CN109735627B - Btbd9基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用 - Google Patents

Btbd9基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了BTBD9基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用,以提取的牛基因组DNA为模板,设计特异性引物一对,克隆牛BTBD9基因基因的部分DNA序列,通过测序及基因型分型并将不同基因型与超数排卵性状进行关联分析,为牛的标记辅助选择提供分子标记;该位点作为牛繁殖和生产性能辅助选择的分子标记并应用于遗传改良提供了重要的理论依据并具有良好的应用前景。

Description

BTBD9基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域,具体涉及牛BTBD9基因片段的克隆以及其在牛超数排卵性状标记辅助选择中的应用。
背景技术
随着分子生物学技术的成熟,超数排卵技术无论在野生动物研究与保护、家畜育种与繁殖中的应用越来越广泛。通过超数排卵技术,可以充分挖掘雌性动物的繁殖潜力,为人工授精、胚胎移植提供充足的卵母细胞,并且,也是基因修饰动物研究与应用中的一种重要技术手段。然而,虽然众多研究通过优化超数排卵关键环节中的激素使用、处理时间与周期等使超数排卵效果有了很大提升,但作为超数排卵基本影响因素-个体的一种用潜力的参差不齐严重限制了超数排卵的效果。
超数排卵的效果可简单而直接的通过获得的总胚胎数和可用胚胎数评价。研究表明,超数排卵效果受遗传基础,也就是基因的影响巨大,而基因多态性往往决定了基因的功能。在基因多态性中,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)因其广泛而重要的作用(Kidd et. al.,2006;Butler et. al.,2010;Thomas et. al.,2011)成为动物相关科学研究和实际生产、应用中长期以来备受关注的一类。众多研究也表明,SNP对动物(包括猪、牛、羊、兔、禽类、鱼类等)繁殖性状具有重要调控作用,其中不乏对于超数排卵效果的影响(Kasarda et. al.,2014;Deng et. al.,2015;Lan et. al.,2015;Gaddis et.al.,2016;Gaviria et. al.,2016),甚至可用于家畜种用性能的评定(Speed et. al.,2014)。
较早研究表明,BTBD9基因SNP多态性与不安腿综合征具有潜在关联。而最近研究表明,其多态性与潜在功能可能影响动物的细胞分化(Freeman et. al.,2015)、生长发育(Wang et. al.,2016;Goszczynski et. al.,2018)。而在动物繁殖领域,BTBD9的相关研究及应用较少。
申请人通过对该基因遗传多态性和牛超数排卵性状进行的关联分析,明确了BTBD9基因特殊位点单核苷酸遗传多态性及其准确鉴定方法,并确定了该位点遗传多态性对牛超数排卵效果的影响,为将其作为牛繁殖和生产性能辅助选择的分子标记并应用于遗传改良提供了重要的理论依据和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克隆牛BTBD9基因片段,鉴定其特定的突变位点以作为牛超数排卵性能相关基因的多态性检测方法,为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。
本发明通过以下技术方案实现:
一种通过特异性引物和PCR(Polymerase Chain Reaction)方法获得的牛超数排卵性能相关基因BTBD9的516bp序列,如表SEQ ID NO:1所示。
所获得BTBD9基因片段的DNA下列中有如表SEQ ID NO:1所述的C→T的碱基突变,导致基因单核苷酸多态性(SNP)的产生。
一种筛选适用于牛超数排卵性状的分子标记的方法,按照以下步骤制备:
通过设计特异性引物一对,正向引物BTBD9-F: 5’- TGTGGGCATTGGCAACAG -3’和反向引物BTBD9-R: 5’- GGAGTAGGTGGGAGTTTGGCTA -3’。从牛血液中提取基因组DNA,进行PCR扩增。由于PCR产物片段的DNA序列第286位存在C-T的碱基突变,导致SNP多态性的产生,利用序列测定可明确具体基因型。将检测结果所示的不同基因型与牛超数排卵性状进行关联分析后,结果表明,具备特定的基因型的个体将获得更好超数排卵效果。
以下对本发明作详细的描述:
一、牛BTBD9基因片段的克隆
利用生物学软件Oligo6.0设计一对特异性引物。建立PCR反应条件,具体情况如下:
BTBD9-F: 5’- TGTGGGCATTGGCAACAG -3’(正向引物);
BTBD9-R: 5’- GGAGTAGGTGGGAGTTTGGCTA -3’(反向引物);
为较快地获得良好的结果,本发明选择Takara公司的2×Premix Taq TM PCR反应预混液进行PCR扩增。具体反应体系为:2×Premix Taq TM (产品包装盒内提供)10.0μl,正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.5μl,基因组DNA 0.5μl(含10-50ngDNA),二馏水8.5μl。PCR反应条件为:94℃预变性1分钟;94℃变性40秒,60℃退火40秒,72℃延伸40秒,共35个循环;72℃最后延伸5分钟。
二、PCR产物序列测定及基因型的判定
用引物BTBD9-F和BTBD9-R扩增牛基因组DNA得到516bp的特异扩增片段(图1及SEQID NO:1)。测序结果发现,在该516bp片段中,由于第286bp处存在C-T的突变,不同基因型CC型、CT型和TT型的产生,其中,CC型个体第286位点为C碱基纯合体;CT型个体286位点为C/T杂合性个体;TT型个体第286位点为T碱基纯合体(图2)。
三、标记性状关联分析
利用申请人所拥有的实验群体为实验对象进行性状关联分析,使用SPSS22.0软件的One-Way ANOVA过程,建立如下模型进行性状关联分析:
统计分析模型为:Yij=μ+Gi+ej。其中,Yij为被观测个体的生产性能表型值;μ为生产性能的最小二乘均值;Gi为基因型对生产性能的效应值;ej为对应于观察值的随机残差。
本发明的效果是如下:
1、牛BTBD9基因部分DNA序列的克隆及不同基因型的判定
PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物,如图1所示。将PCR产物回收测序,结果显示产物长度为516bp。测序结果显示该片段286bp处存在C、T的碱基突变,部分测序峰如图2所示。
2、对标记性状进行关联分析
本发明中牛BTBD9基因的扩增片段序列第286位点与牛超数排卵性状的关联分析结果表明,此位点不同基因型所对应的个体的超数排卵性状中头均可用胚胎数和头均总数存在显著或极显著的差异,即该位点遗传多态性对牛超数排卵效果的影响。因此,本发明为将该位点作为牛繁殖和生产性能辅助选择的分子标记并应用于遗传改良提供了重要的理论依据并具有良好的应用前景。
附图说明
图1是BTBD9基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker,1-10泳道为随机检测的10个PCR产物,在516bp位置具有明显而特异性的条带;
图2是三种基因型个体PCR产物的测序峰图。箭头所指位置为突变位点;CC型个体该位点为C碱基;CT型个体该位点为C/T碱基;TT型个体该位点为T碱基;
图3是实施例1中BTBD9基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果;其中M泳道为标准分子量Marker,1-6泳道为随机检测的6个PCR产物,在516bp位置具有明显而特异性的条带;
图4是实施例三种基因型个体PCR产物的测序峰图;箭头所指位置为突变位点;CC型个体该位点为C碱基;CT型个体该位点为C/T碱基;TT型个体该位点为T碱基。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明,用具体实施方式详细描述具体内容。
本发明以提取的牛基因组DNA为模板,设计特异性引物一对,克隆牛BTBD9基因的部分DNA序列,通过测序及基因型分型并将不同基因型与超数排卵性状进行关联分析,为牛的标记辅助选择提供分子标记。
一、牛BTBD9基因部分DNA片段的克隆
利用Oligo6.0软件设计特异性引物1对,为保证良好的引物质量,在本发明中,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,扩增产物长度为516bp,引物序列如下所示:
BTBD9-F: 5’- TGTGGGCATTGGCAACAG -3’ (正向引物)
BTBD9-R: 5’- GGAGTAGGTGGGAGTTTGGCTA -3’ (反向引物)
PCR反应过程中所需要的Taq酶、Buffer、镁离子、dNTP等可自行选择。为较快地获得良好的结果,本发明选择Takara公司的2×Premix Taq TM PCR反应预混液进行PCR扩增。具体反应体系为:2×Premix Taq TM (产品包装盒内提供)10.0μl,正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.5μl,基因组DNA 0.5μl(含10-50ngDNA),二馏水8.5μl。PCR反应条件为:94℃预变性1分钟;94℃变性40秒,60℃退火40秒,72℃延伸40秒,共35个循环;72℃最后延伸5分钟。
二、PCR产物序列测定及基因型的判定
用引物BTBD9-F和BTBD9-R扩增牛基因组DNA得到516bp的特异扩增片段(图1及SEQID NO:1)。测序结果发现,在该516bp片段中,由于第286bp处存在C→T的突变,导致不同基因型CC型、CT型和TT型的产生,其中,CC型个体第286位点为C碱基纯合体;CT型个体286位点为C/T杂合型个体;TT型个体第286位点为T碱基纯合体(图2)。
三、标记性状关联分析
利用申请人所拥有的实验群体为实验对象进行性状关联分析,使用SPSS22.0软件的One-Way ANOVA过程,建立如下模型进行性状关联分析:
统计分析模型为:Yij=μ+Gi+ej。其中,Yij为被观测个体的生产性能表型值;μ为生产性能的最小二乘均值;Gi为基因型对生产性能的效应值;ej为对应于观察值的随机残差。
本发明中牛BTBD9基因的扩增序列第286多态位点与牛超数排卵性状的关联分析表明,在随机选取的149个体中,CC型个体有13个,CT型个体有29个,TT型个体有107个。拥有不同基因型个体的头均可用胚胎数、头均总胚胎数之间显著差异分析结果(最小二乘均值±标准差)见表1。
表1 不同基因型个体超数排卵性状之间显著差异分析结果
超数排卵性状 CC型个体 CT型个体 TT型个体
头均可用胚胎数 11.17 ± 4.47<sup>A</sup> 7.20 ± 3.93<sup>B</sup> 4.86 ± 3.21<sup>C</sup>
头均总胚胎数 17.28 ± 10.20<sup>A</sup> 11.16 ± 6.17<sup>B</sup> 7.58 ± 4.83<sup>C</sup>
注:不同组数据肩标带有不同大写字母表示差异显著(P<0.01)。头均可用胚胎数=多次超排处理共获得的总可用胚胎数/超排处理次数;头均总胚胎数=多次超排处理共获得的总胚胎数/超排处理次数。
分析结果表明,此SNP位点不同基因型所对应的个体的超数排卵性状存在显著或极显著的差异。总体来说,CC型个体的超数排卵效果优于CT型或TT型个体,用于选择超数排卵供体时,应优先选择CC型个体,而尽量不选择TT型个体。
实施例1
在河北天和肉牛养殖有限公司的待超排母牛群体中随机选定70个待测个体,采集血液进行基因组DNA提取并利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。取Takara公司的2×Premix Taq TM PCR反应预混液进行PCR扩增。具体反应体系为:2×Premix Taq TM 10.0μl,正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.5μl,基因组DNA 0.5μl(含43ngDNA),二馏水8.5μl。PCR反应条件为:94℃预变性1分钟;94℃变性40秒,60℃退火40秒,72℃延伸40秒,共35个循环;72℃最后延伸5分钟。
扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示为特异性PCR产物。如图3所示,其中M泳道为标准分子量Marker,泳道1-6为被检测的PCR产物。将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,结果表明,在所检的所有个体中,6个个体属于CC型;14个个体属于CT型;50个个体属于TT型。
结合这70个个体超数排卵相关记录,以相应数据进行关联分析,利用SPSS22.0软件One-Way ANOVA过程,Yij=μ+Gi+ej。其中,Yij为被观测个体的生产性能表型值;μ为生产性能的最小二乘均值;Gi为基因型对生产性能的效应值;ej为对应于观察值的随机残差。
在此70个个体中,不同基因型与超数排卵性状中头均可用胚胎数、头均总胚胎数之间关联分析结果(最小二乘值和标准差)见表2。
表2 不同基因型个体之间超数排卵性状显著差异分析结果
超数排卵性状 CC型个体 CT型个体 TT型个体
头均可用胚胎数 9.97 ± 3.22<sup>a</sup> 9.08 ± 2.78<sup>a</sup> 5.35 ± 3.59<sup>B</sup>
头均总胚胎数 15.44 ± 7.25<sup>a</sup> 13.32 ± 4.90<sup>a</sup> 8.27 ± 5.53<sup>b</sup>
注:不同组数据肩标均带有不同字母表示差异显著(P<0.05),带有不同大、小写字母表示差异极显著(P<0.01)。
分析结果表明,此位点不同基因型所对应的个体,其超数排卵性状存在显著或极显著的差异,CC型个体的超数排卵性状优于CT型和TT型。
序列表
<110> 吉林大学
<120> BTBD9基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 516
<212> DNA
<213> 牛(Bos taurus)
<400> 1
tgtgggcatt ggcaacagga accatctggg tcacattctc agcttcaatt aaacctactg 60
ctttttctta gtttgctttc tttccagatt ctgggcacac acacaggttt acataagttt 120
tatatttaaa gataagcccc aggatctgtt ttcaagagac ataagaaaac tagaaaatag 180
ctacatcttg ttcatagtta acgtcacggc aaaagagggg tagtgtgtgt gcgcgcgcgc 240
atgcacatgc atgggtatgt gcccactcac atgttcagtc acatctggct ctcttcgacc 300
ctacaaacta cagcccacca ggcagtggtg gtcaaggcag tgcagtcaac ataagacaaa 360
aacagaaaac ggtacctgga tgtgggcaat tataactagt gtcccagggg taattacctg 420
tagactattc ttttaggtct ttgcaaatcc tctccacttt cctgccgccc ctcccatctt 480
ccaatgcact ggactagcca aactcccacc tactcc 516
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 牛(Bos taurus)
<400> 2
tgtgggcatt ggcaacag 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 牛(Bos taurus)
<400> 3
ggagtaggtg ggagtttggc ta 22

Claims (2)

1.一对用于鉴定与牛超数排卵性状相关的BTBD9基因片段分子标记的引物在牛超数排卵性状标记辅助选择中的应用,其特征在于:
该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示,在286位有一个C-T碱基的突变,导致牛超数排卵性状出现差异,CC型个体的超数排卵性状优于CT型和TT型。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,引物的序列如下:
正向引物:BTBD9-F: 5’- TGTGGGCATTGGCAACAG -3’;
反向引物:BTBD9-R: 5’- GGAGTAGGTGGGAGTTTGGCTA -3’;
提取牛的基因组DNA,采用上述引物进行PCR扩增,获得BTBD9基因片段的DNA序列,如序列表SEQ ID NO 1;序列测定结果表明不同个体的所述BTBD9基因片段第286位存在C-T碱基突变,会导致三种基因型的产生;将检测结果所示的不同基因型与牛超数排卵性状关联分析,CC型个体的超数排卵性状优于CT型和TT型。
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