CN111235306A - 用于水果黄瓜绿美1号种子纯度鉴定的ssr引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定水果黄瓜绿美1号种子纯度的SSR引物SSR17922，其中上游引物SSR17922‑F为：5'‑CATTCTAGGTCAATGAATCGCA‑3'，下游引物SSR17922‑R为：5'‑GCAAAGTTGCCACATTGAAG‑3'。通过上述引物，能够准确、快速的鉴定杂交种绿美1号种子纯度。与传统田间小区鉴定相比，在父母本中分别扩增出两条特异的清晰带型，母本中扩增出182bp的条带，父本中扩增出197bp的条带，而在F1品种绿美1号中扩增出同时含有父母本特异带型的182/197bp杂合条带，且条带清晰，遗传性稳定，可将水果黄瓜绿美1号与其父母本种子、其他混杂种子区分开来，快速检测出杂交种绿美1号的种子纯度。避免了传统田间小区鉴定周期长、费时费工、占地面积大等的不足，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。

Description

用于水果黄瓜绿美1号种子纯度鉴定的SSR引物及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于水果黄瓜杂交种“绿美1号”种子纯度鉴定的SSR标记。

背景技术

黄瓜（CucumissativusL.）是葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（CucumisL.）一年生草本攀援植物，在我国已有2000 多年的栽培历史，是世界主要蔬菜作物之一，在蔬菜生产中占有重要的地位。黄瓜具有较强的杂种优势，目前市场上广泛利用的均为杂种一代种子。黄瓜育种工作者培育出许多高产、优质、抗病的优良品种，为农业增产、稳产做出了巨大的贡献。但由于制种技术、机械混杂形成的假杂种、社会上一些不法商贩为追求经济利益购销的假冒伪劣种子，严重影响了黄瓜的产量、品质，不但不能达到增产目的，甚至会导致减产，给国家和农民造成了重大经济损失。因此，开展快速、准确鉴定黄瓜种子纯度方法的研究具有重要意义。

种子纯度是种子质量标准的首要指标，也是保证种子质量的关键。近年来，随着分子技术的发展，DNA 分子标记技术日趋完善，广泛用于农作物和蔬菜种子的真实性检测和纯度鉴定。其中，SSR( simple sequence repeat) 标记因具有数量丰富、多态性高、操作简便、结果稳定可靠等优点，成为当前最经济、最有效的分子标记技术，也为种子纯度鉴定提供了一种更为快速、高效、简便、可靠的方法。

绿美1号为本公司（江苏绿港现代农业发展有限公司）自主研发的一代杂交种，拥有完全自主知识产权的新品种，是以“C87”为母本，“C91”为父本育成的早熟水果黄瓜。该品种植株长势旺盛，瓜条顺直，节节有瓜，瓜长14-16cm ，单瓜重130g左右。近年来，水果黄瓜绿美1号作为无土栽培中的主要品种，因其色泽深亮、口感鲜嫩、高产等优良农艺性状，栽培面积逐年扩大。因此，开发出能快速、高效鉴定绿美1号种子纯度的SSR分子标记技术，将保证该优良品种的经济效益最大化，具有较高的商业应用前景。

发明内容

本发明针对目前黄瓜杂交种子纯度鉴定靠田间表型观察方法存在受环境影响大、鉴定时间长等缺陷，本发明的目的在于提供一种用于鉴定黄瓜杂交种绿美1号种子纯度的SSR 引物，该引物能够在对应父母本中产生特异性标记，特异性强，能够快速、准确、高效的鉴定黄瓜杂交种绿美1号种子纯度。

本发明所采用的技术方案是：

一种用于鉴定水果黄瓜绿美1号种子纯度的SSR引物SSR17922，所述引物包括上游引物SSR17922-F和下游引物SSR17922-R，其中

上游引物SSR17922-F为：5'- CATTCTAGGTCAATGAATCGCA -3'，

下游引物SSR17922-R为：5'- GCAAAGTTGCCACATTGAAG -3' 。

一种采用上述引物SSR17922检测水果黄瓜绿美1号种子纯度的方法，包括以下步骤：

A.通过改良的CTAB法提取绿美1号叶片基因组DNA；

B.将提取的绿美1号叶片基因组DNA通过所述的引物进行PCR扩增，然后再进行检测。

进一步地，所述改良的CTAB法提取绿美1号叶片基因组DNA，包括以下步骤：

A1.取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样90s；

A2.磨好样后，加入600µl CTAB提取液，55℃水浴30min，每隔5min上下翻转混匀一次；

A3.12000rpm离心5min，吸取400µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物（24氯仿：1异戊醇），充分混匀；

A4.13000rpm离心120s，取300µl上清于另一新的1.5ml离心管中，加入在-20℃条件下提前预冷的无水乙醇600µl，混匀， -20℃冰箱放置2h；

A5.12000rpm离心10min，倒掉上清液，室温放置；

A6.待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA。

进一步地，所述PCR扩增及检测，包括以下步骤：

B1.通过扩增仪进行PCR扩增，反应体系为15μL，包括7.5μL 2×Taq MasterMix，1μLDNA，10μM的正反向引物各0.5μL，5.5μL ddH2O。反应程序为94℃预变性2min，[94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃；

B2.在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。

采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：本发明通过对水果黄瓜绿美1号的父母本叶片基因组DNA进行PCR扩增，获得了一个具有多态性强的SSR标记SSR17922。用SSR17922标记对F1品种绿美1号进行纯度鉴定，能够准确、快速的鉴定杂交种绿美1号种子纯度。与传统田间小区鉴定相比，其优点是：本发明筛选出的SSR标记SSR17922，在父母本中分别扩增出两条特异的清晰带型，母本中扩增出182B品的条带，父本中扩增出197bp的条带，而在F1品种绿美1号中扩增出同时含有父母本特异带型的182/197bp杂合条带，且条带清晰，遗传性稳定，可将水果黄瓜绿美1号与其父母本种子、其他混杂种子区分开来，快速检测出杂交种绿美1号的种子纯度。通过本发明，只需简单提取黄瓜叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定黄瓜杂交种绿美1号的种子纯度。本发明避免了传统田间小区鉴定周期长、费时费工、占地面积大等的不足，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。

附图说明

图1 利用SSR标记扩增的亲本与F1品种的电泳图

图中显示了利用标记SSR17922扩增的绿美1号及其亲本的电泳图，其中M表示500bp的Marker。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

本实施例提供一种用于鉴定水果黄瓜绿美1号纯度的引物SSR17922，所述引物包括引物SSR17922的上游引物SSR17922-F和下游引物SSR17922-R，所述上游引物SSR17922-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述下游引物SSR17922-R 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述引物的具体核苷酸序列如下：

上游引物SSR17922-F：5'- CATTCTAGGTCAATGAATCGCA -3' (SEQ ID NO.1)

下游引物SSR17922-R：5'- GCAAAGTTGCCACATTGAAG -3' (SEQ ID NO.2)

利用所述引物SSR17922进行PCR扩增，在绿美1号父本中能扩增出约197bp的特异性条带，在母本中扩增出约182bp的特异性条带，而在其F1绿美1号中扩增出182/197bp的杂合条带（图1）；

所述在水果黄瓜绿美1号中能扩增处182bp的母本特异性标记的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示，所述在水果黄瓜绿美1号中能扩增出197bp的父本特异性标记的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；

SEQ ID N0.3：CATTCTAGGTCAATGAATCGCAACTCATATTTAACGAAAATGAAATTGTAAGTAGATATATTTTGTTGCAATAATAATAATAAAAAGAAGAAGAAGATGAAGGAGAAGAAGAATTGACGGTCAAGATCACCCCCCGAGTTTGGACTCGTGGCAAATTTCATTCTTCAATGTGGCAACTTTGC

SEQ ID N0.4：CATTCTAGGTCAATGAATCGCAACTCATATTTAACAAAAATGAAATTGTAAGTAGATATATTTTGTTGCAATAATAATAATAATAATAATAAAAAGAAGAAGAAGAAGATGAAGAAGGAGAAGAAGAATTGACGGTCAAGATCACCCCCCGAGTTTGAACTCGTGGCAAATTTCATTCTTCAATGTGGCAACTTTGC

本发明的有益效果：本发明通过对水果黄瓜绿美1号的父母本叶片基因组DNA进行PCR扩增，获得了一个具有多态性强的SSR标记SSR17922。用SSR17922标记对F1品种绿美1号进行纯度鉴定，能够准确、快速的鉴定杂交种绿美1号种子纯度。与传统田间小区鉴定相比，其优点是：本发明筛选出的SSR标记SSR17922，在父母本中分别扩增出两条特异的清晰带型，母本中扩增出182B品的条带，父本中扩增出197bp的条带，而在F1品种绿美1号中扩增出同时含有父母本特异带型的182/197bp杂合条带，且条带清晰，遗传性稳定，可将水果黄瓜绿美1号与其父母本种子、其他混杂种子区分开来，快速检测出杂交种绿美1号的种子纯度。通过本发明，只需简单提取黄瓜叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定黄瓜杂交种绿美1号的种子纯度。本发明避免了传统田间小区鉴定周期长、费时费工、占地面积大等的不足，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。

鉴定水果黄瓜绿美1号种子纯度的步骤如下：

（一）材料与方法

1. 植物材料

本研究使用水果黄瓜绿美1号与其亲本为实验材料，根据江苏绿港现代农业发展公司实验方法进行播种和管理。可以理解，通过该实验方法进行播种和管理得到的植物材料，不应当理解为对本申请范围的限制，采用其他方法种植的水果黄瓜绿美1号，同样适用本方法进行鉴定。

2. DNA的提取

利用改良的CTAB法，提取绿美1号叶片基因组DNA，具体方法如下：

1）取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样90s；

2）磨好样后，加入600µl CTAB提取液，55℃水浴30min，每隔5min上下翻转混匀一次；

3）12000rpm离心5min，吸取400µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物（24氯仿：1异戊醇），充分混匀；

4）13000rpm离心120s，取300µl上清于另一新的1.5ml离心管中，加入在-20℃条件下提前预冷的无水乙醇600µl，混匀， -20℃冰箱放置2h；

5）12000rpm离心10min，倒掉上清液，室温放置；

6）待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA。

3. PCR扩增及检测

PCR扩增在中国华盛公司LY96G Thermocycler^TM扩增仪上进行，反应体系为15μL，包括7.5μL 2×Taq MasterMix，1μLDNA，10μM的正反向引物各0.5μL，5.5μL ddH2O。反应程序为94℃预变性2min，[94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。可以理解，扩增仪的型号不应当理解为对本申请的限制，只要适用于PCR扩增的仪器并且能实现发明目的的方案，均应当理解为本发明的保护范围。

4. 具有多态性的标记筛选及纯度鉴定

从黄瓜72对SSR标记中，通过PCR扩增与电泳，利用亲本筛选具有多态性引物。

用筛选到的具有多态性的标记，进行黄瓜F1品种绿美1号的PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，鉴定绿美1号种子纯度。

（二）结果与分析

1. 所选材料的基因组DNA的检测分析

使用超微量紫外可见分光光度计（DeNovixDS-11）对本研究所提取的96个（其中父母本各1个，F1群体94个）黄瓜叶片基因组DNA进行浓度检测，发现提取的DNA浓度均高于100ng /μl，而且OD260/OD280基本都在2.0左右。取不同浓度DNA用2%的琼脂糖电泳检测，电泳图清晰明亮，无明显拖尾，说明提取的DNA质量较好。所以，提取到的高质量绿美1号基因组DNA，适用于PCR扩增、SSR等分子标记的生物学试验。

2. PCR扩增与纯度鉴定

选用黄瓜72对SSR标记对亲本进行扩增、电泳，成功筛选到1对具有稳定多态性的标记SSR17922。

利用该标记对黄瓜F1品种绿美1号进行纯度鉴定，结果见图1，图中可以清晰的看出，在父母本中分别扩增出两条特异的清晰带型，母本中扩增出182bp的条带，父本中扩增出197bp的条带，而在所有F1品种绿美1号中均扩增出了同时含有父母本特异带型的182/197bp杂合条带，且条带清晰，表明F1种子纯度达到了100%，其标记SSR17922可以高效稳定的鉴定水果黄瓜绿美1号杂交种的纯度。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 江苏绿港现代农业发展有限公司

<120> 用于水果黄瓜绿美1号种子纯度鉴定的SSR引物及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cattctaggt caatgaatcg ca 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaaagttgc cacattgaag 20

<210> 3

<211> 182

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus L.)

<400> 3

cattctaggt caatgaatcg caactcatat ttaacgaaaa tgaaattgta agtagatata 60

ttttgttgca ataataataa taaaaagaag aagaagatga aggagaagaa gaattgacgg 120

tcaagatcac cccccgagtt tggactcgtg gcaaatttca ttcttcaatg tggcaacttt 180

gc 182

<210> 4

<211> 197

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus L.)

<400> 4

cattctaggt caatgaatcg caactcatat ttaacaaaaa tgaaattgta agtagatata 60

ttttgttgca ataataataa taataataat aaaaagaaga agaagaagat gaagaaggag 120

aagaagaatt gacggtcaag atcacccccc gagtttgaac tcgtggcaaa tttcattctt 180

caatgtggca actttgc 197

Claims (4)

1.一种用于水果黄瓜绿美1号种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于，所述引物包括上游引物SSR17922-F和下游引物SSR17922-R，其中上游引物SSR17922-F为：5'-CATTCTAGGTCAATGAATCGCA -3'，下游引物SSR17922-R为：5'- GCAAAGTTGCCACATTGAAG -3'。

2.一种采用权利要求1所述的引物鉴定水果黄瓜绿美1号种子纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.通过改良的CTAB法提取绿美1号叶片基因组DNA；

B.将提取的绿美1号叶片基因组DNA通过所述的引物进行PCR扩增，然后再进行检测。

3.根据权利要求2所述的引物鉴定水果黄瓜绿美1号种子纯度的方法，其特征在于，所述改良的CTAB法提取绿美1号叶片基因组DNA，包括以下步骤：

A1.取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样90s；

A2.磨好样后，加入600µl CTAB提取液，55℃水浴30min，每隔5min上下翻转混匀一次；

A3.12000rpm离心5min，吸取400µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物（24氯仿：1异戊醇），充分混匀；

A4.13000rpm离心120s，取300µl上清于另一新的1.5ml离心管中，加入在-20℃条件下提前预冷的无水乙醇600µl，混匀， -20℃冰箱放置2h；

A5.12000rpm离心10min，倒掉上清液，室温放置；

A6.待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA。

4.根据权利要求2所述的引物鉴定水果黄瓜绿美1号种子纯度的方法，其特征在于，所述PCR扩增及检测，包括以下步骤：

B1.通过扩增仪进行PCR扩增，反应体系为15μL，包括7.5μL 2×Taq MasterMix，1μLDNA，10μM的正反向引物各0.5μL，5.5μL ddH2O，反应程序为94℃预变性2min，[94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s]，38个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃；

B2.在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。

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