CN107164529A - 一种与哮喘发生发展相关的基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与哮喘发生发展相关的基因的应用，具体的该基因为PNMA6A。本发明通过高通量测序首次发现了PNMA6A在哮喘患者中差异表达，并通过qPCR进一步做了验证，提示PNMA6A可作为分子标志物应用于哮喘的早期诊断。

Description

一种与哮喘发生发展相关的基因的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种于哮喘发生发展相关的基因的应用，具体地涉及基因PNMA6A在哮喘诊断中的应用。

背景技术

支气管哮喘(简称哮喘)目前在全球范围内有较高的发病率，并呈逐渐上升的趋势，是当今世界威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病，是发达国家中儿童支气管疾病发病率最高的一种。根据世界卫生组织(WHO)发布的报告指出，目前全球约有3亿哮喘患者，其所造成的社会负担超过了结核病和艾滋病的总和。我国的哮喘患者己达3000万以上，其死亡率位列全球第一。因此，支气管哮喘已经成为全球范围内函待解决的公共卫生难题。

哮喘是由免疫、遗传和环境等多重因素共同作用的结果，其发病机制目前尚未完全明了。既往的研究多集中在Th2介导的嗜酸性粒细胞性炎症。近几年，随着遗传学和分子生物学的不断发展，哮喘遗传病因学成为研究的热点。对哮喘遗传机制及其相关基因研究已逐步深入，并证实哮喘是一种多基因遗传病。

对于大部分哮喘患者而言，传统疗法如糖皮质激素、支气管扩张剂治疗有效，临床症状得到控制，但仍有部分患者病情得不到缓解。因此必须改进对哮喘的诊断和监测以筛选出易感个体实施早期预防治疗。传统的诊断技术依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量，而哮喘的临床表现非特异性，肺功能检查不是敏感指标，部分哮喘患者肺功能检查表现为正常或变化不明显。生物标志物的分析，提供了一个有应用前途、非侵入性的方法来诊断哮喘、检测炎症和评价疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供与哮喘发生发展相关的生物标志物用于哮喘的早期诊断，以期实现哮喘的早期治疗。

本发明提供了检测PNMA6A的试剂在制备诊断哮喘的产品中的应用。

进一步，所述试剂包括：通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测样本中PNMA6A基因表达水平用试剂。其中样本包括(但不限于)血液、血清、血浆、痰、组织活检物(例如肺样品)。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

进一步，所述样本为人外周血。

本发明提供了一种体外检测样本中PNMA6A表达水平的产品，所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，其中，基因芯片包括针对PNMA6A的特异性引物或探针，蛋白质芯片包括特异性结合PNMA6A编码的蛋白的抗体或配体。

一方面，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。优选的，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PNMA6A基因转录水平的针对PNMA6A基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的PNMA6A蛋白的特异性抗体或配体。

其中，所述基因芯片可用于检测包括PNMA6A基因在内的多个基因(例如，与哮喘相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PNMA6A蛋白在内的多个蛋白质(例如与哮喘相关的多个蛋白质)的表达水平。

进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒，其中，所述基因检测试剂盒包括检测PNMA6A的特异性引物、探针或基因芯片；所述蛋白免疫检测试剂盒包括特异性结合PNMA6A蛋白的抗体、配体或蛋白质芯片。

进一步，所述特异性扩增PNMA6A基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种诊断哮喘的试剂盒，所述试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因和PNMA6A基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

进一步，扩增PNMA6A基因的引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；扩增管家基因GAPDH的引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步，所述检测试剂盒还包括使用说明书或标签。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了PNMA6A基因表达与哮喘的发生发展相关，对于揭示哮喘的发病机理具有重要的意义。

本发明提供了一种诊断产品，通过检测血液中PNMA6A的表达水平，实现哮喘的早期诊断，从而提高哮喘患者的生活质量。

附图说明

图1是利用QPCR检测PNMA6A基因在哮喘患者中的表达情况图；

图2是利用免疫印迹在蛋白水平上检测PNMA6A基因的差异表达的图。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测哮喘患者和正常人血液中基因的表达水平，发现其中具有明显具有差异表达的基因，探讨其与哮喘的发生之间的关系，从而为哮喘的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了PNMA6A在哮喘患者中显著性下调，为哮喘的诊断提供了一种新途径。

本发明中术语“分子标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，PNMA6A包括包含SEQ ID NO.2的多肽和其它PNMA6A天然序列多肽，诸如天然存在变体和天然序列多肽，其由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码。

本发明所述的分子标志物包括基因和蛋白。此类标志物包括含有编码分子标志物的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的DNA。分子标志物核酸还包括含有所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。分子标志物蛋白是由本发明的DNA分子标志物编码的或对应于本发明的DNA分子标志物的蛋白。分子标志物蛋白包含任何分子标志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。分子标志物基因和蛋白的片段和变体也包括在本发明的范围内。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录或翻译(即蛋白)水平上检测生物标志物的表达水平。

在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组DNA(例如，来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA，包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。

核酸杂交形式的选择不是关键的。多种核酸杂交形式包括但不限于夹心测定和竞争或替代测定。杂交复合物的检测可需要产信号复合物与靶标和探针多核苷酸或核酸的双螺旋的结合。通常，这种结合通过配体和抗配体相互作用而发生，例如配体偶联的探针和偶联有信号的抗配体之间的相互作用。通过暴露于超声能，信号生成复合物的结合也易于得到加速。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如，DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则，可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片，其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如，来自个体或群体，例如，包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时，样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交，有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中，由此确定核酸中发现的标志物是否存在。还可以使用这一手段通过控制杂交条件以允许区别单一核苷酸，例如，用于SNP鉴定和一种或多种SNP的样品基因分型来进行ASH。阵列提供了一种同时(或串连)检测多个多态性标志物的便利性实施方案。

上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中使用的针对上述PNMA6A蛋白质的抗体以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体制备物的优势在于它们一般未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括：杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示技术、、及用于自具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)²或抗体的其它抗原结合子序列。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)²和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠结构中散发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，促成结合抗原的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也可具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

本发明的抗体的“功能性片段”指那些保留与衍生它们的完整全链分子以基本上相同的亲和力结合多肽且在至少一种测定法中有活性(例如抑制TH2诱导的哮喘途径，诸如在小鼠模型中，或在体外抑制抗体片段结合的抗原的生物学活性)的片段。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

实施例

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与哮喘相关的基因标志物

1、样品收集

按照支气管哮喘诊断与防治指南的诊断标准，各收集10例正常人血液和哮喘患者血液外周静脉血3ml，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备及质量分析

2.1RNA样品的制备

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中；

2)3000rpm(400g)离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；

3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物，3000rpm离心5min；

4)重复步骤3两次(共三次)；

5)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认一下BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μl RNA裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；

6)加350μl RNA稀释液，颠倒混合3-4次，室温下13000g离心10min，将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；

7)向澄清裂解液中加入200μl 95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；

8)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体，13000g离心1min；

9)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；

10)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液(确认已加入乙醇)，13000g离心1min；

11)加入600μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，13000g，离心1min；

12)清空收集管，向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min；

13)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于-70℃。

2.2RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

4、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当FDR<0.05时，认为mRNA显著差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，PNMA6A基因在哮喘患者血液中的表达量显著低于正常人的表达量。

实施例2QPCR测序验证PNMA6A基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择PNMA6A基因进行大样本QPCR验证。

按照实施例1中的方法收集选择哮喘患者血液和正常人血液样本各80例。

2、RNA提取 步骤同实施例1。

3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：

(1)取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀；70℃水浴5min后立即冰浴2-3min；

(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至25μl；

(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV；

(4)-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中PNMA6A基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

PNMA6A基因：

正向引物为5’-CACCTTACTGAGCCTCTG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-CAGCATCTCCAAGAAACT-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)配制25μl PCR反应体系：

向无菌EP管中加入去离子水8.5μl、SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl、正(反)向引物1μl、SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl、模板2μl混合均匀；其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与正常人血液相比，PNMA6A基因在哮喘患者血液中的表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3蛋白水平验证PNMA6A的差异表达

按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品中蛋白浓度。以常规Western-blot方法检测PNMA6A蛋白变化，各组实验均重复3次，以β-actin为内参，做PNMA6A蛋白条带吸光度定量分析，表达量以PNMA6A蛋白/β-actin吸光度的比值代表。

结果如图2所示，与正常人相比，哮喘患者中PNMA6A的蛋白水平显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种与哮喘发生发展相关的基因的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atggcggtga ccatgctgca ggactggtgc cggtggatgg gggtcaacgc tcgcaggggc 60

ctgctcatcc tgggcatccc ggaggactgt gatgatgccg aattccaaga gtccctcgag 120

gctgccctga ggcctatggg acactttaca gtgctaggca aagcgtttcg agaggaggat 180

aatgccaccg cggccctggt cgagctcgac cgggaagtca actatgcttt ggtccccagg 240

gaaatccccg gcactggggg cccgtggaac gtggtctttg tgccccgttg ctcaggcgag 300

gagtttctcg gtctcggtcg cgtgttccac ttcccggagc aagaggggca gatggtggag 360

agcgtggccg gcgccctggg tgtggggctg cgcagggtgt gctggctgcg atccatcggt 420

caggcggtcc agccctgggt ggaggccgtg aggtgccaga gcctgggcgt gttttccggg 480

agggaccagc cagccccagg ggaggagtcc tttgaggtct ggctagacca caccaccgaa 540

atgctgcatg tgtggcaggg ggtctcggaa agggagagga ggaggaggct gctggaaggc 600

ttgcgtggga ccgccctgca gctcgtgcac gcgctcctgg cggagaaccc cgccaggacg 660

gcgcaggact gtctggcggc cctggcccag gtgtttggag acaacgagtc ccaggcgacc 720

atccgggtga agtgtctgac cgctcagcag cagtcaggcg agcgtctctc agctttcgtg 780

ttgcggctgg aagtgctgct gcagaaggcc atggagaagg aggccctggc cagagcatcc 840

gccgaccgcg tgcgcctgag gcagatgctc accagggccc accttactga gcctctggat 900

gaagcactga ggaagctgag aatggccggg aggtctccaa gtttcttgga gatgctgggg 960

ctcgttcggg agtctgaggc atgggaggcc agtctagcca ggagcgtgag agcccagaca 1020

caggaagggg ccggtgcccg ggctggtgcc caggctgttg ccagagccag cactaaagta 1080

gaggcggtcc caggaggtcc tggtcgggag ccagagggcc tcctccaggc aggaggccag 1140

gaggctgagg agctcctcca ggaggggctc aagcccgtcc tggaggaatg tgataactag 1200

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Ala Val Thr Met Leu Gln Asp Trp Cys Arg Trp Met Gly Val Asn

1 5 10 15

Ala Arg Arg Gly Leu Leu Ile Leu Gly Ile Pro Glu Asp Cys Asp Asp

20 25 30

Ala Glu Phe Gln Glu Ser Leu Glu Ala Ala Leu Arg Pro Met Gly His

35 40 45

Phe Thr Val Leu Gly Lys Ala Phe Arg Glu Glu Asp Asn Ala Thr Ala

50 55 60

Ala Leu Val Glu Leu Asp Arg Glu Val Asn Tyr Ala Leu Val Pro Arg

65 70 75 80

Glu Ile Pro Gly Thr Gly Gly Pro Trp Asn Val Val Phe Val Pro Arg

85 90 95

Cys Ser Gly Glu Glu Phe Leu Gly Leu Gly Arg Val Phe His Phe Pro

100 105 110

Glu Gln Glu Gly Gln Met Val Glu Ser Val Ala Gly Ala Leu Gly Val

115 120 125

Gly Leu Arg Arg Val Cys Trp Leu Arg Ser Ile Gly Gln Ala Val Gln

130 135 140

Pro Trp Val Glu Ala Val Arg Cys Gln Ser Leu Gly Val Phe Ser Gly

145 150 155 160

Arg Asp Gln Pro Ala Pro Gly Glu Glu Ser Phe Glu Val Trp Leu Asp

165 170 175

His Thr Thr Glu Met Leu His Val Trp Gln Gly Val Ser Glu Arg Glu

180 185 190

Arg Arg Arg Arg Leu Leu Glu Gly Leu Arg Gly Thr Ala Leu Gln Leu

195 200 205

Val His Ala Leu Leu Ala Glu Asn Pro Ala Arg Thr Ala Gln Asp Cys

210 215 220

Leu Ala Ala Leu Ala Gln Val Phe Gly Asp Asn Glu Ser Gln Ala Thr

225 230 235 240

Ile Arg Val Lys Cys Leu Thr Ala Gln Gln Gln Ser Gly Glu Arg Leu

245 250 255

Ser Ala Phe Val Leu Arg Leu Glu Val Leu Leu Gln Lys Ala Met Glu

260 265 270

Lys Glu Ala Leu Ala Arg Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Leu Arg Gln

275 280 285

Met Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Pro Leu Asp Glu Ala Leu Arg

290 295 300

Lys Leu Arg Met Ala Gly Arg Ser Pro Ser Phe Leu Glu Met Leu Gly

305 310 315 320

Leu Val Arg Glu Ser Glu Ala Trp Glu Ala Ser Leu Ala Arg Ser Val

325 330 335

Arg Ala Gln Thr Gln Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ala Gly Ala Gln Ala

340 345 350

Val Ala Arg Ala Ser Thr Lys Val Glu Ala Val Pro Gly Gly Pro Gly

355 360 365

Arg Glu Pro Glu Gly Leu Leu Gln Ala Gly Gly Gln Glu Ala Glu Glu

370 375 380

Leu Leu Gln Glu Gly Leu Lys Pro Val Leu Glu Glu Cys Asp Asn

385 390 395

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccttactg agcctctg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagcatctcc aagaaact 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (10)

1.检测PNMA6A的试剂在制备诊断哮喘的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测样本中PNMA6A基因表达水平用试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样本选自人外周血。

5.一种体外检测样本中PNMA6A表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，其中，基因芯片包括针对PNMA6A的特异性引物或探针，蛋白质芯片包括特异性结合PNMA6A编码的蛋白的抗体或配体。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒，其中，所述基因检测试剂盒包括检测PNMA6A的特异性引物、探针或基因芯片；所述蛋白免疫检测试剂盒包括特异性结合PNMA6A蛋白的抗体、配体或蛋白质芯片。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述特异性扩增PNMA6A基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

9.一种诊断哮喘的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因和PNMA6A基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，扩增PNMA6A基因的引物对如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；扩增管家基因GAPDH的引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。