CN107447012A - 一种利用ssr分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交f1杂种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的一种利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，依据可以生长出幼苗的试验材料，设计SSR分子标记引物的方法，以期达到真杂交种的有效鉴定手段。利用材料进行株高、株幅、叶刺、叶色、叶脉色、茎刺、茎色、花序、花色和花萼色等形态指标，与父母本进行形态学比较作为对照例。采取亲本和杂交种的叶片进行DNA提取，对带型稳定且清晰的条带的DNA进行SSR引物的PCR扩增，使用聚丙烯酰胺胶(PAGE)电泳分离扩增产物，具有父母互补型、父本型条带的杂交种即为真杂交种。本发明方法操作简单方便，鉴定快速，费用低，具有高准确度和通用性，可以对茄子不同栽培茄与野生茄杂交组合的杂交种真实性进行有效鉴定。

Description

一种利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F1杂种的 方法

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，涉及到SSR分子标记鉴定方法，具体涉及一种利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)是茄科茄属植物，是一种深受消费者喜爱的茄果类蔬。但茄子在生产上容易遭受到各种病虫的危害，如黄萎病、根结线虫等，而茄子野生资源中具有高抗病虫害的优良基因。因此，为了实现对栽培品种的改良，将通过各种方法把这些抗性基因导入到栽培茄中。而种间杂交是实现基因转移的重要途径，获得的种间杂种也随之增多。栽培茄与野生茄种间杂交存在单向障碍，将栽培茄作为母本更容易杂交成功，杂种鉴定是遗传育种的基础工作，如何快速准确鉴定出茄子杂交后代的真实性是遗传育种的基础工作。

除形态学鉴定外，分子标记技术被广泛运用于杂交后代的真实性鉴定当中。常见的SRAP分子标记技术属于显性标记，是通过后代是否具有父本特异条带作为杂种鉴定的手段。而此方法操作相对繁琐，花费较多的时间和较高的费用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法。是一种快速、简单、省时、准确的杂交种鉴定方法，该法可真实有效地应用于栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种真实性的鉴定。

实现上述技术问题的技术方案是：

本发明涉及一种利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，具体包括以下步骤：

步骤一：种间杂交F₁杂种及其亲本的DNA提取；

步骤二：建立SSR反应体系及扩增反应程序；

步骤三：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

步骤四：杂交种真实性的鉴定；在杂交后代的扩增产物中，是否具有父母本互补型或父本型条带，若有则为真杂交种，反之，则为假杂交种。

进一步地，步骤一中，以亲本和杂交种植株的叶片为材料，提取DNA；提取的DNA

用1％的琼脂糖凝胶电泳进行纯度的检测。所述DNA样品置于-20℃保存。

进一步地，利用SSR标记引物emg01J09和emh21J12进行杂种鉴定；

引物emg01J09-F具有SEQID NO.1的核苷酸序列；

引物emg01J09-R具有SEQID NO.2的核苷酸序列；

引物emh21J12-F具有SEQID NO.3的核苷酸序列；

进一步地，所述SSR反应体系：6.7μl ddH₂O，1.0μl 10×Buffer，0.2μl dNTPs，1.0μl引物，0.1μl rTaq聚合酶、1.0μl DNA模板；

进一步地，扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性5min，55～60℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环；最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

进一步地，电泳检测具体步骤为：扩增产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，每个样品取1.4μl和0.7μl Loading Buffer混合点样，以DL500DNAMaker为对照，在180V恒压下，电泳1.5h，随后进行银染观察。

更进一步地，银染具体步骤如下：

(1)用自来水将电泳槽和四块玻璃板冲洗干净，放在操作台上自然蒸干。

(2)按照长板外短板内的顺序，将玻璃板垂直安装到电泳槽上，拧紧；然后用1.0％琼脂胶封住底部，待用。

(3)将模具倾斜45°，用摇晃均匀后的6％聚丙烯酰胺凝胶，缓缓倒入玻璃板的缝隙，至模具顶部为止；随后迅速插上梳子，仔细观察是否有气泡残留。确定好后，室温放置1～2h进行凝固。

(4)凝固好后，放到加满1×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，小心地拔出梳子，避免气泡产生，随后点样，然后进行电泳。

(5)结束后，缓缓倒出缓冲液，取下胶板，从玻璃板中取出凝胶，先放入固定液中轻摇2～3min；在染色液中轻晃3～5min；再在蒸馏水中漂洗2～3次，每次时间不超过15s；随后放到显影液中轻轻摇晃，直至条带出现；最后观察后拍照分析。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

本发明是一种利用SSR分子标记技术鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种真实性的鉴定方法，利用SSR标记引物对茄子杂交种植株的DNA进行PCR扩增，使用PAGE胶电泳分离扩增产物。本方法操作简单，鉴定快速，费用低，准确度高，可以有效鉴定栽培茄与野生茄不同亲本杂交组合的杂交种真实性。

附图说明

图1是部分DNA琼脂糖凝胶电泳结果。

图2是引物emg01J09对茄子扩增的结果图。

图3是引物emh21J12对茄子扩增的结果图。

具体实施方式

下面以传统田间形态学观察为对照例，本发明为实施例，进一步阐述本发明对种间F₁杂种的鉴定方法。

对照例1：传统田间形态学鉴定方法

形态学鉴定参照李锡香等《茄子种质资源描述规范和数据标准》，对种间F₁杂种及其亲本的生长发育情况进行性状的观察，主要包括的性状有：株高、株幅、叶刺、叶色、叶脉色、茎刺、茎色、花序、花色和花萼色等。

将16个杂交组合的杂交种均种植在扬州大学园艺与植物保护学院园艺育种实验基地(表1)。

表1：16份茄子杂交种材料的基本情况

在栽培过程中，F₁代植株的形态性状与双亲均有不同的地方。从表2可以看出，以eH15和eH16为例分析，其中，eH15和eH16都是以苏州牛角作为母本，但eH16比eH15更加得偏向于母本。eH15的性状更加偏向于父本，尤其叶片有刺和茎段有刺这一突出性状上，与母本大不相同。另外，在植株的高度和株幅上来看，杂交种明显比亲本高，这可能是杂交种的杂种优势。杂交种与亲本在叶色和叶脉色上的差别不大，在叶刺、花序、花色和茎刺上的差异比较突出，可以初步断定eH15和eH16是真杂交种。运用相同的形态性状观察方法，将其余的14份杂交种进行鉴定，得到初步真杂种有：eH2、eH3、eH4、eH5、eH6、eH7、eH8、eH9、eH10、eH13、eH14。

表2：部分F₁与其父母本形态学比较

实施例1：本发明利用SSR分子标记鉴定方法

步骤一：选取干净的杂交后代及亲本植株的叶片，-80℃保存。

步骤二：基因组DNA提取：

以待鉴定的杂交后代及亲本植株的叶片为材料，采用上海生工生物有限公司生产的Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒进行提取。具体步骤参照试剂盒说明书。提取的DNA样品置于-20℃冰箱保存。

然后采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测的方法对DNA进行检测。如图1：1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，得到的电泳条带较为清晰集中，没有出现拖尾或者弥散的情况，则认为满足SSR分子标记的要求，可用于PCR扩增。

步骤三：建立SSR反应体系及扩增反应程序：

建立10μl的SSR反应体系：6.7μl ddH₂O，1.0μl 10×Buffer，0.2μl dNTPs，1.0μl引物，0.1μl rTaq聚合酶、1.0μl DNA模板。依次向八连管中加入试剂，离心后放入PCR扩增仪中进行扩增，扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性5min，55～60℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环；最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

步骤四：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：

步骤三中的扩增产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，每个样品取1.4μl和0.7μl Loading Buffer混合点样，以DL500DNAMaker为对照，在180V恒压下，电泳1.5h，随后进行银染观察。

步骤五：银染具体步骤如下：

(1)用自来水将电泳槽和四块玻璃板冲洗干净，放在操作台上自然蒸干。

(2)按照长板外短板内的顺序，将玻璃板垂直安装到电泳槽上，拧紧；然后用1.0％琼脂胶封住底部，待用。(1.0％琼脂胶体系为：0.5g琼脂粉+50ml蒸馏水

(3)将模具倾斜45°，用摇晃均匀后的6％聚丙烯酰胺凝胶，缓缓倒入玻璃板的缝隙，至模具顶部为止；随后迅速插上梳子，仔细观察是否有气泡残留。确定好后，室温放置1～2h进行凝固。(6％聚丙烯酰胺凝胶体系为：24ml蒸馏水+8ml 5×TBE Buffer+8ml聚丙烯酰胺+200μl 10％APS+20μl TBMED)

(4)凝固好后，放到加满1×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，小心地拔出梳子，避免气泡产生，随后点样，然后进行电泳。

(5)结束后，缓缓倒出缓冲液，取下胶板，从玻璃板中取出凝胶，先放入固定液中轻摇2～3min；在染色液中轻晃3～5min；再在蒸馏水中漂洗2～3次，每次时间不超过15s；随后放到显影液中轻轻摇晃，直至条带出现；最后观察后拍照分析。(固定液体系：2.5ml冰醋酸+95％乙醇55ml+500ml蒸馏水；染色液体系：2gAgNO₃+1L蒸馏水；显影液体系：7.5gNaOH+2ml甲醛+500ml蒸馏水)(胶做完需要引染显示出条带，分为四步，每一步有固定的溶液)

如图2和3，16份杂交种的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图示，结果发现emg01J09和emh21J12能够分别区分亲本与杂交种，由图可以看出，eH1、eH11和eH12在SSR分子鉴定下，确实不是真杂交种，而其余的13份杂交种(eH2、eH3、eH4、eH5、eH6、eH7、eH8、eH9、eH10、eH13、eH14、eH15、eH16)在SSR分子鉴定的结果与形态学鉴定的一致，均为真杂种。

SSR标记引物emg01J09和emh21J12：

比较分析

通过比较分析，本发明一种利用SSR方法具有以下优点：

(1)本发明针对田间杂种鉴定周期长、费劳力、受环境影响大的缺点；SSR分子标记在鉴定杂种真实性的同时，节省大量的时间，降低费用，具有较高的准确性。

(2)本发明可以较早的排除假杂种，减少后期试验的工作量。为杂种后续研究提供依据的同时，有利于茄子品种改良工作的推进。

综上所述，本发明对杂交种的鉴定方法具有可实施性，可以准确合理验证杂交结果，为杂种后续研究提供依据的同时，也有利于茄子品种改良工作的推进。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F1杂种的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tagaggagga ggcaagtgca aatc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tcttccgtac tatccagagc tcca 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

acagaacaat tcaccagcag tcaa 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aggaacaggg aaaatcgtat cggt 24

Claims (8)

1.一种利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：种间杂交F₁杂种及其亲本的DNA提取；

步骤二：建立SSR反应体系及扩增反应程序；

步骤三：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

步骤四：杂交种真实性的鉴定；在杂交后代的扩增产物中，是否具有父母本互补型或父本型条带，若有则为真杂交种，反之，则为假杂交种。

2.如权利要求1所述的利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，其特征在于，步骤一中，以亲本和杂交种植株的叶片为材料，提取DNA；提取的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳进行纯度的检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA样品置于-20℃保存。

4.如权利要求1所述的利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，其特征在于步骤二中，利用SSR标记引物emg01J09和emh21J12进行杂种鉴定；引物emg01J09-F具有SEQID NO.1的核苷酸序列；

引物emg01J09-R具有SEQID NO.2的核苷酸序列；

引物emh21J12-F具有SEQID NO.3的核苷酸序列；

引物emh21J12-R具有SEQID NO.4的核苷酸序列。

5.如权利要求1所述的利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，其特征在于步骤二中，所述SSR反应体系：6.7μl ddH₂O，1.0μl 10×Buffer，0.2μldNTPs，1.0μl引物，0.1μl rTaq聚合酶、1.0μl DNA模板。

6.如权利要求1所述的利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，其特征在于步骤二中，扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性5min，55～60℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环；最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

7.如权利要求1所述的利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，其特征在于步骤三中，电泳检测具体步骤为：扩增产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，每个样品取1.4μl和0.7μl Loading Buffer混合点样，以DL500DNAMaker为对照，在180V恒压下，电泳1.5h，随后进行银染观察。

8.如权利要求7所述的利用SSR分子标记鉴定栽培茄与野生茄种间杂交F₁杂种的方法，其特征在于银染具体步骤如下：

(1)用自来水将电泳槽和四块玻璃板冲洗干净，放在操作台上自然蒸干；

(2)按照长板外短板内的顺序，将玻璃板垂直安装到电泳槽上，拧紧；然后用1.0％琼脂胶封住底部，待用；

(3)将模具倾斜45°，用摇晃均匀后的6％聚丙烯酰胺凝胶，缓缓倒入玻璃板的缝隙，至模具顶部为止；随后迅速插上梳子，仔细观察是否有气泡残留。确定好后，室温放置1～2h进行凝固；

(4)凝固好后，放到加满1×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，小心地拔出梳子，避免气泡产生，随后点样，然后进行电泳；

(5)结束后，缓缓倒出缓冲液，取下胶板，从玻璃板中取出凝胶，先放入固定液中轻摇2～3min；在染色液中轻晃3～5min；再在蒸馏水中漂洗2～3次，每次时间不超过15s；随后放到显影液中轻轻摇晃，直至条带出现；最后观察后拍照分析。