年至性腺成熟；
(4)从F1代家系挑选生长最快的粉白个体双列杂交，构建F2代全同胞家系；，所获得的F2代个体全部为粉白体色。
所述的PCR反应体系为50μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2，0.01％明胶组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，经35个循环后再72℃延伸10min。
由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成的特异性引物在粉白体色斑点叉尾鮰家系制种中的应用。
本发明包含以下有益效果：
本发明通过对灰黑体色斑点叉尾鮰进行繁育，最终培育出完全具有粉白体色的斑点叉尾鮰家系鱼种。首先通过特异性PCR扩增引物，获得带有隐性突变的父母亲本。根据孟德尔遗传规律，隐性突变的父母亲本交配，F1代会出现1/4的基因型纯合粉白体色个体，粉白体色F1自交获得的F2代全部为粉白体色，即获得一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步阐明本发明，但并不是对本发明做任何形式的限定，仅仅作示例说明。
实施例1
本发明的实施例在国家级斑点叉尾鮰遗传育种中心(江苏省南京市)进行实施。
1、隐性突变亲本筛选
设计一对特异性PCR扩增引物，引物序列为：上游引物SEQ ID NO.1：5'-ctctaaagtgcgtgaggaaggtga-3'，下游引物SEQ ID NO.2：5'-ctcatgcggatggcgtatttg-3'。2010年利用设计的特异性PCR扩增引物对所有收集的核心育种群体216尾亲本进行筛选。(1)利用设计的扩增斑点叉尾鮰HSP4基因的特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2PCR扩增筛选所收集的核心育种群体亲本，对扩增产物进行电泳或者测序，根据电泳或测序结果获得仍是灰黑体色的隐性突变亲本；其中：对扩增产物进行直接电泳，根据电泳图谱结果，进行判定：白化个体有99bp的碱基缺失，只有一条150bp条带；正常个体HSP4基因没有变化，只有一条249bp条带；隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99bp，导致同时存在150bp和249bp一大一小两条带；对扩增产物纯化后，直接测序，根据测序结果，进行判定：白化个体有99bp的碱基缺失，序列长度为150bp，正常个体序列长度为249bp，隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99bp，导致峰形图存在重叠峰；
根据电泳图谱结果，筛选出隐性突变亲本7尾，其中3尾雄鱼，4尾雌鱼。根据测序结果也得到了相同结果。
2、F1代构建
2010年6月，利用7尾亲鱼交配构建家系，其中一尾雄与一尾雌鱼配对全同胞2个，一尾雄鱼与两尾雌鱼配对半同胞家系2个。半同胞家系只有一尾雌鱼产卵，最终获得3个F1代全同胞家系子代。F1代个体3个家系分开独立养殖，经4年培育至性成熟，粉白体色个体占比约25％
3、F2代构建
2014年6月，从性成熟的F1代3个家系中挑选生长速度最快的粉白体色个体，每个家系各挑选8尾雄鱼8尾雌鱼，双列杂交配组繁殖，获得F2代15家系个体，个体全部为粉白体色。
2015年6月，继续性成熟的F1代3个家系中挑选生长速度最快的粉白体色个体，每个家系各挑选12尾雄鱼12尾雌鱼，双列杂交配组繁殖，获得F2代18家系个体，个体全部为粉白体色。
结果分析：
本实施例的粉白体色斑点叉尾鮰家系选育情况见表1所示。
表1粉白体色斑点叉尾鮰家系选育
序列表
<110> 江苏省淡水水产研究所
<120> 一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctctaaagtg cgtgaggaag gtga 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcatgcgga tggcgtattt g 21
Claims (3)
1.一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法，其特征在于下列步骤：
(1)利用设计的扩增斑点叉尾鮰HSP4基因的特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2PCR扩增筛选所收集的核心育种群体亲本，对扩增产物进行电泳或者测序，根据电泳或者测序结果获得仍是灰黑体色的隐性突变亲本；其中：对扩增产物进行直接电泳，根据电泳图谱结果，进行判定：白化个体有99bp的碱基缺失，只有一条150bp条带；正常个体HSP4基因没有变化，只有一条249bp条带；隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99bp，导致同时存在150bp和249bp一大一小两条带；对扩增产物纯化后，直接测序，根据测序结果，进行判定：白化个体有99bp的碱基缺失，序列长度为150bp，正常个体序列长度为249bp，隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99bp，导致峰形图存在重叠峰；
(2)将筛选出的性腺成熟的雌、雄灰黑体色的隐性突变亲本配对繁殖构建F1代家系个体，得到的F1代个体出现体色分离，粉白体色个体约占25％；
(3)将得到的F1代粉白体色个体按照家系分开独立饲养在池塘中，培育4年至性腺成熟；
(4)从F1代家系挑选生长最快的粉白个体双列杂交，构建F2代全同胞家系，所获得的F2代个体全部为粉白体色。
2.根据权利要求1所述的一种粉白体色斑点叉尾鮰家系制种方法，其特征在于步骤(3)中F1代粉白体色个体按照家系分开独立饲养在池塘中，放养密度为每650-700m2放养150尾；亲本培育阶段除投喂配合饲料外，每周投喂两次新鲜鱼糜和小杂鱼虾。
3.由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成的特异性引物在粉白体色斑点叉尾鮰家系制种中的应用。
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