DE68924750T2

DE68924750T2 - Enzym-Nukleinsäurehydrazon und Enzym-Nukleinsäurehydrazid-Konjugat-Zusammensetzung, Sonden und Verfahren.

Info

Publication number: DE68924750T2
Application number: DE68924750T
Authority: DE
Inventors: Soumitra Shankar Ghosh
Original assignee: Siska Diagnostics Inc
Current assignee: Siska Diagnostics Inc
Priority date: 1988-09-26
Filing date: 1989-09-19
Publication date: 1996-05-09
Anticipated expiration: 2009-09-20
Also published as: CA1333366C; ES2081848T3; DE68924750D1; EP0361768B1; JPH02257897A; EP0361768A3; EP0670329A2; ATE130046T1; EP0361768A2; EP0670329A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresonden, worin die Markierung ein katalytisch aktives Enzym ist, welches kovalent mit der Nukleinsäure verknüpft ist, neue Nukleinsäureintermediate zur Herstellung derartiger Sonden und neue Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Sonden.
Nukleinsäuresonden besitzen mehrere Verwendungen bei der Sondierung und der Identifizierung von DNA- und RNA-Analyten in Proben von biologischem Material. Anwendungen von Hybridisierungsassays mit Nukleinsäuresonden schließen den Nachweis von genetischen Erkrankungen, die Diagnose von infektiösen Erkrankungen den Nachweis einer Lebensmittelkontaminationen, den Nachweis von gewünschten Klonen unter aus einer transformierten Kultur abgeleiteten Klonen die Bestimmung der Beschaffenheit und des Ausmaßes von Mutationen in klonierten DNA-Fragmenten und das Anfertigen von Kartierungen von DNA-Molekülen und Chromosomen ein.
Das am häufigsten verwendete Verfahren zur Markierung von DNA- und RNA- Molekülen, wie etwa synthetischen Oligonukleotiden, so daß sie detektiert werden können und deshalb als Sonden in Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassays verwendet werden können, besteht in der enzymatischen oder chemischen Radiomarkierung mit einem Radioisotop wie etwa ³²P, ³H oder ³&sup5;S. Radioaktiv markierte Nukleinsäuresonden, einschließlich Oligonukleotidsonden von weniger als etwa 100 Basen, können eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität in Assays zur Verfügung stellen. Jedoch ist eine derartige Markierung unerwünscht und ineffizient, da radioaktive Nukleinsäuremoleküle eine kurze Lebensdauer bei Lagerung aufweisen und während der Markierung in Hybridisierungsassay-Verfahren und für die Entsorgung spezielle Ausrüstung und Vorsichtsmaßnahmen erfordern, um die Exposition von Personen und der Umwelt mit gefährlicher Radioaktivität zu minimieren. Der weitverbreitete und routinemäßige Gebrauch von Nukleinsäuresonden in klinischen, diagnostischen und anderen Anwendungen wird nicht-radioaktive Markierungen erforderlich machen, welche einfach zu verwenden sind und eine mindestens zu der von radioaktiv markierten Sonden bereitgestellten vergleichbare Empfindlichkeit und Spezifität zur Verfügung stellen.
Üblicherweise, erwendete nicht-radioaktive Nukleinsäuresonden-Nachweissysteme beinhalten vorwiegend indirekte Verfahren, worin die Nukleinsäuresonde, welche an einen Ziel-DNA oder RNA-Analyten hybridisiert in einer Probe hybridisiert, über eine Linker Komponente bzw. einen Linker Rest oder einen "Linker" kovalent mit Biotin oder einem Hapten niedrigen Molekulargewichts als Markierung verknüpft ist, und worin das Signal zum Nachweis der Sonde unter Verwendung eines Proteinkomplexes erzeugt wird, welcher (nicht- kovalent) an das Biotin oder das Hapten gebunden ist. Zum Beispiel sind über kovalente Bindungen an einem terminalen Nukleotid (z.B. über ein 5'-Kohlenstoffatom des 5'- Nukleotiodes) oder an einer oder mehreren Nukleosidbasen an Biotin konjugierte Nukleinsäuren bekannt. Siehe z.B. Chu und Orgel, DNA 4, 327-331 (1985); Ward et al., US- Patent Nr. 4 711 955. Eine derartige biotinylierte Nukleinsäuresonde wird nach Hybridisierung der Sonde an ihr Ziel und Auswaschen der überschüssigen nicht-hybridisierten Sonde aus dem Assaysystem durch Zugeben eines Komplexes aus Avidin oder Streptavidin, welche Proteine sind die sehr hohe Affinitäten für Biotin aufweisen, mit einem Enzym wie etwa Meerrettichperoxidase oder Alkalischer Phosphatase in das System, Auswaschen des überschüssigen Proteinkomplexes welcher nicht an das Biotin gebunden ist, aus dem Assaysystem und dann Zugeben eines Substrates für das Enzym des Proteinkomplexes woraufhin das im System vorhandene Enzym eine chromogene Reaktion katalysiert, worin ein farbiges Produkt welches visuell oder spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann, hergestellt wird, nachgewiesen. Ein ähnliches System, worin die an die Nukleinsäure kovalent geknüpfte Markierung ein "Hapten" ist, welches ein Inhibitor des Enzyms Carboanhydrase ist, und der signalerzeugende Proteinkomplex ein Homopolymer aus Carboanhydrase oder ein Heteropolymer aus Carbo-anhydrase und einem anderen Protein (wie etwa einem Enzym) ist, wird in der Europäischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 0 210 021 beschrieben.
Diese indirekten Nachweisverfahren erfordern nachteiligerweise einen Schritt für die Bindung eines signalerzeugenden Proteinkomplexes an die Nukleinsäuresonde. Dieser Schritt trägt nicht nur zur Schwierigkeit bei der Ausführung eines Hybridisierungsassays durch Hinzufügen von erforderlichen Manipulationen, um den Assay durchzuführen, bei, sondern vermindert ebenfalls die Empfindlichkeit des Assays wegen des unvermeidlichen Anstiegs des Hintergrunds aufgrund nicht-spezifischer Bindung eines Proteinkomplexes im Assaysystem. Wenn zum Beispiel Avidin oder Streptavidin umfassende Proteinkomplexe mit Biotinderivatisierten Nukleinsäuren als Sonden in Hybridisierungsassays verwendet werden, ist die Empfindlichkeit signifikant durch den hohen Hintergrundwert eingeschränkt, welcher aus der Bindung von Avidin oder Streptavidin nicht nur an biotinylierte Nukleinsäuresonden sondern auch an endogene biotinylierte Proteine und verschiedene Glykoproteine resultiert, welche in klinischen Proben häufig zu finden sind.
Bislang wurden direkte, nicht-radioaktrve enzymatische Systeme zum Nachweis von Nukleinsäuresonden, d.h. Systeme, worin die Sonde eine gewöhnlich vor der Hybridisierung der Nukleinsäure mit dem Ziel kovalent an ein katalytisch aktives signalerzeugendes Enzym verknüpfte Nukleinsäure ist, selten angewandt.
Renz und Kurz, Nucl. Acids Res. 12, 3435-3444 (1984), haben DNA-Sonden beschrieben, worin einzelsträngige DNA (d.h. hitzedenaturierte Plasmid-DNA) kovalent mit Glutaraldehyd an einen Komplex aus Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm oder Meerrettichperoxidase geknüpft wird. Der Enzymkomplex wird durch Anknüpfüng von Enzymolekülen an einen Polyethylenimin-Kern hergestellt. Das Enzym in der Sonde bleibt dazu in der Lage, eine chromogene Reaktion zu katalysieren, wodurch die Sonde nachgewiesen wird. Die von Renz und Kurz, siehe oben, beschriebenen Sonden erfordern eine einzelsträngige Nukleinsäure von mindestens etwa 1 Kilobase Länge und besitzen wegen des festgestellten hohen Hintergrundwertes, wenn sie in Hybridisierungsassays verwendet werden, eine eingeschränkte Empfindlichkeit.
Jablonski et al., Nucl. Acids Res. 14 6115-6128 (1986), beschreiben durch Konjugation von Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm an synthetische Oligonukleotide (21-26 Basen Länge) hergestellte Sonden, worin eine der Basen ein Uracil ist, das modifizert wurde, um am Kohlenstoffatom-5 in kovalenter Verknüpfung einen 12-atomigen Rest mit einer freien Aminogruppe aufzuweisen. Das Enzym wird kovalent an ein Oligonukleotid geknüpft, indem zuerst das Oligonukleotid mit einem Disuccinimidylsüberat zur Reaktion gebracht wird, wodurch eine der Carboxylgruppen des Süberats in einer Amidverknüpfting an die an das modifizierte Uracil des Oligonukleotids verknüpfte freie Aminogruppe verknüpft wird, und dann das modifizierte Oligonukleotid mit Alkalischer Phosphatase zur Reaktion gebracht wird, wodurch die andere Carboxylgruppe des Suberats ein Amid mit einer freien Aminogruppe des Enzyms bildet. Jablonski et al., siehe oben, berichten über Komplikationen bei der Synthese der Sonden, offensichtlich aufgrund der Instabilität der N-Hydroxysuccinimidyl-Gruppen des Disuccinimidylisuberat-Linkers.
Li et al., Nucl. Acids Res. 15, 5275-5287 (1987), berichten über Herstellung und Verwendung von Nukleinsäuresonden, worin Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm kovalent über ein Sulfhydryl an ein einzelsträngiges Oligonukleotid geknüpft ist. In den von Li et al., siehe oben, berichteten Sonden wird ein einzelsträngiges Oligonukleotid an der N&sup4;-Position eines Cytidins an dem 3'-Ende eines Spacers von mehreren Nukleotiden derivatisiert, welche an das 3'-Ende des Oligonukleotidsegmentes hinzugefügt werden, dessen Sequenz komplementar zu der des Zielsegmentes ist und gegen das die Sonde in einem Hybridisierungsassay beabsichtigterweise hybridisieren soll. Die an das 3'-Cytidin derivatisierte Gruppe besitzt eine freie Sulfhydrylgruppe, in der das Oligonukleotid an das Enzym verknüpfenden Konjugationsreaktion reagiert das freie an das Oligonukleotid geknüpfte Sulfhydryl mit einer Bromacetylgruppe, welche in einer Reaktion zwischen dem Enzym und dem N-Hydroxysuccinimidester von α-Bromessigsäure an die Alkalische Phosphatase geknüpft worden war. Die von Li et al., siehe oben, berichteten Sonden und ihr Herstellungsverfahren leiden unter der unvorteilhaften Empfindlichkeit von Sulfhydryl-enthaltenden Verbindungen gegenüber oxidierenden Bedingungen, wodurch sich unerwüschte Disulfide bilden. Siehe, z.B., Orgel und Chu, Nucl. Acids Res. 16, 3671-3691(1988). Weiterhin kann der Multi-Nukleotid-Spacer in den Sonden von Li et al. die Spezifität der Sonden nachteilig beeinflußen.
King et al., Biochemistry 25, 5774-5779 (1986), beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten eines Proteins mit einem anderen Protein. Nach King et al. werden, nachdem Ovalbumin modifiziert wird, um entweder Arylaldehyl- oder Acylhydrazidgruppen aufzuweisen, die mit Aldehyd- und Hydrazidgruppen modifizierten Ovalbumine gekoppelt, um oligomere Konjugate zu bilden, worin die Ovalbumine kovalent durch Linker verknüpft sind, welche eine Hydrazongruppe umfassen. Die Reduktion der Hydrazongruppe der Linker zu einer Hydrazidgruppe unter Verwendung von Cyanborhydrid wird ebenfalls beschrieben.
Kremsky et al., Nucl. Acids Res. 15, 2891-2909 (1987), beschreiben die Herstellung eines einzeisträngigen Oligonukleotids (von 16 Basen), das am 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotides mit einer Komponente der Formel -(PO&sub4;)(CH&sub2;)&sub1;&sub1;(CO)(NH)(CHO) mit einer freien Aldehydgruppe derivatisiert ist. Kremsky et al., siehe oben, beschreiben die Reaktion dieses Oligonukleotides mit Biotinhydrazid (d.h. Biotin mit einer zu einer Gruppe der Formel -(CO)(NH)(NH&sub2;) modifizierten Carboxylgruppe) und mit Polystyrol-Latexmikrokügelchen, die mit Gruppen der Formel -(CO)(NH)(NH&sub2;) derivatisiert wurden, wodurch das Oligonukleotid kovalent mit dem Biotin bzw. den Latex-Mikrokügelchen über einen Linker verknüpft wird, welcher eine Hydrazidgruppe umfaßt, die durch eine Cyanborhydrid-Reduktion eines Intermediates gebildet wurde, worin der Linker ein Hydrazon anstelle des Hydrazids umfaßt. Kremsky et al., siehe oben, schlagen vor, daß der Linker mit einer Hydrazongruppe nicht in einer signifikanten Ausbeute in einer Reaktion zwischen einer Aldehydgruppe und einer Hydrazino-Gruppe hergestellt werden kann, und daß eine erfolgreiche Konjugation zwischen einem Aldehyd und einem Hydrazin die Gegenwart von Cyanborhydrid erfordert, um die Reduktion von Hydrazon zu Hydrazid voranzutreiben. Kremsky et al., siehe oben, zeigen, daß das einzelsträngige Oligonukleotid in den Biotin derivatisierten und Latexmikrokugelchen-derivatisierten Konjugaten, wobei der Linkel eine Hydrazidgruppe umfaßt an ein Nukleinsäuresegement von komplementärer Sequenz hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung bringt eine neue Nukleinsäuresonde mit sich, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure umfaßt, die kovalent vom 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotids an ein katalytisch aktives Enzym über einen Linker verknüpft ist, der eine Hydrazongruppe der Formel -NH-N=CH oder eine Hydrazidgruppe der Formel -NH-NH(CH&sub2;)- umfaßt. Die Sonden gemäß der Eifindung hybridisieren mit unerwarteter Geschwindigkeit Effizienz und Spezifität an Zielnukleinsäuren. Ferner ist die Empfindlichkeit der Sonden nach der Erfindung überraschend gut, insbesondere für die Sonden, bei denen die Nukleinsäure ein Oligonukleotid von weniger als etwa 150 Basen Länge in der komplementären Sequenz zu derjenigen des Zielsegmentes ist.
Folglich liefert die Erfindung ebenfalls überraschend vorteilhafte verbesserte Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassays, worin ein direktes Nachweissystem verwendet wird.
Ferner stellt die Erfindung gemäß einem anderen Aspekt eine neue einzelsträngige Nukleinsäure zur Verfügung, welche ein Intermediat zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde gemäß der Erfindung ist und welche am 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotids mit einer Komponente mit einer freien Hydrazinogruppe der Formel -NH(NH&sub2;) derivatisiert ist.
Desweiteren beinhaltet die Erfindung ein mit überraschend hoher Ausbeute verbundenes und überraschend effizientes Verfahren zur Herstellung einer Sonde gemäß der Erfindung, welches das Umsetzen einer Nukleinsäure nach der Erfindung mit einem katalytisch aktiven Enzym umfaßt das derivatisiert ist um eine freie Aldehydgruppe der Formel -(CO)H zu besitzen.
Die Sonden gemäß der Erfindung, worin der Linker zwischen dem terminalen Nukleotid der Nukleinsäure und dem Enzym eine Hydrazongruppe umfaßt, sind überraschend stabil. Darüberhinaus stellt die Erfindung jedoch ein Verfahren zur Herstellung einer Sonde nach der Erfindung bereit worin der Linker zwischen dem terminalen Nukleotid der Nukleinsäure und dem Enzym eine noch stabilere Hydrazidgruppe umfaßt wobei das Verfahren das Reduzieren einer Sonde nach der Erfindung, worin der Linker eine Hydrazongruppe umfaßt, mit Cyanborhydrid umfaßt. Dieses Verfahren ist überraschend vorteilhaft hinsichtlich seiner unerwarteten Spezifität wodurch die Nukleinsäure und das Enzym im wesentlichen nicht beeinträchtigt werden und die einzige Gruppe, die im wesentlichen betroffen wird, die Hydrazongruppe im Linker ist.
Desweiteren beinhaltet die Erfindung noch die Verbindung 4-N'-Benzylamidobenzaldehyd und Nukleinsäuresonden welche mit dieser Verbindung und mit 2,4-Dinitrobenzaldehyd derivatisiert wurden.
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäuresonde zur Verfügung, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt, worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker einer Formel verknüpft sind, welcher gewählt wird aus der aus Formel I
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N=CH(R&sub2;)(CO)- I
und Formel II
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH(CH&sub2;)(R&sub2;)(CO)- II bestehenden Gruppe worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:
worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht: worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist; und worin die Kohlenstoffatome der Carbonylgruppen an den rechts gelegenen Seiten der Figuren I und II an das Stickstoffatom einer freien Aminogruppe des Enzyms gebunden sind
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Nukleinsäuresonde zur Verfügung, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt worin das Enzym ein Glykoprotein ist das mittels Behandlung mit Periodat oxidiert worden ist: worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker einer Formel verknüpft sind, welche gewählt wird aus der aus Formel IX
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N= IX
und Formel X
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH- X
bestehenden Gruppe, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: worin die -(PO&sub3;)- Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist: und worin das -N= an der rechts gelegenen Seite der Formel IX und der Stickstoff der -NH- Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel X an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden sind das das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war.
Gemäß noch einem anderen Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung eine einzelsträngige Nukleinsäure welche ein Intermediat zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde zum Nachweis eines Zielsegments ist, ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der des Zielsegments umfaßt und mit einer Komponente der Formel XIV
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH&sub2; XIV
derivatisiert ist, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: und worin die -(PO&sub3;)- Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt, worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt: worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker der Formel I:
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N=CH(R&sub2;)(CO)- I
verknüpft sind, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:
worin R&sub2;&sub1; Alkylen von 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht: worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist; und worin das Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe an der rechts gelegenen Seite der Figur I an das Stickstoffatom einer freien Aminogruppe des Enzyms gebunden ist, wobei das Verfahren, in einer wäßrigen Lösung, gepuffert auf einen pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 9 (bevorzugt 7,0 bis 9,0), das Umsetzen einer einzelsträngigen Nukleinsäure, welche dieselbe Sequenz wie die der Nukleinsäuresonde besitzt und mit einer Komponente der Formel XIV
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH&sub2; XIV
derivatisiert ist, worin die -(PO&sub3; )-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist, mit einem katalytisch aktiven Enzym, welches an der freien Aminogruppe mit einer Komponente der Formel XVIII
(CHO)(R&sub2;)(CO)- XVIII
derivatisiert ist, umfaßt.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde bereit, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt worin das Enzym ein Glykoprotein ist, das mittels Behandlung mit Periodat oxidiert worden ist; worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker der Formel IX
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N= IX
verknüpft sind, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen NH und N, (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: worin die -(PO&sub3;)- Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist: und worin das -N= an der rechts gelegenen Seite der Formel IX an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden ist, das das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war, wobei das Verfahren, in einer wäßrigen Lösung, gepuffert auf einen pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 9 (bevorzugt 6,0 bis 8,0) das Umsetzen einer einzelsträngigen Nukleinsäure, welche dieselbe Sequenz wie die der Nukleinsäuresonde besitzt und mit einer Komponente der Formel XIV
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH&sub2; XIV
derivatisiert ist, worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids gebunden ist, mit dem katalytisch aktiven Enzym umfaßt.
Gemäß noch einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer ersten Nukleinsäuresonde, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt worin die Nukleinsäure und das Enzym verknüpft sind durch einen ersten Linker der Formel II:
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH(CH&sub2;)(R&sub2;)(CO)- II
oder der Formel XXIX
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH- XXIX,
worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2; R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind; worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:
worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht; und worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist; mit der Maßgabe daß, wenn die Formel des ersten Linkers die Formel II ist, das Kohlenstoffatom der -(CO)- Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel an eine freie Aminogruppe des Enzyms gebunden ist; und ferner mit der Maßgabe, daß, wenn die Formel des ersten Linkers die Formel XXIX ist, das katalytisch aktive Enzym ein Glykoprotein ist und mit Periodat oxidiert worden ist und das Stickstoffatom der -NH-Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden ist, das das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war; wobei das Verfahren, in einer wäßrigen Lösung gepuffert auf einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9 (bevorzugt 5,0 bis 6,0), das Umsetzen eines Alkalimetallsalzes von Cyanborhydrid mit einer zweiten Nukleinsäuresonde umfaßt, welche im wesentlichen die gleiche ist wie die erste Nukleinsäuresonde mit der Ausnahme, daß in der zweiten Sonde die Nukleinsäure und das Enzym durch einen zweiten Linker der Formel I
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N=CH (R&sub2;)(CO)- I
oder der Formel IX
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N= IX
anstelle des ersten Linkers verknüpft sind mit der Maßgabe, daß wenn der erste Linker von der Formel II ist, der zweite Linker von der Formel I ist, und daß wenn der erste Linker von der Formel XXIX ist, der zweite Linker von der Formel IX ist.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen verbesserten Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassay für einen Nukleinsäureanalyten bereit, welcher ein Zielsegment von mindestens 20 Nukleotiden in einer bekannten Sequenz umfaßt worin die Verbesserung die Anwendung einer Sonde als Nukleinsäuresonde zum Nachweis des Nukleinsäureanalyten in dem Assay umfaßt die eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure der Sonde ein Segment mit der komplementären Sequenz zu der Sequenz der Zielsegments umfaßt worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker einer Formel verknüpft sind, welche gewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Formel I
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N=CH(R&sub2;)(CO)- I
Formel II
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH(CH&sub2;)(R&sub2;)(CO)- II
Formel IX
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N= IX
und Formel X
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH- X
worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind; worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:
worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht: worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist: und worin die Kohlenstoffatome der Carbonylgruppen an den rechts gelegenen Seiten der Figuren I und II an das Stickstoffatom einer freien Aminogruppe des Enzyms gebunden sind, mit der Maßgabe, daß wenn der Linker von der Formel IX oder Formel X ist, das katalytisch aktive Enzym ein Glykoprotein ist, das mit Periodat oxidiert worden ist, und -N= an der rechts gelegenen Seite der Formel IX und das Stickstoffatom der -NH-Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel X an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden sind, welches das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war.
Die Erfindung schließt ebenfalls die Verwendung einer Sonde der Erfindung oder einer Nukleinsäure der Erfindung in einem Hybridisierungsassay bzw. bei der Herstellung einer Sonde ein.
Der hier verwendete Begriff "Sonde der Erfindung" bedeutet eine Sonde der Erfindung, welche ein katalytisch aktives Enzym umfaßt.
Wie hier verwendet bedeutet "Nukleinsäure" eine DNA oder eine RNA, außer der Zusammenhang, in dem der Begriff verwendet wird, beschränkt seine Bedeutung auf nur eines der beiden. Ähnlicherweise bedeutet "Polynukleotid" und "Oligonukleotid" eine Nukleinsäure von mindestens 8 Nukleotiden Länge außer der Zusammenhang, in dem die Begriffe verwendet werden, schränkt deren Bedeutung auf nur eines unter DNA und RNA ein. "Nukleoid" bedeutet ein Ribonukleotid oder ein 2'-Desoxyribonukleotid, außer der Zusammenhang, in dem der Begriff verwendet wird, beschränkt dessen Bedeutungen auf nur eines der beiden. Die Bezeichnung "5'-Nukleotid" einer einzelsträngigen Nukleinsäure bezieht sich auf das Nukleotid an dem 5'-Ende der Nukleinsäure.
Die Nukleinsäuren der Erfindung und die Nukleinsäurekomponenten der Nukleinsäuresonden der Erfindung sind bevorzugt DNAs. Es wird weiter bevorzugt, daß sie DNAs sind, welche Oligonukleotide sind, die leicht in reiner Form in signifikanten Mengen durch automatisierte, stufenweise Festphasensynthese-Verfahren bereitgestellt werden können, d. h. von bis zu etwa 150 Nukleotiden Länge sind.
Ein "Nukleinsäureanalyt" bedeutet eine Nukleinsäure (einzelsträngig oder doppelsträngig), deren Vorhandensein in einer Probe in einem Nukleinsäuresonden-Hybridisierungs- Assay getestet wird. Ein Nukleinsäureanalyt umfaßt ein einzelsträngiges Zielsegment, gegen daa eine Nukleinsäuresonde, von welcher man beabsichtigt, sie zu verwenden, um den Analyten in einem Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassay nachzuweisen, durch komplementäre Basenpaarung hybridisiert. Somit umfaßt die Nukleinsäurekomponente einer Nukleinsäuresonde ein Segment (hier bezeichnet als das "hybridisierende Segment") mit einer derartigen Sequenz, daß das hybridisierende Segment, unter den bei den Hybridisierungen und Waschschritten des Hybridisierungsassays, in welchem die Sonde verwendet werden soll angewandten Stringenz-Bedingungen, mit einer für den Assay als annehmbar erachteten Spezifität an ein Zielsegment des Analyten des Assays hybridisieren wird (falls ein derartiger Analyt in einer Probe, mit der ein Assay durchgeführt werden soll, vorhanden sein sollte). Die Sequenz des hybridisierenden Segments der Nukleinsäurekomponente einer Nukleinsäuresonde wird durch die Sequenz des Zielsegmentes des Nukleinsäureanalyten festgelegt gegen den die Sonde zum Nachweis angewandt wird. Um die Spezifität einer Nukleinsäuresonde für ihren im vorraus gewählten Analyten im Hybridisierungsassays zu maximieren, wird die Sequenz des hybridisierenden Segmentes der Nukleinsäurekomponente der Sonde komplementär zu der Sequenz des Zielsegments sein. Ebenfalls um eine solche Spezifität zu maximieren, wird das Zielsegment des Analyten im vorraus nach der zu untersuchenden Sequenz gewählt, um zu gewährleisten, daß die Hybridisierung der Nukleinsäuresonde an das Zielsegment in einem Assay nachweisbar stattfindet, dann und nur dann, wenn der Analyt in der in Untersuchung befindlichen Probe vorhanden ist. Somit wird ein Zielsegment stets von mindestens etwa 8 Nukleotiden Länge und weiter bevorzugt von mindestens etwa 20 Nukleotiden und weniger als etwa 50 Nukleotiden Länge sein. Weiter bevorzugt wird in einer Nukleinsäure oder einer Nukleinsäurekomponente einer Sonde nach der vorliegenden Erfindung das "hybridisierende Segment", zusätzlich dazu, daß es von komplementärer Sequenz zu der des entsprechenden im vorraus gewählten Zielsegments ist, koinzident mit der ganzen Nukleinsäure sein, d.h. die Sequenz der Nukleinsäure wird aus der Sequenz des hybridisierenden Segments bestehen, welches seinerseits komplementär zu der Sequenz des entsprechenden im vorraus gewählten Zielsegments sein wird.
Ein "katalytisch aktives Enzym" ist ein Enzym, das, in einer Sonde nach der Erfindung, die Fähigkeit beibehält, eine Reaktion zu katalysieren, welche das Enzym katalysiert, wenn es nicht Teil einer derartigen Sonde ist. Ein katalytisch aktives Enzym in einer Sonde nach der Erfindung behält bevorzugt mindestens etwa 50 % der Aktivität des freien, nicht modifizierten Enzyms bei. Für den Durchschnittsfachmann ist es naheliegend, die Aktivität eines Enzyms in einer Sonde nach der Erfindung zu messen, um festzustellen, ob es katalytisch aktiv ist. Im wesentlichen wird eine derartige Messung an der Sonde auf die gleiche Weise ausgeführt, wie die an freiem nicht modifizerten Enzym durchgeführt wird, für welches per Definition eine katalysierte Reaktion bekannt sein wird, und bekannt sein wird, wie die katalytische Aktivität des Enzyms in einer derartigen Reaktion zu messen ist. Damit ein Enzym in einer Sonde gemäß der Erfindung seine katalytische Aktivität beibehalt, ist es notwendig, daß das Enzym seine katalytische Aktivität nach einer Modifikation, um eine oder mehrere freie Aldehydgruppen aufzuweisen oder daran kovalent geknüpft zu sein aber bevor es kovalent an die Nukleinsäurekomponente der Sonde geknüpft wird, beibehält.
Unter den Enzymen die als Teil einer Sonde nach der Erfindung verwendet werden können sind Enzyme bevorzugt, welche Reaktionen katalysieren, die Produkte ergeben, die leicht, am meisten bevorzugt spektrophotometrisch (z.B. durch Messung der Fluoreszenzemission oder Lichtabsorption), oder durch einfache visuelle Beobachtung nachweisbar sind. Somit werden Enzyme bevorzugt, welche chromogene Reaktionen katalysieren, die aus Substraten, welche eine geringe oder keine Absorption im sichtbaren Wellenlängenbereich des Lichts aufweisen, Produkte ergeben, die wegen intensiver Fluoreszenzemission oder hoher Absorption bei einer Wellenlänge im sichtbaren Wellenlängenbereich des Lichts intensiv gefärbt sind. Viele derartige Enzyme sind bekannt, die für eine Verwendung als die Enzymkomponenten in Sonden nach der Erfindung geeignet sind. Diese schließen Phosphatasen, wie etwa Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm, E.coli-Alkalische Phosphatase und Saure Phosphatase aus Kartoffeln; Peroxidasen, wie etwa Meerrettichperoxidase und Lactoperoxidase aus Rindermilch, Luciferasen wie etwa diejenigen aus Photobacterium fischeri oder Glühwürmchen; Ureasen wie etwa diejenige aus der Schwertbohne, Carboanhydrasen wie etwa diejenige aus Säuger- (z. B. Rinder-) Erythrozyten, β-Galactosidasen wie etwa die aus E.coli und Aspergillus oryzae; und Oxidasen wie etwa Glucoseoxidase aus Aspergillus niger und Alkoholoxidase aus Pichia pastoris ein. Unter den für die Verwendung als die Enzymkomponente in einer Sonde nach der Erfindung geeigneten Enyymen werden Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm und Meerrettichperoxidase am meisten bevorzugt von diesen beiden wird die Alkalische Phosphatase stärker bevorzugt.
Die Bezeichnung "freie Aminogruppe" eines Enzyms oder anderen Proteins bezieht sich hier auf eine nicht modifizierte &epsi;-Aminogruppe eines Lysins des Enzyms oder anderen Proteins oder die nicht-modifizierte aminoterminale Aminogruppe des Enzyms oder anderen Proteins (oder einer Untereinheit des Enzyms oder Proteins, falls es mehr als eine Untereinheit besitzt).
Die Bezeichnung "Linker, umfassend eine Hydrazongruppe" oder" Linkerkomponente, umfassend eine Hydrazongruppe" bedeutet, hier eine Komponente, welche das 5 Kohlen stoffatom des 5'-terminalen Nukleotides einer Nukleinsäure an ein Enzmolekül, eine 2,4-Dinitrophenylgruppe oder eine 4-N-Benzylamidophenylgruppe geknüpft, und welche eine Gruppe der Formel -(NH)N=CH- einschließt, worin das Kohlenstoffatom (A) kovalent an das Enzym über eine Gruppe der Formel XX
-(R&sub2;)(CO)- XX
geknüpft ist, worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:
worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht, und worin die Carbonylgruppe als Teil einer Amidgruppe an ein Stickstoffatom gebunden ist, welches das Stickstoffatom einer Gruppe ist welche eine freie Aminogruppe des Enzyms war, (B) ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms ist, welches das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war, oder (C) kovalent all eine 2,4- Dinitrophenylgruppe oder eine 4-N'-Benzylamidophenylgruppe geknüpft ist.
Die Bezeichnung "Linker, umfassend eine Hydrazidgruppe" oder "Linkerkomponente, umfassend eine Hydrazidgruppe" bedeutet hier eine Komponente welche das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides einer Nukleinsäure an ein Enzymmolekül, eine 2,4-Dinitrophenylgruppe oder eine 4-N'-Benzylamidophenylgruppe geknüpft, und welche eine Gruppe der Formel -(NH)(NH)(CH&sub2;)- enthält, worin das Kohlenstoffatom (A) kovalent an das Enzym über eine Gruppe der Formel XX
-(R&sub2;)(CO)- XX
geknüpft ist, worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:
worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht, und worin die Carbonylgruppe als Teil einer Amidgruppe an ein Stickstoffatom gebunden ist, welches das Stickstoffatom einer Gruppe ist, welche eine freie Aminogruppe des Enzyms war, (B) ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms ist, welches das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war, oder (C) kovalent an eine 2,4- Dinitrophenylgruppe oder eine 4-N'-Benzylamidophenylgruppe geknüpft ist. Eine Sonde der Erfindung (einschließlich einer indirekten Sonde) mit einem "Linker, umfassend eine Hydrazidgruppe", welcher die Nukleinsäure und das Enzym (oder 2,4-Dinitrophenyl oder 4-N-Benzylamidophenyl) verknüpft, wird hergestellt durch mit Cyanborhydrid erfolgende Reduktion einer Sonde nach der Erfindung, welche dieselbe ist mit der Ausnahme, daß sie eine Hydrazongruppe anstelle der Hydrazidgruppe im Linker besitzt.
Eine Nukleinsäure der Erfindung, welche einzelsträngig, ein Intermediat zur Herstellung einer Sonde (einschließlich einer indirekten Sonde) nach der Erfindung und am 5'- Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides mit einer Komponente der Formel XIV
-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH&sub2; XIV
derivatisiert ist, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: und worin die -(PO&sub3;)- Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist, wird wie folgt hergestellt: Zuerst wird die Sequenz der Nukleinsäure unter Bezug auf das Zielsegment, an welches die Sonde, welche mit der Nukleinsäure hergestellt werden soll, in Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassays hybridisieren soll, festgestellt: die Nukleinsäure wird ein Segment mit einer komplementären Sequenz zu der des Zielsegments umfassen. Nukleinsäuren nach der Erfindung bestehen bevorzugt aus einem Segment von komplementärer Sequenz zu der des entsprechenden Zielsegments (d.h. besitzen die gleiche Anzähl von Basen wie das Zielsegment in der komplementären Sequenz zu derjenigen des Zielsegments) und weisen 20- 50 Basen auf.
Sobald die Sequenz einer Nukleinsäure nach der Erfindung festgelegt worden ist, wird eine nicht-modifizierte Nukleinsäure mit der Sequenz durch irgendeines der zahlreichen im Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt. Somit kann zum Beispiel ein Bakteriophage wie etwa M13 oder Q-β, welcher ein einzelsträngiges Genom besitzt hergestellt werden, um ein Genom zu besitzen, welches ein Segment mit der komplementären Sequenz zu der im vorraus gewählten Zielsegment-Sequenz umfaßt, das Genom eines derartigen Phagen kann isoliert und, wenn geschlossen-zirkulär durch Ultraschall-Behandlung linearisiert werden, welche das Genom in Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge zerlegt, die größer ist als diejenige des Segmentes mit der zu derjenigen des Zielsegmentes komplementären Sequenz. RNA, welche ein Segment von definierter Sequenz umfaßt, kann in vitro durch Run-off-Transkription von einem Promoter z.B. von einer DNA-abhängigen Bacteriophagen-RNA-Polymerase wie etwa der T7- SP6- oder T3 - RNA- Polymerase, aus von einer DNA mit einem Segment, das die komplementäre Sequenz zu derjenigen, die für die RNA gewunscht wird, besitzt, bereitgestellt werden. Es wird jedoch weiter bevorzugt, daß die nicht modifizterte Nukleinsäure der gewünschten Sequenz durch irgendeines der zahlreichen im Fachgebiet bekannten Festphasen- Verfahren wie etwa dem wohlbekannten Cyanoethyl-Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert wird gekoppelt mit irgendeiner chromatographischen Standardtechnik, um die gewünschte Nukleinsäure aus der Mischung zu isolieren welche aus derartigen Synthesen resultiert; die Synthese wird bevorzugt unter Verwendung eines automatisierten Nukleinsäure-Synthesizers durchgeführt.
Sobald die gewünschte nicht-modifizierte Nukleinsäure erhalten worden ist wird sie behandelt, um mit Monophosphat am 5'-Terminus phosphoryliert zu werden, es sei denn sie ist im Verlauf der Herstellung so phosphoryliert worden. Bei einer aus einer Festphasensynthese- Technik erhaltenen Nukleinsäure, welche eine an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides gebundene Hydroxylgruppe aufweist, kann die 5'-Phosphorylierung durch Kinasieren mit ATP und T4-Polynukleotidkinase bewerkstelligt werden, wie im Fachgebiet wohlbekannt. Siehe Maniatis et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (1982). Nach der Kinasierung wird das Oligonukleotid von nicht umgesetztem ATP, Pyrophosphat und Enzym mittels einer Standardtechnik abgetrennt. Ein bevorzugte Technik, hier bezeichnet als "LiCl/Ethanol- Präzipitation" wird wie folgt durchgeführt: Zu 1 Volumen der wäßrigen Reaktionsmischung werden 3 Volumen absoluter Ethanol und 0,1 Volumen 8 M LiCl gegeben, um die LiCl- Konzentration auf etwa 0,2 M zu bringen. Die Lösung mit LiCl wird danach auf -70ºC abgekühlt um die Nukleinsäure zu füllen. Die Lösung wird dann zentrifugiert, um die Nukleinsäure zu pelletieren und der Überstand wird entfernt und verworfen.
Die resultierende Nukleinsäure, einschließlich der 5'-phosphorylierten wird dann mittels eines Verfahrens, das von dem von Chu et al., Nucl. Acids Res. 11, 6513-6529 (1983) beschriebenen adaptiert wurde, behandelt, wobei ein Dihydrazid der Formel XV
H&sub2;N(R&sub1;)NH&sub2; XV
worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffen, (NH)(CO)(NH),
und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind, anstelle des in dem von Chu et al. (1983), siehe oben, beschriebenen Verfahren verwendeten Dialkylamins verwendet wird, um die Nukleinsäure gemäß der Erfindung herzustellen.
Kurz gesagt wird die 5'-phosphorylierte Nukleinsäure in die 5'-Phosphorimidazolid- Nukleinsäure durch Behandlung der Nukleinsäure aus der Kinasierungsreaktion mit wäßrigem Imidazol oder Methylimidazol (bei etwa 0,05 M bis 0,25 M) in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimid-Kopplungsmittels, wie etwa 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid ("EDC") oder N-Cyclohexyl-N'-2-(4'-methylmorpholinium)-ethylcarbodiimid-p-toluolsulfonat (auch bei etwa 0,05 M bis etwa 0,25 M) bei einem pH-Wert von 5,5 - 6,8 und Raumtemperatur 30 Minuten bis 2 Stunden lang umgesetzt. Bevorzugte Reaktionsbedingungen sind etwa 0,1 M Imidazol, etwa 0,15 M Carbodiimid, pH 6,0, 90 Minuten Dauer. Das Oligonukleotid wird dann von den anderen Reagenzien und Produkten durch eine Standardtechnik zur Isolation von Oligonukleotiden abgetrennt, unter welchen eine LiCl/Ethanol-Präzipitation bevorzugt wird.
Um die Nukleinsäure nach der Erfindung herzustellen, wird eine Mischung von Nukleinsäuren, einschließlich des 5'-Phosphorimidazolids in einer wäßrigen Lösung eines Dihydrazids der Formel XV bei zwischen etwa 0,05 M und etwa 0,5 M und bei einem pH zwischen etwa 7 und etwa 10 aufgenommen, und die Reaktion wird von etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden lang bei zwischen etwa 30ºC bis etwa 65ºC voranschreiten gelassen. Die Reaktion wird bevorzugt mit etwa 0,25 M des Dihydrazids bei einem pH von etwa 8,5 und einer Temperatur von etwa 50ºC etwa 3 Stunden lang durchgeführt. Die Nukleinsäure, einschließlich der Nukleinsäure nach der Erfindung, wird dann durch drei aufeinanderfolgende LiCl/Ethanol Fällungen aus dem überschussigen Dihydrazidreagenz isoliert.
Die bevorzugten Nukleinsäuren der Erfindung werden mit Hydrazin (worin R&sub1; in Formel XV eine Bindung zwischen den Stickstoffatomen ist), Carbohydrazid (worin R&sub1; in Formel XV (NH)(CO)(NH) ist) und Adipindihydrazid (worin R&sub1; in Formel XV (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) ist) hergestellt. Die am meisten Bevorzugten werden mit Carbohydrazid hergestellt.
Die Nukleinsäuren der Erfindung sind als Intermediate zur Herstellung von Sonden nach der Erfindung, wie im folgenden weiter beschrieben wird, verwendbar.
Es ist bemerkenswert, daß nach der Kinasierungsreaktion, der Reaktion, um das 5'- Phosphorimidazolidderivat herzustellen, und der Reaktion, um die Nukleinsäure der Erfindung (derivatisiert, um eine freie Hydrazinogruppe zu besitzen) herzustellen, vorteilhafterweise keine Notwendigkeit besteht, das nicht umgesetzte Oligontikleotid (oder Derivat) von dem in der Reaktion hergestellten Derivat abzutrennen. Dies ist so da das Dihydrazid der Formel XV unerwarteterweise nur am Phosphor des Phosphorimidazolidderivates nachweisbar reagiert, und in der im folgenden beschriebenen Reaktion der Nukleinsäure der Erfindung mit einem Aldehydgruppen-derivatisierten Enzym die Reaktion der an das Enzym verknüpften Aldehydgruppe nachweisbar nur am Stickstoffatom der -NH&sub2;-Gruppe der Hydrazinogruppe der Nukleinsäure der Erfindung stattfindet. Ferner wird eine Sonde der Erfindung leicht, aufgrund des Unterschieds ihrer Größe von den Größen der verschiedenen Oligonukleotide und Derivaten davon mittels einfacher Größenausschluß- (z.B. Gelpermeations-) Chromatographie von nicht- reagierten Oligonukleotiden und Derivaten abgetrennt. Alles was benötigt wird, um zu gewähr- leisten, daß die Sonde der Erfindung von Oligonukleotid- und Oligonukleotidderivat-Kontaminanten isoliert wird, ist daher vorteilhafterweise ein auf Größe basierender Abtrennungsschritt nach der Reaktion des Aldehydgruppen-derivatisierten Enzyms mit der Hydrazino-Gruppenderivatisierten Nukleinsäure der Erfindung.
Bei indirekten Sonden der Erfindung wird ein einfacher HPLC-Schritt die Sonde von den anderen Nukleinsäurederivaten und Verbindungen niedrigen Molekulargewichts abtrennen, die während der Synthese auftreten wid nicht in den LiCl/Ethanol-Fällungsschritten entfernt werden.
Das Aldehydgruppen-derivatisierte Enzym zur Verwendung bei der Herstellung einer Sonde nach der Erfindung kann gemäß King et al., siehe oben, hergestellt werden. So wird das Enzym in einer wäßrigen Lösung, gepuffert auf einen pH-Wert zwischen etwa 7,5 und etwa 9,0 (bevorzugt etwa 8,5), bei einer Konzentration von typischerweise etwa 10 uM bis etwa 100 uM gelöst. Zu der Enzym-Lösung wird, gewöhnlich in einem trockenen organischen Lösungsmittel, wie etwa Acetonitril, und in einer Konzentration in dem organischen Lösungsmittel, welche zwischen etwa 100 und etwa 1000mal größer ist als diejenige des Enzyms in der Enzym-Lösung, ein 1- bis 100-facher (bevorzugt 7,5-facher bis 70-facher, am meisten bevorzugt etwa 50-70-facher) molarer Überschuß (im Verhältnis zur Menge des Enzyms in der Enzym-Lösung) eines aktivierten Esters (z.B. N-Hydroxysuccinimidester) einer Verbindung der Formel XVI:
H(CO)(R&sub2;)(CO&sub2;H) XVI,
worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:
worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht, zugegeben. ("Alkylen mit 0 Kohlenstoffatomen" bedeutet, daß R&sub2;&sub1; einfach Teil der Bindung von der Phenylgruppe zu der Carboxylgruppe der Verbindung der Formel XVI ist). Die Reaktion des aktivierten Esters mit der (den) freien Aminogruppe(n) des Enzyms wird etwa 10 Minuten bis etwa eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen etwa 4ºC und etwa 30ºC weiter voranschreiten gelassen. Schließlich werden überschüßiges Reagenz und Produkte der Reaktion mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse der Reaktionslösung bei etwa 0ºC bis etwa 10ºC gegen einen wäßrigen Puffer, bevorzugt einem bei einem pH-Wert zwischen etwa pH 7 und pH 9 der für die Konjugationsreaktion, in der die Sonde durch Reaktion des Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Oligonukleotides mit dem Aldehydgruppen-derivatisierten Enzym hergestellt wird geeignet ist, von dem Enzym entfernt, in dieser Hinsicht werden bevorzugte Puffermittel nicht- nukleophil sein; unter diesen sind im Fachgebiet wohl bekannte sulfonierte Puffermittel wie etwa MOPS, PIPES (Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)), HEPES (N-2-Hydroxy-ethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) und HEPPS (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-propansulfonsäure) und dergleichen. Vor der Dialyse wird die Reaktion bevorzugt etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, N-Hydroxysuccinimidester werden bevorzugt. Bei dem am meisten bevorzugten aktivierten Ester ist R&sub2; p-Phenylen (d.h. R&sub2;&sub1; in Formel XVI ist gleich 0 Kohlen-stoffatome).
Wenn das Enzym ein Glykoprotein ist kann es durch ein alternatives Verfahren das die Oxidation von Zucker-Resten des Glykoproteins beinhaltet, modifiziert werden um freie Aldehydgruppen aufzuweisen, insbesondere kann ein derartiges Enzym in wäßriger Lösung mit Periodat oxidiert werden woraufhin Aldehydgruppen an vizinalen hydroxylierten Kohlenstoffatomen der Zucker-Resten über die Malaprade-Reaktion gebildet werden. Somit wird unter Verwendung eines Alkalimetallsalzes von IO&sub4;&supmin; (bevorzugt dem Na&spplus;-Salz) eine wäßrige Lösung des Enzyms bei einer Konzentration zwischen etwa 1 uM und etwa 100 uM (bevorzugt etwa 50 uM) und einem pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 8 (bevorzugt in destilliertem Wasser und bei einem pH-Wert von etwa 6 bis etwa 7) mit einer wäßrigen Lösung des IO&sub4;&supmin;-Salzes vereinigt, um eine anfängliche Konzentration von IO&sub4;&supmin; in den vereinigten Lösungen von zwischen etwa 10 mM und 100 mM (bevorzugt etwa 500mal bis etwa 1000mal der Konzentration des Enzyms) vorzusehen. Die Oxidationsreaktion wurde etwa 10 Minuten bis etwa eine Stunde lang bei zwischen etwa 4ºC und 30ºC (bevorzugt etwa 20 Minuten lang bei Raumtemperatur) voranschreiten gelassen, und schließlich werden überschussiges Periodat und Produkte der Oxidationsreaktion mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse gegen einen wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert zwischen etwa 4 und etwa 8 und einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und etwa 30ºC von dem Enzym entfernt. Bei einem bevorzugten Verfahren wird eine erste Dialyse bei etwa 4ºC gegen einen Puffer bei einem pH Wert von etwa 4 bis etwa 5 (z.B. Natriumacetatpuffer, pH 4,5) durchgeführt und danach eine zweite Dialyse ebenfalls bei etwa 4ºC durchgeführt, um die Enzym-Lösung zu derjenigen hin zu verändern, in welcher die Konjugationsreaktion mit Hydrazino-Gruppen-derivatisierter Nukleinsäure mit dem Enzym durchgeführt werden soll (d.h. eine mit einem vorzugsweise nicht-nukleophilen, sulfonierten Puffermittel wie etwa MOPS, PIPES, HEPES oder HEPPS auf einen pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 gepufferte Lösung).
Viele von eukaryotischen Organismen hergestellte Enzyme sind glykosyliert und können wie obenstehend beschrieben mit Periodat oxidiert werden, um freie Aldehydgruppen zu besitzen, während sie ihre katalytische Aktivität beibehalten. Besonders bemerkenswert unter diesen Enzymen sind eukaryotische Peroxidasen, wie etwa Meerrettichperoxidase und Lactoperoxidasen aus Säugermilch.
Für ein glykosyliertes Enzym, welches entweder durch eine Reaktion mit einem aktivierten Ester einer Verbindung mit einem Aldehyd oder durch Oxidation mit Periodat derivatisiert werden kann, um freie Aldehydgruppen zu besitzen, scheint die katalytische Aktivität signifikant weniger reduziert zu werden, wenn die Derivatisierung mit einem aktivierten Ester stattfindet, als wenn sie mit Periodatoxidation stattfindet. Andererseits hat es den Anschein, daß das mit einem aktivierten Ester derivatisierte Enzym etwas weniger effizient als das mit Periodat oxidierte Enzym mit der Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Nukleinsäure in der Konjugationsreaktion koppelt, um eine Sonde nach der Erfindung herzustellen.
Aufgrund der überraschenden Spezifität der freien Hydrazino-Gruppe einer Nukleinsäure nach der Erfindung für die freie Aldehydgruppe(n) auf einem Enzym, das mit einem aktivierten Ester einer Verbindung mit einer Aldehydgruppe oder mit Periodatoxidation derivatisiert wurde, und der überraschenden Spezifität derartiger freier Aldehydgruppe(n) auf dem Enzym für die freie Hydrazino-Gruppe der Nukleinsäure ist es vorteilhafterweise nicht notwendig vor der Konjugationsreaktion mit der Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Nukleinsäure das Enzym, welches modifiziert ist, um freie Aldehydgruppe(n) aufzuweisen, von Enzym, welches in der Reaktion mit dem aktivierten Ester oder Periodat nicht derartig modifiziert wurde, abzutrennen.
Eine Sonde nach der Erfindung, worin die Linker Komponente, welche das 5 Kohlen stoffatom des 5'-Nukleotides der Nukleinsäure mit dem Enzym verknüpft, eine Hydrazon-Gruppe umfaßt, wird einfach durch etwa 0,5 Stunden bis etwa 48 Stunden langes Umsetzen bei einer Temperatur zwischen etwa 4ºC und etwa 35ºC (bevorzugt etwa 16 Stunden lang bei Raumtemperatur), in einer waßrigen Lösung, gepuffert (bevorzugt mit einem nicht- nukleophilen Puffermittel wie etwa einem sulfonierten Puffermittel wie etwa MOPS, PIPES, HEPES oder HEPPS oder dergleichen) auf einen pH-Wert zwischen etwa 5 bis etwa 9 (bevorzugt etwa 7 bis etwa 8), der Nukleinsäure nach der Erfindung, worin die Nukleinsäure die Nukleinsäure Komponente der Sonde ist, mit dem Enzym, welches die Enzym Komponente der Sonde ist und derivatisiert wurde, um eine freie Aldehydgruppe zu besitzen, hergestellt. Der freie Aldehydgruppen-derivatisierte Enzym-Reaktant wird in der Lösung anfänglich bei einer Konzentration zwischen etwa 10 uM bis etwa 100 uM (bevorzugt etwa 25 uM bis etwa 75 uM) und bei einem molaren Überschuß relativ zu der Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Nukleinsäure der Erfindung von etwa 1 x (d.h. äquimolar) bis etwa 10 x vorhanden sein.
Die Konjugationsreaktion liefert eine Sonde mit einem Hydrazon-Gruppen-enthaltenden Linker zwischen der Nukleinsäure und dem Enzym oder, im Falle einer indirekten Sonde. 2,4-Dinitrophenyl und 4-N-Benzylamidophenyl in einer überraschend hohen Ausbeute, insbesondere im Hinblick auf die Aussage von Kremsky et al., siehe oben, daß sich keine stabilen Hydrazon-enthaltenden Linker in der Reaktion bilden würden, und daß das Reduktionsmittel Cyanborhydrid in der Konjugationsreaktion vorhanden sein müßte, um eine signifikante Kopplung zwischen der Nukleinsäure und dem Enzym oder 2,4-Dinitrophenyl oder 4-N'-Benzyiamidophenyl zu erreichen.
Die Konjugationsreaktion wird beendet, und die Sonde nach der Erfindung und das nicht-umgesetzte Enzym werden von nicht-umgesetzter Nukleinsäure durch Größenausschluß- Chromatographie (z.B. Gelfiltrations-Chromatographie) bei etwa 0ºC bis etwa 10ºC (bevorzugt 4ºC) unter Verwendung eines Puffers bei einem pH von etwa 7,5 bis etwa 9,5 (z.B. 0,05 M Tris, pH 8,5) als Elutionsmittel abgetrennt. Im Fachgebiet sind viele als Matrices für Größenausschluß-Chromatographie von Proteinen und Nukleinsäuren geeignete Materialien bekannt und zur Abtrennung der Sonde und des nicht-umgesetzten Enzyms von nicht- umgesetzter Nukleinsäure geeignet. Wie der Fachmann verstehen wird, wird das verwendete Material teilweise von den Molekulargewichten der Enzym- und Nukleinsäure-Komponenten der Sonde nach der Erfindung abhängen, da das Material die Sonde und das nicht-umgesetzte Enzym von nicht-umgesetzter Nukleinsäure vorrangig auf der Grundlage von Unterschieden des Molekulargewichts abtrennen muß. Im Hinblick auf Gelfiltrationschromatographie mit Sonden, worin Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm das Enzym ist und ein Oligonukleotid von weniger als etwa 150 Basen die Nukleinsäure-Komponente ist, ist Biorad P-100, erhältlich von BioRad Laboratories, Inc., Richmond, California, USA, ein geeignetes Material, für eine Matrix zur Gelfiltrationschromatographie. Ähnlicherweise ist Sephadex G-75 von Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey, USA, ein geeignetes Material für eine Gelfiltrations- Abtrennung des nicht-umgesetzten Oligonukleotides von Meerrettichperoxidase und Sonden, worin Meerrettichp eroxidase die Enzym- und ein Oligonukleotid von weniger als etwa 100 Basen die Nukleinsäure Komponente ist.
Im Anschluß an die Größenausschluß-Chromatographie um die Sonde und nicht umgesetztes Enzym von nicht-umgesetztein Oligonukleotid abzutrennen, wird die Sonde durch einen chromatographischen Schritt, worin die Abtrennung auf Grundlage der Ladung erfolgt von nicht umgesetztem Enzym sauber abgetrennt. Bei basischen pH-Werten (z.B. etwa 7,5 bis etwa 9,5, bevorzugt etwa 8 bis etwa 9) wird eine Sonde nach der Erfindung signifikant negativer geladen sein als das nicht-umgesetzte Enzym, das nach dem Großenausschluß- Chromatographie Schritt mit der Sonde vereinigt ist. So kann z.B. Ionenaustausch Chromatographie verwendet werden, um die Sonde von nicht-umgesetzten Enzym abzu-trennen. Wiederum wird der Fachmann viele für die ionenaustauschchromatographische Abtrennung der Sonde von nicht-umgesetztem Enzym geeignete Harze kennen, und wird in der Lage sein, für eine gegebene Kombination von Harz, Enzym und Nukleinsäure Waschbedingungen festzulegen, welche für die Abtrennung des nicht-umgesetzten Enzyms von der Sonde geeignet und. Es wurde festgestellt, daß eine Chromatographie über DEAE-Cellulose (z.B. DE-52 von Whatman, Inc.. Clifton, New Jersey USA) unter Verwendung eines Puffers bei pH 8,5 (z.B. 0,1 M Tris) und ein Waschschritt zuerst mit einem Gradienten von steigender NaCl- Konzentration (0 bis 0,2 M NaCl) in dem Tris-Puffer, gefolgt von Waschschritten mit stufenweise ansteigender NaCl-Konzentration (z.B. 0,2 M, 0,5 M) in dem Tris-Puffer besonders wirksam zur einfachen und sauberen Abtrennung der Sonde von nicht-umgesetzten Enzym sind, wenn das Enzym Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm ist. In ähnlicher Weise wurde nicht-umgesetzte Meerrettichperoxidase mit DE-52-Harz mit 0,1 M Tris, pH 8,5, und Waschschritten des Tris-Puffers mit 0 M NaCl, 0,1 M NaCl und 0,2 M NaCl eluiert, während ein anschließender Waschschritt mit dem Puffer mit 0,5 M NaCl die Sonde eluierte, worin die Enzym-Komponente Meerrettichperoxidase war.
Es ist unter Verwendung von DEAE-Cellulose in einer Ionenaustausch-Chromatographie mit 0,1 M Tris, pH 8,5, als Puffer und Waschschritten bei stufenweise ansteigenden Konzentrationen von NaCl ebenfalls möglich gewesen, Spezies der Sonde nach der Erfindung abzutrennen, worin die Anzahl von Nukleinsäuren pro Enzym-Molekül unterschiedlich war, wobei das Verhältnis von Nukleinsäure zu Enzym mit ansteigender Konzentration von NaCl in dem Puffer, welcher verwendet wurde, um die Sonde von der DEAE-Cellulose zu eluieren. anstieg. So wurde z.B., wie ausführlicher in den Beispielen, welche folgen, beschrieben wird, eine "Niedrigsalz"-Sonde, worin das Verhältnis von Nukleinsäure zu Enzym 1:1 beträgt und welche von der DEAE-Cellulose bei pH 8,5, 0,1 M Tris, 0,2 M NaCl eliuerte, von einer "Hochsalz"-Sonde abgetrennt, worin das Verhältnis von Nukleinsäure zu Enzym 2:1 betragt und welche von der DEAE Cellulose bei pH 8,5, 0,1 M Tris, 0,5 M NaCl eluierte, wobei es sich um Sonden handelte, worin die Nukleinsäure Komponente etwa 30 Basen aufweist, und worin die Enzym-Komponente Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm ist. Das Verhältnis von in der Konjugationsreaktion zwischen dem Enzym und der Nukleinsäure hergestellter 2:1- zu 1:1-Sonde ist abhängig von der Anzahl freier Aldehydgruppen, welche an das in dieser Reaktion verwendete Enzym geknüpft sind (wobei mehr Aldehydgruppen pro Enzym Molekül eine höhere Fraktion von 2:1-Sonde begünstigen), und dem Verhältnis der Konzentration von Aldehydgruppen-derivatisiertem Enzym zu der in der Reaktion verwendeten Hydrazino- Gruppen-derivatisierten Nukleinsäure (wobei ein höheres Verhältnis eine geringere Fraktion von 2:1-Sonde begünstigt). Anscheinend beeinflußt auch der G-C-Gehalt der Nukleinsäure das Verhältnis von 2:1- zu 1:1-Sonde, da Oligonukleotide mit einem G-C-Gehalt über etwa 45 % dazu neigen, einen größeren Anteil der Sonde als 2:1-Sonde zu ergeben, als Oligonukleotide mit geringerem G-C-Gehalt.
Es hat den Anschein, daß zumindest in an Filtern durchgeführten Nukleinsäuresonden- Hybridisierungs-Assays (z.B. bei Dot Blots, in Southern-Hybridisierungen) die Empfindlichkeit der 2:1-Sonde im wesentlichen dieselbe ist wie diejenige der 1:1-Sonde.
Die Sonde der Erfindung worin der Linker, der das Enzym und die Nukleinsäure verknüpft, eine Hydrazon-Gruppe umfaßt ist sehr stabil, und eine Reduktion der Hydrazon-Gruppe in eine Hydrazid-Gruppe ist nicht notwendig, um ausreichende Stabilität zu gewährleisten. Falls gewünscht kann jedoch eine Sonde der Erfindung, einschließlich einer indirekten Sonde. worin der das Enzym und die Nukleinsäure verknüpfende Linker eine Hydrazid-Gruppe umfaßt, wie folgend in einer einfachen Reaktion hergestellt werden, welche hinsichtlich ihrer Spezifität für die Reduktion der Hydrazon-Gruppe des Linkers ohne eine beobachtbare Auswirkung auf die katalytische Aktivität des Enzyms oder, im Falle der indirekten Sonde, auf das 2,4-Dinitrophenyl oder 4-N'-Benzylaminodphenyl und ohne eine beobachtbare Auswirkung auf die Spezifität und Empfindlichkeit der Sonde überraschend ist. Eine Lösung der Sonde, worin der Linker eine Hydrazon-Gruppe umfaßt, wird bei einer Konzentration von zwischen etwa 0,5 uM und etwa 10 uM (bevorzugt etwa 2 uM) in einer wäßrigen Lösung aufgenommen, welche auf einen pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 7 (bevorzugt etwa 6) gepuffert ist, und dann wird eine wäßrige Lösung eines Alkalimetallsalzes von Cyanborhydrid (bevorzugt das Natriumsalz) bei 0,1 M bis 0,5 M (bevorzugt 0,3 M bis 0,5 M) zugegeben, um die anfängliche Konzentration von Cyanborhydrid in der Sondenlösung auf zwischen etwa 0,01 M und 0,1 M (bevorzugt etwa 0,02 M) zu bringen. Die Reduktion wird bei 4ºC bis 35ºC (bevorzugt bei Raumtemperatur) 1 Stunde bis 24 Stunden lang (bevorzugt etwa 16 Stunden) voranschreiten gelassen, und schließlich wird die Reaktionsmischung bis zur Sättigung dialysiert, um überschüssiges Cyanborhydrid zu entfernen und den pH-Wert zurück auf etwa 7,5 bis etwa 9,5, bevorzugt etwa 8,5, zu bringen.
Die Synthese der Verbindung 4-N'-Benzylamidobenzaldehyd wird in den Beispielen, die folgen, beschrieben, wie auch die Herstellung von indirekten Sonden der Erfindung, worin die Nukleinsäure an dem 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotides mit einer Komponente der Formel XXIII oder XXIV derivatisiert ist.
Wie im Fachgebiet verstanden, ist mit einer indirekten Sonde der Erfindung ein Nachweis indirekt. Eine derartige Sonde wird zum Beispiel durch die Bindung eines gegen die Gruppe erzeugten Antikorpers an das Benzylamidophenyl- oder 2,4-Dinitrophenyl-Gruppen- Hapten der Sonde nachgewiesen, wobei der Antikorper mittels einer Standardtechnik an ein katalytisch aktives Enzym gekoppelt worden ist. Danach erfolgt die Erzeugung eines beobachtbaren Signals durch eine Reaktion, welche durch das an den Antikörper gekoppelte Enzym katalysiert wird.
Die Sonden der Erfindung, die ein enzymatisch aktives Enzym umfassen, sind in Nukleinsäuresonden-Hybridisierungs-Assays überraschend empfindlich.
Eine Sonde der Erfindung kann vorteilhafterweise als die Detektionssonde (d.h. die Sonde, welche die Grundlage für ein beobachtbares Signal in einem Assay-System liefert, wenn der Nukleinsäure-Analyt in dem System vorhanden ist) in jedem der verschiedenen Typen von im Fachgebiet bekannten Nukleinsäuresonden-Hybridisierungs-Assays verwendet werden. Die Sonden der Erfindung, einschließlich der indirekten Sonden, werden als Detektionssonden in Nukleinsäuresonden-Hybridisierungs-Assays verwendet, welche Standardtechniken anwenden, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, siehe z.B. Meinkoth und Wahl Anal. Biochem. 138, 267 - 284 (1984) und PCT-Internationale Veröffentlichungs-Nr. WO88/01302, was hier durch den Bezug darauf inbegriffen ist. Unter den Nukleinsäuresonden-Hybridisierungs-Assays, in denen Sonden der Erfindung angewandt werden können, sind Assays auf Filterbasis, worin die Nukleinsäure einer in Untersuchung befindlichen Probe in einzelsträngiger Form direkt auf ein Trägermaterial wie etwa einen Nitrocellulose-Filter oder Nylon-Filter, aufgetragen wird, und danach die Detektionssonde an den Nukleinsäure-Analyten hybridisiert wird, welcher vor dem Waschen an den Filter fixiert wurde, welches erfolgte, um Sonde zu ehminieren, die nicht stabil an das Zielsegment hybridisiert hat oder auf andere weise (als Quelle von "Hintergrund") an den Fllter fixiert worden ist, und danach eine Signalerzeugung unter Verwendung der Detektionssonde (direkt oder, im Falle einer indirekten Sonde, indirekt), welche auf dem Filter verbleibt, erfolgt. Unter derartigen Assays auf Filterbasis sind solche, worin die Nukleinsäure einer Probe vor dem Aufbringen auf das Trägermaterial auf irgendeine Weise zuerst aufgetrennt wird, wie in Southern-Assays und Northern-Assays, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Eine Sonde der Erfindung, einschließlich einer indirekten Sonde, kann auch als die Detektionssonde in einem Sandwich-Assay verwendet werden, worin der Analyt zuerst auf einem festen Träger (z.B. einem makroporösen Material wie etwa Sephacryl S-500 (Pharmacia) oder einem Polystyrollatex-Material) durch Hybridisierung an eine erste Sonde ("Emfang Sonde") eingefangen wird, welche an den festen Träger fixiert ist und welche die komplementare Sequenz zu derjenigen eines ersten Zielsegmentes des Analyten besitzt und danach eine zweite Sonde (Detektionssonde), welche die komplementare Sequenz zu derjenigen eines zweiten Zielsegmentes das Analyten besitzt, welches nicht mit dem ersten Zielsegment überlappt an den eingefangenen Analyten vor dem Waschen hybridisiert wird, das erfolgt, um Detektionssonde von dem Träger zu eliminieren, welche nicht stabil an das zweite Zielsegment des Analyten hybridisiert ist oder auf andere Weise (als Quelle von "Hintergrund") an den Filter fixiert ist, und danach die Signalerzeugung unter Verwendung der Detektionssonde (indirekt oder, im Falle von Sonden der vorliegenden Erfindung, direkt) erfolgt. Verfahren zur Messung des "Hintergrundsignals" in diesen Nukleinsäuresonden-Hybridisierungs-Assays sind wohlbekannt; typischerweise ist dies das Signal aus der Durchführung eines Assays mit einer Nukleinsäure-Probe, von der man weiß daß sie den Nukleinsäure-Analyten nicht enthält, gleichzeitig mit dem Assay einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten möglicherweise enthält. Wie im Fachgebiet verstanden, wird die Gegenwart des Nukleinsäure-Analyten in einer Nukleinsäure-Probe durch ein Signal von der Probe von einer Größe angezeigt, welche die Größe des Signals aus der Kontrollprobe, welche bekannterweise den Analyten nicht enthält, übersteigt.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen veranschaulicht.

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON 5'-HYDRAZINO-DERIVATISIERTEN UND MIT 5'-HYDRAZON ENTHALTENDEM LINKER DERIVATISIERTEN EINZELSTRÄNGIGEN NUKLEINSÄUREN

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer einzelsträngigen Nukleinsäure, welche derivatisiert wurde, um eine Hydrazino-Gruppe oder einen Linker aufweisen, welcher eine kovalent all den 5'-Terminus (d.h. das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotids) verknüpfte Hydrazon-Gruppe umfaßt.
Oligonukleotide wurden unter Verwendung des Festphasen-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Verfahrens in einem automatisierten DNA Synthesizer (Modell 380A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, USA) synthetisiert.
Zwei derartig hergestellte Oligonukleotide sind die Oligonukleotide 85-133 und 87-416, welche die folgenden Sequenzen aufweisen, die komplementär zu Sequenzen von Segmenten des Inserts sind, das in dem Plasmid pTB061B für ein Oberflächen-Antigen des Hepatitis B-Virus kodiert. (Das Plasmid pTB061B ist ein pBR322-Plasmid, das modifiziert wurde, um in der EcoRI-Stelle ein etwa 900 Basenpaare großes Insert aufzuweisen, welches für das Oberflächen-Antigen eines Hepatitis B-Virus des adw-Serotyps kodiert.)
Oligo 85-133: 5'TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAG
Oligo 87-416: 5'AACCAATAA(iAAGATGAGGCATAGCAGCA
Die Oligonukleotide aus dem Synthesizer wurden wie folgt gereinigt, die Reinigung der tritylierten Oligonukleotide wurde unter Verwendung von halbpräparativer C-8-Umkehrphasenchromatographie (10 x 250 mm Säule) unter Verwendung eines Gradienten von 15 - 35% Acetonitril in 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 6,00, 40 Minuten lang und bei einer Fließrate von 3 ml/min durchgeführt. Danach wurde 30 Minuten lang eine Detritylierung unter Verwendung von 80 % Essigsäure in Wasser durchgeführt, wonach das Lösungsmittel entfernt wurde. Schließlich wurden die Oligonukleotide durch LiCl/Ethanol-Fällung isoliert. Die gereinigten Oligonukleotide wanderten als Einzelbanden auf einem 20 % Polyacrylamid-Gel und eluierten als Einzelpeaks in der Umkehrphasen-HPLC-Analyse.
Die gereinigten Oligonukleotide wurden unter Befolgen eines Standard-Verfahrens mit ATP und T4-Polynukleotidkinase an ihren 5'-Enden phosphoryliert. Siehe Maniatis et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1982).
Die 5'-phospliorylierten Oligonukleotide wurden in 5'-Hydrazino-derivatisierte Oligonukleotide wie folgend mittels eines Verfahrens umgewandelt, das aus einem von Chu et al., Nucl., Acids Res. 11, 6513 - 6529 (1983), für die Herstellung von 5'-Amino-derivatisierten Oligonukleotiden berichteten adaptiert wurde:
Reaktionsgefäße wurden mit einer frischen 5 % Lösung von Dichlordimethylsilan in Chloroform silanisiert, um die Adhäsion von Nukleinsäure an die Wände der Gefäße zu verhindern.
Ein 5'-phosplioryliertes Oligonukleotid wurde wie folgend in sein aktiviertes 5'- Phosphorimidazolid-Derivat umgewandelt: 8 Nanomol des 5'-phosphorylierten Oligonukleotides wurden 90 Minuten lang bei 23ºC in 3 ml 0,1 M Imidazol, 0,15 M 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid ("EDC"), pH 6,00, reagieren gelassen. Die Nukleinsäure wurde dann durch LiCl/Ethanol-Fällung isoliert.
Die resultierende Nukleinsäure, einschließlich des 5'-Phosphorimidazolid-Derivates wurde dann aufgenommen und 3 Stunden lang bei 50ºC in 2,5 ml einer 0,25 M wäßrigen Lösung bei pH 8,5 von Hydrazin, Carbohydrazid (Formel: (NH&sub2;NH(CO)NH(NH&sub2;)) oder Adipindihydrazid (Formel: (NH&sub2;NH(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)NHNH&sub2;)) umgesetzt um die 5'-Hydrazino- Derivate mit einer Komponente der Formel -(PO&sub3;)NHNH&sub2;, -(PO&sub3;)NH(NH)(CO)(NH)NH&sub2; bzw. -(PO&sub3;)NHNH(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)NHNH&sub2;, welche kovalent an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides der Nukleinsäure verknüpft war, herzustellen.
Eine 5'-Hydrazino derivatisierte Nukleinsäure wurde aus dem überschüssigen Hydrazin, Carbohydrazid oder Adipindihydrazid durch drei anfeinanderfolgende LiCl/Ethanol-Fällungen isoliert.
Die Ausbeuten im Verhältnis zu den 5'-phosphorylierten Oligonukleotid-Ausgangsmaterialen betrugen 60 - 75 %. Die höchsten Ausbeuten wurden mit Carbohydrazid erhalten.
Die 5'-Hydrazino derivatisierten Oligonukleotide wurden wie folgt in Derivate umgewandelt, worin eine 2,4-Dinitrophenyl ("DNP") Gruppe oder 4-N-Benzylamidophenyl ("BAP")-Gruppe über einen Linker der Formel -(PO&sub3;)NH(N=CH)-, der eine Hydrazon- Gruppe umfaßte, kovalent an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotides geknüpft war: Zu 20 Picomol des 5'-Hydrazino-derivatisierten Oligonukleotides in 5 ul 50 mM MOPS (3-(N- Morpholino)propansulfonsäure) Puffer, pH 7,5, wurden 3 ul einer 5 mg/ml Losung von 2,4 Dinitrobenzaldehyd oder 4-N'-Benzylamidobenzaldehydin-Dimethylsulfoxid gegeben, und man ließ die Reaktion 16 Stunden lang bei 23ºC ablaufen.
Das 4-N'-Benzylamidobenzaldehyd wurde durch Zufügen von 0,022 ml (0,2 mMol) Benzylamin zu einer Lösung von 49 mg (0,2 mMol) 4-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester (welcher nach Krachenbuhl et al., J. Exp. Med. 139, 208 - 223 (1974) hergestellt worden war) in 2 ml trockenem N,N-Dimethylformamid ("DMF") unter Stickstoff und durch Voranschreiten-lassen der Reaktion für 2,5 Stunden bei 23ºC hergestellt. Nach den 2,5 Stunden Reaktion wurde das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt und das Rückstands-Öl wurde in 20 ml Ethylacetat aufgenommen. Die resultierende Lösung wurde danach aufeinanderfolgend mit 10 ml kalter HCl, 10 ml gesättigter NaHCO&sub3; und 10 ml Kochsalzlösung gewaschen und schließlich über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und unter Vakuum konzentriert. Das Produkt wurde unter Verwendung von präparativer Dünnschichtchromatographie ("TLC") bei Verwendung von 40 % Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 25 mg 4- N'-Benzylamidobenzaldehyd zu erhalten (Ausbeute: 53 %). Das Infrarot-Spektrum des Produktes besaß Peaks bei 3315, 1704 und 1633 cm&supmin;¹. Die ¹H-NMR des Produktes in CDCl&sub3; bei 350 MHz zeigte Verschiebungen bei 10,05 (1H), 7,93 (4H), 7,35 (5H) und 4,65 (Doubletts, 2H) ppm. Die Elementaranalyse des Produktes ergab das folgende Ergebnis: berechnet: C (75.31 %), H (5,44 %), N (5,86 %): gefunden: C (75,46 %), H (5,63 %), N (6,07 %).
Das vorstehende Verfahren zur Herstellung der DNP- und BAP-Derivate der Oligonukleotide wurde durchgeführt mit (A) den mit ³²PO&sub4; phosphorylierten Oligonukleotiden: (B) den zuerst mit ³²PO&sub4; phosphorylierten und dann mit Imidazol derivatisierten Oligonukleotiden, wie obenstehend beschrieben: und (C) den zuerst mit ³²PO&sub4; phosphorylierten und dann, wie obenstehend beschrieben, mit Hydrazin, Carbohydrazid oder Adipindihydrazid derivatisierten Oligonukleotiden. Die Reaktionsmischungen wurden durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese ("PAGE") auf einem 20 % Polyacrylamidgel mit 8 M Harnstoff, gefolgt von Autoradiographie gemäß Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 560 - 564 (1977) analysiert. Als Kontrollen wurden die am 5'-Kohlen-stoffatom des 5'-Nukleotides lediglich mit ³²PO&sub4; oder ³²P-Phosphoimidazolid derivatisierten bei Konzentration von 2,5 Nanomol/ml in 37,5 % (v/v) DMSO in 50 mM MOPS, pH 7,5, gelösten, aber nicht Reaktanten ausgesetzten, um die Hydrazino und Hydrazon-Linkerhältigen Derivate herzustellen, Oligonukleotide mittels PAGE analysiert.
In der PAGE Analyse konnten lediglich einen einzelnen Hydrazon-Linker enthaltende Produkte bei den mit Hydrazin, Carbohydrazid oder Adipmdihydrazid derivatisierten Oligonukleotiden gefunden werden. Es wurde kein Hinweis auf Hydrazon-Linker enthaltende Produkte bei den Oligonukleotiden gefunden welche vor der Reaktion mit 2,4-Dinitrobenzaldehyd oder 4-N'-Benzylamidobenzaldehyd nur mit -PO&sub4;&supmin;² oder Phospho-imidazolid derivatisiert wurden. Überraschenderweise wurde bei den Reaktionsmischungen aus der Reaktion von den Adipindihydrazid-derivatisierten Oligonukleotiden mit 4-N'-Benzylamidobenzaldehyd, wie oben beschrieben, das vollständige Verschwinden des Hydrazino- Derivates festgestellt, wohingegen in den Reaktionsmischungen aus der gleichen Reaktion mit 2,4-Dinitrobenzaldehyd einiges nicht-umgesetztes Hydrazino-Derivat erhalten wurde.
Die Hydrazon-Linker-enthaltenen Oligonukleotid-Derivate wurden nach der Reinigung durch analytische Umkehrphasen-HPLC weiter analysiert. So wurden zu 1 Nanomol Oligonukleotid, wie obenstehend beschrieben mit -(PO&sub3;)NHNH&sub2; oder -(PO&sub3;)NH(NH)(CO)- (NH)NH&sub2; derivatisiert, in 1 ml 50 mM MOPS, pH 7,5, 25 ul einer 5 mg/ml Acetonitril-Lösung von 2,4-Dinitrobenzaldehyd oder 4-N'-Benzylamidobenzaldehyd zugegeben, und die Reaktion wurde 16 Stunden lang bei 23ºC weiter voranschreiten gelassen. Das Hydrazon-Linkerenthaltende Oligonukleotid wurde aus der unreinen Reaktionsmischung mittels LiCl/Ethanol- Fällung isoliert. Die Reinigung des Hydrazon-derivatisierten Oligonukleotides wurde dann hinter Verwendung einer analytischen Vydac-Umkehrphasen-Säule (C-8, 0,46 x 25 cm) (VYDAC-The Seps. Group, Inc., Hesperia, California, USA) mit einem Gradienten von 0 - 35 %, Acetonitril in 0,1 M Triethylammoniumacetat pH 6,8, 45 Minuten lang bewerkstelligt. Die Fraktionen mit dem Hydrazon-derivatisierten Oligo-nukleotid wurden dann in einen Savant-Rotationsvakuum-System (Savant Instruments, Inc., Farmingdale, New York, USA) bis zur Trockenheit konzentriert und das resultierende Pellet wurde danach in 50 mM MOPS, pH 7,5, aufgenommen. Die Absorptionsspektren der resultierenden Lösungen wurden zwischen 230 und 450 nm unter Verwendung eines Beckman DU-40 UV-VIS-Spektrometers (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, California, USA) aufgenommen. Die 2,4-Dinitrophenyl- Gruppe absorbiert bei 370 nm, während die 4-N'-Benzylamidophenyl-Gruppe bei 320 nm absorbiert. Die Analyse der Elutionsprofile der Hydrazon-Linker-enthaltenden Oligonukleotide und der Oligonukleotide, die lediglich mit 5'-PO&sub4; derivatisiert wurden, etablierte, daß nur eine nachweisbare Hydrazon Gruppe an jedes Oligonukleotid-Molekül geknüpft wurde.
Ferner ergaben die Messungen, welche ergaben, daß die Hydrazino- und Hydrazonderivatisierten Oligonukleotide voll Alkalischer Phosphatase unter den Bedingungen nicht beeinträchtigt wurden, welche in der Dephosphorylierung des 5'-Phosphat enthaltenden Oligonukleotides resultierten, daß die einzelne Hydrazino-Gruppe oder das Hydrazon an das 5'- Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides des Oligonukleotids verk geknüpft wurde.

BEISPIEL 2

DERIVATISIERUNG VON ALKALISCHER PHOSPHATASE AUS KÄLBERDARM UM FREIE ALDEHYD-GRUPPEN AUFZUWEISEN

Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (Reinheitsgrad für Enzym Immunoassays) wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc. (Indianapolis, Indiana, USA) erhalten.
2,86 x 10&supmin;&sup8; Mol des Enzyms in 0,4 ml einer Lösung aus 3 M NaCl, 0,1 mM MgCl&sub2;, mM ZnCl&sub2; und 30 mM Triethanolamin, pH 7,6, wurden 2 Stunden lang gegen drei Wechsel von jeweils 30 ml 0,1 M NaHCO&sub3;, 3 M NaCl, 0,02 % NaN&sub3;, pH 8,5, dialysiert wobei ein Collodion-Beutel (Molekulargewichtausschluß: 25 kD) (Schleicher und Schuell, Inc., Keene, New Hampshire USA) bei 4ºC verwendet wurde. Danach wurde ein 7,5-facher oder 70-facher molarer Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimid-ester in einer 50 mM- Lösung in Acetonitril zu der Enzym-Lösung gegeben, und die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 23ºC voranschreiten gelassen. Nach den 30 Minuten wurde über-schüssiges Reagens durch Dialyse 2 Stunden lang gegen 3 Wechsel von jeweils 30 ml 50 mM MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5, unter Verwendung eines Collodion-Beutels bei 4ºC entfernt
Wenn ein 7,5-facher Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester verwendet wurde, wurden durchschnittlich 1,1 Aldehydgruppen pro Enzym-Molekül eingeführt. Wenn ein 70-facher Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester verwendet wurde, wurden durchschnittlich 3,6 Aldehydgruppen pro Enzym-Molekül eingeführt. Diese Feststellungen stammten aus Messungen der Absorption der modifizierten Enzyme bei 258 nm und 280 nm.
Das Enzym wird auch im wesentlichen auf die gleiche Weise aber unter Verwendung der N-Hydroxysuccinimidester der Formeln H(CO)(CH&sub2;)&sub2;(C&sub6;H&sub4;)(CO)ON(C&sub4;H&sub4;O&sub2;) und (C&sub4;H&sub4;O&sub2;)NO(CO)(CH&sub2;)&sub2;(C&sub6;H&sub4;)(CO)H anstelle von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester modifiziert.

BEISPIEL 3

HERSTELLUNG UND EIGENSCHAFTEN VON KONJUGATEN AUS ALDEHYDGRUPPEN-DERIVATISIERTER ALKALISCHER PHOSPHATASE AUS KÄLBERDARM MIT 5'-HYDRAZIN-DERlVATISIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN

8 nMol des pelletierten Oligonukleotides 85-133, derivatisiert wie in Beispiel 1, um eine Gruppe der Formel -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(NH)NH&sub2; in kovalenter Verknüpfung an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides aufzuweisen, wurde in einem 3,5-fachen molaren Überschuß einer 70 uM Lösung der Aldehydgruppen-derivatisierten Alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm in 50 mM MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5, aufgenommen. Das Aldehydgruppen derivatisierte Enzym wurde wie in Beispiel 2 mit einem 70 fachen molaren Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester hergestellt. Die Reaktion des derivatisierten Oligonukleotids mit dem derivatisierten Enzym wurde bei 23 ºC 16 Stunden lang voranschreiten gelassen.
Es ist bemerkenswert, daß Hydrazino-derivatisiertes Oligonukleotid nicht von underivatisiertem, phosphoryliertem Oligonukleotid vor der Reaktion mit dem Aldehydgruppen derivatisierten Enzym abgetrennt werden mußte, da, wie durch die oben stehend in Beispiel 1 beschriebenen Modellstudien angezeigt die Aldehyd-Funktion ausschließlich mit der freien an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides des Oligonukleotids verknüpften Hydrazino Gruppe reagiert. Es tritt keine nachweisbare Reaktion zwischen dem 5'-phosphorylierten Oligonukleotid (oder Oligonuldeotid mit einer nicht-modifizierten Hydroxyl-Gruppe an dem 5'- Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotides) und dem Aldehyd-derivatisiertem Enzym auf
Eine Gel-Filtration auf einer Biorad P-100-Säule (1,5 x 65 cm) (Biorad, Inc., Richmond, California, USA) bei 4ºC unter Verwendung von 0,05 M Tris, pH 8,5, als Elutionsmittel trennte nicht-umgesetztes Oligonukleotid von dem Enzym-Oligonukleotid-Konjugat und nicht- umgesetztem Enzym ab. Aus Messungen der Radioaktivität in dem nicht-umgesetzten, Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Oligonukleotid im Vergleich mit derjenigen in dem Oligonukleotid-Enzym-Konjugat wurde festgestellt, daß wenn ³²P-markiertes Oligonukleotid zur Herstellung der Konjugate verwendet wurde, 80 - 85 % des Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Oligonukleotides in der Konjugationsreaktion an das Enzym konjugiert worden ist.
Die Enzym-Fraktionen aus der Gelfiltration wurden vereinigt und auf eine DEAE- Cellulose-Säule (1 x 7,2 cm) (DE-52, Whatman, Inc. Clifton, New Jersey, USA) aufgetragen, welche mit 0,05 M Tris, pH 8,5, bei 23ºC äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 0,1 M Tris, pH 8,5 (15 ml) gewaschen, gefolgt von 40 ml eines Salzgradienten von 0 - 0,2 M NaCl in 0,1 M Tris, pH 8,5, um freie Alkalische Phosphatase zu eluieren.
Eine schrittweise isokratische Elution (0,2 M NaCl 0,1 M, Tris, pH 8,5, 40 ml, gefolgt von 0,5 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 8,5, 20 ml) auf DEAE-Cellulose (1 x 7,2 cm, DE-52) erzielte die Abtrennung vom 1:1-Oligonukleotid-Enzym-Konjugat vom 2:1 Oligonukleotid-Enzym- Konjugat. Aus Messungen der Radioaktivität von den zwei Konjugaten, wenn sie mit ³²Pmarkiertem Oligonukleotid hergestellt wurden, wurde festgestellt, daß das 1:1-Konjugat und 2:1-Konjugat in etwa äquimolaren Mengen hergestellt wurden.
Um die Herstellung der Konjugate zu vervollständigen, wurden, für jedes der zwei Konjugate die Fraktionen mit dem Konjugat vereinigt unter Verwendung eines Centriprep- 30-Konzentrators (Amicon Corp., Danvers, Massachusetts, USA) konzentriert und in 0,1 M Tris 0,1 M NaCl pH 8,5, bei 4ºC gelagert
Die Konjugate wurden kolorimetrisch unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat auf enzymatische Aktivität getestet. So wurde die Hydrolyse dieses Substrates bei 410 nm und 23 C in 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl&sub2;, pH 9,5, bei einer anfanghchen Substrat Konzentration von 0, 1 mM verfolgt. Es wurde festgestellt, daß die Aktivität des Enzymes in den Konjugaten etwa 80 - 85 % derjenigen des freien Enzymes betrug.
Man fand heraus, daß die Konjugate extrem stabil waren. Sie verlieren nichts von ihrer Empfindlichkeit in Hybridisierungs-Assays, wenn sie mindestens mehrere Monate lang wie obenstehend beschrieben bei 4ºC gelagert wurden.
Durch Ausführen von Protein-Bestimmungen nach Lowry (kalibriert unter Verwendung von Verdünnungen von Aldehydgruppen-derivatisierter Alkalischer Phosphatase, deren Konzentrationen durch Aminosäure Analyse unter Verwendung eines Beckmann System 6300- Aminosäure Analyzers nach 24 Stunden langer Hydrolyse bei 110ºC bestimmt worden waren) an Proben der zwei Konjugate, welche äquivalente Mengen von Radioaktivität (aufgrund des ³²P des Linkers) aufwiesen, wurde festgestellt, daß das "Niedrigsalz"-Konjugat (d.h. jenes das bei 0.2 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 8,5, wie obenstehend beschrieben von DEAE-Cellulose eluierte) die 2-fache Protein-Menge wie das "Hochsalz"-Konjugat (d.h. jenes, das bei 0,5 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 8,5, wie obenstehend beschrieben von DEAE-Cellulose eluierte) aufwies, wodurch etabliert wurde, daß das "Niedrigsalz"-Konjugat das 1:1-Konjugat war und das "Hochsalz"-Konjugat das 2:1-Konjugat war. Beide Konjugate in der Gelfiltration auf Biorad P-200 (Biorad Inc.) und Sephacryl S-300 (Pharmacia, Inc., Piscata-way, New Jersey, USA) wanderten zusammen, was mit ihren ähnlichen errechneten Molekulargewichten von etwa 150 kD bzw. 160 kD übereinstimmte. Ferner besaß das "Hochsalz"-Konjugat eine höhere elektrophoretische Beweglichkeit als das "Niedrigsalz"-Konjugat auf einem 2 % Agarose-Gel, was mit dem höheren Ladungs/Masse-Verhältnis der "Hochsalz"-Spezies übereinstimmte.
Wenn die Konjugationsreaktion wie obenstehend beschrieben mit einem 5-fachen oder einem 10-fachen molaren Überschuß (anstelle eines 3,5-fachen molaren Überschuß) des Aldehydgruppen-derivatisierten Enzyms durchgeführt wurde, welches mit einem 7,5-fachen molaren Überschuß (anstelle eines 70-fachen molaren Überschusses) von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester hergestellt wurde (und folglich durchschnittlich 1,1 (anstelle von 3,6) Aldehydgruppen pro Enzym-Molekül besaß), wurden 40 - 45 % des Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Oligonukleotides an das Enzym konjugiert, und das Verhältnis von 11-Konjugat zum Gesamtkonjugat betrug etwa 0.8, wenn ein 5-facher molarer Überschuß des Aldehydgruppen derivatisietten Enzyms verwendet wurde, und 50 - 55 % des Hydrazino-Gruppen-derivatisierten Oligonukleotides wurden an das Enzym konjugiert, und das Verhältnis von 1,1 konjugat zum Gesamtkonjugat betrug etwa 0,9, wenn ein 10-facher molarer Überschuß des Aldehydgruppen derivatisierten Enzyms verwendet wurde.
Die obenstehend beschriebenen Konjugate mit Linkern, die eine Hydrazon-Gruppe umfassen, wurden wie folgt in Konjugate umgewandelt, worin die Hydrazon-Gruppe des Linkers in eine Hydrazid-Gruppe (-(NH)(NH)CH&sub2;)-) umgewandelt wird: 500 ul einer 2 uM Lösung des Konjugates mit dem Hydrazon-Gruppen-enthaltenden Linker in 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 8,5, wurde 2 Stunden lang bei 4ºC gegen 3 Wechsel von jeweils 30 ml von 0,1 M MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) pH 6,00, dialysiert und dann wurden 0,4 M Natriumcyanborhydrid zugegeben, um die Konzentration an Cyanborhydnd auf 0,02 M zu bringen. Die Reaktion wurde bei 23ºC 16 h lang voranschreiten gelassen und dann wurde die Lösung bis zur Sattigung gegen 5 oder 6 Wechsel (jeweils 30 mi) von 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 8,5, 4 Stunden lang bei 4 ºC dialysiert. Die Konjugate bei denen das Hydrazon wie beschrieben zu Hydrazid reduziert wurde, zeigen keinen Verlust in der Aktivität des Enzyms. Konjugate mit Linkern, welche eine Hydrazon-Gruppe umfassen, und Linkern, welche eine Hydrazid-Gruppe umfassen, werden im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in diesem Beispiel beschrieben bereitgestellt, wobei Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm, welche wie in Beispiel 2 beschrieben mit einem 50-fachen molaren Überschuß der N-Hydroxysuccinimidester der Formeln H(CO)(CH&sub2;)&sub2;(C&sub6;H&sub4;)(CO)ON(C&sub4;H&sub4;O&sub2;) und (C&sub4;H&sub4;O&sub2;)NO- (CO)(CH&sub2;)&sub2;(C&sub6;H&sub4;)(CO)H derivatisiert ist, und ein Oligonukleotid verwendet werden, das wie in Beispiel 1 beschrieben am 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleo-tides mit einer Komponente der Formel -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(NH)NH&sub2; derivatisiert ist, und wobei Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm, die wie in Beispiel 2 beschrieben mit einem 50-fachen molaren Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester derivatisiert wurde, und ein Oligonukleotid, das wie in Beispiel 1 beschrieben am 5'-Kohlenstoffatom des 5'- terminalen Nukleotides mit einer Komponente der Formel -(PO&sub3;)(NH)NH&sub2; oder -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(NH)NH&sub2; derivatisiert wurde, verwendet werden.
Konjugate werden ebenfalls wie in diesem Beispiel beschrieben mit dem Oligonukleotid 87-416 oder irgendeiner anderen einzelsträngigen Nukleinsäure von zwischen etwa 8 und etwa 150 Basen Länge hergestellt.

BEISPIEL 4

MEERRETTICHPEROXIDASE, DERIVATISIERT, UM FREIE ALDEHYD-GRUPPEN AUFZUWEISEN

Meerrettichperoxidase ist ein Glykoprotein und besitzt folglich in kovalenter Assoziation mit sich Zucker-Komponenten, die benachbarte Hydroxyl-Gruppen aufweisen, welche anfällig für eine Oxidation zu Aldehydgruppen unter Verwendung von Periodat als Oxidationsmittel sind.
Meerrettichperoxidase vom Typ VII wurde daher von Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA) erhalten. Zu 1 mg (2,5 x 10&supmin;&sup8; Mol) Meerrettichperoxidase, gelöst in 0,5 ml Wasser, wurden 0,1 ml einer 0,2 M wäßrigen Natriumperiodat-Lösung zugegeben. Die Oxidationsreaktion wurde 20 Minuten lang bei 23ºC voranschreiten gelassen und dann wurde überschüssiges Periodat durch Dialyse gegen 30 ml 1 mM Natriumacetat, pH 4,5, bei 4 ºC unter Verwendung eines Collodion Beutels (Molekulargewichtausschluß 25 kD) entfernt. Diesem folgte eine 2 Stunden lange Dialyse gegen 3 Wechsel von jeweils 30 ml 0,1 M MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5, bei 4ºC unter Verwendung eines Collodion Beutels vor der Verwendung des Aldehydgruppen enthaltenden Enzyms in einer Konjugationsreaktion.
Meerrettichperoxidase (Typ VII, Sigma Chemical Corp.) wurde auch durch Behandlung mit einem 50 fachen molaren Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester, wie in Beispiel 2 für Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm beschrieben, derivatisiert, um kovalent an freie Aldehydgruppe(n) verknüpft zu sein.
Die enzymatischen Aktivitäten der Meerrettichperoxidasen, die modifiziert wurden, um freie Aldehydgruppen aufzuweisen, wurden mittels einer Standardtechnik getestet, wobei für die Farbentwicklung eine wäßrige Lösung von 0,5 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidinhydrochlorid ("DAB"), 0,05 M Tris, 0,04 % NiCl&sub2;, pH 7,6, verwendet wurde. 1 ul einer etwa 0,04 uMol/ml Lösung des zu untersuchenden Enzyms wurde zu 20 ml der Farbentwicklungs-Lösung gegeben. Bei nicht-modifiziertem Enzym als auch dem mittels den beiden in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren modifizierten Enzym entwickelte sich ein blauschwarzes Präzipitat, was zeigte, daß die Enzyme katalytisch aktiv waren. Die quantitative Analyse der Geschwindigkeit der Farbentwicklung zeigte, daß das mit Periodat modifizierte Enzym mindestens 100-fach weniger aktiv als das nicht-modifizierte Enzym war, und daß das durch die Reaktion mit dem 50-fachen molaren Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester modifizierte Enzym zu 70 - 75 % so aktiv wie das nicht-modifizierte Enzym war.

BEISPIEL 5

HERSTELLUNG UND EIGENSCHAFTEN VON KONJUGATEN AUS ALDEHYDGRUPPEN-DERIVATISIERTER MEERRETTICHPEROXIDASE MIT 5'-HYDRAZINODERIVATISIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN

4 nMol des Oligonukleotids 85-133, derivatisiert nach Beispiel 1, um eine Gruppe der Formel -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(NH)NH&sub2; an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides verknüpft aufzuweisen, in Pelletform wurden in 500 ul einer Lösung von Meerrettichperoxidase, welche gemäß Beispiel 4 mit Periodat modifiziert wurde, oder Meerrettichperoxidase, welche durch die Reaktion mit p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccmimidester gemäß Beispiel 4 modifiziert wurde, gelöst bei 40 nMol/ml in 0,1 M MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5, aufgenommen. Die Konjugationsreaktionen wurden 16 Stunden lang bei 23ºC voranschreiten gelassen.
Das Oligonukleotid-Enzym-Konjugat und nicht-umgesetztes Enzym aus einer Konjugationsreaktion wurden von nicht-umgesetztem Oligonukleotid durch Gelfiltration auf einer Sephadex G-75 -Säule (Pharmacia, Inc.) (1,5 x 47 cm) bei 4ºC unter Verwendung von 0,05 M Tris, pH 8,5, als Elutionsmittel abgetrennt. Die vereinigten Enzymfraktionen wurden dann auf eine DEAE-Cellulose-Säule (DE-52, Whatman, Inc.) (1 x 7,2 cm) aufgetragen, welche bei 23ºC mit 0,05 M Tris, pH 8,5, äquilibriert worden war. Waschschritte mit 0,1 M Tris, pH 8,5, 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 8,5, und 0,1 M Tris, 0,2M NaCl, pH 8,5, wurden verwendet, um nicht-umgesetztes Enzym zu eluieren. Die Elution des Oligonukleotid-Enzym- Konjugates wurde danach unter Verwendung von 0,1 M Tris, 0,5 M NaCl, pH 8,5, erreicht.
Das Verhältnis von Oligonukleotid zu Enzym in dem Konjugat wurde nicht bestimmt, obwohl auf Grundlage der Analogie mit dem in Beispiel 3 beschriebenen "Hochsalz"- Alkalische Phosphatase-Konjugat angenommen wird, daß das Verhältnis 2:1 betragt.
Messungen der Effizienzen der Konjugationsreaktionen durch Anwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren zeigten, daß 55 - 60 % des Oligonukleotides in das Konjugat eingebaut wurden, wenn das Periodat-modifizierte Enzym verwendet wurde, und daß 35 - 40 % des Oligonukleotides eingebaut wurden, wenn das mit p-Carboxybenzaldehyd-N- hydroxysuccinimidester modifizierte Enzym verwendet wurde.
Der Assay auf die enzymatische Aktivität des Enzyms in den Konjugaten durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren unter der Annahme, daß das Verhältnis von Oligonukleotid- Molekülen zu Enzym-Molekülen in den Konjugaten 2:1 ist, zeigte, daß die Konjugationsreaktion die enzymatische Aktivität nicht signifikant von derjenigen des Enzyms, welches modifiziert wurde, um freie Aldehydgruppen aufzuweisen, veränderte. Das Enzym in beiden Konjugaten blieb katalytisch aktiv. Das Enzym in dem mit Periodat-modifiziertem Enzym hergestellten Konjugat war mehr als 100mal weniger aktiv als nicht-modifiziertes Enzym. Das Enzym in dem mit p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccimmidester-modifiziertem Enzym hergestellten Konjugat behielt 70 - 75 % der Aktivität von nicht-modifiziertem Enzym bei.
Konjugate wurden wie in diesem Beispiel beschrieben auch mit dem Oligonukleotid 87- 416 mit den im wesentlichen gleichen Ergebnissen hergestellt.
Konjugate wurden auch wie in diesem Beispiel beschrieben mit den Oligonükleotiden hergestellt, welche modifiziert wurden, um eine Gruppe der Formel -(PO&sub3;)(NR)NH&sub2; oder -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH)NH&sub2; in kovalenter Verknüpfung an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides aufzuweisen.

BEISPIEL 6

SANDWICH-HYBRIDISIERUNGS-ASSAY UNTER VERWENDUNG VON KÄLBERDARM-ALKALISCHER PHOSPHATASE-OLIGONUKLEOTID-KONJUGAT ALS DETEKTIONSSONDE

Ein mit Oligonukleotiden derivatisierter makroporöser Träger der Marke "OligoBean " (Siska Diagnostics, Inc., La Jolla, California, USA) ("Perlen") wurde wie von Ghosh und Musso, Nucl. Acids Research 15, 5353 (1987) beschrieben hergestellt, indem ein mit Cyanogenbromid aktiviertes makroporöses Dextran-Trägermaterial der Marke "Sephacryl S-500 " (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey, USA) mit 6-Aminocapronsäure derivatisiert wurde, um Carboxyl Gruppen in kovalenter Verknupfüng an das Trägermaterial vorzusehen, und indem danach der Carboxyl-derivatisierte Träger derivatisiert wurde mit dem Oligonukleotid ("Einfangsonde") der Sequenz:
5'-TGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTT-3',
das am 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides mit der Komponente der Formel -(PO&sub3;)(NH)(CH&sub2;)&sub6;NH&sub2; derivatisiert war. Siehe auch die PCT-Internationale Veroffentlichungs-Nr. WO88/01302.
Die Einfangsonde besitzt die komplementare Sequenz zu derjenigen des Oligonukleotides 87-416, das in Beispiel 1 beschrieben ist.
50 mg der "OligoBead "-Perlen mit der Einfangsonde wurden durch 15 Minuten langes Einweichen bei 37ºC in 0,75 ml 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 % Dextransulfat (Pharmacia, Inc.), 1 mg/ml ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA und 1 mg/ml Rinderserumalbumin-Fraktion V (Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc.) vorhybridisiert.
M13-Phagen wurden durch eine Standardtechnik hergestellt, um ein Genom aufzuweisen, das einen Strang des EcoRI-Fragmentes des Plasmids pTB061B umfaßte, welcher für ein Oberflächenantigen des Hepatitis B-Virus kodierte. Der Strang des EcoRI-Fragmentes, welcher in dem Phagen-Genom war, war der Strang, welcher ein Segment mit der Sequenz des Oligonukleotids 87-416 umfaßt. Das Phagen-Genom, welches eine einzelsträngige DNA ist, war der Nukleinsäureanalyt in dem in diesem Beispiel beschriebenen Assay. Dieser Analyt umfaßt ein Zielsegment, welches die komplementäre Sequenz zu derjenigen des in Beispiel beschriebenen Oligonukleotids 85-133 besitzt.
Entweder 5 fMol oder 50 fMol des einzelsträngigen M13-Genoms und ein 5-facher molarer Überschuß (im Verhältnis zu dem M13-Genom-Ziel) von Kälberdarm-Alkalische Phosphatase-Oligonukleotid 85-133-Konjugat, worin das Enzym und das Oligonukleotid in einem Verhältnis von 1:1 vorhanden waren und kovalent über einen Linker der Formel -(PO&sub3;)(NH)(NR)(CO)(NH)N=CH(C&sub6;H&sub4;)(CO)- verknüpft waren, und welches mittels des Verfahrens aus Beispiel 3 hergestellt worden war, wurden in 50 ul einer Lösung von 5 x SSC, 5 % Dextransulfat und 1 mg/ml Rinderserumalbumin-Fraktion V vereinigt und 5 Minuten lang bei 65ºC erwärmt. Man ermöglichte danach der Ziel-DNA und dem Enzym-Oligonukleotid- Konjugat, 30 Minuten lang bei 42ºC zu hybridisieren. (Wenn das Ziel bei weniger als etwa 40 fMol/ml vorhanden ist, wird diese Lösung Hybridisierung mindestens 2 Stunden lang fortgesetzt.)
Nach der Vorhybridisierung wurden die Perlen durch Zentrifugation mit einer Tischzentrifuge aus der Vorhybridisierungs-Lösung pelletiert und der Überstand wurde durch Aspiration mit einer Pipette entfernt und verworfen. Danach wurden die Perlen in 200 ul 5 x SSC, 0,1 % SDS, 10 % Dextransulfat und 1 mg/ml Rinderserumalbumin Fraktion V aufgenommen.
Danach wurden die 50-ul-Losung, in denen die Ziel-DNA und das Enzym-Oligonukleotid-Konjugat hybridisiert waren, mit den 200 ul der Losung mit den vorhybridisierten Perlen vereinigt, und die resultierende Lösung wurde 90 Minuten lang bei 42ºC für die Hybridisierung des Ziels (hybridisieit an die Detektionssonde) an die Ein-fangsonde auf den Perlen inkubiert.
Danach wurden die Perlen durch Zentrifugation mit einer Tischzentrifuge pelletiert, der Überstand wurde durch Aspiration mit einer Pipette entfernt und verworfen, und schließlich wurden die Perlen dreimal mit 1 ml 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0) gewaschen, indem sie jedes mal 10 Minuten lang bei 37ºC eingeweicht wurden.
Die Hybridisierung der Enzym-Oligonukleotid-Konjugat-Detektionssonde an die Ziel- DNA, welche durch die kovalent an die Perlen fixierte Einfangsonde eingefangen worden war, wurde durch Farbentwicklung festgestellt. Nach dem dritten Waschen in 2 x SSC wurden die pelletieiien Perlen mit 1,5 ml eines Entwicklungspuffers (100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 100 mm Tris, pH 9,5) gespült und dann, nach Pelletieren der Perlen durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge und Entfernen des Puffers durch Aspiration mit einer Pipette, wurde die Farbentwicklung durch Zugeben von 1 ml Entwicklungspuffer, der 0,1 mM p-Nitrophenylphosphat enthielt, zu den Perlen und Vortexen der Mischung, um die Perlen im Puffer zu suspendieren eingeleitet. Die Farbentwicklung wurde 1,25 Stunden lang bei 23ºC voranschreiten gelassen. Nach den 1,25 Stunden wurde das Trägermaterial durch Zentrifugation pelletiert und die Absorption des Überstandes bei 410 nm gemessen.
Die bei 410 nm bei den obenstehend beschriebenen Proben gemessenen Absorptionen wurden mit denen, die bei Kontrollen gemessenen wurden, verglichen. Die Kontrolldurchgänge waren gleich wie die obenstehend beschriebenen mit der Ausnahme, daß anstelle der mit dem Oligonukleotid 85-133 derivatisierten Perlen, Perlen verwendet wurden, welche so mit einem Oligonukleotid mit einer Sequenz derivatisiert wurden, daß unter den Stringenzen der Hybridisierung und der Waschschritte keine Hybridisierung zwischen dem Oligonukleotid und dem Zielsegment erwartet wurde. Für jede der Proben war die Absorption mindestens zweimal so groß wie die für die entsprechende Kontrolle.
Somit ist das Kälberdarm-Alkalische Phosphatase-Oligonukleotid-1:1-Konjugat dazu in der Lage weniger als etwa 10&sup9; Ziel-Moleküle in dem obenstehend beschriebenen Sandwich- Assay-System zu detektieren.

BEISPIEL 7

AUF NITROCELLULOSEFILTER BASIERENDER HYBRIDISIERUNGSASSAY UNTER VERWENDUNG VON ENZYM-OLIGONUKLEOTID-KONJUGATEN ALS DETEKTIONSSONDEN

Konjugate aus Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (sowohl "Niedrigsalz" als auch "Hochsalz") und Meerrettichperoxidase. welche an das Oligonukleotid 85-133 über den Linker der Formel -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(NH)N=CH(C&sub6;H&sub4;)(CO)- verknüpft sind und wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben hergestellt wurden, wurden als Detektionssonden in auf Filtern basierenden Assays für das Plasmid pTB061B verwendet.
10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 25 pg, 10 pg und 1 pg des Plasmids pTB061B, 10 ug menschlicher DNA, 1 ug E. coli-DNA und 50 ng pBR322 wurden unter alkalischen Bedingungen bei 65ºC denaturiert (0,2 M NaOH, 15 Minuten), mit 2 M Ammoniumacetat neutralisiert und dann unter Verwendung eines Schleicher und Schuell (Keene, New Hampshire, USA) Minifold II Slot-Blot-Systems auf eine Nitrocellulose-Membran slot-geblottet welche mit 10 x SSC vorbehandelt worden war. Der Filter wurde dann bei 80ºC unter Vakuum gebacken und vorhybridisiert, indem er 10 Minuten lang bei 50ºC in einem hitze-versiegelbaren Plastikbeutel mit 3 ml eines Hybridisierungspuffers (5 x SSC, 5 mg/ml Rinderserumalbumin-Fraktion V, 5 mg/ml Polyvinylpyrrolidon (mittleres Molekulargewicht 40 000 Dalton, Sigma Chemical Company, Inc., St. Louis, Missouri, U.S.A.)) und 0,1 % SDS inkubiert wurde.
Nachdem die Filter vorhybridisiert waren, wurden sie in dem Beutel 1 Stunde lang bei 50ºC mit dem Konjugat bei 2 ug/ml in dem Hybridisierungspuffer hybridisiert.
Nach der Hybridisierung wurde der Filter aus dem Beutel entfernt und dreimal, drei Minuten lang pro Waschung, in 1 x SSC, 0,1 % SDS bei 23ºC gewaschen. Der Filter wurde dann eine Minute lang einem Stringenz-Waschschritt in 1 x SSC, 0,1 % SDS bei 50ºC unterzogen.
Für Assays mit den Alkalische Phosphatase-Konjugaten wurde der Filter danach dreimal mit Entwicklungspuffer (0,1 M Tris, 0,1 M NaCl und 10 mM MgCl&sub2;, pH 9,5) gespült und dann mit der Oberseite nach oben in 5 ml Entwicklungspuffer gebracht, dem Nitrotetrazoliumblau zu 0,33 mg/ml, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat zu 0,16 mg/ml und N,N-Dimethylformamid (DMF) zu 0,33 % (v/v) zugegeben worden waren. Der Filter wurde im Dunklen 1 Stunde lang bei 23ºC gelassen, damit die Farbentwicklung vollzogen wurde.
Für Assays mit den Meerrettichperoxidase-Konjugaten wurde der Filter nach dem Stringenz-Waschschritt mit 0,05 M Tris, pH 7,6, gewaschen und dann entwickelt, indem er mit der Oberseite nach oben in 5 ml einer Lösung von 0,5 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidinhydrochlorid 0,05 M Tris, pH 7,6, mit 0,04 % NiCl&sub2; gebracht und eine Stunde lang bei 23ºC in der Lösung gelassen wurde.
Weder die Alkalische Phosphatase-Konjugate noch die Meerrettichperoxidase-Konjugate ergaben in den Assays mit menschlicher DNA, E. coli-DNA oder pBR322 ein visuell beobachtbares Signal.
Die Alkalische Phosphatase-Konjugate ergaben reproduzierbar deutlich visuell beobachtbare Signale sowohl mit 25 pg pTB061B als auch manchmal mit 10 pg pTB061B. Daher sollte es möglich sein, so wenig wie 3 Attomol eines Nukleinsäureanalyten mit einer Alkalische Phosphatase-Oligonukleotid-Konjugatsonde gemäß der vorhegenden Erfindung in einem Filter gestützten Hybridisierungsassay, ähnlich zu dem in diesem Beispiel beschriebenen, nachzuweisen.
Bei Verwendung des ³²P-markierten Oligonukleotides 85-133 in dem in diesem Beispiel beschriebenen Hybridisierungsassay wurde eine 18 Stunden lange Autoradiographie benötigt, um 25 pg von pTB061B zu detektieren.
Das Meerrettichperoxidase Konjugat ergab ein visuell deutlich beobachtbares Signal mit 1 ng von pTB061B. Daher sollte es moglich sein, weniger als 0,3 Femtomol eines Nukleinsäureanalyten mit einer Meerrettichperoxidase-Oligonukleotid-Konjugatsonde gemäß der vorliegenden Erfindung (worin die Peroxidase an der (den) freien Aminogruppe(n) modifiziert ist, um kovalent an eine freie Aldehydgruppe verknüpft zu sein) in einem Filter-gestützten Hybridisierungsassay, ähnlich zu dem in diesem Beispiel beschriebenen, nachzuweisen.
Es kann möglich sein diese Sensitivität mit anderen Substraten für die Peroxidase als Diaminobenzidin/Nickelchlorid zu steigern, wie etwa dem Chemolumineszenz-Assay unter Anwendung von Luminol und Parahydroxyzimtsäure in Natriumboratpuffer, pH 8,3, und Lesen des Signals mit einem Luminometer, wie von Urdea et al., Gene 61, 253 - 264 (1987) beschrieben. Bei diesem Chemolumineszenz-Assay nach Urdea et al. wird das lumineszente Produkt der enzymatischen Reaktion in die Lösung freigesetzt; daher werden, anstatt Banden direkt auf dem Filter zu entwickeln, die Banden aus dem Filter ausgeschnitten und für die Signalentwicklung in der Entwicklungslösung suspendiert.

BEISPIEL 8

KÄLBERDARM-ALKALISCHE PHOSPHATASE-OLIGONUKLEOTID-KONJUGATSONDE IN DER SOUTHERN-BLOT-ANALYSE

Das Plasmid pTB061B wurde vollständig mit EcoRI verdaut, und 3-fache Verdünnungsreihen des geschnittenen Plasmids in 0,04 M Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8, 1 ug/ml Ethidiumbromid (d.h. 100 ng, 33,3 ng, 11,1 ng, 3,7 ng, 1,2 ng, 410 pg, 137 pg, 45 pg, 15 pg, 5 pg und 1,7 pg Plasmid) wurden durch separate Spuren eines 1,5 % Agarosegels elektrophoresiert. Das Gel wurde unter UV-Licht photographiert, und dann wurden die DNA- Fragmente gemäß dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975) auf einen Nitrocellulosefilter transferiert. Der Filter wurde dann gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren entwickelt, wobei 2 ug/ml der Alkalische Phosphatase-Oligonukleotid 85-133- "Hochsalz"-Konjugatsonde und eine einstündige Farbentwickluug verwendet wurden. Bei der Ethidium-bromid-Färbung konnte nur der pBR322-Abschnitt von pTB061B detektiert werden, und dann nur in den Spuren mit 100 ng und 33,3 ng. Im Gegensatz dazu konnte mit der Konjugatsonde für an einen Filter transferierte DNA lediglich der für das Oberflächenantigen codierende Abschnitt von pTB061B detektiert werden, allerdings in allen Spuren bis hinunter zu der Spur mit 410 pg, wo die Färbung visuell deutlich nachweisbar war.

BEISPIEL 9

DERIVATISIERUNG VON UREASE, UM KOVALENT AN FREIE ALDEHYDGRUPPEN VERKNÜPFT ZU WERDEN, UND HERSTELLUNG EINER UREASE- OLIGONUKLEOTID-KONJUGAT-SONDE

Schwertbohnen Urease (Typ VII) wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA erhalten.
25 nMol der Urease in 0,25 ml Wasser wurden bei 4ºC 2 Stunden lang gegen drei Wechsel von jeweils 30 ml 0,1 M NaHCO&sub3;, 3 M NaCl, pH 8,5 dialysiert. Danach wurde ein 50-facher molarer Überschuß von p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxysuccinimidester in 30 ul Acetonitril zu der Enzym-Lösung zugegeben und die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 23ºC voranschreiten gelassen. Überschüssiger p-Carboxybenzaldehyd-N-hydroxy-succinimidester wurde dann durch 2 Stunden lange Dialyse bei 4ºC gegen 3 Wechsel von jeweils 30 ml 0,05 M MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5 entfernt.
4 nMol des Oligonukleotids 85-133, am 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotid mit der Komponente der Formel -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(NH)(NH&sub2;) derivatisiert und in Pelletform, wurden in 200 ul der Lösung der Urease aufgenommen, modifiziert, um kovalent an freie Aldehydgruppen verknüpft zu werden, und in 0,05 M MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5, wie obenstehend in diesem Beispiel beschrieben gelöst. Die Konjugationsreaktion wurde 16 Stunden lang bei 23ºC voranschreiten gelassen. Danach wurden das Urease-Oligonukleotid-Konjugat und die nicht-umgesetzte Urease von nicht-umgesetztem Oligonukleotid mittels Gelfiltration über eine Biorad P-100-Säule (1,5 x 65 cm) bei 4ºC unter Verwendung von 0,05 M Tris, pH 8,5, als Elutionsniittel abgetrennt. Das Konjugat wurde dann von nicht-umgesetztem Enzym durch Ionenaustauschchromatographie der Enzym- und Konjugat-enthaltenden Fraktionen aus der Gelfiltration über eine DEAE-Cellulose (DE-52, Whatman)-Säule (1 x 7,2 cm) abgetrennt, wobei mit 15 ml 0,05 M Tris, pH 8,5; 15 ml 0,1 M Tris, pH 8,5; 20 ml 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 8,5; 40 ml 0,1 M Tris, 0,2 M NaCl, pH 8,5: und 40 ml 0,1 M Tris, 0,5 M NaCl, pH 8,5, eluiert wurde. Das Urease-Oligonukleotid-Konjugat eluierte bei 0,1 M Tris, 0,5 M NaCl, pH 8,5. Schließlich wurde die das Konjugat enthaltende Fraktion entsalzt und unter Verwendung eines Centricon 30 -Mikrokonzentrators (Molekulargewichtsausschluß: 30 kD) (Amicon Corp., Danvers, Massachusetts, USA) konzentriert.

BEISPIEL 10

DERIVATISIERUNG VON CARBOANHYDRASE, UM KOVALENT AN FREIE ALDEHYDGRUPPEN VERKNÜPFT ZU WERDEN, UND HERSTELLUNG EINER CARBOANHYDRASE-OLIGONUKLEOTID-KONJUGAT-SONDE

Carboanhydrase aus Rindererythrozyten wurde von Cooper Biomedical, Inc., Malvern, Pennsylvania, USA, erhalten. Das Enzym wurde unter Verwendung von p-Carboxybenzaldehyd-N-Hydroxysuccinimidester derivatisiert, um kovalent unter Befolgen des in Beispiel 9 für Urease beschriebenen Verfahrens an freie Aldehydgruppen verknüpft zu werden. Das Derivatisierungs-Verfahren begann mit 25 nMol des Enzyms in einer 0,1 uMol/ml Losung und ergab 250 ul der Lösung des gewünschten Aldehydgruppen-derivatisierten Enzyms bei etwa 0,1 uMol/ml in 0,05 M MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5.
4 nMol des Oligonukleotids 85-133, am 5'-Kohlenstoffatom des 5'-terminalen Nukleotides mit der Komponente der Formel -(PO&sub3;)(NH)(NH)(CO)(NH)(NH&sub2;) derivatisiert und in Pelletform wurden in 200 ul der Lösung der Aldehydgruppen derivatisierten Carboanhydrase in 0,05 M MOPS, 0,1 M NaCl, pH 7,5, aufgenommen und die Konjugationsreaktion zwischen dem Oligonukleotid und dem Enzym wurde 16 Stunden lang bei 23ºC voranschreiten gelassen. Danach wurden das Carboanhydrase-Oligonukleotid-Konjugat und die nicht-umgesetzte Carboanhydrase von nicht-umgesetztem Oligonukleotid mittels Gelfiltration bei 4ºC über eine Sephadex G-75 -Säule wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung von 0,05 M Tris, pH 8,5, als Elutionsmittel abgetrennt. Dann wurde eine Ionenaustauschchromatographie der das freie Enzym enthaltenden und der Konjugat-enthaltenden Fraktionen aus der Gelfiltration wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, um das nicht-umgesetzte Enzym von dem Konjugat abzutrennen. Schließlich wurden die Konjugat-Fraktionen entsalzt und wie in Beispiel 9 beschrieben unter Verwendung eines Centricon 30 -Mikrokonzentrators (Molekulargewichtsausschluß: 30 kD) konzentriert.
Die Konjugat-Sonde wird durch das nach der von der Carboanhydrase katalysierten Hydrolyse erzeugte, gefärbte Produkt von p-Nitrophenylacetat detektiert. Es wurde festgestellt, daß das Enzym in der Sonde in einer derartigen Hydrolyse katalytisch aktiv ist.

Claims

1. Nukleinsäuresonde, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt, worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt; worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker einer Formel verknüpft sind, welche gewählt wird aus der aus Formel I

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) N=CH (R&sub2;) (CO)- I

und Formel II

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) NH (CH&sub2;) (R&sub2;) (CO)- II

bestehenden Gruppe worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),

und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind, worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:

worin R&sub2;&sub1; Alkylen von 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht: worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist; und worin die Kohlenstoffatome der Carbonylgruppen an den rechts gelegenen Seiten der Figuren I und II an das Stickstoffatom einer freien Aminogruppe des Enzyms gebunden sind.

2. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments besteht: das katalytisch aktive Enzym aus der aus Phosphatasen. Peroxidasen, β-Galactosidasen, Ureasen, Carboanhydrasen und Luciferasen bestehenden Gruppe gewählt wird: R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird worin n 0 bis 10 ist: und R&sub2; aus der aus p-Phenylen und (CH&sub2;)m bestehenden Gruppe gewählt wird, worin m 1 bis 10 ist.

3. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 2, worin die Nukleinsäure eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist: R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird: und R&sub2; p-Phenylen ist.

4. Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Enzym aus der aus Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm, E.coli-Alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, E.coli-β-Galactosidase, Schwertbohnen-Urease, Rindererythrocyten-Carboan-hydrase, P.fischeri-Luciferase und Glühwürmchen-Luciferase bestehenden Gruppe gewählt wird.

5. Nukleinsäuresonde, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt; worin das Enzym ein Glykoprotein ist, das mittels Behandlung mit Periodat oxidiert worden ist; worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker einer Formel verknüpft sind, welche gewählt wird aus der aus Formel IX

-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N= IX

und Formel X

-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH- x

bestehenden Gruppe, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),

und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist; und worin das -N= an der rechts gelegenen Seite der Formel IX und der Stickstoff der -NH-Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel X an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden sind, das das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war.

6. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 5, worin die Nukleinsäure aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments besteht: das katalytisch aktive Enzym eine eukaryotische Peroxidase ist, z.B. Meerrettichperoxidase: und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NR)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist.

7. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 6, worin die Nukleinsäure eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist; und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird.

8. Einzelsträngige Nukleinsäure, welche ein Intermediat bei der Herstellung einer Nukleinsäuresonde zum Nachweis eines Zielsegments ist, ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der des Zielsegments umfaßt und mit einem Rest der Formel XIV

-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH&sub2; XIV

derivatisiert ist, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),

und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind; und worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist.

9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, worin die Nukleinsäure aus 20-50 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments besteht: und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist.

10. Nukleinsäure nach Anspruch 9, worin die Nukleinsäure eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist: und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird.

11. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt, worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt, worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker der Formel I:

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) N=CH (R&sub2;) (CO)- I

verknüpft sind, worin R aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),

und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind: worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:

worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht; worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist: und worin das Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe an der rechts gelegenen Seite der Figur I an das Stickstoffatom einer freien Aminogruppe des Enzyms gebunden ist, wobei das Verfahren das Umsetzen einer einzelsträngigen Nukleinsäure, welche dieselbe Sequenz wie die der Nukleinsäure der Sonde besitzt und mit einem Rest der Formel XIV

-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)NH&sub2; XIV

derivatisiert ist, worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist, mit einem katalytisch aktiven Enzym, welches an der freien Aminogruppe mit einem Rest der Formel XVIII

(CHO) (R&sub2;) (CO)- XVIII

derivatisiert ist, in einer wäßrigen Lösung, gepuffert auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0, umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Nukleinsäure aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde besteht; das katalytisch aktive Enzym aus der aus Phosphatasen, Peroxidasen, β-Galactosidasen, Ureasen, Carboanhydrasen und Luciferasen bestehenden Gruppe gewählt wird: R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist; und R&sub2; aus der aus p-Phenylen und (CH&sub2;)m bestehenden Gruppe gewählt wird, worin m 1 bis 10 ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Nukleinsäure eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist; R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird; und R&sub2; p-Phenylen ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das Enzym aus der aus Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm, E. coli-Alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, E.coli-β-Galactosidase, Schwertbohnen-Urease, Rindererythrocyten-Carboanhydrase, P.fischeri-Luciferase und Glühwürmchen-Luciferase bestehenden Gruppe gewählt wird.

15. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt, worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt worin das Enzym ein Glykoprotein ist, das mittels Behandlung mit Periodat oxidiert worden ist; worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker der Formel IX

-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N= IX

verknüpft sind, worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen NH und N, (NH)(CO)(NH),

und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind; worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist; und worin das -N= an der rechts gelegenen Seite der Formel IX an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden ist, das das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war, wobei das Verfahren das Umsetzen einer einzelsträngigen Nukleinsäure, welche dieselbe Sequenz wie die der Nukleinsäure der Sonde besitzt und mit einem Rest der Formel XIV

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) NH&sub2; XIV

derivatisiert ist, worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids gebunden ist, mit dem katalytisch aktiven Enzym in einer wäßrigen Lösung, gepuffert auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0, umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäure aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde besteht; das katalytisch aktive Enzym eine eukaryotische Peroxidase, z.B. Meerrettichperoxidase, ist; und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Nukleinsäure eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist; und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird.

18. Verfahren zur Herstellung einer ersten Nukleinsäuresonde, weiche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure ein Segment von mindestens 20 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments der Sonde umfaßt: worin die Nukleinsäure und das Enzym verknüpft sind durch einen ersten Linker der Formel II:

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) NH (CH&sub2;) (R&sub2;) (CO)- II

oder der Formel XXIX

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) NH- XXIX,

worin R&sub1; aus der Gruppe gewählt wird, die aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH),

und (NH)(CO)(R&sub1;&sub1;)(CO)(NH) besteht, worin R&sub1;&sub1; eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der (CO)-Gruppen oder ein Alkylen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und worin R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub4; und R&sub1;&sub5; gleich oder verschieden sind und jeweils aus der aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe gewählt sind; worin R&sub2; gewählt wird aus der Gruppe, welche aus Alkylen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Arylen der Formel:

worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht, und worin die -(PO&sub3;)- Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist; mit der Maßgabe, daß, wenn die Formel des ersten Linkers die Formel II ist, das Kohlenstoffatom der -(CO)-Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel an eine freie Aminogruppe des Enzyms gebunden ist, und ferner mit der Maßgabe, daß wenn die Formel des ersten Linkers die Formel XXIX ist, das katalytisch aktive Enzym ein Glykoprotein ist und mit Periodat oxidiert worden ist, und das Stickstoffatom der -NH-Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden ist, das das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war; wobei das Verfahren das Umsetzen eines Alkalimetallsalzes von Cyanoborhydrid mit einer zweiten Nukleinsäuresonde in einer wäßrigen Lösung, gepuffert auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0, umfaßt welche im wesentlichen die gleiche ist wie die erste Nukleinsäuresonde mit der Ausnahme, daß in der zweiten Sonde die Nukleinsäure und das Enzym durch einen zweiten Linker der Formel I

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) N=CH (R&sub2;) (CO)- I

oder der Formel IX

-(PO&sub3;)NH(R&sub1;)N= IX

anstelle des ersten Linkers verknüpft sind, mit der Maßgabe, daß wenn der erste Linker von der Formel II ist, der zweite Linker, on der Formel I ist, und daß wenn der erste Linker von der Formel XXIX ist, der zweite Linker von der Formel IX ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin der erste Linker von der Formel II ist, worin die Nukleinsäure aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments besteht; das katalytisch aktive Enzym aus der aus Phosphatasen, Peroxidasen, β-Galactosidasen Ureasen, Carboanhydrasen und Luciferasen bestehenden Gruppe gewählt wird; und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist: und R&sub2; aus der aus p-Phenylen und (CH&sub2;)m bestehenden Gruppe gewählt wird, worin m 1 bis 10 ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Nukleinsäure eine Länge von 25-50 Nukleotiden aulweist; R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird; und R&sub2; p-Phenylen ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, worin das Enzym aus der aus Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm, E. coli-Alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, E.coli-β-Galactosidase, Schwertbohnen-Urease, Rindererythrocyten-Carboanhydrase, P.fischeri-Luciferase und Glühwürmchen-Luciferase bestehenden Gruppe gewählt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 18, worin der erste Linker von der Formel XXIX ist; die Nukleinsäure aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz der Zielsequenz besteht; das katalytisch aktive Enzym eine eukaryotische Peroxidase, z.B. Meerrettichperoxidase, ist; und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die Nukleinsäure eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist: und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird.

24. Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassay für einen Nukleinsäureanalyten, der ein Zielsegment mit mindestens 20 Nukleotiden in einer bekannten Sequenz umfaßt wobei der Assay das Anwenden einer Sonde als Nukleinsäuresonde zum Nachweis des Nukleinsäureanalyten in dem Assay umfaßt welche eine einzelsträngige Nukleinsäure und ein katalytisch aktives Enzym umfaßt worin die Nukleinsäure der Sonde ein Segment mit der komplementären Sequenz zu der Sequenz der Zielsegments umfaßt; worin die Nukleinsäure und das Enzym durch einen Linker einer Formel verknüpft sind, welche gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Formel I

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) N=CH (R&sub2;) (CO)- I

Formel II

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) NH (CH&sub2;) (R&sub2;) (CO)- II

Formel IX

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) N= IX

und Formel X

-(PO&sub3;) NH (R&sub1;) NH- X

worin R&sub2;&sub1; Alkylen mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, besteht; worin die -(PO&sub3;)-Gruppe an das 5'-Kohlenstoffatom des 5'-Nukleotids der Nukleinsäure gebunden ist: und worin die Kohlenstoffatome der Carbonylgruppen an den rechts gelegenen Seiten der Figuren I und II an das Stickstoffatom einer freien Aminogruppe des Enzyms gebunden sind: mit der Maßgabe, daß, wenn der Linker von der Formel IX oder Formel X ist, das katalytisch aktive Enzym ein Glykoprotein ist, das mit Periodat oxidiert worden ist, und -N= an der rechts gelegenen Seite der Formel IX und das Stickstoffatom der -NH-Gruppe an der rechts gelegenen Seite der Formel X an ein Kohlenstoffatom eines Zuckerrestes des Enzyms gebunden sind, das das Kohlenstoffatom einer bei der Behandlung des Enzyms mit Periodat gebildeten Carbonylgruppe war.

25. Assay nach Anspruch 24, worin der Linker der Sonde von der Formel I oder der Formel II ist, worin die Nukleinsäure der Sonde aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments besteht: das katalytisch aktive Enzym aus der aus Phosphatasen, Peroxidasen, β-Galactosidasen, Ureasen, Carboanhydrasen und Luciferasen bestehenden Gruppe gewählt wird: R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist: und R&sub2; aus der aus p-Phenylen und (CH&sub2;)m bestehenden Gruppe gewählt wird, worin m 1 bis 10 ist.

26. Assay nach Anspruch 25, worin die Nukleinsäure der Sonde eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist; R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird: und R&sub2; p-Phenylen ist.

27. Assay nach einem der Ansprüche 24 bis 26, worin das Enzym der Sonde aus der aus Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm, E.coli-Alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, E.coli-β-Galactosidase, Schwertbohnen-Urease, Rindererythrocyten-Carboanhydrase, P.fischeri-Luciferase und Glühwürmchen-Luciferase bestehenden Gruppe gewählt wird.

28. Assay nach einem der Ansprüche 25 bis 27, worin der Linker der Sonde von der Formel I ist.

29. Assay nach Anspruch 24, worin der Linker der Sonde von der Formel IX oder der Formel X ist. worin die Nukleinsäure der Sonde aus 20-150 Nukleotiden in der komplementären Sequenz zu der Sequenz des Zielsegments besteht; das katalytisch aktive Enzym eine eukaryotische Peroxidase, z.B. Meerrettichperoxidase, ist; und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen, (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)n(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird, worin n 0 bis 10 ist.

30. Assay nach Anspruch 29, worin die Nukleinsäure der Sonde eine Länge von 25-50 Nukleotiden aufweist; und R&sub1; aus der aus einer Bindung zwischen den Stickstoffatomen. (NH)(CO)(NH) und (NH)(CO)(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH) bestehenden Gruppe gewählt wird.

31. Assay nach Anspruch 29 oder 30, worin der Linker der Sonde von der Formel IX ist.

32. Sonde mach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 10, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 23, oder Assay nach einem der Ansprüche 24 bis 31, worin die Nukleinsäure oder, im Falle des Assays, die Nukleinsäure der Sonde eine DNA ist.

33. Verwendung einer Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder 32 bei einem Hybridisierungsassay bzw. bei der Herstellung einer Sonde.