CN113322330B - 膨腹海马性别鉴定snp位点及性别鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种膨腹海马性别鉴定SNP位点及性别鉴定方法，所述SNP位点所在的碱基序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5。所述膨腹海马性别鉴定方法，包括以下步骤，S1，提取膨腹海马DNA；S2，以提取的DNA为模板，进行PCR，扩增序列SEQ ID No.1‑SEQ ID No.5，序列SEQ ID No.1‑SEQ ID No.5对应的PCR引物依次为SEQ ID No.6‑SEQ ID No.15所示；S3，将PCR产物进行测序验证，并根据所述SNP位点判断海马的雌性；若SNP位点为杂合型，则为雄性，若SNP位点为纯合型，则为雌性。

Description

膨腹海马性别鉴定SNP位点及性别鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种膨腹海马性别鉴定SNP位点及性别鉴定方法，属于膨腹海马性别鉴定技术领域。

背景技术

膨腹海马(Hippocampus abdominalis)，又称大腹海马，为辐鳍鱼纲棘背鱼目海龙科海马属的其中一种，是所有已知海马中最大的一种，分布于西南太平洋区的澳洲及新西兰海域，栖息深度可达109米。膨腹海马常栖息在礁石区，随着海草游动，属肉食性，以小型甲壳类为食，卵胎生。特征是肚子圆鼓。体长达35厘米。环12至13个，背鳍鳍条27-28枚；胸鳍鳍条15-17枚；无尾鳍，具有突出的圆形眼棘。体灰白色，在头部与躯干上有深色的斑点与污点；尾部有交互的深色与淡色的条纹，雄鱼有的黑色斑块比雌性多。夜间活动，属肉食性，以小型甲壳类为食。雄性大腹海马有育儿袋但是不繁殖，雌性将卵产在育儿袋中，雄性受精进入妊娠期，30天左右孵化出1100个幼仔，之后幼仔离开育儿袋肚子生活。

膨腹海马性别鉴定对雌雄膨腹海马分开选育和养殖至关重要。现有性别主要依赖于形态学观察，无法准确判断，也无法进行早期性别鉴定。

发明内容

本发明提供了一种膨腹海马性别鉴定SNP位点及性别鉴定方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种膨腹海马性别鉴定SNP位点，所述SNP位点所在的碱基序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5。

一种膨腹海马性别鉴定方法，包括以下步骤，

S1，提取膨腹海马DNA；

S2，以提取的DNA为模板，进行PCR，扩增序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.5，序列SEQID No.1-SEQ ID No.5对应的PCR引物依次为SEQ ID No.6-SEQ ID No.15所示；

S3，将PCR产物进行测序验证，并根据所述SNP位点判断海马的雌性；若SNP位点为杂合型，则为雄性，若SNP位点为纯合型，则为雌性。

作为进一步改进的，步骤S1的具体为：提取膨腹海马分泌物，采用CTAB法提取膨腹海马基因组DNA。

作为进一步改进的，所述PCR反应的反应体系为：2×Taq PCR MaterMix 1.0μL、DNA模板1.0μL、浓度10μM的引物F 0.4μL、浓度为10μM的引物R 0.4μL和水2μL。

作为进一步改进的，所述PCR的反应程序为：95℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，循环次数为40次；72℃延伸10min，16℃保存。

一种膨腹海马性别鉴定试剂盒，包括膨腹海马DNA提取试剂盒，序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.5对应的PCR引物，2×Taq PCR MaterMix。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供一种确鉴定膨腹海马性别的方法，采用特异引物扩增包含性别连锁SNP位点序列的片段，经过测序分析SNP位点，最终确定膨腹海马性别。

2、本发明提供的膨腹海马性别鉴定方法，所需的膨腹海马的样品可以是含膨腹海马DNA的分泌物，采样对于膨腹海马无伤害。

3、本发明提供的膨腹海马性别鉴定方法，操作简单、时间短、通用性高，不必等到膨腹海马长到可以可以通过形态学鉴定其性别，将膨腹海马性别鉴定时间大大提前，有利于雌雄膨腹海马分开选育和养殖。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例1提供的膨腹海马基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。

图2是本发明实施例1提供的膨腹海马基因组全局Hi-C互作热图。

图3是本发明实施例1提供的膨腹海马雌性和雄性个体的SNP分布图。

图4本发明实施例1提供的膨腹海马雌性和雄性个体的SNP热图分析。

图5本发明实施例1提供的膨腹海马性别连锁的区域在染色体上的定位。

图6是本发明实施例1提供的膨腹海马基因组的6号染色体上的性别连锁区域定位。

图7本发明实施例1提供的SNP1位点PCR的凝胶电泳结果。

图8是发明实施例1提供的膨腹海马的性别鉴定结果。

图9是实施例2提供的膨腹海马的性别鉴定结果。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

实施例1

1.实验样本来源

本研究中，采集的膨腹海马的血液及组织样本材料均来自小嶝岛养殖场养殖的膨腹海马，采集时间为2019年3月，标本采样编号为HM0001。

2.实验方法

2.1提取膨腹海马基因组DNA

⑴组织裂解取膨腹海马尾部，将尾部皮肤去除，取适量的肌肉组织于1.5mL已灭菌的EP管中，将剪刀用75％的酒精进行擦拭，将其剪碎，向其中加入少量组织裂解液，之后用研磨器将组织进一步研磨，并用组织裂解液冲洗研磨棒数次，将研磨棒上残留的组织冲洗干净，并向其中加入475μL TE缓冲溶液，25μL 10％SDS缓冲液，5μL 20mg/mL蛋白酶K，做好标记后，用涡旋震荡仪将其混匀，放入37℃水浴锅中加热裂解3h。

⑵去除杂质将裂解完毕的组织取出后，向其中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀，放在冰上静置5min，放入离心机中，4℃，12000rpm，离心8min。

⑶沉降DNA将样品从离心机取出，小心吸取上清液至新的灭菌的1.5mL EP管中，加入等体积预冷的异戊醇，上下轻微颠倒混匀，放入离心机中，4℃，12000rpm，离心5min。

⑷去除盐离子将离心管取出后，小心吸取上清液移至新的灭菌的1.5mL EP管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，轻微颠倒混匀，将EP管中的白色丝状沉淀用枪头挑出放置在新的灭菌2mL EP管中。

⑸清洗加入1.5mL预冷的75％乙醇溶液，缓慢颠倒，将其混匀，放置于-20℃静置1min。

⑹清洗再次用枪头挑出白色沉淀放置在新的灭菌2mL EP管中，重复操作步骤⑸两次。

⑺溶解DNA将乙醇吸出，将EP管放置在无菌操作台中，开启管盖，至残留的乙醇完全挥发后，加入50μL无菌超纯水，使DNA完全溶解。

⑻去除RNA酶向溶解后的DNA中加入2μL10mg/mL RNAseA，放置于37℃水浴锅中，水浴加热1h。

⑼测量DNA浓度吸取10μL无菌水清洗超微分光光度计3次，清洗完毕后，吸取1μLDNA溶液，检测所提组织DNA的浓度和纯度。

⑽检测DNA完整性配制0.8％琼脂糖凝胶，取1μL DNA溶液同Loading buffer混匀，加入点样孔中，将电泳仪的电压调至180V，电流调至160mA，时间20min。之后将凝胶取出，放入凝胶图像分析仪中，检测电泳结果。结果如图1所示。图中泳道1为膨腹海马基因组的DNA电泳图，该DNA条带清晰且完整，无杂带，无降解现象，符合测序要求。

2.2 DNA文库构建与测序

(1)使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit试剂盒在Illumina X Ten平台上构建长度为150bp配对末端测序文库。再通过Trimmomatic(v0.36)使用默认参数对原始数据进行优化。(2)使用Blue Pippin TM Automated DNA Size Selection System(SageScience Inc.,Beverly,MA,USA)，通过挑选DNA的大小来纯化和修饰DNA。(3)根据PacBio的说明文档来制备SMRT bell libraries(～20Kbp)文库。(4)使用P6-C4chemistry试剂盒，通过PacBio RSII system生成约136Gb的数据，质控后数据量达到预估基因组大小的80x。使用Irys默认参数通过脚手架组装光学图谱，得到2798张平均长度为0.774Mbp的光学图谱。

2.3 Hi-C文库构建和测序

采集的新鲜的膨腹海马的肌肉组织于BioMarker Technologies平台构建Hi-C文库。(1)迅速的将膨腹海马的肌肉组织剪碎，用甲醛进行固定，之后加入甘氨酸终止交联，提取组织的DNA后，加入Hind III后37℃水浴锅过夜消化。(2)在62℃下培养20min.，使限制性内切酶失去活性。(3)将消化后的染色质用biotin-14-dCTP填充在粘性末端，使其钝化，然后在室温下重新连接4小时，形成嵌合连接。(4)收集链霉亲和素珠收集连接的DNA，然后将其剪切成长度为300-700bp的片断。(5)将原始的长链交叉联合作用的嵌合片段分离并加工成文库，在Illumina HiSeq XTen平台上对文库进行测序。得到总数为72.29Gb的长度为150bp reads的配对端。

2.4膨腹海马基因组的原始数据预处理

(1)在不用平台上过滤出＞5％的未知核苷酸、PHRED＜20的低质量reads。(2)PacBio RS II共计产生了17,755,597的原始数据，过滤出质量＜0.75或＜500bp的reads。(3)使用corOut Coverage＝100的参数对SMART reads进行修正，最终保留10,185,636进行进一步分析。(4)BioNano的原始数据采用IrysView package(Bionano Genomics,SanDiego,CA,USA)处理，SNR的分子标记(signal-to-noise ratio)3.0，平均分子强度小于0.6、长度为大于100kb的分子保留用于基因组组装。

2.5基因组的组装和基于Hi-C假染色体的构建

使用Canu(v1.6)对PacBio reads(80x sequence coverage)进行膨腹海马基因组的初始组装，得到7,492条contigs,N50为483.292Kb。使用Pilon对50x的Illumina shortreads进行polish，以提高基因组组装的准确性。根据之前的组装结果，将Hi-C的readsmap到基因组组装草图中，只保留maping到的scaffold。将ALLHiC用于膨腹海马的基因组组装的框架，利用ALLHiC去除collapsed regions、homologous contigs、inter-homologouslinks。随后根据细胞分类结果，将contigs分到各集群中，使用其辅助组装到染色体水平。

3.结果

3.1膨腹海马基因组的染色体级别组装

3.1.1膨腹海马基因组二代和三代测序数据概况

首先将采集的膨腹海马的肌肉样本进行DNA的提取，之后分别构建Illumina以及PacBio文库，使用Illumina HiSeq二代和PacBio RS II三代平台测定序列，分别将两者产生的数据进行质控。

3.1.2 contig级别基因组的组装

用Canu软件对PacBio RS II平台生成的数据进行三代的基因组组装，并且利用Illumina平台生成的二代测序数据，进行Polish矫正。最终获得初始的445Mbp的contig组装数据，其中contig的数量为185，N50为8Mbp，表明contig级别的基因组完整度水平较好。可以进行下一步的hic辅助组装提升基因组到染色体水平(表1-2)。

表1-2.contig水平的基因组组装统计表

3.1.3 Hi-C辅助提升contig膨腹海马基因组组装

3.1.3.1 Hi-C文库的测序数据

将膨腹海马的肌肉组织提取DNA构建Hic文库后，使用Illumina平台进行测序。之后使用contig版本的基因组对于Hic文库进行数据评估，结果如表1-3所示。

表1-3.Hi-C测序结果统计与数据评估

3.1.3.2 Hi-C辅助提升contig膨腹海马基因组组装

使用3D-DNA和All-Hic软件对contig版本的基因组进行染色体的组装提升，最终获得了染色体级别的基因组，组装序列约99.30％被锚定在21条染色体上，其中95.75％的数据被定位和排序。组装得到的染色体级别的基因组统计信息见表1-4。

表1-4.染色体级别的基因组组装统计表

3.1.3.3 Hi-C辅助组装热图验证

Hi-C技术会将染色体以bin(如1M)进行划分，大小称为binsize。把Hi-C获得的数据比对到bin，我们就可获得各bin的交互数值，以热图来表示染色体所有bin之间的交互特征。全局Hi-C交互热图上的交互频率越高，区块展示的颜色就更深。从膨腹海马基因组全局Hi-C热图可以观察到对角线邻近的互作关联大大超过了偏离对角线的互作关联，各个bin的直接互作关联远远大于偏离bin的互作关联(见图2所示)，图中一共有21个scaffold呈现完整的互作方块，与膨腹海马的核型分析结果2n＝42相吻合，评估的结果显示基因组组装的效果较为理想，达到染色体的水平。

3.2 BUSCO预测评估基因组的组装完整度

对组装的序列使用BUSCO进行预测，所用的数据库为eukaryota_odb9，即用同源基因预测基因组现有序列和膨腹海马的基因情况(表1-5)。从303个超保守的核心真核基因中召回290个(95.7％)完整基因模型，并且其中单拷贝的基因模型为282个(93.1％)，重复多拷贝的基因模型为8个(2.6％)，说明组装的基因组完整度好，没有重复的拷贝组装存在。

表1-5 BUSCO的基因组组装分析

3.4膨腹海马的性别决定类型

3.4.1膨腹海马性别连锁区的挖掘

分别取了57个膨腹海马的雌性个体和167个雄性个体进行了基因组的重测序，比对到上述组装好的膨腹海马基因组上进行GWAS分析。结果如图3和4所示，成功筛选到一批性别连锁的SNP序列位点。图3展示RAD seq marker的分布，X轴代表male个体数目，Y轴代表female，方框代表这个marker在雌雄间的测序深度有显著差异，颜色深浅代表一个框里有SNP的marker。

3.4.2膨腹海马性别连锁区的定位

进一步对这些性别连锁的SNP进行染色体定位，发现这些性别连锁的SNP集中存在于膨腹海马的6号染色体上，区域位置有17Mb的长度，见图5，6。

3.4.3膨腹海马性别连锁区的验证

挑选了5个性别差异性最显著的SNP位点的序列，以任意5个雄性个体和5个雌性个体的基因组DNA为模板对上述SNP位点分别进行PCR验证。5个性别差异性最显著的SNP位点序列依次为SEQ ID No.1-SEQ ID No.5(SNP1-SNP5)。PCR的引物依次为SEQ ID No.6-SEQID No.15所示，为全人工合成。

表1-6性别鉴定引物

表1-7膨腹海马SNP位点所在序列

表1-8 5个差异性最显著的SNP位点特征

PCR扩增的反应程序为：95℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，循环次数为40次；72℃延伸10min，16℃保存。

PCR扩增体系：2×Taq PCR MaterMix 10μL，正向引物0.2μL，负向引物0.2μL，DNA模板1μL，无菌水8.6μL。

从琼脂糖凝胶电泳的结果来看雌雄个体出现的条带都与设计的目的条带大小一致，且条带单一。图7为SNP1位点PCR的凝胶电泳结果。图中泳道1-5是以雄性海马DNA为模板的PCR验证结果；泳道6-10是以雌性海马DNA为模板的PCR验证结果。

将所有PCR产物送去测序，对5个差异性最显著的SNP位点进行验证，结果如图8所示，图8A,B为SNP1的测序检测结果，图8C,D为SNP2的测序检测结果，图8E,F为SNP3的测序检测结果，图8G,H为SNP4的测序检测结果，图8I,K为SNP5的测序检测结果，箭头所指为SNP位点所在位置。从测序结果来看，膨腹海马的性别连锁SNP位点，在雄性海马中表现为杂合型，而在雌性海马中表现为纯合型。表明膨腹海马的性别是XX/XY型，但是尚未进化出性染色体。

实施例2

选取早期膨腹海马样品，按照实施例1的方法提取待检测样品的DNA。以DNA样品为模板，使用表1-6所示5对引物进行PCR。将扩增产物进行测序验证，根据测序结果进行膨腹海马性别判断。判断结果如图9所示。

实施例3

一种膨腹海马性别鉴定试剂盒，包括膨腹海马DNA提取试剂盒(现有的DNA提取试剂盒均可)，序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.5对应的PCR引物，2×Taq PCR MaterMix。此试剂盒可以用实施例2的方法，对膨腹海马的性别进行鉴定。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省水产研究院

<120> 膨腹海马性别鉴定SNP位点及性别鉴定方法

<130> 2021

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> Hippocampus abdominalis

<400> 1

taaagccata attgcctaac gaccaacagg tgtgcagctg cagggaaaag ccccacagtg 60

ccacctgttg gtcaaaactg aatcatgaca caaccaatca cggctcacct gttttcagat 120

tgaggttatg tggcattcgc aagttaaacc gtgattggtc attacctgag ccgtgagcaa 180

ccgtgatgtc attttcagtt gacggcaagc gacaaaatgc ctgcccccag agatggataa 240

agatgagtgt ttttgctact taattcattt tcccccaacg caatatgaat caggatgccc 300

cgtttagaca agtccaggcg caatcaacat attatcgtac agacaatttt tgacttgact 360

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cttgacatgg acgcactcac agcagacaac gaggcgctca aaagctgcca caccagtgga 480

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<210> 2

<211> 1001

<212> DNA

<213> Hippocampus abdominalis

<400> 2

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<210> 3

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<211> 1001

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cttagcccat agcactgcct gtcaaccaca ctcagtcatt ttgacacatt ggattcccca 780

atgtagttta gatacgtttt cagccttcat taaatcgttt aacaggtgaa atgtggttgg 840

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<210> 5

<211> 1001

<212> DNA

<213> Hippocampus abdominalis

<400> 5

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aagccaatcg ggcatgcaaa agcatacaga catagcaatc cataaagcgg tgactactat 480

aaccagccat ctgtggagaa cacacaccct caccactaca cttaacttgc gttaattcaa 540

ttacgacgag agaggaaagg gcagcagctg ggtaggctat gtatgccatc cttaaatagc 600

agtttgcttc acactcccag gcacaggatt tgggcacaaa ggccagcaac tcattgaagg 660

aaactcatta agtgcacata catccactga attacattta aactctgaac aaataatatg 720

attccagaaa tgttttgggc cagagaaagt agaatagatg ggatgatgat ggccatattg 780

tcccccatag tctcaagtca gttgccccgc cccccccaaa agaaagaatg gatgaggatg 840

ttgtttccta tcagggtcag gtgagcgcca tcgcccagtc cgtcccagaa aagaaatgtg 900

caccgtaggg accagcggcc cacttatatc agcataaaat aaaaaaataa aacattcctc 960

tatgctttgt taaagtgtgg cccatcatca caccatacca c 1001

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgacggcaag cgacaaaat 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagctgatt tcattgtata tatgg 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccacctgtt ggtcaaaact 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cactgtactc agttgtggca atg 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtttctgtt cggcgggtaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggggaatcc aatgtgtcaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtttctgttc ggcgggtaag 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttggggaatc caatgtgtca a 21

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attgctgttg tgcaataaat gtacc 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

actgacttga gactatgggg ga 22

Claims (6)

1.一种膨腹海马性别鉴定SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记所在的碱基序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5。

2.一种膨腹海马性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1，提取膨腹海马DNA；

S2，以提取的DNA为模板，进行PCR反应，扩增序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.5，序列SEQID No.1-SEQ ID No.5对应的PCR引物依次为SEQ ID No.6-SEQ ID No.15所示；

S3，将PCR产物进行测序验证，并根据所述PCR产物判断膨腹海马的雌雄；若SNP位点为杂合型，则为雄性，若SNP位点为纯合型，则为雌性。

3.根据权利要求2所述的膨腹海马性别鉴定方法，其特征在于，步骤S1的具体为：提取膨腹海马分泌物，采用CTAB法提取膨腹海马基因组DNA。

4.根据权利要求2所述的膨腹海马性别鉴定方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系为：2×Taq PCR MaterMix 1.0μL、DNA模板 1.0 µL、浓度10 μM的引物F 0.4 µL、浓度为10 μM的引物R 0.4 µL和水2 µL。

5.根据权利要求2所述的膨腹海马性别鉴定方法，其特征在于，所述PCR反应的程序为：95℃变性4 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环次数为40次；72℃延伸10 min，16℃保存。

6.一种膨腹海马性别鉴定试剂盒，其特征在于，包括膨腹海马DNA提取试剂盒，序列SEQID No.1-SEQ ID No.5对应的PCR引物，2×Taq PCR MaterMix，所述PCR引物的序列如SEQID No.6-SEQ ID No.15所示。

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