CN107604079A - 一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法，具体为：提取泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。上述引物序列为：L6312：5’‑TCCTCTAGCAGGCAACTTAG‑3’；H6558：5’‑CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA‑3’。有益效果为：本发明通过比对扩增序列与分子标记来鉴别鉴别泰国多鳞鱚隐存种和多鳞鱚，序列长度为254bp，存在11个碱基的差异，表现为9个颠换，2个转换，特征明显；该鉴别方法简单，鉴定结果稳定，可重复性强，表现出高度的一致性。

Description

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及 方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法。

背景技术

泰国多鳞鱚隐存种发现于泰国普吉岛近海，隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属。其外部形态与多鳞鱚极为相似：体呈长圆柱形，略侧扁，口小，开于吻端，上下颌骨和犁骨具带状细齿，但口盖骨、腭骨及舌上均无齿。主鳃盖骨小，有一短棘；前鳃盖骨后缘垂直，平滑或略有锯齿，下缘水平。体被小形栉鳞；颊部具鳞2~3列，皆为圆鳞；侧线完全，一条，略弯曲。第一背鳍具XI硬棘，第二背鳍具I硬棘及21~22软条，臀鳍具II硬棘及21~22软条，具69~72侧线鳞；脊椎骨数34。体背部青灰色，头部背侧深色，腹侧白色；体侧侧线下部时有由黑色小点组成的模糊条带。第一及第二背鳍淡黄色，密布黑色小点；腹鳍和臀鳍黄白色，臀鳍带黑点；尾叉浅，近截形；尾鳍深褐色至深灰色。目前还未有用于鉴定该多鳞鱚隐存种的方法，该种的其它研究也未见报道。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分该多鳞鱚隐存种和多鳞鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

线粒体DNA控制区（又称D-环区，displacement loop region）是线粒体DNA中的一段非编码区，它位于t RNA-Pro和t RNA-Phe之间，是整个mt DNA基因组序列碱基组成和长度变异最大的区域。由于受到选择压力较小，因此积累了较多的突变，如碱基替换、插入、缺失，以及众多的串联重复序列而形成了多态性。因而理论上，线粒体控制区是突变速率最快的序列。被广泛用于群体遗传结构、鱼类遗传多样性的变异分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够准确高效地鉴别泰国多鳞鱚隐存种和多鳞鱚，引物长度适当，与模板的序列紧密互补，鉴别方法简单，易于掌握，准确性高，鉴定结果稳定，可重复性强的鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记，具体标记序列为：

泰国多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：

CCCATGCAGGTGCTTCCGTTGACCTCACTATCTTCTCCCTGCACTTAGCAGGGATTTCATCAATTCTAGGGGCAATCAACTTCATCACGACAATCATTAACATGAAACCTCCTGCAACTTCCCAATACCAAACCCCACTGTTTGTATGGTCCGTCTTAATTACGGCTGTTCTCCTCCTCCTTTCACTCCCCGTACTCGCAGCCGGAATCACCATGCTTCTCACAGATCGAAACCTGAACACCACC；

多鳞鱚的分子标记序列为：

CCCATGCAGGAGCTTCCGTTGACCTTACTATCTTCTCCCTGCACTTAGCAGGGATTTCATCAATTTTAGGAGCAATCAACTTTATCACAACAATCATTAACATGAAACCTCCTGCAACTTCCCAGTACCAAACCCCACTGTTTGTATGGTCCGTCTTAATTACAGCTGTTCTCCTCCTCCTTTCACTGCCTGTACTCGCAGCCGGAATCACCATGCTTCTCACAGATCGAAATCTGAACACCACC。上述多鳞鱚隐存种和多鳞鱚存在11个碱基的差异，表现为9个颠换，2个转换，表现为32个颠换，6个转换。其结果稳定，可重复性强，能够准确高效低鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，引物序列为：

L6312：5’-TCCTCTAGCAGGCAACTTAG-3’；

H6558：5’-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3’。上述引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，且延伸温度小于74℃，有利于扩增反应的进行。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，具体步骤为：

提取泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。该步骤依赖于酶促反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

优选的，PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul、10×buffer 2.5ul、dNTPs2ul、rTaq 0.15ul、模板1ul、Primer各1ul。

优选的，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，72℃最后延伸10min，4℃保存∞。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响rTaq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少，所得的分子标记序列稳定一致。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过比对分子标记来鉴别鉴别泰国多鳞鱚隐存种和多鳞鱚，序列长度为254bp，存在11个碱基的差异，表现为9个颠换，2个转换，特征明显，能够准确高效地鉴别泰国多鳞鱚隐存种和多鳞鱚；该鉴别方法简单，鉴定结果稳定，可重复性强，泰国多鳞鱚隐存种的扩增结果一致，表现出高度的一致性，可以作为泰国多鳞鱚隐存种和多鳞鱚的种质区分的分子标记；该引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，且延伸温度小于74℃，有利于扩增反应的进行。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记，具体标记序列为：选用广西北海沿海多鳞鱚样品与泰国普吉岛多鳞鱚隐存种组成多鳞鱚样本群和多鳞鱚隐存种样本群，两个样本群体的DNA。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，引物序列为：

L6312：5’-TCCTCTAGCAGGCAACTTAG-3’；

H6558：5’-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3’。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，具体步骤为：

提取泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板，以引物进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。

上述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul、10×buffer 2.5ul、dNTPs 2ul、rTaq 0.15ul、模板1ul、Primer各1ul。

上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，72℃最后延伸10min，4℃保存∞。

泰国多鳞鱚隐存种与广西北海沿海多鳞鱚mtDNA COI基因254bp序列排序结果如下：

PJD CCCATGCAGG TGCTTCCGTT GACCTCACTA TCTTCTCCCT GCACTTAGCA

BHD ********** A********* *****T**** ********** **********

Ruler........10.........20.........30.........40.........50

PJD GGGATTTCAT CAATTCTAGG GGCAATCAAC TTCATCACGA CAATCATTAA

BHD ********** *****T**** A********* **T*****A* **********

Ruler .......60.........70.........80.........90.........100

PJD CATGAAACCT CCTGCAACTT CCCAATACCA AACCCCACTG TTTGTATGGT

BHD ********** ********** ****G***** ********** **********

Ruler........110........120........130........140........150

PJD CCGTCTTAAT TACGGCTGTT CTCCTCCTCC TTTCACTCCC CGTACTCGCA

BHD ********** ***A****** ********** *******G* T*********

Ruler .......160........170........180........190.........200

PJD GCCGGAATCA CCATGCTTCT CACAGATCGA AACCTGAACA CCACC

BHD ********** ********** ********** **T******* *****

Ruler........210........220........230........240....245

其中“*”表示相同的碱基序列位点，PJD泰国普吉岛多鳞鱚隐存种；BHD为广西北海沿海多鳞鱚样品。

由泰国多鳞鱚隐存种和广西北海沿海多鳞鱚mtDNA COI基因254bp序列排序结果可以看出：泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚存在38个碱基的差异，表现为32个颠换，6个转换。

实施例2：

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记，具体标记序列为：选用福建东山沿海采集的样品与泰国普吉岛多鳞鱚隐存种组成多鳞鱚样本群和多鳞鱚隐存种样本群，两个样本群体的DNA。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，引物序列为：

L6312：5’-TCCTCTAGCAGGCAACTTAG-3’；

H6558：5’-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3’。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，具体步骤为：

提取泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板，以引物进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。

上述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul、10×buffer 2.5ul、dNTPs 2ul、rTaq 0.15ul、模板1ul、Primer各1ul。

上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，72℃最后延伸10min，4℃保存∞。

泰国多鳞鱚隐存种与福建东山沿海采集的样品mtDNA COI基因254bp序列排序结果如下：

PJD CCCATGCAGG TGCTTCCGTT GACCTCACTA TCTTCTCCCT GCACTTAGCA

DSD ********** A********* *****T**** ********** **********

Ruler.........10.........20.........30.........40.........50

PJD GGGATTTCAT CAATTCTAGG GGCAATCAAC TTCATCACGA CAATCATTAA

DSD ********** *****T**** A********* **T*****A* **********

Ruler........60.........70.........80.........90.........100

PJD CATGAAACCT CCTGCAACTT CCCAATACCA AACCCCACTG TTTGTATGGT

DSD ********** ********** ****G***** ********** **********

Ruler........110........120........130........140........150

PJD CCGTCTTAAT TACGGCTGTT CTCCTCCTCC TTTCACTCCC CGTACTCGCA

DSD ********** ***A****** ********** *******G* T*********

Ruler........160........170........180........190.........200

PJD GCCGGAATCA CCATGCTTCT CACAGATCGA AACCTGAACA CCACC

DSD ********** ********** ********** **T******* *****

Ruler........210........220........230........240....245

其中“*”表示相同的碱基序列位点，PJD泰国普吉岛多鳞鱚隐存种；DSD为福建东山沿海采集的样品。

由泰国多鳞鱚隐存种和广西北海沿海多鳞鱚mtDNA COI基因254bp序列排序结果可以看出：泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚存在38个碱基的差异，表现为32个颠换，6个转换。

实施例3：

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记，具体标记序列为：选用海南八所沿海多鳞鱚样品与泰国普吉岛多鳞鱚隐存种组成多鳞鱚样本群和多鳞鱚隐存种样本群，两个样本群体的DNA。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，引物序列为：

L6312：5’-TCCTCTAGCAGGCAACTTAG-3’；

H6558：5’-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3’。

一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，具体步骤为：

提取泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板，以引物进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。

上述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul、10×buffer 2.5ul、dNTPs 2ul、rTaq 0.15ul、模板1ul、Primer各1ul。

上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，72℃最后延伸10min，4℃保存∞。

泰国多鳞鱚隐存种与海南八所沿海多鳞鱚mtDNA COI基因254bp序列排序结果如下：

PJD CCCATGCAGG TGCTTCCGTT GACCTCACTA TCTTCTCCCT GCACTTAGCA

BSD ********** A********* *****T**** ********** **********

Ruler........10.........20.........30.........40.........50

PJD GGGATTTCAT CAATTCTAGG GGCAATCAAC TTCATCACGA CAATCATTAA

BSD ********** *****T**** A********* **T*****A* **********

Ruler.........60.........70.........80.........90.........100

PJD CATGAAACCT CCTGCAACTT CCCAATACCA AACCCCACTG TTTGTATGGT

BSD ********** ********** ****G***** ********** **********

Ruler........110........120........130........140........150

PJD CCGTCTTAAT TACGGCTGTT CTCCTCCTCC TTTCACTCCC CGTACTCGCA

BSD ********** ***A****** ********** *******G* T*********

Ruler........160........170........180........190.........200

PJD GCCGGAATCA CCATGCTTCT CACAGATCGA AACCTGAACA CCACC

BSD ********** ********** ********** **T******* *****

Ruler........210........220........230........240....245

其中“*”表示相同的碱基序列位点，PJD泰国普吉岛多鳞鱚隐存种；BSD为海南八所沿海多鳞鱚样品。

由泰国多鳞鱚隐存种和海南八所沿海多鳞鱚mtDNA COI基因254bp序列排序结果可以看出：泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚存在38个碱基的差异，表现为32个颠换，6个转换。

由实施例1-3的测序结果表明，泰国多鳞鱚隐存种的10尾样品与多鳞鱚的3个地点采集的15尾样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 245

<212> DNA

<213> 泰国多鳞鱚隐存种(Sillago sihama )

<400> 1

cccatgcagg tgcttccgtt gacctcacta tcttctccct gcacttagca gggatttcat 60

caattctagg ggcaatcaac ttcatcacga caatcattaa catgaaacct cctgcaactt 120

cccaatacca aaccccactg tttgtatggt ccgtcttaat tacggctgtt ctcctcctcc 180

tttcactccc cgtactcgca gccggaatca ccatgcttct cacagatcga aacctgaaca 240

ccacc 245

<210> 2

<211> 245

<212> DNA

<213> 多鳞鱚(Sillago sihama )

<400> 2

cccatgcagg agcttccgtt gaccttacta tcttctccct gcacttagca gggatttcat 60

caattttagg agcaatcaac tttatcacaa caatcattaa catgaaacct cctgcaactt 120

cccagtacca aaccccactg tttgtatggt ccgtcttaat tacagctgtt ctcctcctcc 180

tttcactgcc tgtactcgca gccggaatca ccatgcttct cacagatcga aatctgaaca 240

ccacc 245

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成L6312(Saccharum)

<400> 3

tcctctagca ggcaacttag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成H6558(Saccharum)

<400> 5

cctcctgcag ggtcaaagaa 20

Claims (5)

1.一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记，其特征在于：所述标记序列为：

泰国多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：

CCCATGCAGGTGCTTCCGTTGACCTCACTATCTTCTCCCTGCACTTAGCAGGGATTTCATCAATTCTAGGGGCAATCAACTTCATCACGACAATCATTAACATGAAACCTCCTGCAACTTCCCAATACCAAACCCCACTGTTTGTATGGTCCGTCTTAATTACGGCTGTTCTCCTCCTCCTTTCACTCCCCGTACTCGCAGCCGGAATCACCATGCTTCTCACAGATCGAAACCTGAACACCACC；

多鳞鱚的分子标记序列为：

CCCATGCAGGAGCTTCCGTTGACCTTACTATCTTCTCCCTGCACTTAGCAGGGATTTCATCAATTTTAGGAGCAATCAACTTTATCACAACAATCATTAACATGAAACCTCCTGCAACTTCCCAGTACCAAACCCCACTGTTTGTATGGTCCGTCTTAATTACAGCTGTTCTCCTCCTCCTTTCACTGCCTGTACTCGCAGCCGGAATCACCATGCTTCTCACAGATCGAAATCTGAACACCACC。

2.一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，其特征在于：所述引物序列为：

L6312：5’-TCCTCTAGCAGGCAACTTAG-3’；

H6558：5’-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3’。

3.一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，其特征在于：所述鉴别方法的具体步骤为：提取泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板，以引物进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。

4.根据权利要求3所述的一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul、10×buffer 2.5ul、dNTPs 2ul、rTaq 0.15ul、模板1ul、Primer各1ul。

5.根据权利要求3所述的一种鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，其特征在于：所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，72℃最后延伸10min，4℃保存∞。