CN110643720A - 一种快速检测山羊adipoq基因snp的方法及专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测山羊ADIPOQ基因SNP的方法及专用试剂盒。以山羊全基因组DNA为模板，PCR扩增山羊ADIPOQ基因部分片段；PCR产物经限制性内切酶AvaII消化后，进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定山羊ADIPOQ基因14059C>T的单核苷酸多态性位点的基因型。本发明针对山羊ADIPOQ基因的单核苷酸多态性位点，可以在DNA水平上检测与山羊体斜长和体高密切相关的分子标记，从而用于山羊的辅助选择和分子育种，加快山羊良种繁育速度。

Description

一种快速检测山羊ADIPOQ基因SNP的方法及专用试剂盒

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及山羊基因单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记的检测，特别涉及一种山羊ADIPOQ基因SNP的分型方法及应用。

背景技术

作为第三代分子标记，SNP标记在分子遗传学、药物遗传学、法医学等方面发挥着重要作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，即基因组中单个核苷酸的突变而引起的DNA序列的多态性，它以单个碱基的颠换、转换、插入和缺失等形式存在。根据SNP在基因中的位置，SNP可分为基因编码区SNP(coding SNP，cSNP)、基因周边SNP(peripheral SNP,pSNP)，以及基因间SNP(intronic SNP,iSNP)三类。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为两种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP)，即SNP引起的编码序列的改变并不影响其翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变通常是导致生物性状改变的直接原因。

目前SNP的检测方法大致可以分为两类：一类是以单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DDGE)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的检测方法；另一类是以直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(HRM)等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法。而PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)法是一种准确而又操作简便的方法，也是目前通用的鉴别SNP位点的基因型的方法，其主要利用限制性内切酶对扩增目的片段进行切割，然后进行凝胶电泳，并分析基因型信息。PCR-RFLP解决了传统的PCR-SSCP方法对DNA序列变异不能精确定位、对实验条件要求严格的问题，同时将PCR与RFLP相结合，也避免了RFLP检测周期长、成本额高昂、不适于大规模分子育种等缺陷。

脂联素(ADIPOQ)是一种脂肪细胞因子，最初认为脂联素蛋白只在脂肪组织中表达，但后续研究发现在骨骼肌、大脑、肝脏、血管内皮等组织中也有表达。脂联素参与葡萄糖和脂肪代谢、调节能量稳态、改善胰岛素抵抗及减缓氧化应激等生理过程。Scherer等首先在小鼠3T3-L脂肪细胞mRNA反转录为cDNA后的测序过程中发现了该基因。进一步研究发现小鼠脂联素基因位于16号染色体的B3-B4，全长约20Kb。目前，国内外对ADIPOQ基因的研究多集中在多态性检测、序列分析和组织表达上，且研究对象多为鹅、鸭、牛等，对山羊的研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测山羊ADIPOQ基因SNP的方法及专用试剂盒，从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

以待测山羊个体的全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，通过PCR扩增ADIPOQ基因的部分片段，将扩增产物经限制性内切酶AvaII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定山羊个体ADIPOQ基因的单核苷酸多态性位点的基因型；所述山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性位点为山羊ADIPOQ基因参考基因组序列NC_030808.1的14059C>T单核苷酸突变位点。

优选的，所述14059C>T单核苷酸突变位点位于引物对P扩增的区域内，引物对P的序列为：

上游引物F1：5’-GGTTAAGCTTCTTTACCACAGAGTG-3’

下游引物R1：5’-CTTCCACACTGACCGAAGTC-3’

优选的，所述PCR的扩增反应体系为：10ng/μL模板DNA 1μL、10pmol/L的引物对P对应的上、下游引物各0.5μL以及2×Taq PCR StarMix 5μL和ddH₂O 3μL。

优选的，所述PCR的扩增反应程序为：94～95℃预变性5min；94～95℃变性30s，54.1℃退火30s，72℃延伸25～60s，35个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述限制性内切酶AvaII的酶切体系为：PCR扩增产物5μL、1×NEBuffer0.5μL、AvaII(10～50U/μL)0.1μL，及ddH₂O 4.4μL；酶切条件为：37℃水浴锅中消化40～60min。

优选的，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

优选的，根据琼脂糖凝胶电泳结果判定山羊ADIPOQ基因14059C>T(山羊ADIPOQ基因参考基因组序列NC_030808.1)单核苷酸突变位点的碱基多态性为：CC基因型表现为46bp和272bp的两条条带，CT基因型表现为272bp、46bp和318bp的三条条带，TT基因型表现为318bp的一条条带。

上述检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述山羊ADIPOQ基因参考基因组序列NC_030808.1的14059C>T单核苷酸突变位点CT和TT基因型可做为山羊生长性状(体高和体斜长)早期选择的分子育种基因标记。

一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的试剂盒，包括上述引物对P，以及限制性内切酶AvaII。

本发明的有益效果体现在：

本发明针对山羊ADIPOQ基因参考基因组序列NC_030808.1的14059C>T单核苷酸突变位点(为SNP位点)，可通过PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶进行酶切，根据凝胶电泳分析即可获得关于该位点的基因分型结果，方法简便、分型时间短，并且该位点的特定基因型可作为提高山羊生长性状的分子标记，从而通过检测山羊个体快速建立遗传性状优良的山羊种群。

进一步的，通过PCR反应条件、反应体系，及酶切体系等方法参数的优化，显著提高了检测特异性和准确率、提高了检测速度。

附图说明

图1为山羊ADIPOQ基因14059C>T的测序图(反向测序)；框内为该位点发生的突变。

图2为山羊ADIPOQ基因14059C>T PCR扩增片段的电泳图；泳道M1为Marker。

图3为山羊ADIPOQ基因14059C>T PCR产物经AvaII酶切后电泳结果；泳道M1为Marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

实验室的山羊基因组重测序结果表明，山羊ADIPOQ基因中存在多态性，查阅文献可知，ADIPOQ基因在脂肪酸合成代谢方面有着重要作用，但本发明在对突变位点进行基因型检测、基因频率分析及与三个山羊品种的重要生长性状关联分析基础上，发现山羊ADIPOQ基因参考基因组序列NC_030808.1的14059C>T单核苷酸突变位点的多态性与山羊生长性状密切关联，并验证其可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记位点，可为山羊分子育种提供重要依据，也预示着ADIPOQ基因中存在的多态性位点对山羊的生长发育具有调控作用。最终，本发明建立了利用PCR-RFLP方法对山羊ADIPOQ基因14059C>T位单核苷酸突变位点(验证为SNP位点)进行检测的方法。

一、山羊ADIPOQ基因部分序列的克隆及其多态性检测

1.样本采集及基因组DNA提取

(1)血样的采集(信息见表1)

表1.血样采集信息

(2)全血(基因组)DNA的提取

①室温解冻冷冻血样(主要为血细胞)，用移液枪吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000rpm离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。

②在上述离心管中加入500μL DNA抽提缓冲液，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μL蛋白酶K混匀，继续消化直至澄清。

④取出样品加入200μL的6mol/L NaCl，口底摇动15次使其充分混匀，4℃、12000rpm离心10min，取上清液至2.0mL离心管中。

⑤加入Tris-饱和酚1mL，放置冰上温和摇动20min，使其充分混匀；4℃、12000rpm离心10min，将上层水相用移液器转入另一灭菌2.0mL离心管中。

⑥加入0.5mL的Tris-饱和酚和0.5mL的氯仿，在冰上温和摇动20min；4℃、12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌2.0mL离心管中。

⑦加入1mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃、12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌1.5mL离心管中。

⑧加入1mL预冷无水乙醇(-20℃)，轻扣底部摇晃多次至DNA 析出，然后-20℃放置30min；取出后，4℃、12000rpm离心10min，弃去乙醇。

⑨加入70％乙醇1mL，温和摇动10min；然后4℃、12000rpm离心10min，弃去乙醇；重复漂洗一次。

⑩室温下敞口放置15min，之后放入60℃烘箱30s使乙醇挥发干净；加入超纯水50μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

用紫外光分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值以及其DNA含量。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至10ng/μL。

2.扩增引物设计

本发明通过对NCBI数据库中山羊ADIPOQ基因序列的检索，确定以山羊ADIPOQ基因序列(NC_030808.1)为参考选取合适的设计引物片段，具体利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含山羊ADIPOQ基因第一内含子的PCR引物对P，其引物序列如下：

上游引物F1：5’-GGTTAAGCTTCTTTACCACAGAGTG-3’25nt

下游引物R1：5’-CTTCCACACTGACCGAAGTC-3’20nt

3.PCR扩增

PCR反应体系如表2所示。

表2.PCR反应体系

PCR反应程序如表3所示。

表3.PCR反应程序(引物对P)

4.PCR产物测序验证

将扩增的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。对山羊ADIPOQ基因目的片段测序结果与参考序列进行比对(图1)，发现存在于血样基因组中的山羊ADIPOQ基因14059C>T突变(NC_030808.1的第14059位，存在于引物对P扩增区域内，且具有自然酶切位点)。

5.PCR产物酶切及RFLP检测

提取待测山羊血样基因组DNA，对于PCR扩增(引物对P)后的产物(图2)首先利用限制酶AvaII进行酶切，然后根据电泳结果判定个体的基因型，并验证突变位点的多态性(SNP)。

10μL AvaII酶切体系及条件为：PCR产物5μL，1×NEBuffer 0.5μL，ApaII(50U/μL)0.1μL，及ddH₂O 4.4μL，37℃水浴锅中消化40～60min。

电泳：制作2.5％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，点样后120V电压下电泳40min，待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像。根据电泳条带的图像，判断基因型。

由于引物对P扩增产物不含其它的酶切位点，因此，山羊ADIPOQ基因14059C>T多态性为：CC基因型表现为46bp和272bp的两条条带，CT基因型表现为272bp、46bp和318bp的三条条带，TT基因型表现为318bp的一条条带。但因46bp片段过小，条带无法显示出来，故CC基因型只能看到272bp一条条带，CT基因型只能看到272bp和318bp的两条条带，TT基因型看到318bp的一条条带(图3)。

二、山羊ADIPOQ基因SNP位点的频率统计及其与生长性状的关联分析

1.基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一位点的各种基因型之间的比率。计算公式如下：

P_BB＝N_BB/N

其中P_BB代表某一位点的BB基因型频率；N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：

P_B＝(2N_BB+N_Bb1+N_Bb2+N_Bb3+N_Bb4+……+N_Bbn)/2N

式中，P_B表示等位基因B频率，N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数量，NBbi表示群体中具有Bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因B的n个互不相同的复等位基因。各品种山羊种群的基因频率与基因型频率的统计结果如表4所示。

表4.山羊ADIPOQ基因第14059位SNP群体遗传学分析

2.相关分析统计模型

利用SPSS(20.0)软件分析基因位点与生长性状的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响体重等生长发育指标的因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Gj为各位点的基因型效应；Eijk为随机误差。

利用上述方法对相关数据进行统计，结果见表5。

表5.山羊ADIPOQ基因第14059位不同基因型与生长性状的关联性分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)

结果表明，在山羊ADIPOQ基因组的14059C>T单核苷酸多态性位点(参考序列NC_030808.1)上的不同基因型与山羊生长性状关联分析表明：该位点C到T的碱基突变对体高和体斜长影响显著，且CT型和TT型的山羊个体显著高于CC型。这说明ADIPOQ基因的这一突变位点(14059C>T)的等位基因T与山羊的生长性状(体高和体斜长)密切相关，因此，14059C>T位点中，CT和TT基因型可作为山羊生长性状早期选择的分子育种基因标记。

<110> 铜仁学院

<120> 一种快速检测山羊ADIPOQ基因SNP的方法及专用试剂盒

<160> 2

<210>1

<211>25

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

ggttaagctt ctttaccaca gagtg 25

<210>2

<211>25

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

cttccacact gaccgaagtc 20

Claims (10)

1.一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增ADIPOQ基因的部分片段，将扩增产物经限制性内切酶AvaII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性位点的基因型，所述山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性位点为山羊ADIPOQ基因参考基因组序列NC_030808.1的14059C>T单核苷酸突变位点。

2.如权利要求1所述一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述ADIPOQ基因的部分片段包含14059C>T单核苷酸突变位点，扩增该片段的引物对为：

上游引物F1：5’-GGTTAAGCTTCTTTACCACAGAGTG-3’

下游引物R1：5’-CTTCCACACTGACCGAAGTC-3’。

3.如权利要求1所述一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述PCR的扩增反应体系包括10ng/μL模板DNA 1μL以及10pmol/L的上、下游扩增引物各0.5μL。

4.如权利要求1所述一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述PCR采用的扩增反应程序为：94～95℃预变性5min；94～95℃变性30s，54.1℃退火30s，72℃延伸25～60s，35个循环；72℃延伸10min。

5.如权利要求1所述一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

6.如权利要求1所述一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性位点的电泳鉴定结果为：CC基因型表现为46bp和272bp的两条条带，CT基因型表现为272bp、46bp和318bp的三条条带，TT基因型表现为318bp的一条条带。

7.一种如权利要求1所述的检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性位点的CT和TT基因型为山羊生长性状早期选择的分子育种基因标记。

9.一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：包括基于PCR-RFLP法对位于山羊ADIPOQ基因参考基因组序列NC_030808.1的14059C>T单核苷酸突变位点进行基因分型的扩增引物对，以及限制性内切酶AvaII。

10.根据权利要求9所述一种检测山羊ADIPOQ基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：所述扩增引物对的序列为：

上游引物F1：5’-GGTTAAGCTTCTTTACCACAGAGTG-3’

下游引物R1：5’-CTTCCACACTGACCGAAGTC-3’。

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