CN110257504A - 一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用 - Google Patents

一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用。本发明首次发现了CTSC基因表达与哮喘严重程度及难治性哮喘的发生发展相关，通过筛选难治性哮喘的非侵入式的诱导痰标志物，检测诱导痰中CTSC基因表达量，并将其用于制备难治性哮喘的早期诊断试剂盒。本发明有助于难治性哮喘的进展评估，可实现难治性哮喘的早期无创诊断和哮喘的早期治疗，具有创伤小、检测便捷、敏感性高、患者接受程度高的优势。

Description

一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用。
背景技术
难治性哮喘一种异质性疾病，采用传统的高剂量全身性皮质类固醇治疗或是口服类固醇或生物制剂等无法有效治疗控制该疾病。虽然难治性哮喘患者仅占所有哮喘患者的5％左右，但这些患者的生活质量严重受损，占据哮喘相关医疗费用的一半以上。因此，必须改进对难治性哮喘的诊断和监测以尽早筛选出难治性哮喘的易感个体并实施早期靶向干预治疗。现有传统的难治性哮喘的诊断依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量。但是，难治性哮喘的临床表现具有显著的异质性，传统的诊断方法不能早期、明确诊断难治性哮喘的易感性和严重程度。
难治性哮喘主要的病理改变以气道的动态结构变化为特征，包括大气道和小气道并涉及支气管壁的所有层。这种病理性气道结构变化被统称为气道重塑，主要包括气道上皮损伤修复、基底膜增厚、成纤维细胞活化、平滑肌肥大迁移和血管生成。研究证实气道重塑是难治性哮喘表型的重要决定因素，其与肺功能不可逆转的损失有关。最重要的是，气道重塑已被证实在难治性哮喘的发病机制和治疗效果中发挥重要作用。但是难治性哮喘存在的气道重塑病理改变临床尚无明确的早期诊断依据和有效的临床治疗方法。气道上皮细胞是机体抵御外部环境的第一道屏障细胞，已被证实是气道重塑的起始和发展的核心。但是，难治性哮喘患者气道上皮细胞存在哪些气道重塑的关键差异基因仍不清楚。
现有难治性哮喘的临床诊断依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量。由于难治性哮喘的临床表现具有显著的异质性，传统的诊断方法不能早期、明确诊断难治性哮喘的易感性和严重程度。因此，寻找新的特异生物标志物将为难治性哮喘的诊断、病情监测和疗效评价提供一个新的、有应用前途、非侵入性的临床监测指标。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用，目的是通过筛选难治性哮喘的非侵入式的诱导痰标志物，检测诱导痰中CTSC基因表达量，并将其用于制备难治性哮喘的早期诊断试剂盒，有助于解释难治性哮喘的发病机理和进展评估，实现难治性哮喘的早期无创诊断和哮喘的早期治疗，具有创伤小、检测便捷、敏感性高、患者接受程度高的优势。
本发明的难治性哮喘的检测标记物的筛选方法，所述的难治性哮喘的检测标记物是CTSC基因，按照以下步骤进行：
(1)收集临床明确诊断为哮喘病人及健康对照测试者的诱导痰中的原代气道上皮细胞：
进行细胞分类和活力检测，合格标准为上皮细胞<10个/低倍镜视野，白细胞>25个/低倍镜视野，细胞存活率>40％，筛选鉴定细胞，采用免疫磁珠分选法进行标记，并进一步筛选纯化原代气道上皮细胞；
(2)mRNA转录组测序分析：
进一步筛选纯化后，加入洗脱、片段化和随机引物组成的缓冲液，将磁珠94℃高温孵育，洗脱结合的mRNA同时进行热断裂，使片段分布在100-300bp之间；以片段化且结合了随机逆转录引物的短片段mRNA为模板，在Invitrogen逆转录酶SuperScript IV的作用下进行第一链cDNA的合成，向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，并以一链cDNA为模板，DNA聚合酶合成二链cDNA，经过AgencourtAMpure XP磁珠纯化，最终得到双链ds cDNA；
向纯化后的ds cDNA加入末端补齐体系，其是含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合，最终得到5’端含有磷酸基团的平末端ds cDNA短片段文库；向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系；向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头；
对于加上接头的文库，应用Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选，最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库；
用聚合酶放大原始文库，PCR扩增循环数控制在12-15之间，放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；
对构建好的测序文库进行质检和定量；
对于质检合格的文库经过稀释后按等摩尔数对多个样品进行混样上机，对文库进行测序；
对测序结果进行生物信息学分析，使用tophat2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对，利用cufflinks的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量，利用cuffdiff软件分析差异表达基因，当adj.p-value<0.05时，认为mRNA显著差异表达；
(3)利用健康对照、非难治性哮喘及难治性哮喘患者气道上皮细胞的mRNA转录组测序数据进行差异基因分析，通过对差异基因进行信号通路和富集分析，明确与气道重塑相关性最高的差异基因，确定难治性哮喘的候选生物标志物：
筛选差异表达基因：通过R语言筛选相对于健康对照与非难治性哮喘，在难治性哮喘患者气道上皮细胞差异表达的基因，并通过Benjamini-Hochberg方法对p值进行校正；
差异表达基因筛选参数：Log FC>1,adj.p-value<0.05；
信号通路和富集分析：通过metascape.org在线网站对差异表达基因进行信号通路和富集分析，筛选出与气道重塑相关性最高的差异表达基因；
根据信号通路和富集分析结果，CTSC是与气道重塑的相关性最高的差异基因，可能是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物；
(4)采用大样本量qPCR验证CTSC基因的差异表达，最终确定CTSC是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物。
其中，所述的含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合包括外切酶、聚合酶和磷酸激酶，其中的外切酶活性消化3’端的单链突出，而聚合酶(Polymerase)活性补齐5’端的突出；同时磷酸激酶在5’末端加上后续连接反应必需的磷酸基团，再经过Agencourt AMpureXP磁珠纯化。
所述的在末端修饰完成的双链cDNA两边3’末端加上单个腺苷酸“A”，防止cDNA片段之间的平末端自连，与下一步测序接头5’末端的单个“T”突出互补配对。
所述的连接缓冲液中含有T4DNA连接酶，利用T4DNA连接酶将illumina测序接头连接至文库DNA两端，反应条件为30℃孵育10分钟。
所述的文库片段大小筛选，采用两步法，先用SPRI磁珠去掉目标区域左侧小片段，再去掉位于目标片段区域右侧的大片段最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库，用于下一步的PCR扩增。
所述的对构建好的测序文库进行质检和定量是应用Qubit准确定量文库浓度，用于准确混样，保证每个样本的数据量合适均衡，应用Agilent2100Bioanalyzer确定文库片段大小分布，评估适合上机。
所述的对文库进行测序是采用illumina Hiseq平台，2×150的双端测序策略对文库进行测序。
所述的PCR扩增采用蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附测定、免疫组化、流式类基因检测方法替代。
一种难治性哮喘检测标记物，用于制备难治性哮喘的早期诊断的制剂、芯片或试剂盒。
其中，所述难治性哮喘的早期诊断试剂盒中含有SYBR Green聚合酶链式反应体系，用于扩增管家基因和CTSC基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括：SYBRGreen荧光染料，PCR缓冲液和dNTPs。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明首次发现了CTSC基因表达与哮喘严重程度及难治性哮喘的发生发展相关，对于解释难治性哮喘的发病具有重要意义；
本发明首先通过mRNA转录组测序分析对比了难治性哮喘病人、非难治性哮喘病人和健康对照人群诱导痰中气道上皮细胞的差异表达基因。其中3’末端加“A”缓冲反应体系时，在末端修饰完成的双链cDNA两边3’末端加上单个腺苷酸“A”，能够防止cDNA片段之间的平末端自连，而可以与下一步测序接头5’末端的单个“T”突出互补配对，准确连接，有效降低文库片段之间自身的串联；对文库进行纯化后，去掉了体系中过量的测序接头，和接头自连的产物，避免PCR放大过程的无效扩增，消除对上机测序的影响；PCR扩增cDNA文库时，应用高保真的聚合酶放大原始文库，以保证上测序仪的足够文库总量，同时也只有两端都带上接头的DNA片段能够被扩增，去除掉只连接单端接头的片段，PCR扩增循环数控制在12-15之间(一般1μg起始的总RNA，最终文库放大控制在15个循环)；在保证产物足够的前提下，减少因扩增循环数过大而引入的bias，放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库。
本发明通过信号通路和富集分析进一步筛选发现CTSC是与哮喘气道重塑相关性最高的差异基因。在此基础上进一步扩大样本量验证在难治性哮喘病人、非难治性哮喘病人和健康对照人群气道上皮细胞中CTSC的mRNA表达水平。将CTSC的表达水平与哮喘病人肺功能、哮喘控制测试ACT评分进行相关性分析，结果显示哮喘病人气道上皮细胞中的CTSC表达水平和哮喘病人的FEV1及哮喘病人ACT评分存在负相关关系。
本发明还提供了一种诊断产品，通过检测诱导痰气道上皮细胞中的CTSC的表达水平，实现难治性哮喘的早期无创诊断，以期实现哮喘的早期治疗。
本发明还提供了检测CTSC表达的产品在制备诊断难治性哮喘的产品中的应用。CTSC的表达增高不仅表达在哮喘患者诱导痰的气道上皮细胞，还体现在多种炎症细胞。因此，除了诱导痰的气道上皮细胞外，在诱导痰的其他类型细胞、支气管肺泡灌洗液、外周血或者组织活检物(例如肺样本)都能检测到CTSC的表达增高。因此所述产品包括制剂、芯片或试剂盒等本领域已知的任何检测基因表达的产品，其中样本包括(但不限于)诱导痰、支气管肺泡灌洗液、血液、血清、血浆与组织活检物(例如肺样本)。
CTSC的表达增高不仅可以通过qPCR，还可通过蛋白质免疫印迹，酶联免疫吸附测定，免疫组化，流式等本领域内已知的任何方法检测基因表达。
本发明通过检测诱导痰中CTSC基因表达量来用于临床哮喘患者病情的严重程度评估及难治性哮喘的早期预测，相比现有检测手段而言，具有创伤小、检测便捷、敏感性高、患者接受程度高的优势。
附图说明
图1实施例中健康对照、非难治性哮喘和难治性哮喘患者诱导痰的气道上皮细胞中表达CTSC基因的水平；
图2是实施例中哮喘病人的FEV1评分相关性图；
图3是实施例中CTSC表达水平和哮喘病人ACT评分相关性图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
本实施例的难治性哮喘生物标记物的筛选方法，包括以下步骤：
1、收集临床明确诊断为哮喘病人及健康对照测试者的诱导痰中的原代气道上皮细胞
非难治性哮喘组选取的对象为中南大学湘雅医院确诊并且符合诊断标准与排除标准的6人，难治性哮喘组选取的对象为中南大学湘雅医院确诊并且符合诊断标准与排除标准的6人，对照组选择同一时间段在中南大学湘雅医院体检无明显异常人群6人。所有受试者均告知入组的目的，并且全部都签署了知情同意书，并对两组间的性别、年龄、身高进行比较发现无显著性差异。收集病例的时间为2016年1月到2016年12月。
支气管哮喘诊断标准：支气管哮喘防治指南中的支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案，具体如下：
(1)反复发作喘息、气急、胸闷或咳嗽，多与接触变应原、冷空气、物理、化学性刺激、病毒性上呼吸道感染、运动等有关。
(2)发作时在双肺可闻及散在或弥漫性，以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长。
(3)上述症状可经治疗缓解或自行缓解。
(4)除外其他疾病所引起的喘息、气急、胸闷或咳嗽。
(5)临床症状不典型者(如无明显喘息或体征)应至少具备以下一项试验阳性：
①支气管激发试验或运动试验阳性；
②支气管舒张试验阳性(FEV1增加15％以上，且FEV1绝对值增加>200ml)；
③PEF日内变异率或昼夜波动率≥20％。
符合以上1～4条或4、5条者，可诊断为哮喘。
难治性哮喘诊断标准：
(1)符合我国哮喘防治指南中哮喘的诊断标准；
(2)排除患者治疗依从性不良,并排除诱发加重或使哮喘难以控制的因素；
(3)按照我国哮喘防治指南,采用第4级治疗方案:即2种或2种以上控制性药物规范治疗和管理6个月以上,尚不能达到理想控制。
符合以上3条标准的患者,可诊断为难治性哮喘。
非难治性哮喘诊断标准：
(1)符合我国哮喘防治指南中哮喘的诊断标准；
(2)排除符合难治性哮喘诊断标准的哮喘患者。
符合以上2条标准的患者,可诊断为非难治性哮喘。
2、标本采集
(1)收集诱导痰标本:采用氧气雾化吸入法收集受试者的诱导痰，诱导前10分钟让病人吸入喘乐宁(沙丁胺醇气雾剂)，随后检测一秒最大呼气量(FEV1)，当FEV1<70％，对病人进行自然咳痰或等渗盐水诱导处理，反之使用梯度高渗盐水诱导，每两分钟一次。痰液诱导完成后显微镜下进行细胞分类和活力检测，合格标准为上皮细胞<10个/低倍镜视野，白细胞>25个/低倍镜视野，细胞存活率>40％。
(2)标记筛选痰液中的人原代气道上皮细胞(sHBEC)
a.痰液收集后，离心，PBS重悬痰液细胞，排除总细胞计数低于800,000的样本。
b.痰液中的HBEC(sHBECs)筛选并鉴定为EGFR+CD326+CD138-细胞。首先通过免疫磁珠分选法对EGFR+细胞进行标记：按100μl/108个细胞数量加入FcR阻断试剂以阻断非特异性结合；按100μl/5×106个EGFR+细胞的量加入抗EGFR+微磁珠，充分混匀，6～12℃孵育20min；用PBS洗涤3次，以2×108细胞/ml重悬。用30μm的尼龙滤网过滤除去小的凝块，将上述细胞加至磁铁分离柱中，重力作用下流尽液体，从磁铁分离器上取下柱子，用特殊注射器吸取冲洗液加压注入，洗脱下吸附的EGFR+细胞。纯化效率用流式细胞仪测定，筛选出EGFR+细胞后，利用流式细胞仪进一步筛选纯化D326+CD138-细胞。
3、mRNA转录组测序分析
(1)提取RNA，具体步骤如下：
①取纯化后的原代气道上皮细胞转移至1.5ml离心管。加入1ml Trizol，混匀，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。4℃，12000g，离心15min。
②取上层水相，加入0.5ml异丙醇，轻轻震荡5s，室温放置10min。4℃，12000g，离心15min。
③75％乙醇洗两次，室温放置至干燥。将RNA溶于50μl无核酶水，用紫外分光光度计测定RNA的浓度。
(2)RNA质量检测
①RNA的浓度和总量：Qubit精确定量浓度；
②RNA的纯度：Nanodrop检测OD260/280和260/230的比值；
③RNA的完整度：琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100Bioanalyzer检测RNA的降解程度；
RNA样品总量在1-4μg之间，260/280比值在1.8-2.0之间，或者Agilent 2100Bioanalyzer检测的RIN≥8。
(3)分选纯化mRNA及片段化(Purify and Fragment mRNA)
取1μg的总RNA分选mRNA，利用带有oligo-dT的磁珠特异性结合带有poly(A)结构的mRNA通过两轮的纯化，最大限度降低rRNA等与分选磁珠的非特异性结合，达到从总RNA中富集，纯化mRNA的效果。
在第二轮磁珠纯化后，加入洗脱、片段化和随机引物组成的缓冲液，方便下一步cDNA合成中的随机引物结合。将磁珠94℃高温孵育，洗脱结合的mRNA同时进行热断裂，使片段分布在100-300bp之间(该区间比较适合2×150bp的测序模式)。根据RNA的质量，调整时间来优化片段化效果。
(1)合成第一链cDNA(Synthesize First Strand cDNA)
以片段化且结合了随机逆转录引物的短片段mRNA为模板，在Invitrogen逆转录酶SuperScript IV(SS IV)的作用下进行第一链cDNA的合成。
(2)合成第二链cDNA(Synthesize Second Strand cDNA)
向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，并以一链cDNA为模板，DNA聚合酶合成二链cDNA，经过Agencourt AMpure XP磁珠纯化，最终得到双链cDNA(Double-strand cDNA，ds cDNA)；
(3)双链cDNA末端修复反应(End Repair)
向纯化后的ds cDNA加入末端补齐体系，含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合。其中的外切酶(Exonuclease)活性消化3’端的单链突出，而聚合酶(Polymerase)活性补齐5’端的突出；同时磷酸激酶(PNK)在5’末端加上后续连接反应必需的磷酸基团，经过Agencourt AMpure XP磁珠纯化，最终得到5’端含有磷酸基团的平末端ds cDNA短片段文库；
(4)3’末端加“A”反应(Adenlylate 3’Ends)
向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系。在末端修饰完成的双链cDNA两边3’末端加上单个腺苷酸“A”，防止cDNA片段之间的平末端自连，而可以与下一步测序接头5’末端的单个“T”突出互补配对，准确连接，有效降低文库片段之间自身的串联；
(5)连接测序接头(Ligate Adapters)
向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头，利用T4DNA连接酶将illumina测序接头连接至文库DNA两端。50ul反应体系在30℃孵育10分钟，快速有效的进行连接反应；
(6)文库片段筛选(Select Size)
对于加上接头的文库，应用Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选。采用两步法筛选(Double Size selection)，先用SPRI磁珠去掉目标区域左侧小片段(Left-side Size selection)，再去掉位于目标片段区域右侧的大片段(Right-side Size selection)最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库，用于下一步的PCR扩增。经过纯化后的文库，去掉了体系中过量的测序接头，和接头自连的产物，避免PCR放大过程的无效扩增，消除对上机测序的影响；
(7)PCR扩增cDNA文库(PCR Amplification)
在50μL反应体系中应用高保真的聚合酶放大原始文库，以保证上测序仪的足够文库总量。同时也只有两端都带上接头的DNA片段能够被扩增，去除掉只连接单端接头的片段。PCR扩增循环数控制在12-15之间(一般1μg起始的总RNA，最终文库放大控制在15个循环)。在保证产物足够的前提下，减少因扩增循环数过大而引入的bias。放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；
(8)文库的质量检测(Library Quality Check)
对构建好的测序文库进行质检和定量。应用Qubit准确定量文库浓度，用于准确混样，保证每个样本的数据量合适均衡。应用Agilent2100Bioanalyzer确定文库片段大小分布，评估适合上机。
(9)混样并进行上机测序(Pool Library and Sequencing)
对于质检合格的样品经过稀释后按等摩尔数对多个样品进行混样上机。采用illuminaHiseq平台，2×150的双端测序策略对文库进行测序。
(10)高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析，使用tophat2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对，利用cufflinks的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量，利用cuffdiff软件分析差异表达基因。当adj.p-value<0.05时，认为mRNA显著差异表达。
4、利用健康对照，非难治性哮喘及难治性哮喘患者气道上皮细胞的mRNA转录组测序数据进行差异基因分析，通过对差异基因进行信号通路和富集分析，明确与气道重塑相关性最高的差异基因，确定难治性哮喘的候选生物标志物。
筛选方法
(1)筛选差异表达基因：通过R语言筛选相对于健康对照与非难治性哮喘，在难治性哮喘患者气道上皮细胞差异表达的基因，并通过Benjamini-Hochberg方法对p值进行校正。
差异表达基因筛选参数：Log FC>1,adj.p-value<0.05。
(2)信号通路和富集分析：通过metascape.org在线网站对差异表达基因进行信号通路和富集分析，筛选出与气道重塑相关性最高的差异表达基因。
筛选结果
根据信号通路和富集分析结果，CTSC是与气道重塑的相关性最高的差异基因，可能成为难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物。
5、采用大样本量qPCR验证CTSC基因的差异表达：
(1)按照1中的方法收集非难治性哮喘88人，难治性哮喘46人，健康对照测试者120人。
(2)按照2中的方法收集诱导痰标本并提取人原代气道上皮细胞。
(3)按照3中的方法提取RNA。
(4)逆转录：使用Sigma公司的反转录试剂盒进行操作，具体步骤如下：取1μgRNA，根据上述已测的RNA浓度，计算出需要加入的RNA体积，应用随机引物1μl Oligo引物1μl和无核酶水配制12μl反应体系，在65℃条件下变性5min。应用AMV逆转录酶和RNase抑制剂在25℃5min，42℃60min，70℃5min条件下进行逆转录反应。
(5)Real-Time qPCR：
①引物设计:根据Genebank中CTSC基因与GAPDH编码基因序列设计QPCR扩增引物，由上海生物生工技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
CTSC基因：
正向引物为：5’-CGGCTTCCTGGTAATTCTTC-3’
反向引物为：5’-GTGGTCCCATAACCGAGCAG-3’
GAPDH基因：
正向引物为：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’
反向引物为：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’
②配置25μl反应体系：SYBR green Mix 12.5μl，去离子水8.5μl，正(反)向引物1μl，模板2μl，混合均匀。其中SYBR green Mix购自于TAKARA公司。
③PCR反应条件:95℃30s，95℃5s，60℃30s，40cycles。以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过△△CT法进行相对定量。
结果如图1所示，相对于健康对照，CTSC基因在哮喘患者诱导痰的气道上皮细胞中表达上调，差异具有统计学差异(P<0.05)；相对于健康对照与非难治性哮喘，难治性哮喘患者诱导痰的气道上皮细胞中CTSC表达显著上调，差异具有统计学差异(P<0.01)。
6、CTSC与哮喘病人的气道阻力，哮喘控制测试ACT评分的相关性分析：
根据样品的分组信息，Benjamin-Hochberg方法用于控制错误发现率(FDR)，皮尔森相关性用于评估CTSC表达水平和哮喘病人的肺功能(FEV1)、哮喘控制测试ACT评分之间的关联。统计分析采用R语言和SPSS.19软件完成，p<0.05被认为具有统计学意义。
结果如图2所示，CTSC表达水平和哮喘病人的FEV1及哮喘病人ACT评分存在负相关关系，与图3对照，提示CTSC可作为生物标记物应用于临床哮喘严重程度及难治性哮喘的诊断与疗效评估。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述难治性哮喘检测标记物为CTSC基因，其按照以下步骤进行：
(1)收集临床明确诊断为哮喘病人及健康对照测试者的诱导痰中原代气道上皮细胞：
进行细胞分类和活力检测，合格标准为上皮细胞<10个/低倍镜视野，白细胞>25个/低倍镜视野，细胞存活率>40％，筛选鉴定细胞，采用免疫磁珠分选法进行标记并进一步筛选纯化原代气道上皮细胞；
(2)mRNA转录组测序分析：
①进一步筛选纯化后，加入洗脱、片段化和随机引物组成的缓冲液，将磁珠94℃高温孵育，洗脱结合的mRNA同时进行热断裂，使片段分布在100-300bp之间；以片段化且结合了随机逆转录引物的短片段mRNA为模板，在Invitrogen逆转录酶SuperScript IV的作用下进行第一链cDNA的合成，向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，并以一链cDNA为模板，DNA聚合酶合成二链cDNA，经过Agencourt AMpureXP磁珠纯化，最终得到双链ds cDNA；
②向纯化后的ds cDNA加入末端补齐体系，其是含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合，最终得到5’端含有磷酸基团的平末端ds cDNA短片段文库；向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系；向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头；
③对于加上接头的文库，应用Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选，最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库；
④用聚合酶放大原始文库，PCR扩增循环数控制在12-15之间，放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；
⑤对构建好的测序文库进行质检和定量；
⑥对于质检合格的文库经过稀释后按等摩尔数对多个样品进行混样上机，对文库进行测序；
⑦对测序结果进行生物信息学分析，使用tophat2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对，利用cufflinks的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量，利用cuffdiff软件分析差异表达基因，当adj.p-value<0.05时，认为mRNA显著差异表达；
(3)利用健康对照、非难治性哮喘及难治性哮喘患者气道上皮细胞的mRNA转录组测序数据进行差异基因分析，通过对差异基因进行信号通路和富集分析，明确与气道重塑相关性最高的差异基因，确定难治性哮喘的候选生物标志物：
①筛选差异表达基因：通过R语言筛选相对于健康对照与非难治性哮喘，在难治性哮喘患者气道上皮细胞差异表达的基因，并通过Benjamini-Hochberg方法对p值进行校正；
②差异表达基因筛选参数：Log FC>1,adj.p-value<0.05；
③信号通路和富集分析：通过metascape.org在线网站对差异表达基因进行信号通路和富集分析，筛选出与气道重塑相关性最高的差异表达基因；
④根据信号通路和富集分析结果，CTSC是与气道重塑的相关性最高的差异基因，可能是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物；
(4)采用大样本量qPCR验证CTSC基因的差异表达，最终确定CTSC是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物。
2.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述的含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合包括外切酶、聚合酶和磷酸激酶，其中的外切酶活性消化3’端的单链突出，而聚合酶(Polymerase)活性补齐5’端的突出；同时磷酸激酶在5’末端加上后续连接反应必需的磷酸基团，再经过Agencourt AMpure XP磁珠纯化。
3.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述的在末端修饰完成的双链cDNA两边3’末端加上单个腺苷酸“A”，防止cDNA片段之间的平末端自连，与下一步测序接头5’末端的单个“T”突出互补配对。
4.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述的连接缓冲液中含有T4 DNA连接酶，利用T4 DNA连接酶将illumina测序接头连接至文库DNA两端，反应条件为：30℃孵育10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述文库片段大小筛选采用两步法，先用SPRI磁珠去掉目标区域左侧小片段，再去掉位于目标片段区域右侧的大片段最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库，用于下一步的PCR扩增。
6.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述对构建好的测序文库进行质检和定量是应用Qubit准确定量文库浓度，用于准确混样，保证每个样本的数据量合适均衡，应用Agilent2100 Bioanalyzer确定文库片段大小分布，评估适合上机。
7.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述的对文库进行测序是采用illumina Hiseq平台，2×150的双端测序策略对文库进行测序。
8.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述PCR扩增可采用蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附测定、免疫组化、流式类基因检测方法替代。
9.根据权利要求1所述的一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述诱导痰等同替代为包括但不限于支气管肺泡灌洗液、外周血与组织活检物。
10.一种难治性哮喘检测标记物的应用，用于制备难治性哮喘的早期诊断试剂、芯片或试剂盒，所述难治性哮喘的早期诊断试剂盒中含有SYBR Green聚合酶链式反应体系，用于扩增管家基因和CTSC基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液和dNTPs。
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