CN110522912B

CN110522912B - Mlec基因抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN110522912B
Application number: CN201910963425.5A
Authority: CN
Inventors: 岳淑芬
Original assignee: Inner mongolia university of science and technology baotou medical college
Current assignee: Inner mongolia university of science and technology baotou medical college
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2039-10-11
Also published as: CN110522912A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及MLEC基因抑制剂及其应用。本发明发现的与胃癌细胞增殖相关的功能基因，为MLEC基因，位于人类12号染色体的120686869bp至120701864bp之间，该基因可作为胃癌治疗的靶点，本发明还提供了MLEC基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途；本发明的MLEC基因抑制剂可抑制癌细胞的增殖速率，可制备用于治疗胃癌的药物。

Description

MLEC基因抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及MLEC基因抑制剂及其应用。

背景技术

人胃癌变是一个涉及多种基因及其产物相互作用的复杂过程。寻求人胃癌发生发展过程的关键基因，将有助于探讨其癌变的内在分子生物学机制，并将对胃癌的预防、诊断和治疗产生重要的意义。人胃癌变关键基因的寻求不仅依赖于对现有已知基因功能研究的不断深化，还依赖于对其相关未知新基因的探索。人类基因组草图表明，人体大约有3-4万个基因。

就现有胃癌相关基因的数量来说，对于科研和应用还是不够的，探索更多人胃癌变相关基因以及功能基因仍是我们目前亟需解决的问题，将为我们最终诊断和治疗胃癌提供基础。

发明内容

为解决上述背景技术中的不足，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的，提供一种MLEC基因抑制剂，所述抑制剂是以MLEC基因作为靶标制备或筛选得到的对MLEC基因具有抑制效果的分子或制剂。

进一步的，所述抑制剂是核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物。

更进一步的，上述核酸分子为shRNA，所述核酸分子作用的MLEC基因靶序列如SEQID NO：6、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7任一序列所示，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13任一序列所示。

进一步的，上述核酸构建体为含有编码所述核酸分子中shRNA的基因片段，能表达所述的shRNA。

进一步的，上述核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

本发明的第二个目的是提供上述MLEC基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的应用。

本发明使用生物信息学的方法筛出来胃癌新的差异基因，细胞株验证胃癌细胞株中高表达，将基因沉默后证实对胃癌细胞的增殖有较显著影响，是胃癌新的功能基因，并有望成为胃癌治疗新的靶标，该基因为MLEC基因，位于人类12号染色体的120686869bp至120701864bp之间，该基因可作为胃癌治疗的靶点，本发明的MLEC基因抑制剂可抑制癌细胞的增殖速率，可制备用于治疗胃癌的药物。

附图说明

图1为MLEC基因在癌细胞系和正常胃黏膜上皮细胞中的表达。

图2为载体图谱及信息。

图3为慢病毒感染72小时后细胞图片，图中感染图片命名规则：CON空细胞，NC阴性对照，“KD1”、“KD2”和“KD3”为实验分组名，“第1组”为三组重复感染中的第一组，“第2组”为三组重复感染中的第二组，“视野1”和“视野2”为Celigo扫描视野序号，W为明视野，G为绿色荧光视野。

图4为CCK-8检测MLEC基因慢病毒对胃癌细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明从TCGA胃腺癌数据（TCGA-STAD）RNA-seq的表达数据中选取癌症组数据与癌旁组数据作为研究对象，数据来源及分组见表1，利用Ballgown对两组数据进行比较，得到显著性p值，q值和基因间的差异倍数（Fold-change），进行差异基因筛选，筛选条件为P<0.05，q<0.05，且Fold change>2，最终成功筛选出与胃癌细胞增殖相关的功能基因MLEC，且该基因迄今为止尚未在胃癌领域得到进一步的研究和开发。

本发明的与胃癌细胞增殖相关的功能基因为MLEC基因，位于人类12号染色体的120686869bp至120701864bp之间。

实施例1

MLEC基因在癌细胞系和正常胃黏膜上皮细胞中的表达

针对MLEC基因进行引物设计，以GAPDH为内参，通过q-PCR检测MLEC在正常人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃腺癌细胞SGC-7901、BGC-823、AGS、及人胃癌细胞MGC-803 中的表达。

表1 基因信息

物种	名称	编号
			Human	MLEC	NM_014730

表2 目的细胞信息

细胞名	细胞中文名	来源物种
			SGC-7901	人胃腺癌细胞	人
BGC-823	人胃腺癌细胞	人
			AGS	人胃腺癌细胞	人
GES-1	人胃黏膜上皮细胞	人
			MGC-803	人胃癌细胞	人

内参基因和目的基因引物由吉凯基因设计和合成，引物设计如下：

表3 内参基因引物信息

内参基因	上游引物序列	下游引物序列	扩增片段大小 (bp)
				GAPDH	TGACTTCAACAGCGACACCCA，SEQ ID NO：1	CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA，SEQ ID NO：2	121

表4 目的基因引物序列

目的基因	上游引物序列	下游引物序列	扩增片段大小 (bp)
				MLEC	GAGGAGACCTTTGGCTACGA，SEQ ID NO：3	AATACCTTTTGCTGGGACTGT，SEQ ID NO：4	104

实验步骤

1.总RNA 抽提（使用上海普飞公司Trizol 试剂盒抽提，说明书链接：http：//www.pufei.com/product/info/31055）

(1)收取样品， Trizol裂解。

细胞样品：收集细胞(6孔板80%细胞密度)，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1 mL Trizol，充分混匀后室温静置5 min，然后转移至新的1.5 mL EP管中；

组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80°C冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约3 mmx3 mmx3 mm大小，置于装有1 mL Trizol裂解液的1.5mL EP管中。将超细匀浆机工作头浸入Trizol裂解液中5-10s 灭活RNA酶后，组织研磨；研磨后4°C，5000rpm 3min离心，弃沉淀，吸取上清移至新的1.5mLEP管中。

(2) 每管加入200 μL氯仿，用手上下颠倒EP管15s ，室温静置10 min。

(3)4°C、12800 rpm ，离心15 min。

(4)吸取上层液体移至新的1.5 mL EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4°C静置10 min。

(5)4°C、12800 rpm离心12 min后，弃上清。

(6)加入1mL、75%乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀。

(7)4°C、11800 rpm离心5 min，弃去大部分上清。

(8) 4°C、11800 rpm再次离心5 min，弃去上清，室温干燥。

(9)待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水(加入体积视RNA沉淀量而定)至完全溶解， Nanodrop 2000/2000C 分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。

2. 反转录获得cDNA（使用Promega M-MLV 试剂盒，protocol 链接http：//cn.promega.com/resources/protocols/product-information-sheets/g/mmlv-reverse-transcriptase-protocol/）

(1)每1 nmol引物加入RNase-free water 200 μL，涡旋振荡充分溶解，然后瞬时离心，配成终浓度为5 μM弓物储存液。

(2)RT引物取5 μM的RT引物储存液1 μL，加入79 μL的RNase-free water ，配制成62.5 nM的RT引物工作液( 如果需要配制多种RT引物混合工作液，取各种5 μM的RT引物工作液各1 μL，最后加RNase-free water 至80 μL即可)。

(3)PCR引物：按照5μM的浓度使用。

反转录：

(1) 将2 μL反转录引物(0.5 μg/μL)和2.0 ug Total RNA加入到PCR小管中，补RNase-Free H₂O至11 μL ；混匀后离心， 70°C温浴10 min ；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使反转录引|物和模板退火。

(2)在上述混合物中按下表的比例，在冰浴中进行反应体系( 25 μL体系)配制，混匀，短暂离心。

表5 反转录反应体系

试剂	每管加入量
		5x RT buffer	5μl
10 mM dNTPs	2 μl
		Rnasin ( 40 U/μL)	0.4 μl
M-MLV-RTase ( 200 U/μl)	1 μl
		RNase-Free H2O	5.6 μl

注： dNTPs是dATP ， dCTP， dGTP， dTTP的混合，浓度为10 mM。

(3)上述体系在 42°C水浴反应1 h ，然后在70°C水浴10 min使RT酶失活，将得到的反转录产物cDNA ，置于-20°C保存备用。

3. q-PCR检测

(1)按下列比例配置反应体系(12μL体系)：

①MicroRNA PCR引物来自广州市锐博生物科技有限公司。

表6 PCR反应体系

试剂	每管加入量
		SYBR premix ex taq	6.0 μL
上游引物( 5 μM )	0.5 μL
		下游引物(5μM)	0.5 μL
模板(反转录产物)	1.0 μL
		RNase-Free H2O	4.0 μL

②RNA PCR

表7 q-PCR反应体系

试剂	每管加入量
		SYBR premix ex taq	6.0 μL
引物mix(5 μM)	0.3 μL
		模板(反转录产物)	0.6 μL
RNase-Free H2O	5.1 μL

(2) 两步法进行Real-Time PCR ，并制作熔解曲线。

数据分析：相对定量分析F=2-ΔΔCt ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值； -ΔΔCt=NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值； 2-ΔΔCt反映各样品相对NC组样品目的基因的相对表达水平。

结果（如图1所示）表明，在癌细胞系中的表达高于正常胃黏膜上皮细胞中。

实施例2

MLEC基因抑制剂：慢病毒的构建

1.慢病毒制备

针对MLEC基因设计3个RNA干扰靶序列，3个RNA干扰靶序列如表8所示，

表8 MLEC基因的靶序列

NO.	Target序列信息	GC 含量(%)	Start Pos.	编号
					MLEC-RNAi (74956-11)	GAATATGATGAA GGGTCTAAT	33.33%	885	SEQ IDNO：5
MLEC-RNAi (74957-1)	GAGGACCAGATC CTGTATCAA	47.62%	453	SEQ IDNO：6
					MLEC-RNAi (74958-1)	CAGCAGGGAAAT GCCATCTTA	47.62%	1414	SEQ IDNO：7

2.干扰慢病毒载体

载体名称：GV493(该载体为吉凯基因公司提供)，载体如图2所示。

元件顺序：hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin。

对照编号：CON313。

对照插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT。

设计的shRNA干扰序列如表9所示，根据该序列合成shRNA寡核苷酸链，其中，MLEC-RNAi(74956-11)-a和MLEC-RNAi(74956-11)-b合成寡核苷酸链MLEC-RNAi(74956-11)；MLEC-RNAi(74957-1)-a和MLEC-RNAi(74957-1)-b合成寡核苷酸链MLEC-RNAi(74957-1)；MLEC-RNAi(74958-1)-a和MLEC-RNAi(74958-1)-b合成寡核苷酸链MLEC-RNAi(74958-1)。

表9 shRNA的核苷酸序列

序号

5’

正义链片段

茎环

反义链片段

3’

编号

MLEC-RNAi(74956-11)-a

Ccgg

GAATATGATGAAGGGTCTAAT

TTCAAGAGA

ATTAGACCCTTCATCATATTC

TTTTTg

SEQ ID NO：8

MLEC-RNAi(74956-11)-b

aattcaaaaa

GAATATGATGAAGGGTCTAAT

TCTCTTGAA

ATTAGACCCTTCATCATATTC

SEQ ID NO：9

MLEC-RNAi(74957-1)-a

Ccgg

GAGGACCAGATCCTGTATCAA

TTCAAGAGA

TTGATACAGGATCTGGTCCTC

TTTTTg

SEQ ID NO：10

MLEC-RNAi(74957-1)-b

aattcaaaaa

GAGGACCAGATCCTGTATCAA

TCTCTTGAA

TTGATACAGGATCTGGTCCTC

SEQ ID NO：11

MLEC-RNAi(74958-1)-a

Ccgg

CAGCAGGGAAATGCCATCTTA

TTCAAGAGA

TAAGATGGCATTTCCCTGCTG

TTTTTg

SEQ ID NO：12

MLEC-RNAi(74958-1)-b

aattcaaaaa

cagcagggaaatgccatctta

tctcttgaa

taagatggcatttccctgctg

SEQ ID NO：13

分别将寡核苷酸链MLEC-RNAi(74956-11)、MLEC-RNAi(74957-1)和MLEC-RNAi(74958-1)构建至GV493载体中，转染293T细胞，在转染48-72h获得未纯化的细胞上清，并对上清进行纯化浓缩获得高滴度的慢病毒，获得的慢病毒分别为LV-MLEC-RNAi(74956-11)、LV-MLEC-RNAi(74957-1)和LV-MLEC-RNAi(74958-1)，慢病毒滴度如表10所示。同时将对照插入序列构建至GV493载体中，按照上述方法转染293T细胞后获得对照组慢病毒。

表10慢病毒滴度

ID	Titer
		LV-MLEC-RNAi(74956-11)	2.5E+9
LV-MLEC-RNAi(74957-1)	9E+8
		LV-MLEC-RNAi(74958-1)	3E+9

实施例3

慢病毒对癌细胞的影响

本实施例的目的细胞信息如表11所示，细胞感染病毒信息如表12所示。

表11目的细胞信息

细胞名	来源物种	培养基
			MGC803	人	1640+10%FBS

表12细胞感染病毒信息如表

病毒序号	病毒名称
		PSC53349-1	阴性对照病毒CON313
LVpFU-GW-016PSC74956-11	LV-MLEC-RNAi(74956-11)
		LVpFU-GW-016PSC74957-1	LV-MLEC-RNAi(74957-1)
LVpFU-GW-016PSC74958-1	LV-MLEC-RNAi(74958-1)

1.准备目的细胞

(1)从液氮罐中取出细胞冻存管迅速放入37℃水浴中并不时摇动使其尽快解冻。

(2)完全解冻后， 1300 rpm ，离心3 min ， 75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。

(3)吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37°C、5% CO2培养箱。

(4) 24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

2.目的细胞慢病毒感染

a.按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成3-5×10⁴个/ml悬液，并根据表2接种相应的细胞数到培养板中，使铺板量达到15-30%左右。

表13细胞感染参数

孔板	感染时细胞密度/孔	感染条件	感染MOI
				12孔板	20%	Eni.S+polybrene	20

b.铺板后无需培养，参照预实验确定的MOI加入最适病毒量感染。

表14病毒用量

病毒序号	实验分组标记	病毒滴度 (TU/ml)	病毒用量(μl)
				PSC53349-1	NC	1E+09	2.00
LVpFU-GW-016PSC74956-11	KD1	2.5E+09	0.80
				LVpFU-GW-016PSC74957-1	KD2	9.0E+08	2.22
LVpFU-GW-016PSC74958-1	KD3	3.0E+09	0.67

C.参照预实验结果，感染后16 小时将各孔中细胞收集到干净的1.5mlEP管中，以2000rpm离心2min，去掉上清液，更换为完全培养基，轻轻混匀后放回培养板中继续培养，感染后72小时，荧光拍照，见附图3，图片信息与表14的病毒用量相对应。

实施例4

CCK-8检测

1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。

2) 每孔100 μl，每组3-5孔重复，根据实验设计决定铺板数量(如检测5天，则铺5张96板)

3)统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如：发现Con组细胞较多，降低细胞量再次铺板)，放入细胞培养箱中培养。

4)从铺板后第二天开始，培养终止前2~4 h加入10 μL CCK-8试剂于孔中，无需换液。

5)4h后96孔板置于振荡器上振荡2-5min，酶标仪450nm检测OD值。

6) 数据分析。

结果如图4所示，图中KD为KD1、KD2和KD3的平均值，反映了慢病毒感染MGC80-3细胞，培养5天后，实验组（KD组）和对照组（NC组）的细胞在波长450nm的光的吸收率随时间变化的对比，结果显示，相比NC组，KD组的细胞增殖减缓，说明MLEC基因干扰病毒具有抑制胃腺癌细胞增殖的作用，抑制MLEC基因能抑制胃腺癌细胞的增殖。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 内蒙古科技大学包头医学院

<120> MLEC基因抑制剂及其应用

<141> 2019-09-05

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgacttcaac agcgacaccc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caccctgttg ctgtagccaa a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggagacct ttggctacga 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatacctttt gctgggactg t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaatatgatg aagggtctaa t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaggaccaga tcctgtatca a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagcagggaa atgccatctt a 21

<210> 8

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgggaatat gatgaagggt ctaatttcaa gagaattaga cccttcatca tattcttttt 60

g 61

<210> 9

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aattcaaaaa gaatatgatg aagggtctaa ttctcttgaa attagaccct tcatcatatt 60

c 61

<210> 10

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgggaggac cagatcctgt atcaattcaa gagattgata caggatctgg tcctcttttt 60

g 61

<210> 11

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aattcaaaaa gaggaccaga tcctgtatca atctcttgaa ttgatacagg atctggtcct 60

c 61

<210> 12

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccggcagcag ggaaatgcca tcttattcaa gagataagat ggcatttccc tgctgttttt 60

g 61

<210> 13

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aattcaaaaa cagcagggaa atgccatctt atctcttgaa taagatggca tttccctgct 60

g 61

Claims

1.MLEC基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的应用，其特征在于，所述治疗是指抑制胃癌细胞增殖，所述抑制剂为核酸分子、核酸构建体、慢病毒，所述核酸分子为shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13任一序列所示；所述核酸构建体为含有编码所述核酸分子中shRNA的质粒，该质粒能表达所述的shRNA；所述慢病毒由所述核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。