CN117089624A - 一种小黄鱼全基因组snp液相芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小黄鱼全基因组SNP液相芯片及其应用,涉及生物技术领域。所述小黄鱼全基因组SNP液相芯片包括一种探针组合,所述探针组合用于鉴别SNP位点组合中各SNP位点的基因型。本发明提供的小黄鱼全基因组SNP液相芯片,其SNP位点在全基因组染色体均匀分布,覆盖度高,能够应用于小黄鱼生长和抗病等重要经济性状基因组选择育种,采用本发明的小黄鱼全基因组SNP液相芯片,可以快速地对小黄鱼样品进行基因分型,应用于基因组选择育种,有助于缩短小黄鱼育种周期,加快小黄鱼新品种选育进程。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种小黄鱼全基因组SNP液相芯片及其应用。
背景技术
DNA分子标记(Molecular Markers)是分子育种的重要基础。通过分子标记,可以对水产动物进行遗传多样性分析、遗传结构和种质资源的鉴定,在重要水产动物中筛选出重要性状相关的功能基因,快速识别优良种质,实现基于分子标记辅助选择的遗传改良。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)具有数量众多、检测准确度高等特点,是目前使用最为普遍的分子标记。SNP分型检测技术主要以全基因组重测序技术和SNP芯片检测技术为主。全基因组重测序技术能获取最为全面的基因组变异信息,但操作流程繁琐、数据分析复杂,若应用于个体数较多的大规模分析,测序和运算成本相对较高。为了降低成本和数据量,基于对部分位点或区域进行分型的SNP芯片出现并广泛应用。SNP芯片主要包括固相芯片和液相芯片。其中固相芯片根据芯片上的标记序列与基因组杂交后荧光显色信号鉴定基因信息。基于靶向测序基因型检测(Genotyping By Target Sequencing,GBTS)的液相芯片,利用针对靶点附近区域设计的生物素标记的探针,并与基因组杂交后进行扩增、建库、二代测序,实现对基因组关键区域分型。与固相芯片相比,液相芯片检测位点灵活性较强、分型成本较低,不仅能对靶点进行分型,对该点周围位于探针覆盖范围内的其他位点也可以进行分型。液相芯片已在水稻、玉米等作物,猪、鸡等家畜家禽以及水产动物中开发液相芯片50余套,在物种进化分析、种质资源评价与DNA指纹鉴定、分子遗传图谱构建、基因/QTL定位和基因克隆、分子标记辅助选择、全基因组选择等方面已经有着较为成熟的应用。
小黄鱼(Larimichthys polyactis)隶属于鲈形目,石首鱼科、黄鱼属。由于长期的捕捞压力和海洋环境变化,近年来小黄鱼野生群体资源结构遭到严重破坏,表现为个体小型化、性成熟提前等种质衰退现象。小黄鱼的人工繁殖于2015年取得成功,随后突破苗种规模化繁育,实现网箱规模化养殖,成活新兴的海水养殖对象。但是目前,小黄鱼养殖过程中个体间生长差异大、病害问题较为严重,快速生长和抗病良种严重匮乏,阻碍了小黄鱼产业化健康快速发展,迫切需要开展良种选育,获得性状优良的小黄鱼新品种。因此,运用高效的分子育种技术方法,快速识别优良种质、培育性状优良的新品种,实现小黄鱼经济性状遗传改良和良种选育的跨越式发展,是促进小黄鱼养殖业发展的重要途径。为了提高小黄鱼选择育种的效率,亟需开发一种覆盖全基因组、通量高、灵活性高、单个标记数据成本低的小黄鱼全基因组SNP芯片,以满足小黄鱼优良新品种培育的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种小黄鱼全基因组SNP液相芯片及其应用,以解决上述现有技术存在的问题,该小黄鱼全基因组SNP液相芯片中的SNP位点在全基因组染色体均匀分布,覆盖度高,能够应用于小黄鱼生长和抗病等重要经济性状基因组选择育种,采用本发明的小黄鱼全基因组SNP液相芯片,可以快速地对小黄鱼样品进行基因分型,应用于基因组选择育种,有助于缩短小黄鱼育种周期,加快小黄鱼新品种选育进程。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种用于小黄鱼全基因组基因分型检测的SNP位点组合,包括如表3所示的SNP位点。
本发明还提供上述的SNP位点组合在制备小黄鱼全基因组SNP液相芯片中的应用。
本发明还提供上述的SNP位点组合在小黄鱼基因组选择育种中的应用。
本发明还提供一种小黄鱼全基因组SNP液相芯片,所述小黄鱼全基因组SNP液相芯片包括一种探针组合,所述探针组合用于鉴别上述的SNP位点组合中各SNP位点的基因型。
本发明还提供上述的小黄鱼全基因组SNP液相芯片在小黄鱼基因组选择育种中的应用。
本发明还提供一种小黄鱼全基因组基因分型检测的方法,包括以下步骤:
(1)获取得到待检小黄鱼样本的基因组DNA;
(2)利用上述的小黄鱼全基因组SNP液相芯片对所述基因组DNA进行检测,获得原始数据;
(3)对所述原始数据进行数据分析,得到基因分型结果。
本发明公开了以下技术效果:
本发明提供了一种用于小黄鱼全基因组分型的分子标记组合,包括100,031个SNP位点。该100,031个SNP位点是在高通量测序获得高质量小黄鱼基因组序列基础上,将不同海区小黄鱼野生群体和浙江地区小黄鱼养殖群体的重测序数据比对至小黄鱼参考基因组后,进行过滤、评估获得,同时囊括生长、性别、耐高温、多不饱和脂肪酸和必需氨基酸组分含量等性状显著相关位点。本发明利用上述分子标记组合构建基因组选择育种液相芯片,芯片位点在全基因组染色体上均匀分布,覆盖度高。采用本发明制备的小黄鱼全基因组SNP液相芯片可以对小黄鱼样品进行快速地基因分型,能够应用于小黄鱼生长和抗病等重要经济性状的基因组选择育种,有助于缩短小黄鱼育种周期,加快小黄鱼新品种选育进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的小黄鱼全基因组SNP液相芯片在小黄鱼样本中的基因型检出率;
图2为本发明的小黄鱼全基因组SNP液相芯片在小黄鱼重复样本中的基因型检出一致率;
图3为本发明的小黄鱼全基因组SNP液相芯片在大黄鱼样本中的基因型检出率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
利用最新的pacbio HiFi和Hi-C技术获得小黄鱼高质量基因组序列,基因组大小为678.61Mb,contigN50=25.99Mb,组装到24条染色体上,注释基因数量为28641个。具体实现如下:
高通量测数及数据质控:采用IlluminaNovaSeq 6000测序技术对样品DNA进行paired-end测序,获得的下机数据利用Trimmomatic-0.39(http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)软件去除reads中的adapter序列、剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基、修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)、去除含N的比例达到10%的reads、剔除adapter及质量修剪后长度小于75bp的小片段。最终获得高质量检测数据86,074,560,513bp。同时获得高质量的Hi-C数据73,637,837,943bp。利用PacbioSequel II进行HiFi测序,获得的原始测序数据进行如下处理:过滤掉长度小于200bp的Polymerase reads;过滤掉质量小于0.80的Polymerase reads;从Polymerase reads中提取Subreads,过滤掉adapter序列;过滤掉长度小于500bp的Subreads。过滤后获得的PacBioSubreads为53,645,721,691bp。
基因组组装:采用基于K-mer=21对测序数据进行分析,估算得到样品的基因组大小为620.2Mb、杂合度为0.697%、重复率为13.4%。使用软件Hifiasm(https://github.com/chhylp123/hifiasm)组装三代Pacbio HiFi long-reads。获得小黄鱼基因组大小为680,520,371bp。使用软件ALLHIC(https://github.com/tanghaibao/allhic)对基因组contigs或scaffolds进行聚类、排序、定向,得到染色体水平基因组,各染色体长度见表1。
表1各染色体组装结果统计
说明:ChrLen:序列总长度;Eff_Len:除去不明确的碱基N,余下的总长度。
编码基因分析:采用de novo预测、同源蛋白比对和转录组数据相结合的方法对基因组进行基因预测,通过AUGUSTUS v3.2.3软件(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/)进行de novo基因预测;用参考基因组的蛋白序列进行同源比对预测,先把蛋白序列快速比对到样本基因组序列(tblastn),过滤不好的比对结果,去冗余,然后运行Genewise v2.4.1(https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/THD/GeneWise)做精确比对,确定基因编码区和intron区;用软件TopHat v2.1.1(http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)把转录组数据比对到基因组序列,然后用软件Trinityv2.11.0(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases)拼接获得转录本;用EVidenceModeler v1.1.1(http://evidencemodeler.github.io/)软件对以上3种基因集进行整合,得到样品基因组编码基因28641个。
实施例2
基于实施例1获得的基因组信息,使用小黄鱼野生群体60个样本和养殖群体1139个样本的重测序数据进行变异分析,获得大规模的全基因组变异信息;过滤筛选获得高质量的、具有群体及个体代表性的SNP位点,结合QTL定位和GWAS分析筛选的重要经济性状显著相关的SNP位点,同时根据基因组注释及变异注释进行多态性位点区段的确定,最终在基因组水平合成高密度SNP液相芯片。具体实现如下:
基于小黄鱼高质量参考基因组,使用野生群体和养殖群体重测序数据进行变异分析:从组织中提取DNA经琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检测合格后,通过Covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illuminaNovaSeq 6000进行测序,测序获得的paired-end原始数据,使用trimmomatic软件(http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)去除带接头(adapter)的reads、含有N的比例大于5%的reads、质量值Q<=10的碱基数占整个reads的百分之20以上的低质量reads,获得高质量有效数据。利用BWA比对软件将测序片段比对回参考基因组,接着利用Picard-tools去除PCR-duplication产生的测序片段。根据比对结果,利用GATK软件(https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us)中的推荐流程,对过滤后的小黄鱼野生群体重测序数据进行参考基因组的比对分析及变异位点筛选和过滤,获得698万个SNP位点。利用ANNOVAR软件对SNP检测结果进行注释。
通过QTL定位筛选性状显著相关SNP位点:通过基因组重测序技术测定F1全同胞家系子代+双亲共计202个样本基因组序列,与参考基因组比对筛选SNP位点,构建高密度遗传连锁图谱,连锁图谱中包含标记390,937个,图谱长度1871.83cM,分为24个连锁群。结合全同胞家系生长、性别和肌肉营养组成(7种必需氨基酸和6种多不饱和脂肪酸)等性状表型信息,通过QTL定位分析成功筛选到性状显著相关SNP位点736个(表2),其中,耐高温性状相关SNP位点27个,生长(体重、体长、全长)性状相SNP关位点13个、性别(Sex)相关SNP位点21个,肌肉品质性状中脂肪酸(C18_2n6c、C18_3n3、C20_4n6、EPA、DHA)含量相关SNP位点519个,氨基酸(Ile、Leu、Lys、Val、Met、Phe、Thr)含量相关SNP位点156个,剩余为背景位点,有99295个,SNP位点在小黄鱼参考基因组上按照6.5Kb的平均距离间隔分布。
cGPS标记设计与合成以及芯片有效性验证:在包括性状相关位点的基础上,按照SNP位点平均分布于基因组上为基本原则筛选获得标记538024个,最终筛选获得100031个优异SNP位点(表3),用于后续探针合成,至此即可制备得到小黄鱼全基因组SNP液相芯片。分别利用12份小黄鱼样本和大黄鱼样本进行液相芯片有效性验证。经测序和数据分析,小黄鱼样本数据的位点检出率在98.47%-99.02%之间,平均检出率为98.75%(图1);重复样本基因型一致率在98.43%-98.68%之间,平均一致率为98.53%(图2)。大黄鱼样本数据位点检出率在92.85%-93.67%之间,平均检出率为93.23%(图3)。
表2重要经济性状显著相关SNP位点信息
表3100K液相芯片SNP标记位点信息
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实施例3
利用实施例2的小黄鱼全基因组SNP液相芯片对对小黄鱼选育群体中的2044尾个体进行基因型检测,方法如下:
(1)获得DNA样本:采集小黄鱼鳍条组织样本,用酚-氯仿法或专用试剂盒提取组织中基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检测合格后,将DNA浓度调整到工作浓度10ng/μL(10~50ng/μL可达相同效果)。
(2)基因芯片检测:按照华智生物技术有限公司cGPS液相芯片标准检测流程操作。
(3)数据分析:对检测获得的原始数据采用fastp软件进行质控,之后用BWA软件将测序数据分别比对到小黄鱼参考基因组序列,采用GATK软件的标准流程检测SNP,进行基因分型。
结果显示,群体SNP位点平均检出率98.08%,平均杂合率27.66%,重复样本检测一致性98.26%。分型数据进行质量控制处理:删除缺失率>10%、MAF<0.05的个体和标记,质控后,获得高质量SNP标记82901个,用于后续重要经济性状的基因组选择育种。针对小黄鱼生长和抗病性状,使用Asreml软件的REML方法,基于小黄鱼全基因组SNP液相芯片分型获得SNP信息对各性状遗传力进行估计,同时利用GBLUP方法预测个体基因组估计育种值(GEBV)。通过对全长、体长、体重、感染病原菌后存活时间和存活状态等性状的遗传力估计(表4),GEBV预测可靠性较好,在0.467~0.548之间,证明了小黄鱼全基因组SNP液相芯片用于生长、抗病等性状的基因组选择育种具有较高的可靠性。
表4重要经济性状遗传力估计及GEBV预测可靠性评估
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种用于小黄鱼全基因组基因分型检测的SNP位点组合,其特征在于,包括如下表所示的SNP位点:
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2.一种如权利要求1所述的SNP位点组合在制备小黄鱼全基因组SNP液相芯片中的应用。
3.一种如权利要求1所述的SNP位点组合在小黄鱼基因组选择育种中的应用。
4.一种小黄鱼全基因组SNP液相芯片,其特征在于,所述小黄鱼全基因组SNP液相芯片包括一种探针组合,所述探针组合用于鉴别权利要求1所述的SNP位点组合中各SNP位点的基因型。
5.一种如权利要求4所述的小黄鱼全基因组SNP液相芯片在小黄鱼基因组选择育种中的应用。
6.一种小黄鱼全基因组基因分型检测的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)获取得到待检小黄鱼样本的基因组DNA;
(2)利用权利要求4所述的小黄鱼全基因组SNP液相芯片对所述基因组DNA进行检测,获得原始数据;
(3)对所述原始数据进行数据分析,得到基因分型结果。
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