CN107541556A - 一种鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物及方法 - Google Patents

Abstract

一种鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物及方法，分子标记引物的引物序列为：L5979：5’‑TTTAGTATTCGGAGCCTGAG‑3’；H6241：5’‑CCTCAACACCTGATGAGGCC‑3’；所述的方法包括：提取波斯湾鱚与砂鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于0.5％；所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性40sec，50℃退火40sec，72℃延伸40sec，进行38个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。

Description

一种鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物及方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物及方法，属于分子生物技术领域。

背景技术

波斯湾鱚隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属，目前仅在阿拉伯海及巴基斯坦近海有分布。其外部形态与砂鱚极为相似：第一背鳍具XII硬棘，第二背鳍具I硬棘及19-20软条，臀鳍具II硬棘及18-20软条，具73-77侧线鳞；脊椎骨数37-39。波斯湾鱚体呈长圆柱形，略侧扁，头部至体背侧土褐色至淡黄褐色，腹侧灰黄色，腹部近于白色。各鳍透明。波斯湾鱚同砂鱚一样，皆为巴基斯坦近海重要的经济鱼种。其肉质细腻鲜美，具有很高的食用价值。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分波斯湾鱚和砂鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种方法操作简单，易于掌握，准确性高，有助于解决鱚属鱼类种质混杂问题的鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物及方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：一种鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物，所述引物序列为：

L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；

H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。

一种利用所述分子标记引物鉴别波斯湾鱚与砂鱚的方法，该方法包括：

提取波斯湾鱚与砂鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于0.5％；

所述波斯湾鱚的分子标记序列为：

CAGGAATAGTAGGCACAGCCCTAAGCTTGCTTATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCCCTGCTTGGAGACGACCAAATCTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCTTTCGTAATGATTTTCTTTATAGTAATACCTATCCTAATTGGCGGGTTTGGCAATTGACTAGTCCCTCTAATGATCGGAGCTCCCGACATAGCATTCCCCCGAATGAACAATATGAGTTTCTGGCTCCTCCCCCCTTCTTTCCTACTTCTCCT；

所述砂鱚的分子标记序列为：

CAGGTATAGTAGGCACAGCCTTGAGCCTACTAATCCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCCCTACTTGGGGACGACCAGATCTACAACGTAATTGTTACGGCACATGCTTTCGTAATAATTTTTTTTATGGTCATGCCAATCCTAATTGGAGGGTTCGGAAATTGACTTGTCCCCCTAATGATCGGGGCTCCTGACATAGCCTTCCCTCGGATAAATAATATAAGCTTCTGATTACTTCCGCCATCCTTTCTCCTCCTCCTT；

本发明所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；

PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性40sec，50℃退火40sec，72℃延伸40sec，进行38个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。

本发明与现有技术相比的有益效果：由波斯湾鱚和砂鱚mtDNA COI基因262bp序列排序结果可以看出波斯湾鱚与砂鱚存在43个碱基的差异，表现为12个颠换，31个转换；其结果稳定，可重复性强。26尾波斯湾鱚(巴基斯坦群体)的扩增结果一致，表现出高度的一致性；因此基于COI基因的碱基差异可以作为波斯湾鱚和砂鱚的种质区分的分子标记；同时，鉴别方法简单。

具体实施方法

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

一种鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物，所述引物序列为：

L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；

H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。

一种利用所述分子标记引物鉴别波斯湾鱚与砂鱚的方法，该方法包括：

提取波斯湾鱚与砂鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于0.5％；

所述波斯湾鱚的分子标记序列为：

CAGGAATAGTAGGCACAGCCCTAAGCTTGCTTATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCCCTGCTTGGAGACGACCAAATCTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCTTTCGTAATGATTTTCTTTATAGTAATACCTATCCTAATTGGCGGGTTTGGCAATTGACTAGTCCCTCTAATGATCGGAGCTCCCGACATAGCATTCCCCCGAATGAACAATATGAGTTTCTGGCTCCTCCCCCCTTCTTTCCTACTTCTCCT；

所述砂鱚的分子标记序列为：

CAGGTATAGTAGGCACAGCCTTGAGCCTACTAATCCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCCCTACTTGGGGACGACCAGATCTACAACGTAATTGTTACGGCACATGCTTTCGTAATAATTTTTTTTATGGTCATGCCAATCCTAATTGGAGGGTTCGGAAATTGACTTGTCCCCCTAATGATCGGGGCTCCTGACATAGCCTTCCCTCGGATAAATAATATAAGCTTCTGATTACTTCCGCCATCCTTTCTCCTCCTCCTT；

本发明所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；

PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性40sec，50℃退火40sec，72℃延伸40sec，进行38个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。

实施例1：选用巴基斯坦沿岸波斯湾鱚、砂鱚样本，组成波斯湾鱚样本群和砂鱚样本群，提取2个样本群体的DNA，然后以所提取的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。

所述的引物序列为L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’；所述的PCR扩增的反应体系组成为：

0.2ml离心管中依次加入：

PCR扩增程序为94℃预变性5min，(94℃变性40sec，50℃退火40sec，72℃；延伸40sec)×38个循环，72℃延伸10min，4℃保存∞。对PCR产物进行纯化后测序，并对个群体的测序结果进行比对。

由波斯湾鱚和砂鱚mtDNA COI基因262bp序列排序结果可以看出波斯湾鱚与砂鱚存在43个碱基的差异，表现为12个颠换，31个转换。

波斯湾鱚和砂鱚的mtDNA COI基因262bp序列比对结果为：

其中“*”表示相同的碱基序列位点。PKC：巴基斯坦沿岸砂鱚样品；PKA：巴基斯坦沿岸波斯湾鱚样品。

测序结果表明，26尾波斯湾鱚样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。

Claims (3)

1.一种鉴别波斯湾鱚与砂鱚的分子标记引物，其特征在于所述引物序列为：

L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；

H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。

2.一种利用权利要求1所述分子标记引物鉴别波斯湾鱚与砂鱚的方法，其特征在于该方法包括：

提取波斯湾鱚与砂鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于0.5％；

所述波斯湾鱚的分子标记序列为：

CAGGAATAGTAGGCACAGCCCTAAGCTTGCTTATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCCCTGCTTGGAGACGACCAAATCTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCTTTCGTAATGATTTTCTTTATAGTAATACCTATCCTAATTGGCGGGTTTGGCAATTGACTAGTCCCTCTAATGATCGGAGCTCCCGACATAGCATTCCCCCGAATGAACAATATGAGTTTCTGGCTCCTCCCCCCTTCTTTCCTACTTCTCCT；

所述砂鱚的分子标记序列为：

CAGGTATAGTAGGCACAGCCTTGAGCCTACTAATCCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCCCTACTTGGGGACGACCAGATCTACAACGTAATTGTTACGGCACATGCTTTCGTAATAATTTTTTTTATGGTCATGCCAATCCTAATTGGAGGGTTCGGAAATTGACTTGTCCCCCTAATGATCGGGGCTCCTGACATAGCCTTCCCTCGGATAAATAATATAAGCTTCTGATTACTTCCGCCATCCTTTCTCCTCCTCCTT。

3.根据权利要求2所述鉴别波斯湾鱚与砂鱚的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；

PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性40sec，50℃退火40sec，72℃延伸40sec，进行38个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。