CN104593494B - 猪初生重性状相关plac1基因分子标记的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪初生重性状相关PLAC1基因分子标记的克隆及应用。所述的分子标记是从影响胎儿正常发育的胎盘特异表达基因PLAC1中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，在该序列的73bp处有一个C\T等位基因突变，该突变导致HhaI-RFLP多态性。本发明公开了该分子标记的具体应用。

Description

猪初生重性状相关PLAC1基因分子标记的克隆及应用

技术领域

本发明属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪初生重性状相关PLAC1基因分子标记的克隆及应用。所述的分子标记从猪PLAC1基因中克隆得到，它包括猪PLAC1基因编码区序列突变位点的检测方法与应用。

背景技术

在养猪生产过程中，如何达到使母猪多产以及仔猪多活、快长从而提高生产性能、降低生产成本成了养猪生产者关注的焦点，因此猪繁殖性状越来越受到人们的重视。

猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，对猪出生后的生长速度及成活率具有重要的作用。最近有很多文献报道了初生重对猪出生后生长速度的影响。Beaulieu等(BeaulieuAD等，Impactofpigletbirthweight,birthorderandlittersizeonsubsequentgrowthperformance,carcassquality,musclecompositionandeatingqualityofpork[J].JAnimSci.2010)和Poore等(PooreK.R.等，Theeffectsofbirthweightandpostnatalgrowthpatternsonfatdepthandplasmaleptinconcentrationsinjuvenileandadultpigs.J.Physiol.2004)研究发现，初生重较低的猪生长速度较慢，从而使其进入市场的时间增加。另有研究表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在1.0Kg以下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1.0Kg以上时仔猪育成率没有明显的规律。初生重小于等于0.5Kg时仔猪育成率仅为55.56％(高建国.二花脸猪初生重对出生后生长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992，24(1)：26)，Gondret,F.L.等(Gondret,F.L.等，Lowbirthweightisassociatedwithenlargedmusclefiberareaandimpairedmeattendesnessofthelongissimusmuscleinpigs.J.Anim.Sci.2006)和Wolter等(Wolter,B.F.等Theeffectofbirthweightandfeedingofsupplementmilkreplacertopigletsduringlactationonpreweaningandpostweaninggrowthperformanceandcarcasscharacteristic.J.Anim.Sci.2002)研究报道称，猪出生重与出生后早期的生长速度相关，初生重小的胎儿初生重大的胎儿更虚弱，出生后需要更好地环境条件来保证它的存活。

胎盘是保证胎儿健康发育的重要场所，母体营养物质都要通过胎盘转运给胎儿。猪胎盘是上皮绒毛膜型胎盘，胎儿侧的胎盘滋养层上皮不会嵌入母体子宫内膜基质内，而是与子宫腔上皮相互粘附，并随着妊娠的进行形成褶皱(Miles,J.R.等MolecularcloningandcharacterisationofheparanasemRNAintheporcineplacentathroughoutgestation.ReprodFertilDev.2009)。胎盘褶皱的形成与发育可以大大增加母体与胎儿营养物质交换的面积，即增加胎盘传输营养物质的效率(Vallet,J.等Developmentofthepigplacenta.SocReprodFertilSuppl.2009；Linjun,H.等ExpressionofHeparanaseIsAssociatedwithBreed-SpecificMorphologicalCharactersofPlacentalFoldedBilayerBetweenYorkshireandMeishanPigs.BiolReprod.2014)，而充足的营养物质是保证胎儿健康发育的基础，营养物质供给不足会导致胎儿发育迟缓，并降低胎儿的初生重，严重者甚至会导致胎儿死亡。因此胎盘褶皱的形成与发育对胎儿初生重具有重要影响。

PLAC1基因是在人、小鼠等哺乳动物胎盘中特异表达的基因，近期的研究表明PLAC1基因在妊娠过程中对胎盘滋养层上皮细胞的迁移、运动具有重要作用(Wen-Lin,C.等Roleofplacenta-specificprotein1inthetrophoblastsinvasionandmigration.Reproduction.2014)，从而增大滋养层与母体子宫接触的面积，增加营养物质的运输，有利于胎儿健康发育。另外有研究发现，敲除PLAC1基因会导致胎盘肥大和胎儿宫内发育迟缓(IUGR)，胎儿往往于妊娠后期或分娩后不久死亡，说明PLAC1基因是正常的胎盘和胚胎发育所必需的(Jackman,S.M.等Plac1(Placenta-specific1)IsEssentialforNormalPlacentalandEmbryonicDevelopment.MolReprodDev.2012)。

常规的育种技术对猪繁殖性状的改良进展缓慢，效果不明显，而且选择过程花费时间长，耗费资金多，准确性有待提高(Linville,R.C.等Candidategeneanalysisforlociaffectinglittersizeandovulationrateinswine.JAnimSci.2001)。分子生物学技术的迅速发展使得猪的育种工作出现了新的曙光，目前，标记辅助选择(MAS)已经成功应用到国内外的猪育种实践中，取得了巨大的经济效益，凭借这一技术手段，育种工作者们发掘出了一大批与猪的初生重，生长速度，断奶重，产仔数等重要的繁殖性状有着显著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提高。

鉴于PLAC1基因在妊娠过程中对胎盘滋养层上皮细胞的迁移发挥重要作用，我们认为它很可能在猪妊娠过程中对胎盘滋养层上皮细胞参与形成胎盘褶皱发挥着重要作用，进而影响猪胎盘对营养物质的运输效率，从而对胎儿初生重具有重要影响。研究基因突变位点在群体中的多态性，并对其进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段，所以申请人对这个基因进行了多态性研究和关联分析，以期能够发现它对猪繁殖性状的影响。

发明内容

发明的目的在于获得一种与猪初生重性状相关的分子标记，克隆PLAC1基因编码区序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪初生重性状检测提供一种分子标记和方法。

本发明的技术方案如下：

一种分子标记HhaI-RFLP在猪初生重性状关联分析中的应用，其步骤如下所述：

1)用人PLAC1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性高的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪妊娠95天胎盘组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为5’-TCCTCTTCCGCCAATCCC-3’，反向引物为5’-GCCATCAGAAATTTATTTTCTCTC-3’(见序列表SEQIDNO：5，6)，用RT－PCR方法扩增猪PLAC1基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列(即cDNA序列)；

2)根据SEQIDNO：2所示的核苷酸序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：正向引物：5＇-CTGCTACGACGTGTTCACCTT-3＇，反向引物：5＇-AGCACAGGCTACCCATAAGAG-3＇(见序列表SEQIDNO：3，4)，扩增猪基因组DNA，将PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列：

CTGCTACGACGTGTTCACCTTGTCTCAGGCCGGCCGAAGGCCCACCTGCCACTGTCCGCCCTATGTCTTCAGRGCAGGCGGGCGTACTTAGCCCTGCGGGCCCAGGCGGGGGCTCGGGAGGGCCACCTGTGCAGTAGTCTTCCTTCCTTTATACTTCTGACGATGAATCTCTTCTCTCGGGTGATCTGGCTGAGTCCAGGGATCCCCGGGCTTGGGGGGCTCCTGTACTTGCCCTTTCTGAAATTGGTATATACTAGGGACTAATCCGTGCTCTTGTGGCCCTCTTATGGGTAGCCTGTGCT

上述序列中的R是C或T，导致HhaI-RFLP多态性；

3)检测目的基因PLAC1mRNA在猪胎盘的绒毛膜组织样中转录水平的表达，设计用于检测目的基因PLAC1mRNA表达水平的引物对以及作为内参基因GAPDH的引物对，其核苷酸序列分别如下所示：

扩增目的基因PLAC1的引物对：

正向引物：5'GAAACCTCCACCAGACAGC3'，(见序列表SEQIDNO：7)

反向引物：5'CCGTGACCATGAGCCAGT3'，(见序列表SEQIDNO：8)

扩增内参基因GAPDH的引物对的DNA序列如下：

正向引物：5'CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTG3'，(见序列表SEQIDNO：9)

反向引物：5'GATGACAAGCTTCCCGTTCTCC3'；(见序列表SEQIDNO：10)

4)PLAC1基因组织表达谱分析；

5)定位PLAC1基因的mRNA在猪胎盘组织的表达位置；

6)应用PCR-RFLP方法对序列表SEQIDNO：1的第73位碱基进行检测，然后进行基因型与猪初生重性状的关联分析。

SNP发现与检测方法建立：申请人设计了扩增包含该SNP的引物，经分析T/C位点的突变可以采用HhaI进行酶切检测多态性。在扩增的302bp的片段上，存在一个HhaI的酶切位点，电泳检测结果显示在PLAC1基因的T/C位点存在3中基因型，CC型(228bp、74bp)，TC型(302bp、228bp、74bp)，TT型(302bp)。酶切电泳结果证实了PLAC1基因CDS区该突变位点的存在。

同时通过荧光定量PCR检测了PLAC1基因在大白猪妊娠的第26天、50天和95天胎盘组织样中转录水平的表达情况，结果表明(如图3所述)，PLAC1基因在胎盘褶皱形成初期(妊娠26天)表达量较低，随着妊娠的进行，表达量逐渐增高，在妊娠末期(妊娠95天)仍具有较高的表达量。组织表达谱结果表明PLAC1基因只在猪胎盘组织中特异表达(如图4所述)。另外通过原位杂交实验表明PLAC1基因mRNA只在胎盘滋养层上皮细胞中表达，在胎盘基质细胞以及子宫中都不表达，其杂交模式在梅山与大白猪中没有显著区别(图5所示)。由杂交信号的强弱程度可以看出，在妊娠26天，PLAC1基因mRNA的杂交信号较弱，表明其表达量较低，而在妊娠50天和95天杂交信号都很强，表明其表达量在这两个时期都很强，这与定量的结果相一致。PLAC1基因在猪胎盘组织中的时期特异性表达说明其在胎盘发育及功能中有重要作用，很可能与促进猪胎盘褶皱的发育有关。

附图说明

序列表SEQIDNO：1是本发明制备的分子标记的核苷酸序列，序列全长为302bp，在该序列的第73bp处有一个C/T突变，该突变导致HhaI-RFLP多态性(其中序列表SEQIDNO：1中73bp处的碱基已经由C突变为T)。

序列表SEQIDNO：2是扩增的PLAC1基因的cDNA序列，序列全长为1106bp。

序列表SEQIDNO：3-10是设计的引物序列(这些引物序列与说明书正文中的序列说明是一致的)。

图1：是本发明PLAC1基因的分子标记的制备流程图。

图2：本发明中猪PLAC1基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段，即本发明制备的分子标记(下划线部分为引物，英文字母R代表突变位点，等位基因的突变以R(C/T)表示。

图3：猪胎盘组织PLAC1mRNA表达量qPCR检测结果(纵坐标表示目的基因PLAC1mRNA转录水平的相对表达量，横坐标表示大白猪的不同妊娠时间)。

图4：猪PLAC1基因组织表达谱分析结果图。图中1-12泳道分别代表PLAC1基因在猪心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏，肌肉，十二指肠，胃，脂肪，淋巴结，子宫内膜，胎盘组织中的表达情况，13泳道为空白对照。

图5：猪胎盘组织中PLAC1mRNA定位结果。附图标记说明：红色为杂交的阳性信号，红色信号越强表示mRNA的表达量越高。Y26d，大白猪妊娠26天；Y50d，大白猪妊娠50天；Y95d，大白猪妊娠95天；NC，阴性对照。图片通过荧光显微镜(尼康ECLIPSETE2000-S，日本)拍摄，bar＝100μm。

图6：本发明中猪PLAC1基因HhaI-RFLP的三种基因型(TTTCCC)电泳结果。图中M：DNA分子量标准(markerI,购自宝生物工程大连有限公司，即Takara公司)。

具体实施方式

实施例1PLAC1基因的克隆

(1)引物设计

用人PLAC1基因cDNA(GenBank收录号：NM_021796.3)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计一对引物，其核苷酸序列如下所述：

PLAC1：正向引物：5＇-CACAGAGAAACCTCCACCAGA-3＇，

反向引物：5＇-GCCACAAGAGCACGGATTAGT-3＇。

(2)PCR产物的克隆和测序

将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5mlEpendorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，于37℃振荡培养45min。取100μl上述LB涂布于异丙基硫代－β-D－半乳糖苷(IPTG)X-gal的琼脂平板上，于37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2－3mlLB中，于37℃，300r/min培养过夜。用1.5mlEP管12000r/min离心30秒收集菌体制备少量质粒。将验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定委托武汉擎科伟业生物技术有限公司完成，得到一条长度为如SEQIDNO：2所示的cDNA序列，其长度为1106bp，包含了PLAC1基因全部的CDS区。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

实施例2PLAC1基因在胎盘组织中mRNA表达量的荧光定量检测

(1)猪胎盘组织样品采集

选取纯种大白猪青年母猪(来自华中农业大学精品猪场)为研究对象，在妊娠的第26天、50天、95天(每个时期的妊娠母猪各3头)分别进行屠宰采集猪胎盘组织样品。

(2)组织总RNA的提取

猪胎盘组织样品的总RNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(货号：DP431)，具体操作步骤详见该试剂盒说明书。提取的RNA用Thermoscientific公司的NanoDrop2000核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度。

(3)第一链cDNA的合成

在DEPC处理过的无RNase污染的的0.2mL的离心管中加入2μg的总RNA与0.4μg的oligo(dT)引物和0.1μg的随机引物，70℃温育5min以解开总RNA的二级结构，迅速置于冰上以防二级结构复性。然后依次加入：10μL5×反转录缓冲液，2.5μL10mmol/LdNTPmix，1μLRNaseinhibitor，1.5μLM-MLV反转录酶(200U/μL)，用无核酸酶水(万分之一的DEPC水，通过高温高压灭菌)将终体积补至50μL，混匀离心后于37℃温育10min，42℃温育50min，在85℃温育5min以灭活反转录酶。反转录后的cDNA可于－20℃保存3个月。

(4)用于荧光定量PCR检测的引物设计

用已克隆的猪PLAC1基因mRNA序列(见序列表SEQIDNO：2)，和从NCBI的Genebank下载目的内参基因GAPDH(GenBank收录号：NM_001206359.1)的mRNA序列，采用primer5.0设计引物，其核苷酸序列分别如下所述：

目的基因PLAC1的引物对：

正向引物：5'GAAACCTCCACCAGACAGC3'，

反向引物：5'CCGTGACCATGAGCCAGT3'，

内参基因GAPDH的引物对：

正向引物：5'CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTG3'，

反向引物：5'GATGACAAGCTTCCCGTTCTCC3'；

利用Mfold网站验证引物的特异性9http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)。

(5)荧光定量检测

反应体系(总体积)为20μl，其中cDNA各0.5μl，SYBRgreenIMix10μl,正、反向引物各0.3μM，余下体积用灭菌纯净水补足。样品在96孔板混合均匀后直接放入Roche实时定量PCR仪(型号Roche410)上进行扩增反应，反应程序为95℃3min，40个循环，94℃20s，60℃30s，72℃20s，最后做融解曲线从55℃－90℃每分钟上升0.5℃。

(6)定量PCR数据分析

目的基因PLAC1的各个样品都与内参基因GAPDH的引物同时扩增，反应的相对量以目标基因PLAC1与内参基因GAPDH的Ct值(取三个重复的平均值)的差值ΔCt计算，再选取ΔCt最大作为参照，用其它样品的ΔCt减去参照ΔCt得到ΔΔCt。最后各基因的相对表达水平用PfaffI(MichaelW.Pfaffl，Anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timeRT–PCR，2001)方法计算，具体公式如下：

$\mathrm{ratio}=\frac{\left(E_{t\arg \mathrm{et}}\right){\mathrm{\ΔCP}}_{t\arg \mathrm{et}}(\mathrm{control}-\mathrm{sample})}{\left(E_{\mathrm{ref}}\right){\mathrm{\ΔCP}}_{\mathrm{ref}}(\mathrm{control}-\mathrm{sample})}$

(7)荧光定量PCR结果

结果表明(如图3所述)，PLAC1基因在胎盘褶皱形成初期(妊娠26天)表达量较低，随着妊娠的进行，表达量逐渐增高，在妊娠末期(妊娠95天)仍具有较高的表达量，说明PLAC1基因在胎盘发育及功能中有重要作用，很可能与促进猪胎盘褶皱的发育有关。

实施例3组织表达谱分析发现PLAC1基因只在猪胎盘组织中特异表达

(1)大白猪各组织样品采集及总RNA提取

收集妊娠95天大白猪母猪的心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏，肌肉，十二指肠，胃，脂肪，淋巴结，子宫内膜，胎盘组织样品。总RNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(货号：DP431)，具体操作步骤详见该试剂盒说明书。提取的RNA用Thermoscientific公司的NanoDrop2000核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度。

(2)第一链cDNA的合成

在DEPC处理过的无RNase污染的的0.2mL的离心管中加入2μg的总RNA与0.4μg的oligo(dT)引物和0.1μg的随机引物，70℃温育5min以解开总RNA的二级结构，迅速置于冰上以防二级结构复性。然后依次加入：10μL5×反转录缓冲液，2.5μL10mmol/LdNTPmix，1μLRNaseinhibitor，1.5μLM-MLV反转录酶(200U/μL)，用无核酸酶水(万分之一的DEPC水，通过常规的高温高压灭菌)将终体积补至50μL，混匀离心后于37℃温育10min，42℃温育50min，在85℃温育5min以灭活反转录酶。反转录后的cDNA可于－20℃保存3个月。

(3)RT-PCR结果

RT-PCR所用的PLAC1和GAPDH引物对与实施例2中所用的引物对相同。PCR产物跑胶结果显示PLAC1基因只在猪胎盘组织中表达，而在猪其它主要组织中未发现有表达(如图4所述)。初步判定PLAC1基因为猪胎盘特异表达基因。

实施例4原位杂交检测显示PLAC1基因mRNA只在猪胎盘组织中的滋养层上皮细胞中表达

(1)样品采集

采集大白猪妊娠第26天、50天和95天的猪胎盘组织样，切成1cm×2cm组织块，浸泡在4％的多聚甲醛溶液中24h-48h。

(2)石蜡切片制作

1)水洗：将上步得到的猪胎盘组织置于脱水盒中，流水冲洗约12h。

2)脱水：将上步处理后的猪胎盘组织放在脱水盒中依次用梯度浓度(50％(2h)，70％，(过夜)80％(2h)，95％(2h)，100％I(2h)，100％II(2h))酒精脱水至100％无水乙醇；

3)透明：将上步处理后的猪胎盘组织经过1：1(体积比)的无水乙醇二甲苯和二次二甲苯透明各一小时。

4)浸蜡与包埋：将上步处理得到的已透明的猪胎盘组织块投入熔化的石蜡内进行包埋。

5)切片：切片厚度6微米；56℃水浴展片，用多聚赖氨酸处理过的玻片捞片,然后放入30℃温箱。

(3)原位杂交

为了确定PLAC1基因mRNA在猪胎盘组织中的原位表达位置，采用Affymetrix公司(美国)提供的viewRNA试剂盒(QuantiGeneViewRNAISHTissueAssayKit,Catalog:QVT0012；QuantiGeneViewRNATYPE1ProbeSet,Catalog:VX1-99999-01)具体操作步骤详见该试剂盒说明书；同时也可以参考Honkavuori和Lee,K.,etal等的报道(Honkavuori,K.S.,etal.,NovelPicornavirusinTurkeypoultswithhepatitis,California,USA.EmergInfectDis,2011.17(3):480-7.和Lee,K.,etal.,PrecursormiR-886,anovelnoncodingRNArepressedincancer,associateswithPKRandmodulatesitsactivity.RNA,2011.17(6):1076-89.)中的主要步骤。

(4)猪胎盘组织中PLAC1基因mRNA定位结果

PLAC1基因mRNA只在胎盘滋养层上皮细胞中表达，在胎盘基质细胞以及子宫中都不表达(图5所示)。

实施例5PCR-RFLP诊断方法的建立

(1)引物序列：

正向引物：5＇-CTGCTACGACGTGTTCACCTT-3＇

反向引物：5＇-CTCTTATGGGTAGCCTGTGCT-3＇

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2UTaqDNA聚合酶(购自Promega公司)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，54℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到302bp特异扩增片段，该片段位于CDS区(编码区)(如图2和序列表SEQIDNO:1所示的序列)。测序的结果发现在该302bp片段中存在一个HhaI酶切位点(GCG↓C)，其中第73bp处为多态性位点，位于外显子3中。

(3)PCR-RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶HhaI为0.3μl(10U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第73bp位置是T时，则该HhaI酶切位点不存在，HhaI酶切后检测结果只有1个片段，长度是302bp(定为等位基因T)；但存在T73→C73替换时，其结果导致第74bp处一个HhaI酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为228bp和74bp(定为等位基因C)，三种基因型CC、TT、TC(如图6所述)。

(4)本发明的分子标记在猪初生重标记性状关联分析中的应用

关联分析所用的实验猪群来自江苏省农业科学院的苏钟猪，包括113头母猪，公猪51头，共记录371窝数据。繁殖性状取自猪场2007～2009年的繁殖记录资料，记录的繁殖性状包括产活仔数(NBA)、总产仔数(TNB)、窝平初出生重(BW)和断奶重(WW)等。提取血样基因组DNA的方法按照常规苯酚/氯仿抽提法(参考J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等翻译的分子克隆实验指南第三版(2002)，科学出版社，463-470页)，其具体步骤如下所述：

第一步：过夜消化：2ml(苏钟母猪)全血+2ml裂解液(Tris/EDTA/SDS)+20μl蛋白酶k，55℃，摇床水浴，过夜消化。

第二步:酚仿醇抽提

1)Tris-饱和酚抽提

4mlTris-饱和酚，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

2)重复抽提

4mlTris-饱和酚，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

3)酚仿醇抽提

4ml酚/仿/醇(体积比为25：24：1)，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

4)氯仿/异戊醇抽提

4ml酚/氯仿(体积比为24：1)，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

5)沉淀DNA

4ml无水乙醇，轻微震荡，析出絮状DNA，-20℃放置1h-3h。

6)洗涤DNA

用剪口黄枪头将DNA吸至1.5ml离心管中，加入1-1.5ml75％乙醇，洗涤，离心(4℃，3000rpm，5min)，弃乙醇。

7)重复洗涤

加入1-1.5ml75％乙醇，洗涤，离心(4℃，3000rpm，5min)，弃乙醇。

8)自然晾干。

对苏钟猪PLAC1基因Hhal-RFLP多态性位点进行性状关联分析，结果见表3-2，该突变位点在113个个体中，有80个CC基因型的个体，有28个TC基因型的个体，有5个TT基因型的个体。采用SAS软件对该突变位点的多态性进行性状关联分析，发现该突变位点的多态与窝平均初生重有显著影响(P<0.05)，其中CC基因型个体的窝平均初生重显著高于TC基因型个体的对应值，TT基因型居中。

采用SAS软件对该突变位点的多态性进行性状关联分析，具体模型如下：

Y＝μ+gene_i+month_j+parity_k++sire_l+sow(sire)_lm+TNB+ε_ijklm

Y为性状值，μ为总体均数，其中固定效应：gene为基因型，month为仔猪出生所在的月份效应；parity为胎次效应；随机效应：sire为公猪效应，sow(sire)_lm为公猪内母猪效应，TNB为总产仔数效应协变量，ε为随机误差。

由表1可知，PLAC1基因SNP位点对窝平均初生重有显著影响(P<0.05)，其中CC基因型个体的窝平均初生重显著高于TC基因型个体的对应值，TT基因型居中。因此可以看出TC基因型个体的窝平均初生重较低。

表1.胎盘特异表达基因(PLAC1)SNP性状关联分析结果

注：表1中性状值为平均数±标准误，P<0.05代表有显著性差异。

Claims (4)

1.一种与猪初生重相关性状检测的分子标记，其特征在于，该分子标记的核苷酸序列如下所示：

CTGCTACGACGTGTTCACCTTGTCTCAGGCCGGCCGAAGGCCCACCTGCCACTGTCCGCCCTATGTCTTCAGRGCAGGCGGGCGTACTTAGCCCTGCGGGCCCAGGCGGGGGCTCGGGAGGGCCACCTGTGCAGTAGTCTTCCTTCCTTTATACTTCTGACGATGAATCTCTTCTCTCGGGTGATCTGGCTGAGTCCAGGGATCCCCGGGCTTGGGGGGCTCCTGTACTTGCCCTTTCTGAAATTGGTATATACTAGGGACTAATCCGTGCTCTTGTGGCCCTCTTATGGGTAGCCTGTGCT

上述序列中的R是C或T，导致HhaI-RFLP多态性。

2.一种检测如权利要求1所述分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：CTGCTACGACGTGTTCACCTT，

反向引物：AGCACAGGCTACCCATAAGAG。

3.一种分子标记在猪初生重性状关联分析中的应用，其特征包括:

1)用人PLAC1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性高的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪妊娠95天胎盘组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为TCCTCTTCCGCCAATCCC，反向引物为GCCATCAGAAATTTATTTTCTCTC，用RT-PCR方法扩增猪PLAC1基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；

2)根据SEQIDNO：2所示的核苷酸序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：正向引物：CTGCTACGACGTGTTCACCTT，反向引物：AGCACAGGCTACCCATAAGAG,扩增猪基因组DNA，将PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列：

CTGCTACGACGTGTTCACCTTGTCTCAGGCCGGCCGAAGGCCCACCTGCCACTGTCCGCCCTATGTCTTCAGRGCAGGCGGGCGTACTTAGCCCTGCGGGCCCAGGCGGGGGCTCGGGAGGGCCACCTGTGCAGTAGTCTTCCTTCCTTTATACTTCTGACGATGAATCTCTTCTCTCGGGTGATCTGGCTGAGTCCAGGGATCCCCGGGCTTGGGGGGCTCCTGTACTTGCCCTTTCTGAAATTGGTATATACTAGGGACTAATCCGTGCTCTTGTGGCCCTCTTATGGGTAGCCTGTGCT

上述序列中的R是C或T，导致HhaI-RFLP多态性；

3)检测目的基因PLAC1mRNA在猪胎盘的绒毛膜组织样中转录水平的表达，设计用于检测目的基因PLAC1mRNA表达水平的引物对以及作为内参基因GAPDH的引物对，其核苷酸序列分别如下所示：

扩增目的基因PLAC1的引物对如下：

正向引物：GAAACCTCCACCAGACAGC，

反向引物：CCGTGACCATGAGCCAGT；

扩增内参基因GAPDH的引物对如下：

正向引物：CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTG，

反向引物：GATGACAAGCTTCCCGTTCTCC；

4)对PLAC1基因的组织表达谱进行分析；

5)定位PLAC1基因的mRNA在猪胎盘组织的表达位置；

6)应用PCR-RFLP方法对序列表SEQIDNO：1的第73位碱基进行检测，然后进行基因型与猪初生重性状的关联分析。

4.权利要求2所述引物对在猪初生重分子标记辅助选择中的应用。