CN111996265B - 一种影响细毛羊羊毛纤维直径的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用，所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第14号染色体上第42678119个核苷酸位点T/G突变。本发明还涉及了利用SNaPshot技术检测上述SNP分子标记的特异性引物对和含有该特异性引物对的试剂盒及核苷酸多态性检测方法，与传统的检测法相比，该技术具有准确性高，检测速度快，成本低廉，结果容易判断等特点。将SNP位点检测用于开展细毛羊羊毛性状早期选择，缩短培育周期、加快培育进程，建立一种细毛羊羊毛性状早期选择技术，减少细毛羊羊毛纤维直径优良性状的育种时间，降低育种成本，具有很高的应用价值。

Description

一种影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用。

背景技术

羊毛纤维直径是评价毛纺性能的重要指标，也是羊毛纤维重要的性能指标，其粗细在一定程度上决定了羊毛的纤维品质。羊毛的纤维品质是超细毛羊育种中最主要的经济指标，纤维直径决定了羊毛的经济价值和纺纱性能。SNP是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。SNP分子标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点。本领域技术人员通过定位和功能基因组技术筛选与细毛羊重要性状相关的分子遗传标记，分析分子遗传标记对候选性状的遗传效应，探讨对候选性状的分子遗传基础；应用SNP标记进行基因组扫描，定位影响羊毛生长发育与细度和生长期变化、抗病性能相关的分子标记，进一步分离具有重要遗传效应的功能基因；建立和优化标记(基因)辅助选择与标记辅助导入聚合育种的方法，通过以上筛选的分子标记，建立各种辅助标记选择模型，并对可能获得的后代进行个体育种值的评分，选择适合性状的标记基因型或单倍型，在育种群体内展开育种选择和杂交导入；建立优良基因从供体高效导入到受体的方法，并进行杂交后代的测定，验证分子标记辅助选择，进而培育具有特定形状的细毛羊。

SNaPshot技术是使用引物扩增目标SNPs所在片段，在扩增产物中加入核酸外切酶I(Exo I)和碱性磷酸酶(FastAP)消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后以纯化后的扩增产物为模板，使用测序酶、双脱氧核苷酸(ddNTPs)和5′-端紧靠SNP位点的延伸引物进行PCR反应。最后使用测序仪和GeneScan等软件进行基因分型和数据分析。SNaPshot技术具有分型准确；通量高：检测速度快；不受SNP位点多态性特性限制和不受样本个数限制等优点。

针对上述技术问题，本发明提供了一种新的影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用方法，其主要目的是为了培育符合养殖需求的细毛羊新品种，也为细毛羊分子标记辅助育种提供依据，加强细毛羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种利用SNaPshot技术检测影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记，所述的SNP分子标记位于细毛羊基因组Oar_v4.0版本第14号染色体第42678119位点的碱基处；突变碱基为T或G。

进一步地，含有所述的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的SNP分子标记位于第501位，突变碱基为T或G。

本发明的第二目的是提供所述的SNP分子标记在细毛羊育种中的应用。

进一步地，当所述的SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；当所述的SNP分子标记碱基为G时，基因型为GT或GG；

所述的SNP位点的GG基因型和TT基因型的细毛羊的羊毛纤维直径显著小于GT基因型。

本发明的第三目的是提供一种与细毛羊羊毛粗细性状相关联的SNP分子标记检测试剂盒，所述的试剂盒包括：用于扩增包含所述SNP分子标记的特异性引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

还包括一个用于检测所述SNP分子标记的延伸引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、核酸外切酶I和碱性磷酸酶中的一种或多种。

本发明的第四目的是提供所述的试剂盒在检测细毛羊羊毛粗细形状中的应用。

本发明的第五目的是利用所述的试剂盒检测细毛羊羊毛纤维直径的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)提取待测细毛羊血液基因组DNA；

(2)利用所述的特异性引物对，将步骤(1)获得的待测细毛羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)用核酸外切酶I和碱性磷酸酶对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行纯化；

(4)以纯化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物进行延伸反应；

(5)分析延伸产物，从而确定待测细毛羊血液的所述SNP分子标记的基因型。

进一步地，所述的步骤(2)中的PCR扩增体系15μL：2X Taq 7.5μL，10μM上、下游引物各0.3μL，DNA模板1μL，ddH₂O 5.9μL；所述的PCR扩增程序：95℃3min；94℃20s，58℃20s，72℃40s，共35个循环；72℃延伸5min。

进一步地，所述的步骤(3)中对PCR扩增产物进行纯化，使用的反应体系以7μL计为：PCR扩增产物3μL，10U/μL酶ExoI 0.2μL，5U/μL酶FastAP 0.8μL，酶ExoI缓冲液0.7μL，ddH₂O 2.3μL；反应条件为：37℃15min，80℃15min。

进一步地，步骤(4)中延伸反应使用的反应体系以6μL计为：纯化后的PCR扩增产物2μL，Snapshot Mix试剂1μL，10μmol延伸引物0.2μL/条，ddH₂O 2.8μL；

延伸反应条件为：94℃10s；52℃5s，60℃30s，30个循环。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记，检测细毛羊第14号染色体上第42678119个位点的碱基；当碱基为T时，基因型为TT；当碱基为G时，基因型为GT或GG；所述GG基因型和TT基因型的细毛羊的羊毛纤维直径显著小于GT基因型(p<0.05)。GG和TT基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。本发明提供的利用SNaPshot技术检测与细毛羊羊毛纤维直径相关的核苷酸多态性的方法，该技术准确性高，检测速度快，成本低廉，并且结果判读更容易。利用本方法可对羊毛细度相关的SNP位点多态性实现自动化检测，通过对细毛羊羊毛细度相关的SNP位点进行检测，可用于育种早期选留，将GG型和TT型纯合子个体保留下来，提高细毛羊选育准确性，在对细毛羊进行大规模分子精准育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1利用SNaPshot技术对细毛羊第14号染色体上第42678119个核苷酸位点的多态性检测结果

A为GG基因型，B为GT基因型，C为TT基因型

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有试验的实验条件如无特殊说明，均为常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明所述的SNP是单核苷酸多态性的简称，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

实施例1利用SNaPshot技术进行细毛羊羊毛细度分子标记辅助选择

1、实验材料

选取383只细毛羊为检测对象。

2、试剂及仪器

ProFlex PCR系统购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，3730XL基因测序仪购自美国ABI公司，Allegra 25R台式高速冷冻离心机购自美国Beckman公司，Micro 17R微量台式离心机购自美国Thermo公司，微量可调移液器购自德国Eppendorf公司，Taq DNA聚合酶、dNTP、ExoI酶以及FastAP酶购自加拿大Fermentas公司，Snapshot试剂盒购自美国ABI分司。

3、基因组DNA的提取

细毛羊颈静脉采血1ml，用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重新溶解于DNA溶解液。

4、SNaPshot技术进行基因分型

针对位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第14号染色体设计引物组合。

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-CTGAGACAGGCAATGATT-3’

下游引物R：5’-TTAGGAGGTGAGACTTACAT-3’

延伸引物：5’-CTGACTGACTGACTGACTGATTGTCAAGTCCCTGCTTTAC CT-3’

上述引物由武汉君诺德生物技术有限公司合成。

检测流程如下：

(1)提取待测绵羊的基因组DNA；

(2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用引物F和R，进行PCR扩增反应；

(3)用ExoI酶和FastAP酶对PCR扩增产物进行纯化；

(4)以纯化后的PCR扩增产物为模板，利用延伸引物进行延伸反应；

(5)分析延伸产物，从而对绵羊FecB基因型进行判定。

其中，PCR扩增反应使用的反应体系以15μL计为：100ng/μL基因组DNA1μL，10×PCR反应缓冲液1.5μL，1.5mmol/L MgCl2 1.5μL，200μmol/L dNTPs 0.3μL，100pmol/μL上、下游引物各0.15μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，去离子水补齐至15μL。

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃3min；95℃15s，56℃15s，72℃30s，35个循环；72℃3min。

对PCR扩增产物进行纯化，主要是用ExoI酶去除反应产物中的剩余引物，用FastAP酶去除反应中剩余的dNTP。使用的反应体系以7μL计为：PCR扩增产物3μL，10U/μL酶ExoI0.2μL，5U/μL酶FastAP 0.8μL，酶ExoI缓冲液0.7μL，去离子水补齐至7μL。反应条件为：37℃15min，80℃15min。

延伸反应使用的反应体系以6μL计为：纯化后的PCR扩增产物2μL，Snapshot Mix试剂1μL，100pmol/μL延伸引物0.1μL，去离子水补齐至6μL。

延伸反应条件为：96℃1min；96℃10s，52℃5s，60℃30s，30个循环。

取1μL延伸产物，加9μL上样HIDI，95℃变性3min，立即冰水浴，用测序仪进行测序。

5、结果分析

对位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第14号染色体上所述SNP位点进行基因分型鉴定。PCR延伸反应扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将其进行测序，获得的峰图用GeneMapper4.0软件对不同样本的基因型结果进行输出。输出结果如图1所示，其中A为GG基因型，B为GT基因型，C为TT基因型，统计不同基因型的样本数见表1，从中可以看出，GG基因型和GT基因型的细毛羊的数量显著高于TT基因型。

表1待测细毛羊第14号染色体上第42678119位点不同基因型分析统计

从群体遗传学角度对细毛羊第14号染色体所述SNP位点的基因型频率(Genotypefrequency)和等位基因频率(Gene frequency)进行分析。由表2可见，在所述SNP位点上，GT基因型频率最高，为优势基因型，G等位基因频率为66.1％，表现为优势等位基因。由χ2适应性检验表明，SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)(表1)。该位点期望杂合度为0.448，多态信息含量(polymorphism information content，简称PIC)为0.348，0.25＜PIC＜0.50，属于中度多态。

表2细毛羊第14号染色体第42678119位点SNP多态性

将不同基因型与羊毛纤维直径这一细毛羊重要的经济性状表型利用SPSS进行相关分析，结果如表3所示。从中可以看出，GG基因型和TT基因型的细毛羊的羊毛纤维直径显著小于GT基因型(p<0.05)。GG和TT基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。通过检测细毛羊第14号染色体所述SNP位点的碱基，能够判断细毛羊的羊毛纤维直径。

表3细毛羊不同基因型与羊毛纤维直径之间的相关分析

注：同一行数据间标有不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

综上所述，本发明提供了一种影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记，检测细毛羊第14号染色体上第42678119个位点的碱基；当碱基为T时，基因型为TT；当碱基为G时，基因型为GT或GG；所述GG基因型和TT基因型的细毛羊的羊毛纤维直径显著小于GT基因型(p<0.05)。GG和TT基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。本发明提供的利用SNaPshot技术检测与细毛羊羊毛纤维直径相关的核苷酸多态性的方法，该技术准确性高，检测速度快，成本低廉，并且结果判读更容易。利用本方法可对羊毛细度相关的SNP位点多态性实现自动化检测，通过对细毛羊羊毛细度相关的SNP位点进行检测，可用于育种早期选留，将GG型和TT型纯合子个体保留下来，提高细毛羊选育准确性，在对细毛羊进行大规模分子精准育种中具有潜在的应用价值

通过所述的特异性引物对和延伸引物，可以检测细毛羊的羊毛粗细形状，通过细毛羊的羊毛粗细进而筛选出细毛羊，也可以将制备含有该引物对和延伸引物的试剂盒，进而建立高效准确的分子标记辅助育种技术，采用与羊毛纤维直径性状相关的分子标记进行羊毛纤维直径优良性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选纤维直径细的细毛羊，提高品种甄选的精确度，减少细毛羊羊毛纤维直径优良性状的育种时间，降低育种成本，缩短培育周期，加快培育进程，具有很高的应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

<120> 一种影响细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 绵羊(ARIET IS.)

<400> 1

cttcacactc ccagatgtct ggctccaggt gagtgatcac actatcatgg ttatccaggt 60

cattaagata ttttttgtat agttcttctg tgtattgttg ccacctcttc ttaatatctt 120

ctgcttctgt taggtccata ccatttctgt cctttactgt gtgtcctggc aggcatcttc 180

tggccctggg aaccatctgt gtgtccctcc tagaggctgt gcagtaccag acatctgtag 240

acattctcat gactccttgc agggggctca caggcctgag cccttatctc tgatcctgct 300

gcgatcagga aatgagagcc actgctgcta acccagcagg acggtaactt ctgaccccct 360

atttgtcaac cctgctggtg ttgtgtgtca caggaaccac caatgagcct ctgtgctcct 420

aataaaagag ctgggctggg aactcctgag acaggcaatg attaaaatct caactatttt 480

gtcaagtccc tgctttacct tctggctggg gccagcagct gactctccag ggattcagtt 540

tctccaaata aaatgtaagt ctcacctcct aagacttgtt tgttgaaaaa cgagcactgg 600

tttctctggg agcagcctga tgtacatcct ttcttggaga atcagatgaa atttgctaac 660

tagaagccaa aatcacaatg taacccttaa atgaatgaag ttatagaaca aattatagat 720

ccagggacta tcctggctgt ccagtagtta agtccctgct ctttcaattc aaggggcttg 780

ggtttgatcc ctgattggga agctaagatt ccacatgccc tgcagcatgc ccaggaaaaa 840

aaaacttata gatcaagttt gcatttttca agaaaaaaat cttagaaatt gaagccacat 900

ggtgccatgg agcactgact tgagaaaacc acaccaggct ctgtaggctt tgccactaca 960

tcaccttgac cagacccttt tacccctcgt ggcctcactt t 1001

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 绵羊(ARIET IS.)

<400> 2

ctgagacagg caatgatt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 绵羊(ARIET IS.)

<400> 3

ttaggaggtg agacttacat 20

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 绵羊(ARIET IS.)

<400> 4

ctgactgact gactgactga ttgtcaagtc cctgctttac ct 42

Claims (2)

1.一种检测细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记的检测试剂在检测细毛羊羊毛粗细形状的应用，其特征在于，所述的SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第14号染色体上第42678119位点的碱基处；突变碱基为T或G。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测细毛羊羊毛纤维直径的SNP分子标记的检测试剂包括用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的特异性引物对：上 游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；和用于检测所述SNP分子标记的延伸引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

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