CN105039575A - 用于黄瓜杂种f1“宝科1号”种子纯度鉴定的ssr引物及方法 - Google Patents
用于黄瓜杂种f1“宝科1号”种子纯度鉴定的ssr引物及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的SSR引物与方法。该方法包括：（1）黄瓜基因组DNA的提取；（2）选择SSR特异性引物进行PCR扩增；（3）对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并制备“宝科1号”品种的SSR标准图谱；（4）根据凝胶条带的相对位置，与“宝科1号”品种标准图谱对照，鉴定种子纯度。该发明的方法可在1天内将杂交种子“宝科1号”与其父本、母本种子区分开，能快速、准确地检测出杂交种子的纯度，具有操作方便、重复性好、结果准确等特点。本发明可替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，在“宝科1号”的制种、繁种和经销企业推广应用，具有较高的商业价值。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的SSR引物及方法。
背景技术
种子纯度是种子质量的核心指标，在生产中若种子纯度不高，会导致产品性状不整齐和收成减少，直接影响农户的经济利益。目前应用于黄瓜种子纯度鉴定的方法主要是田间表型鉴定，但其周期长、工作量大、易受环境因素影响等特点已越来越不能满足育种工作和种子市场贸易的需求，急需发展一种能快速、简便、准确鉴定黄瓜种子纯度的技术。
SSR分子标记是近年来发展迅速的一种DNA分子遗传标记技术，具有共显性遗传，能准确、高效地鉴别大量等位基因，可鉴别杂合子与纯合子，具有重复性好、稳定性高、成本低和易操作的优点，因此在作物种子纯度鉴定的工作中逐渐得到了应用。
“宝科1号”黄瓜是以“申母光23-1”为父本，“刺5短”为母本育成的近华南型黄瓜一代杂种。具有全雌性、早熟性、产量高、抗病性强等特点，为适应上海地区种植的优良黄瓜品种。开发出能快速、准确鉴定“宝科1号”种子纯度的SSR分子标记技术将保证该优良品种的经济效益最大化，具有良好的商业应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供用于黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的SSR引物，并建立一种快速、准确鉴定黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的方法。
本发明所提供的用于黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的SSR引物，为3对SSR引物对序列，其中，PCR产物长度为171-331bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列，3对SSR引物对中的任意1对～3对的自由组合均可鉴定“宝科1号”的种子纯度。
引物对的序列表（5’→3’）：
引物对1：
SEQIDNO.1CACACCATTTACGGTTATGGG（正向序列），
SEQIDNO.2CATTTGGTTCAGAAAGGGGA（反向序列）；
引物对2：
SEQIDNO.3TAAACATATGTGATTATACAGCAA（正向序列），
SEQIDNO.4GTGTTTTGGTGTTATGTGAATATC（反向序列）；
引物对3：
SEQIDNO.5CGTATGTACGACAAAATGTGAACAG（正向序列），
SEQIDNO.6TCGAAACCTCAATACTTCTACCAA（反向序列）。
本发明中，使用3对引物中任意一对引物，均可对“宝科1号”的种子纯度进行鉴定，使用引物对越多，结果越准确可靠，即使用3对引物时，结果最准确可靠。
本发明提供的用于黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的方法，具体步骤如下：
（1）分别提取“宝科1号”父本、母本以及待测黄瓜种子或幼苗的基因组DNA；
（2）以上述提取的DNA为模板，选择3对SSR引物对中的1对～3对SSR引物对进行PCR扩增；
（3）对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
（4）对电泳结果进行分析：
“宝科1号”品种的SSR标准图谱为同时具有两个亲本特异性条带的图谱；其中，引物对1产生183bp的父本特异性条带，产生193bp的母本特异性条带；引物对2产生325bp的父本特异性条带，产生331bp的母本特异性条带；引物对3产生175bp的父本特异性条带，产生183bp的母本特异性条带。被检测的种子的电泳图谱与“宝科1号”标准图谱一致时，鉴定为“宝科1号”。
本发明中，PCR扩增采用10μl反应体系如下：
（1）10×PCR缓冲液(含25mmol/LMgCl2)1.0μl；
（2）2.5mmol/LdNTPMixture0.8μl；
（3）20μmol/LPCR引物0.2μl；
（4）1UTaqDNAPolymerase0.05μl；
（5）DNA模板1.0μl；
（6）ddH2O6.95μl。
PCR扩增的程序如下：
（1）94℃预变性5min；
（2）94℃变性30s；
（3）退火温度：52℃，退火时间：30s；
（4）72℃延伸40s；
（5）循环步骤为（2）（3）（4），20个循环；
（6）72℃延伸7min；
（7）4℃保存。
本发明中，所述电泳的检测方法为：在10μlPCR产物加入2.5μlLoadingBuffer，室温变性10min后，取2μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。
本发明的方法可将“宝科1号”杂交种子与其母本、父本种子以及其他品种的黄瓜种子区分开，能快速、准确鉴定杂种F1“宝科1号”种子纯度。可根据实际情况，选择1对～3对SSR引物进行检测，具有较高的商业应用价值。
附图说明
图1为引物对SSR07100对黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P：父本申母光23-1；M：母本刺5短；F1:宝科1号种子）。
图2为引物对CSWTA04对黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P：父本申母光23-1；M：母本刺5短；F1:宝科1号种子）。
图3为引物对SSR8956对黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P：父本申母光23-1；M：母本刺5短；F1:宝科1号种子）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但以下描述不对本发明的保护范围构成任何意义上的限定。
对实施例所涉材料的说明：
“宝科1号”：上海市种子管理总站主要农作物品种审定委员会认定：沪农品认蔬果2013第009号；经由上海市宝山区蔬菜科学技术推广站育成，是以“申母光23-1”为父本，“刺5短”为母本育成的近华南型黄瓜一代杂种。具有全雌性、早熟性、产量高、抗病性强等特点，为适应上海地区种植的优良黄瓜品种。
实施例1：利用3对SSR引物分别制作黄瓜品种“宝科1号”的标准图谱
1、提取基因组DNA：取“宝科1号”以及其父本“申母光23-1”，母本“刺5短”的幼苗叶片,使用天根生化科技（北京）有限公司生产的DNAquick快捷型植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
2、PCR扩增:采用10μlPCR扩增体系:
（1）10×PCR缓冲液(含25mmol/LMgCl2)1.0μl；
（2）2.5mmol/LdNTPMixture0.8μl；
（3）20μmol/LPCR引物0.2μl；
（4）1UTaqDNAPolymerase0.05μl；
（5）DNA模板1.0μl；
（6）ddH2O6.95μl。
PCR扩增的程序如下：
（1）94℃预变性5min；
（2）94℃变性30s；
（3）退火温度：52℃，退火时间：30s；
（4）72℃延伸40s；
（5）循环步骤为（2）（3）（4），20个循环；
（6）72℃延伸7min；
（7）4℃保存。
3、电泳检测的方法为：在10μlPCR产物加入2.5μlLoadingBuffer,室温变性10min后，取2μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，500V稳压电泳1.5小时，电泳结束后进行0.1%AgNO3染色10min；再用含2%NaOH和0.4%甲醛的溶液显色，待电泳条带清晰时在灯箱上拍照分析。
4、扩增结果
3对SSR引物在黄瓜“宝科1号”父母本及杂交一代种子分别能扩增出两条特异电泳条带，父本PCR扩增产物的核苷酸序列比母本的要短，因此父本电泳条带的位置在母本的前面，而“宝科1号”是杂种，因此同时具有父本和母本的特征条带。（图1，2，3）。
5、“宝科1号”父本和母本PCR产物的序列长度测定：在SSR正向引物的5’端加上通用型引物M13(5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’)，再加入带有红色荧光标记ROX的通用型M13引物，对“宝科1号”的父本和母本DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在ABI3730XL型测序仪进行毛细管凝胶电泳，分别获得“宝科1号”父本和母本的3对SSR引物PCR扩增产物的片段大小的数值:引物对1：“宝科1号”的父本的PCR产物长度为183bp，“宝科1号”的母本的PCR产物长度为193bp；引物对2：“宝科1号”的父本的PCR产物长度为325bp，“宝科1号”的母本的PCR产物长度为331bp；引物对3：“宝科1号”的父本的PCR产物长度为175bp，“宝科1号”的母本的PCR产物长度为183bp。
<110>复旦大学
<120>用于黄瓜杂种F1"宝科1号"种子纯度鉴定的SSR引物及方法
<130>001
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>
<400>1
cacaccatttacggttatggg21
<210>2
<211>20
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<212>DNA
<213>
<400>6
tcgaaacctcaatacttctaccaa24
Claims (5)
1.一种用于黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于PCR产物长度为171-331bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列；其中：
引物对1：
SEQIDNO.1：CACACCATTTACGGTTATGGG，为正向序列，
SEQIDNO.2：CATTTGGTTCAGAAAGGGGA，为反向序列；
引物对2：
SEQIDNO.3：TAAACATATGTGATTATACAGCAA，为正向序列，
SEQIDNO.4：GTGTTTTGGTGTTATGTGAATATC，为反向序列；
引物对3：
SEQIDNO.5：CGTATGTACGACAAAATGTGAACAG，为正向序列，
SEQIDNO.6：TCGAAACCTCAATACTTCTACCAA，为反向序列。
2.一种用于黄瓜杂种F1“宝科1号”种子纯度鉴定的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）分别提取“宝科1号”父本、母本以及待测黄瓜种子或幼苗的基因组DNA；
（2）以上述提取的DNA为模板，选择权利要求1所述的SSR引物对中的1对～3对SSR引物对进行PCR扩增；
（3）对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
（4）对电泳结果进行分析：
“宝科1号”品种的SSR标准图谱为同时具有两个亲本特异性条带的图谱；其中，引物对1产生183bp的父本特异性条带，产生193bp的母本特异性条带；引物对2产生325bp的父本特异性条带，产生331bp的母本特异性条带；引物对3产生175bp的父本特异性条带，产生183bp的母本特异性条带；被检测的种子的电泳图谱与“宝科1号”标准图谱一致时，鉴定为“宝科1号”。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于PCR扩增采用的10μl反应体系如下：
（1）10×PCR缓冲液，含25mmol/LMgCl21.0μl；
（2）2.5mmol/LdNTPMixture0.8μl；
（3）20μmol/LPCR引物0.2μl；
（4）1UTaqDNAPolymerase0.05μl；
（5）DNA模板1.0μl；
（6）ddH2O6.95μl。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于PCR扩增的程序如下：
（1）94℃预变性5min；
（2）94℃变性30s；
（3）退火温度：52℃，退火时间：30s；
（4）72℃延伸40s；
（5）循环步骤为（2）（3）（4），20个循环；
（6）72℃延伸7min；
（7）4℃保存。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述电泳的检测方法为：在10μlPCR产物加入2.5μlLoadingBuffer，室温变性10min后，取2μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。
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