CN114317781B

CN114317781B - 一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114317781B
Application number: CN202210213857.6A
Authority: CN
Inventors: 冯春刚; 段颖; 史凯; 鹿西学; 刘相平; 李东锋; 赵茜; 宋迟; 徐善金
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-03-07
Filing date: 2022-03-07
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-07
Also published as: CN114317781A

Abstract

本发明涉及一种分子标记及应用，尤其涉及一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了鉴定鸽长短绒性状相关的SNP标记引物对，并提供了用其检测鸽子长短绒性状的分子方法。本发明所述的SNP标记位点为鸽参考基因组版本Cliv_1.0的Z染色体769369bp位点的核苷酸，且具有A/G多态性。所述SNP标记与长短绒性状高度关联，该单核苷酸多态性可以作为鸽子育种的遗传标记，利用分子生物学手段，进行标记辅助选择，具有重要的育种价值和经济价值。

Description

一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种分子标记及应用，尤其涉及一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP），是指在基因组上单个核苷酸的变异，在遗传物质传递过程中可以稳定遗传给后代，可以作为分子标记进行育种和保种。

鸽子是我国仅次于鸡鸭鹅的第四大家禽，但是和鸡相比，鸽子的遗传学和基因组学研究进展较为缓慢。羽毛是禽类所特有的表皮衍生物，具有保温、飞翔等功能。羽毛具有不同的颜色、性状等变异，是遗传学和发育学研究的重要模型。羽毛类型十分丰富，绒羽是羽毛的一种类型，具有保温和护体等作用，是一种优良的热绝缘体和调料。绒羽又分为雏绒羽、体绒羽和粉绒羽，其中雏绒羽存在于大部分鸟类的雏形阶段。鸽子的长短绒性状是指鸽子在出壳后大约1-7天，其表皮的雏绒羽（natal down）的长短以及疏密程度。大部分野生型的鸽子出壳后表皮被大约1cm长的绒毛紧密覆盖，命名为野生型绒毛或者长绒毛，而携带某些突变基因的鸽子出壳后绒毛很短，命名为短绒毛。全身大部分，尤其是头部区域绒毛短且稀疏，肉眼可以直接区分开，但是该表型只有雏鸽出壳后七天之内能够准确判断，之后随着雏绒羽的生长，长绒和短绒个体之间难以区分。20世纪40年代，人们通过杂交试验发现，鸽子短绒表型符合伴性隐性遗传规律，但是关于该性状的natal-down基因和分子标记的研究尚未见报道。该性状作为一种伴性遗传的性状，有望在鸽的雌雄自别技术的研究开发中发挥重要作用。如果要将该性状运用到育种工作中，则需要利用分子标记来准确鉴定鸽子的长短绒位点的基因型，但是目前尚缺少鸽子的长短绒性状的分子标记及其检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用，为检测鸽子长短绒性状基因型提供新的途径。

本发明首先提供一种与鸽长短绒性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。两个核苷酸序列的长度为429bp，包含鸽子Z染色体的769369bp位点。

本发明进一步提供分子标记所需鸽子DNA特异性引物对，上游引物F：5’-GATGCTGAGGCCTTTCATGT-3’ （如SEQ ID NO：1所示），

下游引物R：5’-TTTCCCCAAAGATCCAACAG-3’ （如SEQ ID NO：2所示）。

本发明再进一步提供一种与鸽长短绒性状相关的分子标记的应用，主要是利用鸽Z染色体的769369bp位点（参考基因组版本Cliv_1.0）的一个核苷酸进行单核苷酸多态性（SNP）检测，根据检测结果判定鸽的长短绒基因（natal-down基因）的基因型以及该基因是否纯合。具体的方法包括以下步骤：

步骤一、用鸽子DNA特异性引物对鸽子DNA样品进行PCR扩增，得到扩增产物；

步骤二、在所述扩增产物中加入限制性内切酶，得到酶切产物；

步骤三、将所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到检测结果；

步骤四、依据所述检测结果判断酶切产物的条带数目和条带大小，鉴定待测鸽子的长短绒性状位点基因型。

上述方法的所述步骤一中，鸽子DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，PCR扩增产物长度为429bp，包含鸽子Z染色体的769369bp位点；

PCR扩增的反应体系以50 μl计，待测鸽子DNA 50 ng，

Accurate Taq DNA 聚合酶 1.25 IU，

10X PCR反应缓冲液 (含Mg2+) 5μl，

10mM dNTPs 1μl，

10μM 上游引物F 1μl，

10μM 下游引物R 1μl，

无菌水补足至50μl；

PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸5min；20℃保存；取10μl用于琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到单一目的条带后进行下一步酶切。

所述步骤二中，限制性核酸内切酶选用TSP45I内切酶；酶切反应体系以20 μl计，

PCR产物 10μl，

10X NEB缓冲液 2μl，

TSP45I内切酶 10 IU，

无菌水补足至20μl，反应条件为65℃，1h。

所述步骤三中，琼脂糖凝胶电泳检测结果中的三条条带分别对应长度为166bp、263bp的酶切产物和长度为429bp的原始PCR产物。

所述步骤四中，鉴定标准是，待测样品的酶切产物显示一条条带，大小为429bp，则待测样品为短绒纯合基因型；待测样品的酶切产物显示两条条带，大小为166bp和263bp，则待测样品为长绒纯合基因型；待测样品的酶切产物显示三条条带，大小为166bp、263bp和429bp，则待测样品为长绒杂合基因型。

本发明SNP标记位点为鸽参考基因组版本Cliv_1.0的Z染色体769369bp位点的核苷酸，且具有A/G多态性。经过验证SNP标记与长短绒性状高度关联，该单核苷酸多态性可以作为鸽子育种的遗传标记，其有益效果是：利用分子生物学手段，进行标记辅助选择，具有重要的育种价值和经济价值。

附图说明

图1为长绒和短绒雏鸽个体表型。

图2为三种基因型PCR产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3为三种基因型PCR扩增产物的Sanger测序结果。

具体实施方式

实施例1

下面通过实施例和附图进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

鸽子的长短绒性状是指鸽子在出壳后大约1-7天，其表皮的雏绒羽（natal down）的长短以及疏密程度，如图1所示，左为长绒毛雏鸽，右为短绒毛雏鸽。本实施例利用鸽Z染色体的769369bp位点（参考基因组版本Cliv_1.0）的一个核苷酸进行单核苷酸多态性（SNP）检测，根据检测结果判定鸽的长短绒基因（natal-down基因）的基因型以及该基因是否纯合。

实验步骤如下：

1.基因型分析

（1）实验材料

早期雏绒羽的长短绒表型记录清晰的卡奴鸽30只，银王鸽23只，白羽王鸽10只。上述鸽子品种为市售，不再赘述。

（2）基因组DNA的提取

对待测鸽子采用翅下静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用饱和氯化钠方法提取，TE溶解之后-20℃保存。

（3）PCR扩增

以上述提取的基因组DNA为模板，对包含Z染色体的769369bp位点的片段进行PCR扩增。

上游引物F：5’-GATGCTGAGGCCTTTCATGT-3’ （如SEQ ID NO：1所示）

下游引物R：5’-TTTCCCCAAAGATCCAACAG-3’ （如SEQ ID NO：2所示）

反应体系终浓度（50μl）为：

待测鸽子DNA 50 ng

Accurate Taq DNA 聚合酶 1.25 IU

10X PCR反应缓冲液 (含Mg2+) 5μl

10mM dNTPs 1μl

10μM 上游引物F 1μl

10μM 下游引物R 1μl

无菌水补足至50μl。

PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸5min；20℃保存。

取10μl用于琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到单一目的条带长度为429bp的扩增产物，且含鸽子Z染色体的769369bp位点，如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

（4）扩增产物的酶切

选用NEB公司的TSP45I内切酶，在65℃水浴的条件下反应1h，反应体系终浓度（20μl）为：

酶切反应体系（20μl）：

PCR产物 10μl

10X NEB缓冲液 2μl

TSP45I内切酶 10 IU

无菌水补足至20μl。

（5）结果分析

酶切产物长度分别为166bp和263bp，包含长度为429bp原始产物，对应检测结果中的三条条带。取酶切反应彻底的溶液10μl，加入1μl Loading Buffer混匀，用于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图2所示，1泳道Marker为GL DNA Marker 1000，从下向上分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，700bp，1000bp。

2、3、4、5、6、14泳道显示有一条条带，大小为429bp，这些鸽子的长短绒性状SNP位点基因型均为G/G型，为短绒纯合基因型。

7、8、9、10、11泳道显示有两条条带，大小为166bp和263bp，这些鸽子的长短绒性状SNP位点基因型均为A/A型，为长绒纯合基因型。

12、13泳道显示有三条条带，大小为166bp、263bp和429bp，这些鸽子的长短绒性状SNP位点基因型均为A/G型，为长绒杂合基因型。

2.测序验证

分别将各个样本的PCR产物进行Sanger测序，结果表明，所有个体的鸽子中：酶切结果显示两条条带的个体基因型为A/A，一条条带的个体基因型为G/G型，三条条带的个体基因型为A/G型，如图3所示。图3的测序结果和图2的酶切结果完全一致。

3.相关性分析

选取3个不同品种共63个个体进行相关性分析。结果如表1所示，在所检测63个个体中，A/A基因型有39个，A/G基因型有2个，G/G基因型有22个。A/A和A/G基因型个体均为长绒表型， G/G基因型个体均为短绒表型。其中A/A基因型均为显性纯合子，A/G基因型均为杂合子。结果表明鸽子Z染色体769369bp位点与长短绒表型完全关联。

表1 Z染色体769369bp位点不同基因型与长短绒性状的相关性分析

品种	总样品数	A/A基因型个体数	A/G基因型个体数	G/G基因型个体数
					长绒表型
卡奴鸽	10	10	0	0
					银王鸽	21	19	2	0
白羽王鸽	10	10	0	0
					短绒表型
卡奴鸽	20	0	0	20
					银王鸽	2	0	0	2
白羽王鸽	0	0	0	0

除上述实施外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 1

gatgctgagg cctttcatgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 2

tttccccaaa gatccaacag 20

<210> 3

<211> 429

<212> DNA

<213> 鸽(Columba livia domestica)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(429)

<400> 3

gatgctgagg cctttcatgt gctattagct gttttattag ccttcagggc aataatactg 60

tattattgtt atatacttgc ttttaggatc agaggcggat gacccttaaa tcactcctga 120

agacacttct aaatatgcca tcccactatc gccatctgtg tgtgagtcac ctctttggat 180

ggatggcttt cctgtccaac atgcttttct tcacagattt catgggacag gtaaaagcat 240

aaaatccttt cacttctctt tcctcatagc atcttcttct ccactgaaaa taagacagcg 300

ttgtaatcct gaaggaatca cagtgatcgc agagccagct gtgtctggat ggctcaacaa 360

gacttttgta aaaccactaa ttgatctcag gcccttgttc caagctagtc tgttggatct 420

ttggggaaa 429

<210> 4

<211> 429

<212> DNA

<213> 鸽(Columba livia domestica)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(429)

<400> 4

gatgctgagg cctttcatgt gctattagct gttttattag ccttcagggc aataatactg 60

tattattgtt atatacttgc ttttaggatc agaggcggat gacccttaaa tcactcctga 120

agacacttct aaatatgcca tcccactatc gccatctgtg tgtgagtcgc ctctttggat 180

ggatggcttt cctgtccaac atgcttttct tcacagattt catgggacag gtaaaagcat 240

aaaatccttt cacttctctt tcctcatagc atcttcttct ccactgaaaa taagacagcg 300

ttgtaatcct gaaggaatca cagtgatcgc agagccagct gtgtctggat ggctcaacaa 360

gacttttgta aaaccactaa ttgatctcag gcccttgttc caagctagtc tgttggatct 420

ttggggaaa 429

Claims

1.一种与鸽长短绒性状相关的分子标记的特异性引物对，其特征在于：分子标记所需鸽子DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

2.一种与鸽长短绒性状相关的分子标记的应用，其特征在于：用于鉴别鸽子的长短绒性状位点基因型，包括以下步骤：

步骤一、用鸽子DNA特异性引物对鸽子DNA样品进行PCR扩增，得到扩增产物；鸽子DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示，PCR扩增产物长度为429bp，包含鸽子Z染色体的769369bp位点；PCR扩增的反应体系以50 μl计，待测鸽子DNA 50 ng，

Accurate Taq DNA 聚合酶 1.25 IU，

含Mg²⁺的10X PCR反应缓冲液 5μl，

10mM dNTPs 1μl，

10μM 上游引物F 1μl，

10μM 下游引物R 1μl，

无菌水补足至50μl；

PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸5min；20℃保存；取10μl用于琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到单一目的条带后进行下一步酶切；

步骤二、在所述扩增产物中加入限制性内切酶，得到酶切产物；限制性核酸内切酶选用TSP45I内切酶；酶切反应体系以20 μl计，

PCR产物 10μl，

10X NEB缓冲液 2μl，

TSP45I内切酶 10 IU，

无菌水补足至20μl，反应条件为65℃，1h；

步骤四、依据所述检测结果判断酶切产物的条带数目和条带大小，鉴定待测鸽子的长短绒性状位点基因型，鉴定标准是，待测样品的酶切产物显示一条条带，大小为429bp，则待测样品为短绒纯合基因型；待测样品的酶切产物显示两条条带，大小为166bp和263bp，则待测样品为长绒纯合基因型；待测样品的酶切产物显示三条条带，大小为166bp、263bp和429bp，则待测样品为长绒杂合基因型。

3.根据权利要求2所述与鸽长短绒性状相关的分子标记的应用，其特征在于：所述步骤三中，琼脂糖凝胶电泳检测结果中的三条条带分别对应长度为166bp、263bp的酶切产物和长度为429bp的原始PCR产物。