CN112662771A - 一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用。利用本发明探针组合,结合高通量测序技术,能够检测转录水平BCR、ABL1、RUNX1、CBFB、PML、RARA和KMT2A相关的融合基因,检出率高、灵敏度高、检测周期短、检测成本低,其中,检测灵敏度达到百分之一以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用。
背景技术
造血系统肿瘤的疾病诊断和靶向治疗非常依赖融合基因的检测。如PML-RARA融合基因阳性急性早幼粒细胞白血病采用维甲酸靶向治疗,BCR-ABL1融合基因阳性慢性髓细胞白血病采用imatinib靶向治疗,CBFB-MYH11和RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性急性髓系白血病提示对化疗敏感预后较好,而KMT2A融合基因在急性髓系白血病中提示预后较差常采用中高危组强化疗方案治疗等等。
当前传统的检测融合基因的技术方法主要有以下几种:
1.PCR、定量PCR技术:该方法主要原理是根据常见融合基因断裂位点设计引物定量 PCR方法检测。该方法的优点是检测灵敏度高,但是只能检测已知断裂位点类型的融合基因。对于不在引物设计位置产生的新融合基因不能检测。2.全基因组测序:该方法的原理是通过对整个基因组测序,经过结构变异分析,能够分析基因融合或重排。但是对于重复序列位置发生基因融合的融合基因,或者全基因组测序漏检的地方发生基因融合,会存在漏检的情况。并且全基因组测序存在成本相对较高,检测周期较长,检测灵敏度低等缺点,导致其很难作为常规检测手段。3.全转录组测序:该方法的原理是通测序检测细胞表达所有基因的mRNA序列,通过生信分析融合基因。全转录组测序的优势是能够分析基因表达,理论上能够检测所有融合基因。但是全转录组测序受基因表达影响较大,某些低表达基因产生融合往往由于测不到足够的数据量而导致检测灵敏度下降。需要标本中肿瘤细胞比例较高才能检测。4.荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)的原理是设计目的基因不同荧光标记探针,通过荧光显微镜观察虽然也能够检测目的基因是否产生融合,但是不能明确对手基因详细断裂位点。并且实验方法中存在两个细胞重叠及探针假阳性信号等因素,检测灵敏度约3-5%左右。5.2019年heyer EE等人发表了靶向捕获RNA 测序的方法检测肿瘤中融合基因方法(PMID:30918253),即转录组靶向捕获测序技术。其原理是提取细胞总RNA,经过加热打断后逆转成cDNA并合成双链DNA。利用探针靶向捕获目的基因序列并测序,测序结果生信分析融合基因。探针设计是依据基因组基因所在外显子DNA序列进行设计,但是该文章没有公布探针设计原理和探针序列。
目前,国内外并没有依据基因转录本号序列来进行探针设计并应用于转录水平靶向捕获测序,更未见转录组水平BCR、ABL1、RUNX1、CBFB、PML、RARA和KMT2A融合基因的检测。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用。本发明提供的靶向捕获探针可准确检测出转录水平BCR、ABL1、RUNX1、CBFB、PML、RARA和KMT2A 相关的融合基因,检出率高、灵敏度高、检测周期短、检测成本低,其中,检测灵敏度达到百分之一以上。
本发明提供了一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针,包括分别针对BCR、ABL1、RUNX1、 PML、RARA、CBFB和KMT2A基因的外显子的起始位点或其附近、终止位点或其附近设计的探针;和
针对BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A基因转录本设计的探针;各基因的转录本号及其对应的基因组一致编码序列号为:
所述靶向捕获探针的长度为120bp,相邻探针之间的间隔为15~20bp。
其中,基因组编码序列号为转录本RNA序列在基因组DNA上的分布组合序列号。
一些实施方案中,所述靶向捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~1037所示。
本发明根据上述基因转录本号设计探针,并在此基础上增加了各基因外显子起始位点或终止位点的捕获探针,通过人为优化调整,共获得1037条靶向捕获探针(如SEQ IDNO:1~1037所示),探针长度为120bp,相邻探针的间隔为15~30bp,各探针在转录本上均匀分布。经试验验证,本发明探针组合能够准确、有效地检测RNA水平BCR、ABL1、 RUNX1、CBFB、PML、RARA和KMT2A基因涉及的融合基因,包括已知的融合类型和未知的融合类型,检测灵敏度可达到1%以上。
本发明还提供了所述的靶向捕获探针在制备检测肿瘤融合基因的产品中的应用。
一些实施方案中,所述肿瘤融合基因包括如下融合基因中的至少一种:
与BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB、KMT2A中任意一个基因融合的融合基因。
其中,所述融合基因包括与BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB、KMT2A、中任意一个基因融合的已知的融合基因,还包括与BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、 CBFB中任意一个基因融合的已知的未知的融合基因。“已知的融合基因”表示两个基因发生融合在有技术已有相关的研究和报道。“未知的融合基因”表示两基因的融合在现有技术从未报道过。
一些具体表实施例中,所述肿瘤融合基因包括:与KMT2A基因融合的融合基因、BCR-ABL1融合基因、RUNX1-RUNX1T1融合基因、PML-RARA融合基因和CBFB-MYH11 融合基因中的至少一种。
本发明提供的靶向捕获探针不仅能够准确检测出以上融合基因,而且还能检测出融合基因的具体融合信息,如BCR-ABL1融合基因的e13a2型、e8a2型、e14a2型。BCR-ABL1 融合基因的e13a2型代表BCR的13号外显子和ABL1基因的2号外显子融合;e8a2型代表BCR的8号外显子和ABL1基因的2号外显子融合;e14a2型代表BCR的14号外显子和ABL1基因的2号外显子融合。
本发明提供的靶向捕获序列除了能够准确检测已知的与BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB、KMT2A融合的融合基因,还能检测未被报道的融合基因,以RARA为例说明。实验表明,本发明靶向捕获探针还可准确检测到未被报道的TNRC18-RARA融合基因类型。
利用本发明提供的靶向捕获探针对待测样本进行检测时,首先提取待测样本的总RNA,反转录获得cDNA,制备cDNA文库,利用本发明靶向捕获探针捕获cDNA文库中与其结合的片段。其中,总RNA的要求较低,待测样本中总RNA的RIN值≥6.5,总RNA 的含量为100ng。
本发明还提供一种肿瘤融合基因靶向检测的试剂盒,包括本发明所述的靶向捕获探针。
一些实施方案中,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂和DNA杂交试剂。
本发明还提供了所述靶向捕获探针或上述试剂盒在制备血液肿瘤临床诊断、预后分型的产品中的应用。
其中,所述血液肿瘤为急性髓系白血病。
本发明还提供了一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针的设计方法,包括:
步骤1:根据BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A基因市的转录本对应的基因编码序列,以120碱基长度为单位,20碱基为间距,筛选获得探针组A,其中,各基因的编码序列的序列号和转录本号为:
步骤2:分别针对BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A基因的外显子的起始位点或其附近、终止位点或其附近设计至少一条探针,获得探针组A;
步骤3:将探针组A和探针组B组合、优化,获得所述靶向捕获探针;
所述优化为:
将探针组A和探针组B的序列在转录组数据库中进行blast比对,剔除探针中与数据库其余基因重合碱基数大于60bp的序列;比较剩余的探针序列,剔除探针组A中与探针组B高度重复和相邻探针间距<15bp的序列。
本发明还提供了一种检测肿瘤融合基因的方法,包括:
提取待测样本总RNA反转录获得cDNA,构建cDNA文库;
将本发明所述的靶向捕获探针与所述cDNA文库杂交捕获,获得cDNA捕获文库;
对所述cDNA捕获文库进行测序,根据测序数据分析融合基因的结果。
一些实施方案中,步骤1中所述总RNA的RIN值≥6.5,所述总RNA的含量为100ng 以上。
本发明提供的肿瘤融合基因的靶向捕获探针可准确检测出转录水平BCR、ABL1、RUNX1、CBFB、PML、RARA和KMT2A相关的融合基因,检测灵敏度达百分之一以上。同时,至少还具有以下优势之一:
1.通过靶向捕获目的基因,排除总RNA中高表达看家基因对数据的干扰,从而对低表达的融合基因具有较高的检出率。
2.能够在3天之内完成检测,检测时间较快、灵活和成本较低,具有巨大的临床应用前景。
3.能够通过增加测序数据量进一步提高融合基因的检测灵敏度,达到定量PCR检测灵敏度。
4.能够通过靶向捕获发现检测目的基因与新的对手基因产生融合,较传统的定量PCR 及多重PCR检测大大提高检出率。
5.明确对手基因和融合位点,能够为临床治疗提供更精准的伴随诊断医疗信息。
6.相比较全转录组测序,转录水平靶向捕获测序对RNA质量要求更低,有利于异地送检。
具体实施方式
本发明公开了一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用。
其中,本发明靶向捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~1037所示。具体序列如表1’所示。
表1’
本发明还提供了一种靶向捕获探针的设计方法,该设计方法具体包括:
步骤1:根据BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A基因的转录本对应的基因编码序列,以120碱基长度为单位,20碱基为间距,筛选获得探针组A,其中,各基因的编码序列的序列号和转录本号为:
步骤2:分别针对BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A基因的外显子的起始位点或其附近、终止位点或其附近设计至少一条探针,获得探针组A;
步骤3:将探针组A和探针组B组合、优化,获得所述靶向捕获探针;
所述优化为:
将探针组A和探针组B的序列在转录组数据库中进行blast比对,剔除其中与数据库其余基因重合碱基数大于60bp的序列;比较剩余的探针序列,剔除探针组A中与探针组 B高度重复和相邻探针间距<15bp的序列。
本发明提供的一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
以RARA基因exon2号外显子探针序列SEQ ID NO:312: CGGTGCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCCCCCCTATGCTGGGTGGACTCTCCCCGCCAGG CGCTCTGACCACTCTCCAGCACCAGCTTCCAGTTAGTGGATATAGCACACCATCCCCA GCCA为例,经过http://grch37.ensembl.org/Multi/Tools/Blast序列比对人转录数据库,结果显示,该探针100%一致序列均为RARA基因转录水平序列,与其余基因序列最高只有17 个碱基的重合,表明该探针特异性良好。
实施例2BCR-ABL1融合基因检测
标本信息:BCR-ABL1融合基因阳性患者骨髓标本
实验步骤:
(1)提取骨髓标本中总RNA,用QubitTM RNA IQ Assay Kit检测样品RNA的完整度,要求RNA的完整度(RIN值)大于等于6.5。要求总RNA的起始总量为1-100ng的范围,将RNA溶于10微升的无核酶的水中。
(2)在片段化、预备和洗脱缓冲液(1X)中重悬起始RNA,并在高温下通过孵育将其片段化成所需片段大小。我们所需的目标片段大小为400bp左右,片段化条件为:85℃, 6分钟。
(3)将RNA逆转成cDNA(两步法),采用随机引物结合进行第一条链合成,合成第二链时,为了保证链特异性将dUTP掺入第二条cDNA链,并在所得dscDNA的3’末端加入dAMP。
(4)进行接头连接,即在文库插入片段上连接带有3’dTMP端的dsDNA接头。
(5)文库扩增,使用高保真低偏差PCR,扩增在两端携带特异接头序列的文库片段。标记有dUTP的链未被扩增,允许进行链特异性测序。
(6)纯化扩增后的文库并对文库进行质检定量,取等量的文库与SEQ ID NO:1~1037 所示的探针进行杂交过夜。
(7)杂交后捕获,采用链霉亲和素磁珠对杂交后文库进行捕获并用洗脱缓冲液进行洗脱。
(8)捕获后文库扩增,根据探针panel大小以及杂交的文库量优化PCR的循环数。
(9)扩增后纯化文库并进行文库定量和质检,采用illuminaNextseq 550测序平台对文库进行测序。
(10)测序结果分析,采用Ariba和STAR-FUSION软件分析融合基因结果。
检测仪器:illumina nextseq550。STAR-FUSION软件分析结果见表1。检测结果,检测到BCR-ABL1融合基因(e13a2型)转录本。
表1BCR-ABL1(e13a2型)转录本
实施2罕见型BCR-ABL1融合基因检测
标本信息:BCR-ABL1融合基因阳性患者骨髓标本。
实验步骤:同实施例2。
检测仪器:illumina nextseq550。
检测结果:检测到BCR-ABL1(e8a2型)融合基因转录本。
STAR-FUSION软件分析结果见表2。
表2BCR-ABL1(e8a2型)转录本
实施例3百分之一阳性标准品中BCR-ABL1融合基因检测
标本信息:BCR-ABL1融合基因阳性K562细胞株同Jurkat细胞株按照1:100比例混合。
实验步骤:同实施例2。
检测仪器:illumina nextseq550。
检测结果:检测到BCR-ABL1(e14a2型)融合基因转录本。STAR-FUSION软件分析结果见表3。
表3BCR-ABL1(e14a2型)转录本
实施例4 RUNX1-RUNX1T1融合基因检测
标本信息:RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性患者骨髓标本。
实验步骤:同实施例2。
检测仪器:illumina nextseq550。
检测结果:检测到RUNX1-RUNX1T1融合基因转录本。
STAR-FUSION软件分析结果见表4。
表4RUNX1-RUNXT1转录本
实施例5 CBFB-MYH11融合基因检测
标本信息:CBFB-MYH11融合基因阳性患者骨髓标本。
实验步骤:同实施例2。
检测仪器:illumina nextseq550。
检测结果:检测到CBFB-MYH11融合基因转录本。
STAR-FUSION软件分析结果见表5。
表5CBFB-MYH11转录本
实施6PML-RARA融合基因检测
标本信息:PML-RARA融合基因阳性患者骨髓标本。
实验步骤:同实施例2。
检测仪器:illumina nextseq550。
检测结果:检测到PML-RARA(L型)融合基因转录本。
STAR-FUSION软件分析结果见表6。
表6PML-RARA(L型)转录本
实施例7罕见型RARA融合基因检测
标本信息:非典型APL患者骨髓标本。
实验步骤:同实施例2。
检测仪器:illumina nextseq550。
检测结果:检测到TNRC18-RARA融合基因转录本(未报道的融合基因),具体融合信息见表7所示的STAR-FUSION软件分析结果,该结果与一代测序的结果一致。
表7罕见型RARA融合基因转录本
实施例8KMT2A融合基因检测
标本信息:KMT2A融合基因阳性患者骨髓标本。
实验步骤:同实施例2。
检测仪器:illumina nextseq550。
检测结果:检测到KMT2A-MON2融合基因转录本(未报道的融合基因)。具体融合信息见表8所示的STAR-FUSION软件分析结果,该结果与一代测序的结果一致。
表8KMT2A融合基因转录本
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的靶向捕获探针,其特征在于,所述靶向捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~1037所示。
3.权利要求1或2所述的靶向捕获探针在制备检测肿瘤融合基因的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述肿瘤融合基因包括如下融合基因中的至少一种:
与BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A中任意一个基因融合的融合基因。
5.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述肿瘤融合基因包括:与KMT2A基因融合的融合基因、BCR-ABL1融合基因、RUNX1-RUNX1T1融合基因、PML-RARA融合基因和CBFB-MYH11融合基因中的至少一种。
6.一种肿瘤融合基因靶向检测的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的靶向捕获探针。
7.权利要求1或2所述的靶向捕获探针或权利要求7所述的试剂盒在制备血液肿瘤临床诊断、预后分型的产品中的应用。
8.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述血液肿瘤为急性髓细胞白血病诊断分型。
9.一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针的设计方法,其特征在于,包括:
步骤1:根据BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A基因的转录本对应的基因编码序列,以120碱基长度为单位,20碱基为间距,筛选获得探针组A,其中,各基因的转录本号及其对应的基因组编码序列的序列号为:
步骤2:分别针对BCR、ABL1、RUNX1、PML、RARA、CBFB和KMT2A基因的外显子的起始位点或其附近、终止位点或其附近设计至少一条探针,获得探针组A;
步骤3:将探针组A和探针组B组合、优化,获得所述靶向捕获探针;
所述优化为:
将探针组A和探针组B的序列在转录组数据库中进行blast比对,剔除探针中与数据库其余基因重合碱基数大于60bp的序列;比较剩余的探针序列,剔除探针组A中与探针组B高度重复和相邻探针间距<15bp的序列。
10.一种检测肿瘤融合基因的方法,其特征在于,包括:
提取待测样本总RNA反转录获得cDNA,构建cDNA文库;
将所述权利要求1或2所述的靶向捕获探针与所述cDNA文库杂交捕获,获得cDNA捕获文库;
对所述cDNA捕获文库进行测序,根据测序数据分析融合基因的结果。
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN113249469A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-08-13 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种克隆性嗜酸性粒细胞增多症融合基因检测探针组合物、试剂盒及其应用 |
CN114317753A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-12 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 眼肿瘤融合基因的检测模型及构建方法和检测方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060134667A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-06-22 | Masatoshi Narahara | Method for detecting fusion gene |
WO2013105801A1 (ko) * | 2012-01-12 | 2013-07-18 | 건국대학교 산학협력단 | 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프로브, 프라이머 및 이의 이용방법 |
CN108486235A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-09-04 | 北京圣谷智汇医学检验所有限公司 | 一种高效经济检测融合基因的方法和体系 |
CN111321202A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-06-23 | 广州金域医学检验集团股份有限公司 | 基因融合变异文库构建方法、检测方法、装置、设备及存储介质 |
CN111979307A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-24 | 伯科生物科技有限公司 | 用于检测基因融合的靶向测序方法 |
-
2020
- 2020-12-30 CN CN202011601688.0A patent/CN112662771B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060134667A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-06-22 | Masatoshi Narahara | Method for detecting fusion gene |
WO2013105801A1 (ko) * | 2012-01-12 | 2013-07-18 | 건국대학교 산학협력단 | 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프로브, 프라이머 및 이의 이용방법 |
CN108486235A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-09-04 | 北京圣谷智汇医学检验所有限公司 | 一种高效经济检测融合基因的方法和体系 |
CN111321202A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-06-23 | 广州金域医学检验集团股份有限公司 | 基因融合变异文库构建方法、检测方法、装置、设备及存储介质 |
CN111979307A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-24 | 伯科生物科技有限公司 | 用于检测基因融合的靶向测序方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113249469A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-08-13 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种克隆性嗜酸性粒细胞增多症融合基因检测探针组合物、试剂盒及其应用 |
CN113249469B (zh) * | 2021-07-05 | 2021-10-15 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种克隆性嗜酸性粒细胞增多症融合基因检测探针组合物、试剂盒及其应用 |
CN114317753A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-12 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 眼肿瘤融合基因的检测模型及构建方法和检测方法 |
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