CN117731666A - 一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，本发明的石蒜碱氧酯及其盐应用于抗冠状病毒，可显著抑制SARS‑CoV‑2的GD108株引起的细胞病变(CPE)，且药效较阳性药瑞德西韦更好；同时对冠状病毒四种变异株Alpha株、Beta株、Delta株和Omicron株都有很好的抑制作用。体内对金黄地鼠的抗病毒实验表明，石蒜碱氧酯对染毒动物也有显著抗病毒作用，为进一步开发抗冠状病毒药物奠定了基础,具有重要的开发价值和广泛的应用前景。且本发明药物原材料毒性小，安全性高；其来源丰富，应用于抗冠状病毒药物的制备，降低冠状病毒的感染，对于冠状病毒的预防和治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用。
背景技术
新型冠状病毒疫情(COVID-19)已扩散至全球各个国家。该病毒主要经呼吸道飞沫和接触传播，对人群普遍易感并且可通过无症状感染者进行传播。据世界卫生组织(WHO)最新统计数据，截至目前，全球COVID-19确诊病例已超过5亿例，累计死亡超过600万例。多国面临具有超强传染能力的变异病毒产生的疫情多次暴发的难题。病毒变异已经导致研发上市的新冠疫苗保护力下降或无效的情况发生。目前虽有帕罗维德(Paxlovid)、莫努匹韦(Molnupiravir)、阿兹夫定(Azvudine)等新冠病毒治疗药物上市，但新冠病毒变异太快，已上市或即将上市的药物多为核苷类药物副作用较大且治疗一段时间后易产生耐药性。因此，抗新型冠状病毒的新药发现，是防控措施的重要组成部分，新药发现将为临床防治新型冠状病毒病提供重要的治疗方案。
石蒜的鳞茎作为传统天然药物应用有着悠久的历史。石蒜科植物在我国的分布较为广泛，石蒜碱等生物碱类化合物是其中的主要成分。研究表明，石蒜碱具有较强的广谱抗病毒作用，包括冠状病毒(SARS-CoV)、登革热病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)、逆转录病毒(HIV-1)、单纯疱疹病毒(HSV-1)、脊髓灰质炎病毒(PV)、肠道病毒(EV71)、流感病毒(H5N1)、丙肝病毒(HCV)、黄热病病毒(YFV)、寨卡病毒(ZIKV)等。近期研究报道，石蒜碱具有体外抗冠状病毒(SARS-CoV-2)活性，且作用强度与瑞德西韦相当。由于石蒜碱本身具有亲水性强、代谢稳定性差及毒副作用较大等成药性缺陷，因此，石蒜碱类广谱抗病毒药物的开发是当务之急。
发明内容
针对现有技术所存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种够显著抑制SARS-CoV-2诱导的细胞病变，具有较好的体外抑制活性的石蒜碱氧酯及其盐在制备抗冠状病毒药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，所述石蒜碱氧酯及其盐的结构式如式I、II所示，
进一步地，所述盐为无机盐或有机盐，选自盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、甲酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐中的任意一种。
进一步地，所述冠状病毒毒株包括新冠病毒GD108株、Alpha株、Beta株、Delta株和Omicron株。
进一步地，所述冠状病毒包括石蒜碱氧酯及其盐显著抑制SARS-CoV-2诱导的细胞病变。
进一步地，所述抗冠状病毒药物包括石蒜碱氧酯及其盐和药学上可接受的载体和辅料。
进一步地，所述抗冠状病毒药物剂型为经胃肠道给药剂型和非经胃肠道给药剂型；所述经胃肠道给药剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂溶液剂乳剂或混悬剂；所述非经胃肠道给药剂型包括注射剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型和腔道给药剂型。
进一步地，所述的抗冠状病毒药物由石蒜碱氧酯及其盐与至少一种其它药物活性成分组成。
采用本发明的技术方案带来的有益效果是，一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，本发明的石蒜碱氧酯及其盐应用于抗冠状病毒，可显著抑制SARS-CoV-2的GD108株引起的细胞病变(CPE)，且药效较阳性药瑞德西韦更好；同时对冠状病毒四种变异株Alpha株、Beta株、Delta株和Omicron株都有很好的抑制作用。药物原材料毒性小，安全性高；且其来源丰富，应用于抗冠状病毒药物的制备，降低冠状病毒的感染，对于冠状病毒的预防和治疗具有重要意义。
附图说明
图1是发明实施例一提供的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151抑制SARS-CoV-2的GD108株诱导的细胞病变效应(CPE)示意图；
图2是发明实施例一提供的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY200抑制SARS-CoV-2的GD108株诱导的细胞病变效应(CPE)示意图；
图3是发明实施例一提供的石蒜碱氧酯LY151和LY200对冠状病毒敏感株GD108抗病毒效果示意图(EC50)；
图4是发明实施例一提供的石蒜碱氧酯LY151和LY200对Vero细胞的细胞毒性结果示意图(CC50)；
图5是发明实施例一提供的石蒜碱氧酯LY151对冠状病毒变异Alpha株、Beta株、Delta株和Omicron株抑制曲线和EC50值。
其中，NC为病毒阴性对照，PC为病毒阳性对照，Remdesivir为瑞德西韦阳性药。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
实施例一
本发明实施例提供了一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，所述石蒜碱氧酯及其盐的结构式如式I、II所示，
优选地，所述盐为无机盐或有机盐，选自盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、甲酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐中的任意一种。
优选地，所述冠状病毒毒株包括新冠病毒GD108株、Alpha株、Beta株、Delta株和Omicron株。
优选地，所述冠状病毒包括石蒜碱氧酯及其盐显著抑制SARS-CoV-2诱导的细胞病变。
优选地，所述抗冠状病毒药物包括石蒜碱氧酯及其盐和药学上可接受的载体和辅料。
优选地，所述抗冠状病毒药物剂型为经胃肠道给药剂型和非经胃肠道给药剂型；所述经胃肠道给药剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂溶液剂乳剂或混悬剂；所述非经胃肠道给药剂型包括注射剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型和腔道给药剂型。
优选地，所述的抗冠状病毒药物由石蒜碱氧酯及其盐与至少一种其它药物活性成分组成。所述其它药物活性成分包括治疗肺部疾病药，如治疗肺纤维化、或免疫调节药；也可包含其它抗病毒药。
实验材料
本发明实施例中使用的Vero细胞株购自美国模式培养物集存库(ATCC)；SARS-CoV/SARS-CoV-2Nucleocapsid Antibody(40143-MM08)和SARS-CoV-2(2019-nCoV)SpikeAntibody(40591-T62)购自义翘神州公司；核酸提取试剂盒(磁珠法，Y502-K30)购自济凡生物；TaqMan FastTM病毒1步法预混液(#4444434)购自Thermo Fisher Scientific；CellCounting Kit-8细胞增殖毒性检测试剂盒(CK04)购自东仁化学。
天然石蒜碱和石蒜碱衍生物LY-55均由中国医学科学院药物研究所合成；所使用毒株由国家昆明高等级生物安全灵长类动物实验中心提供，所有涉及生物安全相关实验均由中国医学科学院医学生物学研究所有资质的老师在P3实验室完成。
引物和探针(Target N)：
Forward:GACCCCAAAATCAGCGAAAT
Reverse:TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
Probe:5’-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1-3’
实验仪器
本发明实施例采用的是Thermo Scientific KingFisher Flex全自动磁珠提取纯化系统、BIO-RAD CFX384实时定量PCR仪及BioTek 800TS酶标仪。
实施例二
采用本发明实施例一的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151、LY200在10μM下抑制SARS-CoV-2的GD108株诱导的细胞病变效应(CPE)测定。
将密度为2×105/mL的Vero细胞铺于96孔板，每孔100μL，过夜贴壁培养。称取适量的石蒜碱和LY-151、LY200，用DMSO配制为10mM储存液，用DMEM或含2％FBS的DMEM将药物进行稀释得到10μM稀释液。用此待测药物处理Vero细胞1小时(96孔板，100μL/孔)后，加入病毒(100μL/孔)感染Vero细胞1小时(MOI＝0.05)，弃去药物-病毒混合物，重新加入2％FBS的DMEM稀释的药物，37℃培养箱孵育48小时。观察药物作用后的细胞病变效应。并作相应对照组。
参照附图1、2，表明本发明实施例的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151、LY200在10μM下可显著抑制SARS-CoV-2的GD108株引起的细胞病变(CPE)，且其影像效果优于阳性药瑞德西韦。
实施例三
采用本发明实施例一的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151、LY200对冠状病毒敏感株GD108抗病毒活性(EC50)效果检测。
化合物配制与攻毒实验
将密度为2×105/mL的Vero细胞铺于96孔板，每孔100μL，过夜贴壁培养。称取适量的石蒜碱和LY-151、LY200，用DMSO配制为10mM储存液。用DMEM或含2％FBS的DMEM将药物进行2倍倍比稀释(从10μM开始稀释)，共7个浓度梯度。用DMEM稀释待测药物处理Vero细胞1小时(96孔板，100μL/孔)后，加入病毒(100μL/孔)感染Vero细胞1小时(MOI＝0.05)，弃去药物-病毒混合物，重新加入2％FBS的DMEM稀释的药物，37℃培养箱孵育48小时。观察药物作用后的细胞病变情况(CPE)，取培养细胞上清液100μL，加200μL Trizol处理，用核酸提取试剂盒提取RNA进行后续实验。
实时荧光定量检测病毒RNA拷贝数
将SARS-CoV-2的N蛋白(Nucleocapsid protein)引物和FAM荧光探针(由生工生物合成)稀释为5μM，N质粒作为标准品(10ng/μL，实验室构建)稀释到10-1至10-8。在384孔白底板中继续加入以下组分并离心：
获得总体积为10μL的反应体系，设置PCR仪按如下步骤运行：
实时荧光定量PCR仪分析各孔的荧光值，通过公式：抑制率＝(病毒对照组N基因拷贝数－药物组N基因拷贝数)/病毒组对照组N基因拷贝数×100％计算化合物的对病毒复制的抑制率，并用统计软件GraphPad Prism 7作图并计算药物对病毒N基因复制的半数抑制浓度(EC50，50％inhibition concentration)。
参照附图3，本发明实施例的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151、LY200在冠状病毒GD108敏感株的抗病毒活性EC50值分别为0.7181和2.655μM，表明本发明实施例的石蒜碱氧酯LY-151、LY200具有较好的抗病毒作用。
体内对金黄地鼠的抗病毒实验表明,石蒜碱氧酯对染毒动物也有显著抗病毒作用，为进一步开发抗冠状病毒药物奠定了基础,具有重要的开发价值和广泛的应用前景。
实施例四
采用本发明实施例一的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151、LY200对Vero细胞毒性(CC50)检测(CCK8法)。
将密度为2×105/mL的Vero细胞加入96孔板，每孔100μL，过夜贴壁培养。用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，改良伊格尔培养基)或含2％FBS的DMEM培养基梯度稀释到50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0.78μM。弃去96孔板中的培养基，每孔加入200μLDMEM稀释的化合物，37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，加入100μL含CCK-8的DMEM培养基，37℃孵育2小时。设置阴性对照孔(加入0.1％DMSO)和空白对照孔(无细胞，加入DMEM)。使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度值，通过公式：抑制率＝(阴性组－药物组)/(阴性组－空白组)×100％计算化合物的细胞抑制率，其中阴性为阴性组OD平均值，药物组为化合物组OD平均值，空白为空白组OD平均值，并用统计软件GraphPad prism 7计算CC50。
参照附图4，由图中可看出，本发明实施例一的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151、LY200在冠状病毒GD108敏感株的CC50值分别为0.7181和2.655μM，
实施例五
采用本发明实施例一的抗冠状病毒药物石蒜碱氧酯LY-151对冠状病毒四种变异株Alpha株、Beta株、Delta株和Omicron株分别进行抑制活性与瑞德西韦对四种毒株抑制活性比较。比较结果见表1。
表1本发明实施例石蒜碱氧酯LY151和瑞德西韦对四种冠状病毒变异株的抑制活性
参照附图5，由图及表1中可看出，本发明实施例的石蒜碱氧酯LY-151对冠状病毒四种变异株均具有良好抑制作用，且其抑制效果优于瑞德西韦。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征是：所述石蒜碱氧酯及其盐的结构式如式I、II所示，
2.根据权利要求1所述的一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征是：所述盐为无机盐或有机盐，选自盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、甲酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征是：所述冠状病毒的毒株包括新冠病毒GD108株、Alpha株、Beta株、Delta株和Omicron株。
4.根据权利要求1所述的一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征是：所述冠状病毒包括石蒜碱氧酯及其盐显著抑制SARS-CoV-2诱导的细胞病变。
5.根据权利要求1所述的一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征是：所述抗冠状病毒药物包括石蒜碱氧酯及其盐和药学上可接受的载体和辅料。
6.根据权利要求1所述的一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征是：所述抗冠状病毒药物剂型为经胃肠道给药剂型和非经胃肠道给药剂型；所述经胃肠道给药剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂溶液剂乳剂或混悬剂；所述非经胃肠道给药剂型包括注射剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型和腔道给药剂型。
7.根据权利要求1所述的一种石蒜碱氧酯及其盐在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征是：所述的抗冠状病毒药物由石蒜碱氧酯及其盐与至少一种其它药物活性成分组成。
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