CN116515958A - 一种捕获目标区域序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种捕获目标区域序列的方法，所述方法利用寡核苷酸序列竞争性结合与目标区域序列杂交的探针，进而获得目标区域序列。本发明的方法可有效提高对目标区域序列的捕获效率，节约测序成本。

Description

一种捕获目标区域序列的方法
技术领域
本发明属于高通量测序领域，具体涉及一种捕获目标区域序列的方法。
背景技术
基因组数据量庞大，即使采用高通量测序技术(二代测序技术)对全基因组测序仍然面临着成本高、数据分析复杂、周期长等问题。基因捕获测序技术是一种基于核酸分子碱基互补杂交原理、针对目标区域设计特异性探针并将探针与构建好的全基因组文库进行杂交捕获实现对目标区域特异性富集、通过高通量测序获得目标序列信息的技术。该技术可以有效降低测序成本，提高目标区域测序深度，更精确发现特定区域遗传变异信息。目前，常用的液相杂交捕获技术是通过在溶液中使目标文库和带有生物素标记的探针直接杂交，然后通过探针上的生物素与磁珠包裹的链霉亲和素结合使目标文库锚定在带有亲和素的磁珠上。洗去磁珠上粘连的以及探针非特异性杂交的非目标文库，实现对目标文库的富集，通过对带有目标文库的磁珠进行扩增，构建高通量测序文库。
杂交捕获技术虽然能通过对目标文库的富集，降低测序成本，但对于目标区域较小或病原微生物感染样本的杂交捕获，非目标区域文库相对占比较高，使得现有的捕获方法效果较差。现有的捕获方法的缺点包括捕获率低、浪费测序数据量、增加测序成本。
因此，本领域亟需一种高效捕获目标区域序列的方法。
发明内容
如前所述，本领域亟需一种高效捕获目标区域序列的方法。
为降低测序过程中非目标文库的影响、解决目标区域文库捕获率低、测序成本高的问题，本发明人提出了一种提高文库目标区域捕获效率的置换洗脱方法，通过本发明的方法可以高效捕获目标区域序列。
在第一方面，本发明提供了一种捕获目标区域序列的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取样本的基因组DNA，构建全基因组文库；
2)在第一温度下，将步骤1)所述全基因组文库与目标区域序列的探针进行杂交；
3)将步骤2)的反应体系进行探针捕获；
4)在第二温度下，将步骤3)所述捕获的探针置于置换洗脱液中，所述置换洗脱液含有竞争性结合所述探针的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列与所述探针反向互补；
5)纯化获得所述目标区域序列。
在第二方面，本发明提供了一种捕获目标区域序列的试剂盒，所述试剂盒用于实现第一方面所述的方法。
本发明的有益效果包括：(1)省去了对捕获磁珠进行的繁琐洗涤步骤，缩短了制备捕获文库的时间；(2)置换过程仅需对上清液进行扩增反应，实现了不带磁珠进行扩增，有效避免了捕获磁珠在扩增过程中形成空间位阻对扩增反应造成不利影响，同时还避免了扩增产物纯化过程中磁珠总量过多、干燥时间长的不利影响，大大提高了纯化步骤的便捷性；(3)置换反应显著提高了对目标区域文库的捕获效率，节约测序成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式中的附图作简单地介绍。
图1示出了本发明中寡核苷酸序列Oligo(O)竞争性结合探针(P)从而释放文库(L)的示意图。
图2示出了本发明中置换反应过程的示意图。
图3示出了本发明中置换反应前后反应体系的示意图。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
在本文中，术语“探针”是指通常用于检测与探针的序列互补的靶序列的单链寡核苷酸。探针的长度取决于预期用途以及所需的探针特异性。通常，探针的长度为20至500个核苷酸，优选20至100个，更优选20至50个核苷酸。探针可以是经直接标记的或经间接标记的，例如用链霉抗生物素蛋白复合物随后可结合的生物素标记的。标记可以引入核酸中的任何位置，例如3’端、5’端或内部。术语“探针”还涵盖其骨架组成不同的核酸，例如但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
在本文中，术语“链霉亲和素”是指可与生物素结合的蛋白质或肽，并且可包括：天然蛋清抗生物素蛋白、重组抗生物素蛋白、抗生物素蛋白的去糖基化形式、细菌链霉亲和素、重组链霉亲和素、截短型链霉亲和素和/或其任何衍生物。
在本文中，术语“磁珠”是指可在溶液中分散或悬浮的任何颗粒，其可通过施加磁场来吸引或引导。磁珠现已广泛用于细胞分离、酶的固定、核酸纯化等多个领域。
在本文中，术语“寡核苷酸序列”是指2-10个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段，但在使用这一术语时，对核苷酸残基的数目并无严格规定，有时把含有30个甚至更多核苷酸残基的多核苷酸分子也称作寡核苷酸序列。寡核苷酸序列可以包括一个或更多个非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。
如前所述，本发明旨在提供一种高效捕获目标区域序列的方法。
因此，在第一方面，本发明提供了一种捕获目标区域序列的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取样本的基因组DNA，构建全基因组文库；
2)在第一温度下，将步骤1)所述全基因组文库与目标区域序列的探针进行杂交；
3)将步骤2)的反应体系进行探针捕获；
4)在第二温度下，将步骤3)所述捕获的探针置于置换洗脱液中，所述置换洗脱液含有竞争性结合所述探针的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列与所述探针反向互补；
5)纯化获得所述目标区域序列。
所述目标区域序列是指科学研究、临床检验等场景中需检测的基因组上的一段序列。例如在非小细胞肺癌患者的临床治疗中需检测HER2基因的突变情况以指导用药，此时HER2基因的外显子区域即为所述目标区域序列。上述方法中可以利用磁珠进行探针捕获，磁珠捕获序列与探针的杂交产物可以通过以下方式：所述探针上带有生物素标记，所述磁珠上带有链霉亲和素，获得生物素-链霉亲和素复合物，进而获得探针、目标区域序列、磁珠的复合物。应理解，其他富集序列与探针的杂交产物的方法也适用于本发明。
图1示出了寡核苷酸序列(Oligo)竞争性结合探针的示意图，其中P表示探针、O表示Oligo、L表示文库，探针(P)、Oligo(O)、文库(L)在特定条件下进行置换反应。ΔGPL表示P和L→PL双链的自由能，ΔGPO表示P和O→PO双链的自由能，此处从热力学和动力学角度使用以下公式计算置换反应的灵敏度(Sensitivity)：
其中，ΔΔGL表示目标文库(目标区域序列)与探针形成双链结构与解除双链结构反应相比的自由能差，R为气体常数，T为温度，KPLO为P、L、O三者的平衡常数，ΔΔGPO表示Oligo与探针形成双链与解除双链结构反应相比的自由能差，Oligo与探针结合可释放更多的能量，目标文库解链释放所需能量较少，推动置换反应的正向进行。
图2示出了上述方法中置换反应过程的示意图。置换反应前，捕获磁珠捕获目标文库与探针的杂交产物，Oligo处于游离状态；置换反应过程中Oligo竞争性结合探针；置换反应后，捕获磁珠捕获Oligo与探针的杂交产物，目标文库处于游离状态。置换反应后，目标文库处于反应体系的上清液中(图3)。
在一个实施方案中，所述置换洗脱液含有Na+。
在一个实施方案中，所述置换洗脱液不含有扩增反应抑制剂。
在一个实施方案中，所述第二温度高于所述第一温度。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸序列包含肽核酸(PNA)，PNA含量可以占整个序列的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％等。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸序列中10％的核苷酸是肽核酸(PNA)。PNA由电中性的酰胺骨架组成，PNA链与DNA链之间无排斥现象，使用核酸类似物PNA可增强寡核苷酸序列(Oligo)与探针的结合力。与相同序列的天然核苷酸序列相比，每增加1个PNA，解链温度提高1℃，因此大大提高了PNA链与DNA链结合的稳定性。使用下式计算寡核苷酸序列(Oligo)的Tm值：
Tm(Oligo)＝81.5+16.6x Log10[CNa+]+0.41x(PGC)–600/size+N，
其中，size为寡核苷酸序列(Oligo)的长度，等于探针的长度，N为寡核苷酸序列(Oligo)中掺入PNA的数量，CNa+为洗脱buffer中Na+的浓度(含有Na+可增大Oligo的Tm值)，PGC为寡核苷酸序列的GC含量。
在一个实施方案中，所述置换洗脱液中所述寡核苷酸序列的浓度高于所述探针的浓度，例如所述寡核苷酸序列的浓度是所述探针的浓度的10倍、100倍、1000倍。在一个实施方案中，所述置换洗脱液中所述寡核苷酸序列的浓度高于所述目标区域序列的浓度，例如所述寡核苷酸序列的浓度是所述目标区域序列的浓度的10倍、100倍、1000倍。置换洗脱液中寡核苷酸序列(Oligo)的浓度影响置换反应的灵敏度，计算公式如下：
其中，F(x,[PO]o)表示寡核苷酸序列(Oligo)对探针的灵敏度，co为目标文库(目标区域序列)的浓度，x为平衡常数，[PO]o为探针的初始浓度，[O]o为Oligo的初始浓度。
在一个实施方案中，所述方法的步骤4)与步骤5)之间还包括步骤：获得步骤4)的反应体系的上清液，扩增所述目标区域序列，获得所述目标区域序列的文库。
在一个进一步的实施方案中，在扩增反应前，去除所述上清液中的所述磁珠。去除捕获磁珠后进行扩增反应，可避免由磁珠引起的空间位阻对扩增反应的抑制作用。
在第二方面，本发明提供了一种捕获目标区域序列的试剂盒，所述试剂盒用于实现第一方面所述的方法。
实施例
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1
本实施例对人类血液样本和人类肝脏穿刺样本构建全基因组文库，具体包括以下过程：
1、建库前准备
(1)提前将IGTTM Fast Library Prep Kit v2.0试剂盒中的建库试剂及所配套的接头和引物试剂取出解冻，之后置于冰盒或4℃冰箱暂存；提前30min取出纯化磁珠，涡旋混匀，平衡至室温；
(2)提前用无水乙醇和Nuclease Free Water配制80％乙醇；
(3)建库前，将样本的DNA片段化处理，片段大小为150-200bp。
2、末端修复，3’端加“A”
(1)将End Repair&A-Tailing Buffer和End Repair&A-Tailing Enzyme Mix短暂涡旋混匀，瞬时离心，在冰盒上按表1配制反应液；
表1：末端修复反应体系
试剂 体积
DNA fragment ×μL
Nuclease Free Water (50-X)μL
End Repair&A-Tailing Enzyme Mix 3μL
End Repair&A-Tailing Buffer 7μL
总体积 60μL
(2)使用移液器吸打混匀或短暂涡旋混匀(避免剧烈振荡混匀)，瞬时离心；设置PCR仪参数如表2所示，将反应液置于PCR仪上，运行程序。
表2：末端修复的PCR程序
3、接头连接
(1)将Ligation Buffer、DNA Ligase和Adapter(稀释后)短暂涡旋混匀，瞬时离心，在冰盒上按表3配制反应液；
表3：接头连接反应体系
试剂 体积
来自STEP2反应结束的样品 60μL
Adapter(稀释后) 5μL
Ligation Buffer 30μL
DNA Ligase 5μL
Nuclease Free Water 10μL
总体积 110μL
(2)使用移液器吸打混匀或短暂涡旋混匀(避免剧烈震荡混匀)，瞬时离心；设置PCR仪参数如表4所示(关闭热盖或不加盖热盖)，将反应液置于PCR仪上，运行程序。
表4：接头连接的PCR程序
4、连接后纯化
(1)将已经平衡至室温的纯化磁珠涡旋混匀，在步骤3完成后的反应液中加入88μL的磁珠，吸打混匀或涡旋混匀，室温静置5min；瞬时离心，将反应管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
(2)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，用200μL 80％乙醇溶液洗涤两次，移弃上清，保证PCR管底部无残留乙醇，保持PCR管在磁力架上，室温静置3-5min，晾干磁珠使残留乙醇彻底挥发；加入22μL的Nuclease Free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀或涡旋混匀，室温静置2min；瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清；用移液器吸取20μL上清液，转移到新的PCR管中，做好标记，准备下一步反应。
5、PCR扩增
(1)将PCR Master Mix、UDI Primer(Index primer)短暂涡旋混匀后，瞬时离心，按照对应体系在冰盒上配制PCR反应液，并记录好所使用的Index号，反应体系如表5所示；
表5：PCR扩增反应体系
试剂 体积
来自STEP 4反应结束的样品 20μL
PCR Master Mix 25μL
UDI Primer 5μL
总体积 50μL
(2)吸打混匀或涡旋混匀，然后瞬时离心；设置PCR程序如表6所示，将反应液置于PCR仪上，运行程序。
表6：PCR扩增的程序
6、扩增后纯化
(1)程序运行完成后进行磁珠纯化，将已经平衡至室温的纯化磁珠涡旋混匀，向扩增后的PCR产物中，加入1倍体积的磁珠(50μL)，吸打混匀，室温静置5min；瞬时离心，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；保持PCR管在磁力架上，移弃上清，用200μL 80％乙醇溶液洗涤两次，移弃上清，保证PCR管底部无残留乙醇，保持PCR管在磁力架上，室温静置3-5min，晾干磁珠使残留乙醇彻底挥发；
(2)加入30μL Nuclease Free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀或涡旋混匀，室温静置2min；瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清；用移液器吸取28μL上清液，转移到新的PCR管中(置于冰盒上)，做好标记；
(3)取1μL样品使用Qubit(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。
完成建库后，针对人类基因组中1.6K目标区域设计并合成带有生物素标记的RNA探针，该探针可以捕获目标区域序列；合成与上述RNA探针具有更强结合力的Oligo，并使用不含有扩增反应抑制剂的溶液进行溶解，配置成置换洗脱液，Oligo为与探针反向互补的长链寡核苷酸序列，其中10％核苷酸由核酸类似物PNA替代来增强其与探针的结合力。例如，本实施例中的一个探针的序列为TGATTGTGCCCAGATCCACCGGCAACACATCTTAGAAATGACCTC ATCCATTACACCACTATCTACTAACACCCTCAGGGTGGTTTCCTAC CCCAGTCCA(SEQ ID NO:1)，该探针对应的Oligo的序列为TGGACTGGGGTAGGA*A*C*CCC*GAGGG*GTTAGT*GATAGTGGT GT*ATGGATGAG*TCATTTCTAAGATGTGTTGCCG*TG*ATCTGGGC ACAATCA(SEQ ID NO:2，其中*表示PNA)。
本实施例分为实验组和对照组，利用上述全基因组文库、RNA探针、Oligo进行目标区域序列的捕获。其中，实验组使用本发明的方法对置换获得的上清液进行扩增获得捕获文库；对照组使用现有的捕获方法对捕获磁珠洗涤后，带磁珠进行扩增获得捕获文库。实验组和对照组均使用构建的12个全基因组文库(6个人类血液样本和6个人类肝脏穿刺样本)与上述RNA探针进行过夜杂交，后进行捕获文库的构建，并进行测序和数据分析。
实验组的具体实验过程如下：
1、过夜杂交反应
将制备的目标区域的RNA探针、人类全基因组文库以及杂交反应液混合成杂交反应体系。杂交反应条件：置于80℃温度下5min，50℃温度下过夜杂交16h。
2、捕获磁珠与探针进行结合(binding)
(1)将捕获磁珠放置在室温30min将磁珠平衡至室温，使用binding buffer对捕获磁珠进行三次洗涤，最后一次使用150μL binding buffer重悬磁珠；
(2)将过夜杂交反应体系与binding buffer重悬的捕获磁珠进行混合，并在室温条件下缓慢旋转，充分反应30min。
3、洗去杂交液
(1)上述反应结束后将其放置在磁力架上，吸附3min，待液体澄清后弃掉上清液；
(2)使用洗涤液重悬磁珠并放置在50℃温度下洗涤10min，结束后将其放置在磁力架静止3min，待液体澄清，弃掉上清液。
4、置换反应
(1)使用25μL包含Oligo的置换洗脱液重悬上述捕获磁珠，吹打混匀后将其放置在80℃温度下加热模块，加热洗脱3min；
(2)反应结束后，进行瞬时离心，将其放置在磁力架上，静止3min，待液体澄清后将24μL上清液转移到新的PCR管中。
5、扩增反应
向上述上清液中添加1μL扩增引物(P5：AATGATACGGCGA CCACCGA(SEQ ID NO:3)，P7：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:4))、25μL扩增试剂，总体系50μL，根据表7程序进行扩增反应。
表7：扩增程序
6、扩增后纯化
(1)取出纯化磁珠，混匀后置于室温平衡30min；
(2)扩增反应结束后，向扩增产物中加入55μL纯化磁珠，吹打混匀，室温静止5min；
(3)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
(4)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s；
(5)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，再次向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移弃上清；
(6)保持PCR管在磁力架上，室温静置3-5min，晾干磁珠使残留的乙醇彻底挥发；
(7)加入25μL Nuclease Free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀，室温静置2min；
(8)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清；
(9)吸取上清液，转移至新的PCR管中，获得捕获文库；
(10)取1μL文库进行定量，记录文库浓度；
(11)取1μL文库进行片段质检，文库长度约在220-320bp之间。
7、测序及分析
对上述文库进行测序，获得测序数据进行分析。
对照组的具体实验过程如下：
1、过夜杂交反应
将制备的目标区域的RNA探针、人类全基因组文库以及杂交反应液混合成杂交反应体系。杂交反应条件：置于80℃温度下5min，50℃温度下过夜杂交16h。
2、捕获磁珠与探针进行结合(binding)
(1)将捕获磁珠放置在室温30min将磁珠平衡至室温，使用binding buffer对捕获磁珠进行三次洗涤，最后一次使用150μL binding buffer重悬磁珠；
(2)将过夜杂交反应体系与binding buffer重悬的捕获磁珠进行混合，并在室温条件下缓慢旋转，充分反应30min。
3、洗去杂交液
(1)上述反应结束后将其放置在磁力架上，吸附3min，待液体澄清后弃掉上清液；
(2)使用洗涤液重悬磁珠并放置在50℃温度下洗涤10min，结束后将其放置在磁力架静止3min，待液体澄清，弃掉上清液；重复该洗涤过程3次。
4、扩增反应
向上述反应体系中添加1μL扩增引物(P5：AATGATACGGC GACCACCGA(SEQ ID NO:3)，P7：CAAGCAGAAGACGGCATACG A(SEQ ID NO:4))、25μL扩增试剂，总体系50μL，根据表7程序进行扩增反应。
5、扩增后纯化
(1)取出纯化磁珠，混匀后置于室温平衡30min；
(2)扩增反应结束后，向扩增产物中加入55μL纯化磁珠，吹打混匀，室温静止5min；
(3)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
(4)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s；
(5)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，再次向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移弃上清；
(6)保持PCR管在磁力架上，室温静置3-5min，晾干磁珠使残留的乙醇彻底挥发；
(7)加入25μL Nuclease Free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀，室温静置2min；
(8)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清；
(9)吸取上清液，转移至新的PCR管中，获得捕获文库；
(10)取1μL文库进行定量，记录文库浓度；
(11)取1μL文库进行片段质检，文库长度约在220-320bp之间。
6、测序及分析
对上述文库进行测序，获得测序数据进行分析。
结果如表8所示：现有捕获方法的捕获效率整体偏低，在56％-61％之间；置换洗脱捕获方法(本发明的方法)捕获效率较稳定，基本大于80％。与现有捕获方法相比，使用本发明的方法使得目标区域捕获效率提升20％-26％，捕获效率平均提升22.3％。
表8：现有捕获方法与本发明的方法对血液和组织全基因组文库中目标区域捕获效率的比较
实施例2
病原微生物可以侵犯人体，进而引起人体不同程度病理变化，尽早识别致病病原对临床治疗具有重要意义。目前基因捕获方法广泛应用于病原微生物感染检测，但是在病原微生物含量较低的样本中，由于人类基因组的影响，病原微生物目标片段的捕获率很低，使得对病原微生物的感染判定十分困难。
本实施例对人基因组DNA掺入不同数量的低拷贝数HPV18基因组进行充分混合后构建文库(建库方法与实施例1相同)；针对HPV18基因组全长7.9kb序列设计并合成带有生物素标记的RNA探针；合成与上述RNA探针具有更强结合力的Oligo，并使用不含有扩增反应抑制剂的溶液进行溶解，配置成置换洗脱液，Oligo为与探针反向互补的长链寡核苷酸序列，其中10％核苷酸由核酸类似物PNA替代来增强其与探针的结合力。例如，本实施例中的一个探针的序列为ATTAATACTTTTAACAATTGTAGTATATAAAAAAGGGAGTAACCGA AAACGGTCGGGACCGAAAACGGTGTATATAAAAGATGTGAGAAA CACACCACAA(SEQ ID NO:5)，该探针对应的Oligo的序列为TTGTGGTGTGTTTCT*A*A*CTT*TATAT*CACCGT*TTCGGTCCCGA*CGTTTTCGG*TACTCCCTTTTTTATATACTAC*AT*GTTAAAAGTAT TAAT(SEQ ID NO:6，其中*表示PNA)。
本实施例分为实验组和对照组，利用上述文库、RNA探针、Oligo进行目标区域序列的捕获，其中，实验组使用本发明的方法对置换获得的上清液进行扩增获得捕获文库，对照组使用现有的捕获方法对捕获磁珠洗涤后，带磁珠进行扩增获得捕获文库。实验组和对照组均使用上述构建的文库(HPV与人类基因组的拷贝数比例分别为1:10、1:100、1:1000，每一比例四个重复)与上述RNA探针进行过夜杂交，后进行捕获文库的构建，并进行测序和数据分析。
实验组的具体实验过程如下：
1、过夜杂交反应
将制备的目标区域的RNA探针、混合DNA构建的文库以及杂交反应液混合成杂交反应体系。杂交反应条件：置于80℃温度下5min，50℃温度下过夜杂交16h。
2、捕获磁珠与探针进行binding
(1)将捕获磁珠放置在室温30min将磁珠平衡至室温，使用binding buffer对捕获磁珠进行三次洗涤，最后一次使用150μL binding buffer重悬磁珠；
(2)将过夜杂交反应体系与binding buffer重悬的捕获磁珠进行混合，并在室温条件下缓慢旋转，充分反应30min。
3、洗去杂交液
(1)上述反应结束后将其放置在磁力架上，吸附3min，待液体澄清后弃掉上清液；
(2)使用洗涤液重悬磁珠并放置在50℃温度下洗涤10min，结束后将其放置在磁力架静止3min，待液体澄清，弃掉上清液。
4、置换反应
(1)使用25μL包含Oligo的置换洗脱液重悬上述捕获磁珠，吹打混匀后将其放置在80℃温度下加热模块，加热洗脱3min；
(2)反应结束后，进行瞬时离心，将其放置在磁力架上，静止3min，待液体澄清后将24μL上清液转移到新的PCR管中。
5、扩增反应
向上述上清液中添加1μL扩增引物(P5：AATGATACGGCGA CCACCGA(SEQ ID NO:3)，P7：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:4))、25μL扩增试剂，总体系50μL，根据表7程序进行扩增反应。
6、扩增后纯化
(1)取出纯化磁珠，混匀后置于室温平衡30min；
(2)扩增反应结束后，向扩增产物中加入55μL纯化磁珠，吹打混匀，室温静止5min；
(3)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
(4)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s；
(5)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，再次向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移弃上清；
(6)保持PCR管在磁力架上，室温静置3-5min，晾干磁珠使残留的乙醇彻底挥发；
(7)加入25μL Nuclease Free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀，室温静置2min；
(8)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清；
(9)吸取上清液，转移至新的PCR管中，获得捕获文库；
(10)取1μL文库进行定量，记录文库浓度；
(11)取1μL文库进行片段质检，文库长度约在220-320bp之间。
7、测序及分析
对上述文库进行测序，获得测序数据进行分析。
对照组的具体实验过程如下：
1、过夜杂交反应
将制备的目标区域的RNA探针、混合DNA构建的文库以及杂交反应液混合成杂交反应体系。杂交反应条件：置于80℃温度下5min，50℃温度下过夜杂交16h。
2、捕获磁珠与探针进行结合(binding)
(1)将捕获磁珠放置在室温30min将磁珠平衡至室温，使用binding buffer对捕获磁珠进行三次洗涤，最后一次使用150μL binding buffer重悬磁珠；
(2)将过夜杂交反应体系与binding buffer重悬的捕获磁珠进行混合，并在室温条件下缓慢旋转，充分反应30min。
3、洗去杂交液
(1)上述反应结束后将其放置在磁力架上，吸附3min，待液体澄清后弃掉上清液；
(2)使用洗涤液重悬磁珠并放置在50℃温度下洗涤10min，结束后将其放置在磁力架静止3min，待液体澄清，弃掉上清液；重复该洗涤过程3次。
4、扩增反应
向上述反应体系中添加1μL扩增引物(P5：AATGATACG GCGACCACCGA(SEQ ID NO:3)，P7：CAAGCAGAAGACGGCATA CGA(SEQ ID NO:4))、25μL扩增试剂，总体系50μL，根据表7程序进行扩增反应。
5、扩增后纯化
(1)取出纯化磁珠，混匀后置于室温平衡30min；
(2)扩增反应结束后，向扩增产物中加入55μL纯化磁珠，吹打混匀，室温静止5min；
(3)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
(4)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s；
(5)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，再次向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移弃上清；
(6)保持PCR管在磁力架上，室温静置3-5min，晾干磁珠使残留的乙醇彻底挥发；
(7)加入25μL Nuclease Free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀，室温静置2min；
(8)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清；
(9)吸取上清液，转移至新的PCR管中，获得捕获文库；
(10)取1μL文库进行定量，记录文库浓度；
(11)取1μL文库进行片段质检，文库长度约在220-320bp之间。
6、测序及分析
对上述文库进行测序，获得测序数据进行分析。
结果如表9所示：在病毒侵染样本拷贝数含量低的情况下，现有捕获方法捕获率低，在病毒与人类基因组拷贝数比例为1:1000的情况下，病毒捕获率仅有0.02％左右，不能覆盖病毒全长，对于具有相似序列的病毒无法进一步判定人体病毒感染情况，使得临床治疗十分困难；而置换洗脱捕获方法(本发明的方法)极大提高了病毒目标区域捕获效率，最大提升倍数可达到224倍，使用本发明的方法可以获得更多的有效数据，提高测序深度，有利于进一步的感染诊断，提升诊断的准确率。
表9：现有捕获方法与本发明的方法对不同拷贝数比例的病毒、人类基因组混合文库中目标区域捕获效率的比较
以上对本发明所提供的捕获目标区域序列的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种捕获目标区域序列的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取样本的基因组DNA，构建全基因组文库；
2)在第一温度下，将步骤1)所述全基因组文库与目标区域序列的探针进行杂交；
3)将步骤2)的反应体系进行探针捕获；
4)在第二温度下，将步骤3)所述捕获的探针置于置换洗脱液中，所述置换洗脱液含有竞争性结合所述探针的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列与所述探针反向互补；
5)纯化获得所述目标区域序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述置换洗脱液含有Na+。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述置换洗脱液不含有扩增反应抑制剂。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二温度高于所述第一温度。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸序列包含肽核酸；优选地，所述寡核苷酸序列中10％的核苷酸是肽核酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述置换洗脱液中所述寡核苷酸序列的浓度高于所述探针的浓度。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述置换洗脱液中所述寡核苷酸序列的浓度高于所述目标区域序列的浓度。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤4)与步骤5)之间还包括步骤：获得步骤4)的反应体系的上清液，扩增所述目标区域序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在扩增反应前，去除所述上清液中的所述磁珠。
10.一种捕获目标区域序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于实现权利要求1-9中任一项所述的方法。
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