CN115927734A - 一种鉴定梨果实硬度的kasp分子标记及其kasp引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定梨果实硬度的KASP分子标记及其KASP引物和应用，涉及分子标记辅助育种技术领域，该KASP分子标记为qFirm，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该分子标记的KASP引物包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的3条引物。本发明提供的KASP引物可用于鉴定梨果实硬度的性状，避开肉质粗硬的后代，能够提高果肉细软的砂梨品种的选育进程，显著提高育种效率，对创制果肉细软的砂梨品种提供一个可靠的方法，促进了梨种植业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种鉴定梨果实硬度的KASP分子标记及其KASP引物和应用。
背景技术
相比其它蔷薇科植物，梨果实中含有大量的石细胞，石细胞含量较高的梨果实硬度较大、果肉粗硬，相反，石细胞含量低高的梨果实肉质细软。果实硬度直接影响梨的口感，南方早熟梨肉质细软的品种占绝对优势。例如：肉质细软的品种有：‘早生新水’、‘库尔勒香梨’等。
果肉粗硬的推广品种非常少，在育种过程中会被首先淘汰。因此在梨育种过程中培育果肉细软的品种是一个重要的研究方向。
目前关于梨果实硬度相关的SNP标记还未见报道，而梨果实硬度的鉴定难、不准确，很大程度上限制了梨果实细软株系的育种效率，影响了果实优质的梨品种的鉴别，一定程度上制约了梨种植业的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定梨果实硬度的KASP分子标记及其KASP引物和应用，可用于鉴定梨果实硬度的性状，避开肉质粗硬的后代，能够提高果肉细软的砂梨品种的选育进程，显著提高育种效率，对创制果肉细软的砂梨品种提供一个可靠的方法，促进了梨种植业的发展。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于鉴定梨果实硬度的KASP引物，该KASP引物包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的3条引物，该KASP引物可用于鉴定梨果实的硬度性状为硬或细软；
其中，该KASP引物是由位于翠冠梨参考基因组，基因组版本号为GWHBAOS00000000的GWHBAOS00000386片段上第25068229bp位置处的SNP位点开发所得，该SNP位点多态性为C/T。
本发明还提供了一种鉴定梨果实硬度的KASP分子标记，该分子标记为qFirm，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该分子标记是由上述的3条KASP引物扩增所得。
本发明提供的KASP引物可被应用于梨的育种中，包含梨果肉硬度性状的鉴定或创制果肉细软的砂梨品种。
本发明还提供了一种用于鉴定梨果实硬度的试剂盒，该试剂盒包含上述的3条KASP引物。
本发明还提供了一种鉴定梨果实硬度性状的方法，包含如下步骤：
(1)提取待测梨植株的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，利用上述的3条KASP引物进行PCR扩增；
(3)检测PCR扩增产物的荧光，当扩增产物的荧光为FAM和FAM与HEX混合型时，代表该植株的梨果实性状为硬；当表现为HEX型代表低硬度基因型，当扩增产物的荧光为HEX时，代表该植株的梨果实性状为细软。
优选地，上述步骤(2)中的PCR扩增，其PCR反应体系为10μL，包括5μL的预混液KASP-TFV4.0MasterMix，上游引物qFirm-FAM和qFirm-HEX各0.5μL，1μL的下游引物qFirm-R，1μL的基因组DNA提取液，2μL的双蒸水；其中，上述的三条引物的浓度均为10mM。
优选地，上述步骤(2)中的PCR扩增，其PCR程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃延伸60s，每个循环延伸温度下降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃延伸60s，共26个循环。
本发明提供的鉴定梨果实硬度的KASP分子标记及其KASP引物，通过梨果实硬度相关的SNP标记和可用于鉴定梨果实硬度的KASP引物，解决了梨果实硬度鉴定难、不准确等问题，从而提高了梨果细软株系的育种效率，促进了梨种植业的发展，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明中的SNP位点的QTL定位遗传图谱。
图2为本发明中的分子标记所在位点的基因序列对比结果。
图3为本发明中的KASP引物对早生新水、秋水以及部分F1杂交后代的KASP分型检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
由于目前关于梨果实硬度相关的SNP标记和可用于鉴定梨果实硬度的KASP引物还很少，梨果实硬度的鉴定困难、不准确，从而制约了果肉细软的梨品种的选育，而梨果实硬度鉴定的分子标记的开发有利用辅助选择梨果肉细软性状，可提高选择效率，缩短育种周期。
实验例1KASP分子标记引物的开发
1、构建梨果实硬度的遗传群体
使用果肉细软的‘早生新水’梨和果肉硬的‘秋水’梨进行杂交，获得120株F1代单株，种植于梨资源圃，这些梨树已经进行盛果期。
2、梨F1代果实硬度鉴定
对120株F1代单株果实在成熟期进行果实硬度测定，使用质谱仪对削皮后的梨果实硬度进行测定。
3、基于SLAF简化重测序构建遗传图谱并挖掘相关SLAF标记
使用简化重测序对双亲本(‘早生新水’、‘秋水’)和其F1代进行测序，利用SLAF标签对2017年和2018年的梨杂交后代果实硬度性状进行定位。根据两年的平均LOD值大于3，成功定位到14号连锁群上的qFirm分子标记与果实硬度相关，该qFirm分子标记的SNP位点信息为C/T，位于翠冠梨参考基因组(国家生物信息中心，https://ngdc.cncb.ac.cn/，基因组版本号：GWHBAOS00000000)GWHBAOS00000386片段上第25068229bp位置处，其QTL定位遗传图谱如图1所示，箭头处所示为该遗传位置的LOD值。该分子标记所在位点的基因序列对比结果如图2所示。其中C基因型为高硬度基因型，T基因型为低硬度基因型，基因型及表型如下表1所示。
表1后代群体的基因型对应的硬度统计结果
4、KASP引物的开发
根据KASP引物设计原则，采用Primer软件设计引物。qFirm的正向引物有2个，分别为qFirm-FAM和qFirm-HEX，反向引物为qFirm-R。其中，qFirm-FAM的5’端添加FAM修饰，qFirm-HEX的5’端添加HEX修饰，三条引物的核苷酸序列如下所示：
KASP引物序列如下(5’→3’)：
qFirm-FAM(SEQ ID NO.1)：
CAGGTCCTTGTCATTAGAGCTAACC；
qFirm-FAM(SEQ ID NO.2)：
CAGGTCCTTGTCATTAGAGCTAACT；
qFirm-R(SEQ ID NO.3)：
AGTGGCTAAATCATCTCCAAGTC。
5、表型检测
取待测试梨样品(早生新水、秋水、部分F1杂交后代)嫩叶组织500mg，液氮速冻后使用研磨机进行研磨，采用CTAB法，加入0.8mLCTAB提取缓冲液，加入16μL巯基乙醇，混匀后65℃水浴30分钟；加入等体积的24:1的氯仿/异戊醇混合液，上下颠倒混匀，然后12000rpm/min下离心1分钟，将上清转移至新的1.5mL离心管。加入等体积的异丙醇和1/10体积的醋酸钠(3M)，室温静置1小时，离心后取沉淀，使用无水酒精清洗2次后烘干。使用100μL的TE溶液进行溶解，即得基因组DNA提取液。
采用上述的3条KASP引物进行PCR扩增，其中，PCR反应体系为10μL(5μL预混液KASP-TFV4.0MasterMix，10mM的qFirm-FAM和qFirm-HEX引物各0.5μL，1μL的10mM下游引物qFirm-R，DNA提取液1μL，双蒸水2μL)。PCR程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃延伸60s，每个循环延伸温度下降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃延伸60s，共26个循环。
使用罗氏480荧光定量仪器对PCR产物中FAM和HEX荧光值进行检测，KASP分型检测结果如图3所示，当荧光值表现为FAM和FAM与HEX混合型代表高硬度基因型，此时位点的基因型分别对应为CC和CT，当表现为HEX型代表低硬度基因型，此时位点的基因型为TT。
实验例2KASP引物的验证
选择了8个梨品种，分别为早生新水、秋水、黄蜜、沪晶梨18号、翠冠、苏翠1号、早秋3、早秋7，采用实验例1中开发的qFirm分子标记的KASP引物进行KASP分型测定，具体扩增参数同上，检测其产物的荧光结果。
经测定可知，上述8个品种的KASP分型结果如下表2所示。结果显示不同品种含有不同的表型，其中秋水、黄蜜、早秋3和早秋7的分型结果是FAM、HEX混合荧光型，为高硬度表型，和实测果实的硬度吻合。其它品种的分型结果是HEX荧光型，和实测果实的硬度一致。据此可以得出本发明中的硬度关联标记可以应用于砂(果肉细软)梨的杂交群体的筛选，只要检测到果肉粗硬的基因型，其后代需要及时淘汰。本标记及其KASP引物的开发和应用可用于鉴定梨果实硬度的性状，避开肉质粗硬的后代，能够提高果肉细软的砂梨品种的选育进程，显著提高育种效率，对创制果肉细软的砂梨品种提供一个可靠的方法，促进了梨种植业的发展。
表2qFirm的KASP引物在8个品种中的分型结果
本发明提供的鉴定梨果实硬度的KASP分子标记及其KASP引物和应用具有以下优点：
由于梨杂交后代的童期长达5年，因此小苗期确定果肉硬度非常重要。本发明可快捷地获得与梨果实硬度相关联的qFirm位点的基因型。与传统的田间自然观察相比，可以在梨杂交后代小苗期鉴别出肉质细软的后代，淘汰肉质粗硬的后代。操作便捷，为梨果实细软株系的定向育种奠定基础，加快育种进程，显著提高育种效率，促进了梨种植业的发展。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (8)
1.一种用于鉴定梨果实硬度的KASP引物，其特征在于，该KASP引物包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的3条引物，该KASP引物可用于鉴定梨果实硬度性状，该性状为硬或细软；
其中，所述的KASP引物是由位于翠冠梨参考基因组，基因组版本号为GWHBAOS00000000的GWHBAOS00000386片段上第25068229bp位置处的SNP位点开发所得，所述的SNP位点多态性为C/T。
2.一种鉴定梨果实硬度的KASP分子标记，其特征在于，该分子标记为qFirm，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该分子标记是由权利要求1所述的KASP引物扩增所得。
3.如权利要求1所述的KASP引物在梨育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用包含梨果肉硬度性状的鉴定或创制果肉细软的砂梨品种。
5.一种用于鉴定梨果实硬度的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如权利要求1所述的KASP引物。
6.一种鉴定梨果实硬度性状的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)提取待测梨植株的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的KASP引物进行PCR扩增；
(3)检测PCR扩增产物的荧光，当扩增产物的荧光为FAM和FAM与HEX混合型时，代表该植株的梨果实性状为硬；当表现为HEX型代表低硬度基因型，当扩增产物的荧光为HEX时，代表该植株的梨果实性状为细软。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PCR扩增，其PCR反应体系为10μL，包括5μL的预混液KASP-TFV4.0MasterMix，上游引物qFirm-FAM和qFirm-HEX各0.5μL，1μL的下游引物qFirm-R，1μL的基因组DNA提取液，2μL的双蒸水；其中，所述三条引物的浓度为10mM。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PCR扩增，其PCR程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃延伸60s，每个循环延伸温度下降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃延伸60s，共26个循环。
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