CN107164551A - Ubap2l在儿童i型糖尿病诊断或预后中的用途 - Google Patents

Ubap2l在儿童i型糖尿病诊断或预后中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了可用于诊断儿童I型糖尿病的基因标志物。该基因标志物是UBAP2L基因。通过检测受试者血液中UBAP2L基因和UBAP2L蛋白的水平，可以判断受试者是否患有儿童I型糖尿病或者判断受试者是否患有儿童I型糖尿病的风险。根据UBAP2L基因和UBAP2L蛋白可以开发通过检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的含量来诊断儿童I型糖尿病的产品，该诊断产品可在临床上推广使用。

Description

UBAP2L在儿童I型糖尿病诊断或预后中的用途
技术领域
本发明涉及儿童I型糖尿病诊断、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测UBAP2L异常为手段的儿童I型糖尿病诊断、预测预后方法。
背景技术
I型糖尿病(T1DM)为在遗传基础上由环境因素激发的、自身免疫介导的以胰腺β细胞受损为特征的自身免疫性疾病，是一种由于胰岛素缺乏或作用不足引起的能量代谢疾病。通常在儿童、少年、青年时期被诊断，发病风险最高的年龄段是10-14岁，青少年以后，发病率下降。儿童I型糖尿病以往多指小于15岁发生的糖尿病，由于WHO(世界卫生组织)已经儿童定义为0-18岁，因此儿童糖尿病应指小于18岁发生的糖尿病。儿童1型糖尿病的临床表现为多尿、多饮、多食及消瘦。儿童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病较急，不易早期发现，胰岛β细胞的功能可出现明显下降甚至发展为衰竭，早期并发症即可出现，如糖尿病酮症甚至酸中毒，如处理不及时或不当，可能危及生命。I型糖尿病确切发病机制尚未完全阐明，目前认为是遗传、免疫和环境因素共同作用所致。
高通量测序技术(High-throughput sequencing)是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。高通量测序技术是对传统测序一次革命性变革，随着2005年罗氏的454测序仪及2006年Solexa测序仪出现后飞速发展，2009年左右高通量测序技术在国内兴起。高通量测序类型分为多种，基因芯片、基因深度测序(genome re-sequencing)、转录组深度测序(transcriptome re-sequencing又称RNA-Seq)等。
细胞的功能是从基因的表达开始的，转录组是指某一时间细胞内所有基因转录而来的RNA总称。通过高通量测序技术可获得基因表达的RNA水平有关信息，可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系。
高通量测序技术的快速发展和应用，为儿童I型糖尿病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也为儿童I型糖尿病的进一步治疗方案提供崭新思路。深入研究儿童I型糖尿病相关基因的调控机制，有助于了解儿童I型糖尿病的遗传分子机制，为寻找新的药物提供理论依据。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测UBAP2L基因或蛋白表达差异来诊断儿童I型糖尿病的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过检测UBAP2L基因或蛋白表达差异来预测儿童I型糖尿病预后的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的产品在制备儿童I型糖尿病诊断工具中的用途。
本发明还提供了检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的产品在制备预测儿童I型糖尿病预后工具中的用途。
进一步，所述检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的产品包括检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合UBAP2L基因的核酸或者能够结合UBAP2L蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测UBAP2L基因的表达水平；所述物质能够检测UBAP2L蛋白的表达水平。
本发明的检测UBAP2L基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增UBAP2L基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测UBAP2L蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测UBAP2L蛋白的产品包括特异性结合UBAP2L蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测UBAP2L蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的UBAP2L蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对UBAP2L蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
进一步，所述检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的产品可以是检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
利用前面所述的检测产品检测儿童受试者样本中的UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平，与正常儿童相比，儿童受试者样本中的UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平降低，则诊断该儿童受试者为儿童I型糖尿病患者或该患有儿童I型糖尿病的儿童受试者的预后差。
作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样本来自儿童受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断儿童I型糖尿病的工具，所述工具能够检测儿童受试者样本中UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合UBAP2L基因的核酸或者能够结合UBAP2L蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测UBAP2L基因的表达水平；所述物质能够检测UBAP2L蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断儿童I型糖尿病的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断儿童I型糖尿病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知UBAP2L基因的异常与儿童I型糖尿病相关也属于UBAP2L基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种预测儿童I型糖尿病预后的工具，所述工具能够检测儿童受试者样本中UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平，所述预测儿童I型糖尿病预后工具包括能够结合UBAP2L基因的核酸或者能够结合UBAP2L蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测UBAP2L基因的mRNA水平；所述物质能够检测UBAP2L蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述预测儿童I型糖尿病预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知UBAP2L基因的异常与儿童I型糖尿病相关也属于UBAP2L基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗UBAP2L抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合UBAP2L即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制UBAP2L功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗UBAP2L抗体的其他性质同前面所述。
进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
本发明还提供了一种诊断儿童I型糖尿病或预测儿童I型糖尿病预后的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取儿童受试者的样品；
(2)检测儿童受试者样品中UBAP2L基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的UBAP2L基因或蛋白的表达水平与儿童受试者的患病与否关联起来。
(4)与正常儿童相比，UBAP2L基因或蛋白的表达水平降低，则该儿童受试者被诊断为儿童I型糖尿病，或判断患有儿童I型糖尿病的儿童受试者预后差。
在本发明的上下文中，“诊断儿童I型糖尿病”既包括判断儿童受试者是否已经患有儿童I型糖尿病、也包括判断儿童受试者是否存在患有儿童I型糖尿病的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明发现了一种诊断儿童I型糖尿病以及预测儿童I型糖尿病患者预后的分子标志物，使用该分子标志物可以在儿童I型糖尿病发生的早期即可作为判断，提高了患者的生存率。另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。
附图说明
图1显示利用QPCR检测UBAP2L基因在儿童I型糖尿病患者和正常儿童中的表达差异；
图2显示利用免疫印迹检测UBAP2L基因在儿童I型糖尿病患者和正常儿童中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选儿童I型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因
1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童I型糖尿病(按WHO 1999年糖尿病诊断标准)住院患者10例，其中男5例，女5例，年龄5-16岁；正常对照组8例，其中男3例，女5例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。
2、血液总RNA提取
使用BD PAXgene RNA采血管(BD，762165)收集待检测外周血样本 193例，本实验血液样本收集的具体步骤包括：
1)将BD PAXgene RNA采血管放置室温(18℃-25℃)保存；
2)准备采血针和BD PAXgene RNA采血管；
3)用BD PAXgene RNA采血管采集2.5ml血液；
4)采血时要防止BD PAXgene RNA采血管内液体的倒流；
将病人手臂放置适合位置，采血时，将BD PAXgene RNA采血管垂直放置，低于病人手臂平面，松开采血带，让血液自动流入BD PAXgene RNA采血管内，注意不要将BDPAXgeneRNA采血管内液体倒流入病人体内；
5)当血液停止流出10秒钟后，将BD PAXgene RNA采血管取下。BDPAXgene RNA采血管为负压设计，会自动吸取2.5ml血液。采血结束后立即将BD PAXgene RNA采血管上下颠倒8-10次；
6)将BD PAXgene RNA采血管正立放置，室温(18℃-25℃)放置2小时。
7)放入4℃冰箱保存，运输过程中要保存在4℃冰盒当中；
8)如果不需要运输室温放置2小时后即可进行RNA的提取，如果需要保存先将BDPAXgene RNA采血管置于-20℃冰箱中保存24小时后转入-80℃冰箱保存。
3、待检测外周血样本总RNA的提取纯化
本实验同时使用QIAGEN公司的PAXgeneTMBlood RNAKit(QIAGEN，762174)和miRNeasy Mini Kit(QIAGEN，217004)提取外周血总RNA，具体步骤包括；
1)室温5000rpm离心PAXgene RNA采血管10分钟；
2)小心弃去上清，加入4ml无RNA酶的水，盖紧胶盖；
3)在涡旋振荡器上重新将沉淀悬起，室温5000rpm离心10分钟，小心弃去上清；
4)加入350μl重悬buffer(BR1)，用移液器悬起沉淀，混匀直至无可见沉淀为止；
5)将重悬液移至1.5mlEP管中，加入300μl结合缓冲液(BR2)和40μl蛋白酶K，在涡旋振荡器上震荡5秒钟，将EP管置于55℃水浴摇床之中400-1400rpm孵育10分钟；
6)将上述液体移至PAXgene Shredder spin column(PSC)，室温12000rpm离心3分钟；
7)小心用移液器将上清移至新的1.5EP管中，不要吸到离心管底的沉淀；
8)将EP管中的液体平均分入2个EP管中，在每管中加入875μl无水乙醇(96-100％，分析纯)，扣紧盖子上下颠倒8-10次，简短离心，使液体全部收集在管底；
9)先将700μl液体移入RNeasy mini spin column柱中，室温12000rpm离心1分钟，弃去收集管中的过滤液体，在RNeasy mini spin column柱中继续加入700μl液体室温12000rpm离心1分钟；
10)将液体全部离心完后，弃去收集管以及其中的液体；
11)加入350μl Buffer RWT至RNeasy spin column柱中，轻轻盖上盖子，室温12000rpm离心15秒，弃去离心后的液体；
12)将10μl加入DNA酶(DNase I stock solution)加入70μl RDD中，轻轻上下颠倒8-10次，简短离心；
13)将上述80μl液体直接滴入RNasy spin column柱的中央，室温放置15分钟以去除DNA；
14)加入350μl Buffer RWT至RNeasy spin column柱中，轻轻盖上盖子，室温12000rpm离心15秒，弃去离心后的液体；
15)加入500μl Buffer RPE至RNeasy spin column柱中，轻轻盖上盖子，室温12000rpm离心15秒，弃去离心后的液体；
16)加入500μl Buffer RPE至RNeasy spin column柱中，轻轻盖上盖子，室温12000rpm离心2分钟，弃去离心后的液体；
17)将RNeasy spin column柱移至一新的收集管中，室温12000rpm离心1分钟；
18)将RNeasy spin column柱移至新的无RNA酶的EP管中，向膜的中央加入30μl去RNA酶的水，静置1分钟后室温12000rpm离心1分钟；
19)将离心后的30μl含RNA溶液重新滴入膜的中央，重复步骤18一次；
20)抽提好的RNA通过紫外分光光度计分析RNA浓度，在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度，A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)，通过琼脂糖电泳，检测RNA28S，18S，检测RNA的完整性。A260/A280大于1.90并且28S的电泳条带与18S的电泳条带之比在2∶1左右认为RNA质检合格，如果28S的电泳条带与18S的电泳条带之比小于1并且存在大量5S条带认为RNA出现降解或部分降解，RNA质检不合格。
4、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
6、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
7、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
8、Illumina x-ten上机测序
Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。
9、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；
(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。
10、结果
用以上标准筛选得到差异表达基因342个，其中表达上调的基因159个，表达下调的基因有183个。
实施例2 QPCR实验验证儿童I型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因
选择实施例1筛选出的UBAP2L基因进行大样本验证。
1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童I型糖尿病(按WHO 1999年糖尿病诊断标准)住院患者10例，其中男5例，女5例，年龄5-16岁；正常对照组8例，其中男3例，女5例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。
2、血液总RNA提取
同实施例1。
3、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
4、QPCR
采用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR，反应体系为25μl：2×QuantiTectSYBR Green PCR Master mix(12.5μl)，10×miScript Universalprimer(2.5μl)，10×miScript Primer Assay(2.5μl)，RNase-free水(5.5μl)，cDNA模板(2μl)。实施3平行，以GAPDH为内参。使用ABI 7500Fast型荧光定量PCR仪(ABI，美国)，反应条件为：94℃反应15s，55℃反应30s，70℃反应34s，40个循环，添加熔解曲线。
引物序列如下：
扩增UBAP2L基因的正向引物序列为5’-TGTTGCCTAATCCGTATA-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物序列为5’-ATGCTGTAGTAATCCAATG-3’(SEQ ID NO.2)；
扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ IDNO.3)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。
5、结果
采用2-△△Ct相对定量法，以正常儿童组的mRNA相对表达水平为1。结果如图1所示，与正常儿童相比，儿童I型糖尿病患者血液中UBAP2L基因的mRNA水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3免疫印迹实验验证儿童I型糖尿病患者和正常儿童中差异表达基因的表达产物
1、临床对象：同实施例2。
2、单核细胞分离
儿童I型糖尿病患者和正常儿童取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HPO4 0.132g，KH2PO4 0.06g，KCl 0.4g，酚红1ml，NaHCO3 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×106个/ml备用。
3、单核细胞总蛋白质提取
将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
4、Western blot检测
每个样本均取25μg总蛋白上样进行电泳，并在电泳中加入预染marker，选用8％的PAGE胶电泳。
根据预染marker(预染标记物)的显示，判定目的蛋白充分分离后，停止电泳。取出凝胶，根据Marker显示的条带切下目的条带，用蒸馏水冲洗目的条带。
预制大小与PAGE凝胶相同的PVDF膜和若干滤纸，将PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和若干滤纸一同放置于电转缓冲液中浸泡2h后取出。
将凝胶、纤维垫、黑色板、白色板、浸泡后的PVDF膜和若干滤纸，按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板的顺序依次放好，夹紧黑色板和白色板后，按照黑色板的一面对照黑色负极的顺序放入转膜仪内，先在转膜电流为200mA的条件下转膜10min，再在转膜电流为300mA的条件下转膜30min至转膜完成，得到印记PVDF膜。
将印记PVDF膜放入含有5％脱脂奶粉的TBST缓冲溶液中，在室温下震荡2h进行封闭。
按照TBST缓冲溶液与一抗的体积比为1:1000的条件制备一抗孵育液，将封闭后的印记PVDF膜放入一抗孵育液中，在温度为4℃的条件下孵育12h，得到第一孵育PVDF膜，使用TBST缓冲溶液冲洗第一孵育PVDF膜，冲洗次数为5～6次，每次冲洗的时间均为5min。
按照TBST缓冲溶液和二抗体积比为1:5000的条件制备二抗孵育液，将冲洗后的第一孵育PVDF膜放入二抗孵育液中，在室温下震荡2h得到第二孵育PVDF膜，使用TBST缓冲溶液按照冲洗次第二孵育PVDF膜，冲洗次数为5～6次，每次冲洗的时间均5min。
在每张冲洗后的第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜上滴加ECL(ElectroChemiLuminescence，化学发光底物)化学发光底物，孵育至第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜有明显的荧光后，用滤纸吸去第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜上的ECL化学发光底物，用保鲜膜包裹第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜后，进行X光胶片压片，依次放入显影液显影、定影液定影，得到第一胶片和第二胶片，利用BandScan软件，分析所有第一胶片、第二胶片的灰度值，得到样本中UBAP2L蛋白的表达结果。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图2所示，与正常儿童相比，儿童I型糖尿病患者血液中UBAP2L蛋白含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> UBAP2L在儿童I型糖尿病诊断或预后中的用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgttgcctaa tccgtata 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgctgtagt aatccaatg 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttaactctg gtaaagtgga tat 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (10)

1.检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的产品在制备诊断儿童I型糖尿病预后的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的产品包括检测UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测儿童受试者样本中的UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平，与正常儿童相比，儿童受试者样本中的UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平降低，则诊断该儿童受试者为儿童I型糖尿病或判断患有儿童I型糖尿病的儿童受试者的预后差。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述儿童受试者样本的来源是血液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合UBAP2L基因的核酸或者能够结合UBAP2L蛋白的物质；所述核酸能够检测UBAP2L基因的表达水平；所述物质能够检测UBAP2L蛋白的表达水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增UBAP2L基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.一种诊断儿童I型糖尿病或预测儿童I型糖尿病预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测儿童受试者样本中的UBAP2L基因或UBAP2L蛋白的表达水平的工具。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合UBAP2L基因的核酸或者能够结合UBAP2L蛋白的物质；所述核酸能够检测UBAP2L基因的表达水平；所述物质能够检测UBAP2L蛋白的表达水平。
9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增UBAP2L基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述儿童受试者样本的来源是血液。
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