CN107267504A - 一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果肉高石细胞含量的snp标记及其应用 - Google Patents

一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果肉高石细胞含量的snp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果肉高石细胞含量的SNP标记及其应用。一种与梨梨果肉石细胞含量的紧密相关的SNP标记Psc397‑15，引物：SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.2。利用该特异引物基于高分辨率溶解曲线可对果肉高石细胞含量进行良好分型。本发明提供的梨果肉石细胞含量分子标记引物可用于梨果肉高石细胞含量的分子标记辅助选择育种，对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

Description

一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果肉高石细胞含量的SNP 标记及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种领域，涉及一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果肉高石细胞含量的SNP标记及其应用。
背景技术
梨在我国栽培历史悠久，同时也是世界上重要的落叶果树。梨果实营养价值高,肉脆多汁，深受人们的喜爱。梨果实的食用品质一直是人们所关注的问题，它是决定梨果实经济价值的重要因素，因此提高梨的食用品质具有重要的意义。梨果实食用品质受众多因素的影响，其中石细胞是影响梨果实品质的重要因素之一。石细胞是梨果实中特有的一类厚壁细胞，它不仅影响梨果实的食用品质，而且影响其加工品质。降低梨果实石细胞的含量，对改善梨的品质至关重要。近年来，我国梨的主栽品种砀山酥梨由于品种退化或是管理不善的原因，石细胞含量增加，肉质变粗，口感多渣，严重影响了砀山酥梨的品质和经济价值。因此，优质低石细胞含量梨育种不仅成为二十一世纪国际梨育种的主要目标之一，也成为最近几年我国梨品种品质改良的热点和显著趋势。
梨新品种的选育主要以杂交选育为主，而杂交选育通常是通过表型进行的，多数控制梨果实经济性状的基因为数量性状(QTL)基因，并且梨的童期较长，利用传统的育种技术选育新的品种需要很长的时间，因此培育出品质优良、抗病、抗虫、丰产耐贮的综合性状优良的新品种具有很大困难。利用分子标记辅助选择(MAS)育种技术可以提高选择效率，加快育种步伐。SNP(single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)分子标记作第三代分子标记的代表，具有变异丰富、高度稳定且易实现高通量自动化分析等特点，是传统的分子标记无可比拟的。近年来SNP分子标记受到了分子育种和系统进化研究领域的高度关注[1,2]，在群体遗传及系统发育分析[3]、遗传图谱构建[4]和物种多样性分析[5]等方面得到广发应用，成为作物研究领域的一项重要工具。
目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些病害或生长性状，对梨果肉高石细胞含量的SNP分子标记开发应用研究尚未有报道。因此，开展梨果肉高石细胞含量的SNP分子标记开发，并建立自然群体辅助选择技术体系，对于提高育种效率，节约生产成本显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是利用梨的重测序数据信息，开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果肉高石细胞含量的SNP特异标记Psc397-15。通过该分子标记可以预测高果肉石细胞含量的梨品种，为实现梨果肉石细胞含量早期鉴定和筛选提供分子标记辅助育种的技术支持。
与梨果肉高石细胞含量紧密相关的SNP标记Psc397-15，其特征在于位于登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr5的第26607684个碱基处；该标记在低石细胞含量品种中为A，高石细胞含量品种中为G。
本发明所述的SNP标记Psc397-15在鉴定梨果肉高石细胞含量中的应用。
本发明所述的SNP标记Psc397-15在梨果肉石细胞含量早期鉴定和筛选的分子育种中的应用。
与梨果肉高石细胞含量紧密相关的SNP标记引物对，由Psc397-15-F：SEQ ID NO.1和 Psc397-15-R：SEQ ID NO.2组成。
本发明所述的SNP标记引物对在鉴定梨果肉高石细胞含量中的应用。
本发明所述的SNP标记引物对在改善梨果肉石细胞含量的分子育种中的应用。
本发明发现登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr5的第26607684个碱基处存在一个与梨果肉高石细胞含量相关的位点(Psc397-15)。Psc397-15位点在低石细胞含量品种中为A，高石细胞含量品种中为G。通过检测该位点的基因型，可以预测梨果肉石细胞含量，以实现果肉高石细胞含量的早期鉴定和筛选。
一种基于高分辨率溶解曲线筛选梨果肉高石细胞含量的方法，其特征在于采用本发明所述的SNP标记引物对对果肉石细胞含量高的对照梨品种以及待鉴定果肉石细胞含量的梨品种进行高分辨率溶解曲线分析，通过对待鉴定梨品种的高分辨率溶解曲线与上述对照梨品种的高分辨率溶解曲线的比较，鉴定该梨品种是否为果肉高石细胞含量的品种；砀山酥梨；所述的果肉石细胞含量低的对照梨品种选自：脆绿。
所述的高分辨率溶解曲线反应体系按照LightCycler 480 High ResolutionMelting Master试剂盒中的说明书进行，HRM分析在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。
高分辨率溶解曲线反应体系为20μL：含有30ng梨基因组DNA模板，1×Master Mix，2.5mmol/L MgCl2，200nM权利要求1所述的SNP标记引物对；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR)：95℃预变性10min，然后95℃变性10s、65-55℃退火10s、每循环下降 0.5℃72℃，延伸10s的程序进行45个循环；PCR循环结束后进行熔解，其程序为：95℃1min， 40℃1min，65℃1s，再从70℃连续升温至95℃，每升高0.04℃，收集荧光1次，最后降温至40℃；最后，在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。有益效果
本发明发现登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr5的第26607684个碱基处存在一个与梨果肉高石细胞含量相关的位点(Psc397-15)，通过检测该位点的基因型，可以预测梨果肉石细胞含量，以实现果肉高石细胞含量的早期鉴定和筛选。基于上述发现，申请人开发了上述位点的SNP标记引物。利用开发的SNP标记引物，对56个梨自然群体进行差异基因型检测，能很好地用于鉴定高果肉石细胞含量群体，与果实实际果肉石细胞含量相符。群体试验表明，开发的SNP标记特异引物可以对自然群体高果肉石细胞含量品种进行良好分型，因此，具有良好的应用价值，可实现对高梨果肉石细胞含量品种的预先选择和辅助育种。
附图说明
图1SNP标记Psc397-15开发的HRM特异标记引物，56个梨自然群体个体中检测的归一化平移溶解曲线，可良好分型。
(a)Psc397-15标记引物检测的归一化平移溶解曲线。
(b)检测个体的排列，A1-C6为高石细胞含量群体，E1-G2低石细胞含量群体。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1 石细胞含量的测定
石细胞的分离称量参照Tao等(2009)的方法进行[6]。将果实去皮去核并取100g果肉加蒸馏水打浆，再用蒸馏水稀释匀浆液，搅拌后于室温下静置30min，弃去漂浮物，沉淀物重新悬浮于0.5mol/L盐酸中30min，弃去漂浮物，用蒸馏水洗涤。重复以上步骤直至石细胞与其他细胞碎片分离，烘干后称量。56个梨自然群体花后35天果肉石细胞含量见表1。
表1 56个梨自然群体花后35天果肉石细胞含量
注：序号1-30为高石细胞含量品种，31-56为低石细胞含量品种。
实施例2 利用SNP标记位点Psc397-15开发HRM特异引物
从砀山酥梨全基因组数据库中搜索出第5条染色体上SNP标记Psc397-15的DNA序列，选取的该位点前后300bp的序列，依据引物设计原则，开发设计SNP标记引物(表2)。利用设计的SNP标记引物在砀山酥梨的基因组DNA上进行PCR扩增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小。
表2 SNP标记引物
实施例3 利用HRM(high-resolution melting，高分辨率溶解曲线)技术对梨果肉石细胞含量进行分型
HRM反应体系按照LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。20μL反应体系：含有30ng梨基因组DNA模板，1×Master Mix，2.5mmol/L MgCl2，200nM权利要求1或2所述的引物；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR)：95℃预变性10min，然后95℃变性10s、65-55℃ (每循环下降0.5℃)退火10s、72℃延伸10s的程序进行45个循环。PCR循环结束后进行熔解，其程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，再从70℃连续升温至95℃，每升高0.04℃，收集荧光1次，最后降温至40℃。最后，在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
利用实施例2得到的SNP标记引物对56个梨自然群体进行HRM分析(图1)。
Psc397-15引物分型结果：
线型1—红色曲线，18个体线型相似，其中16个体为低果肉石细胞含量；线型2—蓝色曲线，25个体线型相似，其中24个体为低果肉石细胞含量；线型3—绿色曲线，10个体线型相似，为杂合基因型，其中9个体为低果肉石细胞含量；线型4—粉色曲线，3个体线型相似，PCR产物中存在其他SNP位点，其中3个体为高果肉石细胞含量。统计分析表明，56个个体分型为四种基因型，分离比例为18：25：9：3。根据Psc397-15引物分型结果将56个自然群体果肉石细胞含量生理数据进行Fisher’s exact test(p-value＝9.43E-11)。
因此，通过对梨花后35天果肉石细胞含量的生理性状测定结果与HRM分型结果的比较分析，证明Psc397-15标记的基因型与果肉石细胞含量有关，能很好地用于检测梨果肉高石细胞含量个体。
主要参考文献
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2.Rafalski A:Applications of single nucleotide polymorphisms in cropgenetics.Current Opinion in Plant Biology 2002,5(2):94-100.
3.Monk D,Arnaud P,Apostolidou S,Hills FA,Kelsey G,Stanier P,Feil R,Moore GE:SNPs in ecology,evolution and conservation.Trends in Ecology&Evolution 2004,19(4):208-216.
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5.Sattarzadeh A,Achenbach U,Lübeck J,Strahwald J:Single nucleotidepolymorphism(SNP) genotyping as basis for developing a PCR-based markerhighly diagnostic for potato varieties with high resistance to Globoderapallida pathotype Pa2/3.Molecular Breeding 2006,18(4):301-312.
6.Tao S,Khanizadeh S,Zhang H,Zhang S:Anatomy,ultrastructure andlignin distribution of stone cells in two Pyrus species.Plant Science 2009,176(3):413-419。

Claims (9)

1.与梨果肉高石细胞含量紧密相关的SNP标记Psc397-15，其特征在于位于登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr5的第26607684个碱基处；该标记在低石细胞含量品种中为A，高石细胞含量品种中为G。
2.权利要求1所述的SNP标记Psc397-15在鉴定梨果肉高石细胞含量中的应用。
3.权利要求1所述的SNP标记Psc397-15在梨果肉石细胞含量早期鉴定和筛选的分子育种中的应用。
4.与梨果肉高石细胞含量紧密相关的SNP标记引物对，其特征在于由Psc397-15-F：SEQID NO.1和Psc397-15-R：SEQ ID NO.2组成。
5.权利要求1所述的SNP标记引物对在鉴定梨果肉高石细胞含量中的应用。
6.权利要求1所述的SNP标记引物对在梨果肉石细胞含量早期鉴定和筛选的分子育种中的应用。
7.一种基于高分辨率溶解曲线筛选梨果肉高石细胞含量的方法，其特征在于采用权利要求4所述的SNP标记引物对对果肉石细胞含量高的对照梨品种以及待鉴定果肉石细胞含量的梨品种进行高分辨率溶解曲线分析，通过对待鉴定梨品种的高分辨率溶解曲线与上述对照梨品种的高分辨率溶解曲线的比较，鉴定该梨品种是否为果肉高石细胞含量的品种；其中所述的果肉石细胞含量高的对照梨品种选自：砀山酥梨；所述的果肉石细胞含量低的对照梨品种选自：脆绿。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的高分辨率溶解曲线反应体系按照LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂盒中的说明书进行，HRM分析在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于高分辨率溶解曲线反应体系为20μL：含有30ng梨基因组DNA模板，1×Master Mix，2.5mmol/L MgCl2，200nM权利要求4所述的SNP标记引物对；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR)：95℃预变性10min，然后95℃变性10s、65-55℃退火10s、每循环下降0.5℃72℃，延伸10s的程序进行45个循环；PCR循环结束后进行熔解，其程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，再从70℃连续升温至95℃，每升高0.04℃，收集荧光1次，最后降温至40℃；最后，在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
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