CN101410132A - 用于治疗骨疾病的gdf-9/bmp-15调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防骨退行性疾病的方法。治疗或预防的疾病包括，例如，骨质减少、骨软化、骨质疏松、骨髓瘤、骨营养不良、佩吉特病、成骨不全，和与慢性肾病、甲状旁腺机能亢进，和长期使用皮质类固醇相关的骨退行性疾病。本发明公开的方法包括向哺乳动物施用GDF－9的抑制剂或BMP－15的抑制剂，所述抑制剂的量可有效的：(1)治疗或预防骨退行性疾病；(2)减慢骨破坏；(3)重建缺失的骨；(4)刺激新骨形成；和/或(5)维持骨量和/或骨质量。本发明还提供施用GDF－9激动剂或BMP－15激动剂治疗特征为骨密度或骨量增加为特征的骨疾病。

Description

用于治疗骨疾病的GDF-9/BMP-15调节剂
本申请要求于2006年3月28日提交的美国临时申请号60/787,246的优先权，其全部内容并入本文作为参考。
技术领域
本发明的技术领域涉及GDF-9和BMP-15调节剂在骨疾病治疗中的应用，例如骨质疏松、骨质减少、骨软化、骨营养不良和骨折。
背景技术
转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员具有生理重要的生长调节和形态发生特性(Kingsley等人，Genes Dev.8：133-146(1994)；Hoodless等人，Curr.Topics Microbiol.Immunol.228：235-272(1998))。近年，大量的注意力集中在两个TGF-β超家族成员在卵巢功能和生育力中的作用：生长和分化因子-9(GDF-9)和骨形态发生蛋白-15(BMP-15，也被称为GDF-9b；McNatty等人，Reprod.128：379-386(2004)；Juengel等人，HumReprod.Upd.11：144-161(2005))。
GDF-9在1993年首次被描述为在卵巢中特异性表达的TGF-β超家族成员(McPherron等人，J.Biol.Chem.268：3444-3449(1993))。和TGF-β家族的其他成员类似，GDF-9编码为由信号肽、原区域(proregion)和C-端成熟区域组成的前肽原，所述C-端成熟区域通过属于弗林样(furin-like)蛋白酶组中的一种胞内蛋白酶从前体肽切割而来。GDF-9mRNA存在于卵泡发育的所有阶段的卵母细胞中，并且从初级卵泡阶段到排卵后均表达(McPherron和Lee，J.Biol.Chem.268：3444-3449(1993)；McGrath等人，Mol.Endocrinol.9：131-136(1995)；Elvin等人，Mol.Endocrinol.13：1035-1048(1999))。缺乏GDF-9的雌性小鼠由于发育的卵母细胞停滞在初级卵泡阶段而不育(Dong等人，Nature 383：531-535(1996)；Carabatsos et al.，Dev.Biol.204：373-384(1998))。
BMP-15，还称为GDF-9b，已发现是编码GDF-9同源物的X连锁基因，并在成熟区域与GDF-9具有52％氨基酸同一性(Dube等人，Mol.Endocrinol.12：1809-1817(1998)；Laitinen等人，Mech.Dev.78：135-140(1998))。虽然BMP-15的表达与GDF-9相同，但是，它却不能补偿在GDF-9敲除小鼠中的GDF-9缺失。缺乏BMP-15的雌性小鼠是低生育力的，表现为降低的每窝产仔数和每月窝数(Yan等人，Mol.Endocrinol.15：854-866(2001))。在绵羊中，GDF-9和BMP-15对生育力都是关键的(Juengel等人，Bio.Reprod.67：1777-1789(2002))。在绵羊中天然发生的BMP-15突变导致纯合雌性的不育。BMP-15在女性人类生育力中也扮演着关键性的角色，因为BMP-15突变与妇女卵巢发育不全相关(Di Pasquale等人，Am.J.Hum.Genet.75：106-111(2004))。
GDF-9和BMP-15在目前描述过的TGF-β家族成员中是独特的，它们在成熟区域中缺乏七个特征性保守半胱氨酸残基的第四个(Dube等人，Mol.Endocrinol.12：1809-1817(1998)；Laitinen等人，Mech.Dev.78：135-140(1998))。第四个半胱氨酸是特别重要的，因为它负责大多数TGF-β家族成员成熟二聚体的亚基之间二硫键的形成。虽然GDF-9和BMP-15缺乏该半胱氨酸，并且不形成共价连接的二聚体，研究发现GDF-9和BMP-15均在体外可以形成同型二聚体和异型二聚体(Liao等人，J.Biol.Chem.278：3713-3719(2003)；Liao等人，J.Biol.Chem.279：17391-17396(2004))。
GDF-9和BMP-15的表达都主要局限在哺乳动物生长的卵泡的卵母细胞内。与该表达模式一致，在携带了这些基因突变的动物包括绵羊和小鼠中，以及在用GDF-9和BMP-15肽免疫的绵羊中，在卵巢以外没有观察到任何效果(Galloway等人，Nat.Genet.25：279-283(2000)；Hanrahan等人，Biol.Reprod.121：843-852(2004)；Dong等人，Nature 383：531-535(1996)；Yan等人，Mol.Endocrinal.15：854-866(2001)；Juengel等人，Biol.Reprod.70：557-561(2004)；和Elvin等人，Mol.Endocrinol.13：1018-1034(1999))。因此，这些因子被认为是具有低非卵巢副作用风险的控制生育力的吸引人的靶，包括用于开发雌性不育的新型临床治疗，用于开发女性的新型非类固醇避孕剂，和用于在农业生产中调节生育力(见例如，美国专利号6,030,617)。
虽然主要分布在卵巢，在非卵巢组织中也观察到了GDF-9和BMP-15的表达，包括垂体和睾丸(Fitzpatrick等人，Endocrinol.139：2571-2578(1998)；Aaltonen等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.84：2744-2750(1999)；Eckery等人，Mol.Cell.Endocrinol.192：115-126(2002)；Otsuka和Shimasaki，Endocrinol.143：4938-4941(2002))。然而，由于这些蛋白质的表达主要局限于卵巢，GDF-9和BMP-15的非繁殖性功能和应用没有得到太多关注。
多种病症与骨的缺失相关，特别是在老年人和/或闭经后的妇女中。例如，骨质疏松是以骨骼骨量和矿物质密度降低，骨的结构破坏，并且相应的骨易碎性和骨折倾向增加为特征的使人虚弱的疾病。临床骨质减少发生在人的骨质疏松之前，是在美国约2500万人口中出现的病症。
在整个成年生活中，通过骨形成和再吸收的成对过程，骨持续的经历着更新。骨的再吸收是由骨再吸收细胞，破骨细胞介导的，破骨细胞是由单核吞噬细胞形成的。取代失去的骨的新骨是由骨形成细胞，成骨细胞沉积的，成骨细胞是由间充质基质细胞形成的。参与改建过程的多种其他细胞类型被全身性因子(例如，激素、淋巴因子、生长因子和维生素)和局部因子(例如，细胞因子、黏附分子、淋巴因子和生长因子)严密的控制。骨改建过程的正确时空协调对于骨量和完整性的维持是关键的。多种骨退行性疾病与骨改建循环的失衡有关，导致骨量的异常缺失(骨质减少)，包括代谢性骨疾病，例如骨质疏松、骨增殖(骨软化)、骨营养不良和佩吉特氏病(Paget′s disease)。
目前可用于骨质疏松治疗的有两种主要的药物疗法类型。第一种和最常用的方法是使用激素疗法降低骨组织的再吸收。已知雌激素替代疗法(“ERT”)预防进一步的恶化，从而降低骨折的可能性。然而，雌激素作为治疗的使用是局限的，认为长期的雌激素疗法与子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、频繁阴道出血和血栓形成有关。由于这些严重的副作用，许多女性选择避免该治疗。此外，几乎很少的男性同意使用该类疗法。骨质疏松的第二种主要的治疗方法是使用二膦酸盐，特别是阿伦膦酸盐、利塞膦酸盐和伊本膦酸盐。虽然实验显示这些化合物持续的增加骨质疏松患者的骨矿物质密度，但是使用二膦酸盐治疗骨质疏松仍然有严重的问题，包括对食管和上消化道的刺激(irritation)。
因此，需要开发新的治疗方法用于治疗和预防骨疾病。
发明概述
GDF-9影响骨密度，包括骨皮质和骨小梁的矿物质密度。因此，发明提供了通过施用GDF-9的调节剂调节GDF-9来治疗或预防骨疾病的方法。发明还提供通过施用BMP-15的调节剂来治疗或预防骨疾病的方法。发明还提供使用包含治疗有效量的GDF-9或BMP-15调节剂的组合物来制备在哺乳动物中治疗或预防骨疾病的药物。
在一个实施方案中，施用GDF-9的抑制剂治疗或预防骨退行性疾病。在另一实施方案中，施用BMP-15的抑制剂来治疗或预防骨退行性疾病。在一些实施方案中，GDF-9或BMP-15的调节剂被用于制备治疗或预防骨退行性疾病的药物。治疗或预防的疾病包括，例如骨质减少、骨软化、骨质疏松、骨髓癌(osteomyeloma)、骨营养不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障碍(aplastic bone disorder)、骨髓癌高钙血症(humoralhypercalcemic myeloma)、多发性骨髓癌和转移后的骨薄化。治疗或预防的疾病还包括与高血钙、慢性肾病(包括晚期肾病)、肾透析、原发性或继发性甲状旁腺机能亢进、炎症性肠病、克罗恩氏病(Crohn′s disease)，和长期使用皮质类固醇或GnRH激动剂或拮抗剂相关的骨退行性疾病。
本发明的方法包括向哺乳动物施用有效量的GDF-9或BMP-15抑制剂，所述抑制剂的量可有效的：
(1)治疗或预防骨退行性疾病；
(2)减慢骨破坏(bone deterioration)；
(3)重建缺失的骨；
(4)刺激新骨形成；和/或
(5)维持骨(骨量和/或骨质量)。
本发明还提供包含GDF-9或BMP-15抑制剂的组合物用于制备药物的用途，其可有效的：
(1)治疗或预防骨退行性疾病；
(2)减慢骨破坏；
(3)重建缺失的骨；
(4)刺激新骨形成；和/或
(5)维持骨(骨量和/或骨质量)。
在一些实施方案中，调节剂是GDF-9或BMP-15的抑制剂，包括例如抗GDF-9抗体、抗BMP-15抗体、抗GDF-9受体的抗体、抗BMP-15受体的抗体、可溶性GDF-9受体、可溶性BMP-15受体、显性失活的GDF-9肽或显性失活的BMP-15肽。在一些实施方案中，包括例如siRNA的抑制剂降低GDF-9或BMP-15的表达。
本发明还提供用于评估GDF-9或BMP-15抑制剂治疗骨退行性疾病的功效的检测。还提供本发明的方法中使用的给药方法、组合物和装置。
本发明还提供通过施用GDF-9或BMP-15的激动剂来降低骨密度的方法，以及GDF-9或BMP-15的激动剂制备用于降低骨密度的药物的用途。可以治疗的疾病包括，例如硬化性骨发育不良、骨骼骨发育不良、例如骨硬化病(osteopetrosis，osteosclerosis)和骨内膜肥厚；卡-恩二氏病(与增加的TGF-β信号发放相关)；范布切姆氏病和硬化性骨化病(sclerosteosis，导致增加的BMP信号发放)；常染色体显性遗传骨硬化病、I型常染色体显性遗传骨硬化病和Worth病。因此，本发明的方法和用途包括向哺乳动物施用有效量的GDF-9或BMP-15激动剂，来治疗或预防骨发育不良病。
本发明的其它目的和优势将在后续描述中部分陈述，并且一部分从描述中是显而易见的，或可以通过实施本发明进行了解。本发明的目的和优势将通过后附权利要求书中特别指出的组成部分和组合而实现并达到。
需要理解的是，如所要求的那样，前面的概括描述和此后的详细描述仅为示例性的和解释性的且对于本发明不是限制性的。
序列的简要描述
SEQ ID NO：1是人GDF-9基因的核苷酸序列(另见GeneBank登录号NM_005260)。
SEQ ID NO：2是人GDF-9的氨基酸序列(另见GeneBank登录号NP_005251.1)。
SEQ ID NO：3是人BMP-15基因的核苷酸序列(另见GeneBank登录号NM_005448)。
SEQ ID NO：4是人BMP-15的氨基酸序列(另见GeneBank登录号NP_005439)。
SEQ ID NO：5是GDF-9肽的氨基酸序列
详细描述
本发明提供了向哺乳动物施用GDF-9或BMP-15的调节剂来治疗或预防骨疾病的方法。
本发明的方法可用于在任何需要此类治疗的哺乳动物中治疗或预防骨疾病，所述哺乳动物特别包括人、灵长类、猴子、啮齿类、绵羊、大鼠、狗、荷兰猪、马、牛和猫。
在一些实施方案中，施用GDF-9抑制剂或BMP-15抑制剂来治疗或预防骨退行性疾病。通过施用GDF-9抑制剂或BMP-15抑制剂来治疗或预防的骨退行性疾病包括，例如骨质减少、骨软化、骨质疏松(例如闭经后的、类固醇诱导的、高龄或使用甲状腺素诱导的)、骨髓癌、骨营养不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨髓癌高钙血症、多发性骨髓癌和转移后的骨薄化。治疗或预防的疾病还包括与高血钙、慢性肾病、原发性或继发性甲状旁腺机能亢进、炎症性肠病、克罗恩氏病，和长期使用皮质类固醇、GnRH激动剂或拮抗剂，以及营养缺陷相关的骨退行性疾病。
在其他实施方案中，施用GDF-9激动剂或BMP-15激动剂来治疗或预防骨疾病，包括例如以过度骨生长或骨骼过度生长为特征的疾病，例如硬化性骨发育不良。该病被命名为“硬化性骨化病”是进行性疾病，其特征是普遍的骨骼过度生长、巨人症、脑神经受压、由于颅骨的颅盖拓宽导致的颅内压升高、以及增加的骨小梁和骨皮质的厚度和密度。疾病以过度的骨生长或骨骼过度生长为特征，包括但不限于，硬化性骨营养不良、骨骼骨depplasias，例如骨硬化、骨硬化病、骨内膜肥厚；卡-恩二氏病、范布切姆氏病和硬化性骨化病、常染色体显性遗传骨硬化病、I型常染色体显性遗传骨硬化病和Worth病。参见Wesenbeck等人，Am.J.Human Genet.72：763-771(2003)，以其引用的文献。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防闭经后妇女中的骨退行性疾病的方法。本发明的一个实施方案提供了治疗或预防具有类固醇-诱导的骨质疏松的个体中的骨退行性疾病的方法。本发明还提供了治疗或预防个体中的老年骨质疏松的方法。本发明的另一个实施方案提供了在个体中治疗或预防使用甲状腺素或使用糖皮质素诱导的骨质疏松的方法。
本发明提供了在哺乳动物中降低生育力同时减慢骨破坏、维持骨、重建缺失的骨、或刺激新骨形成的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了在女性中降低生育力并同时治疗或预防骨退行性疾病的方法。
本方法还提供在男性中治疗或预防骨退行性疾病的方法。
公开的方法包括向哺乳动物施用GDF-9的抑制剂或BMP-15的抑制剂，所述抑制剂的量可有效的：
(1)治疗或预防骨退行性疾病；
(2)减慢骨破坏；
(3)重建缺失的骨；
(4)刺激新骨形成；和/或
(5)维持骨(骨量和/或骨质量)。
本发明的方法可用于治疗骨小梁和骨皮质中的微观缺陷。骨质量可以通过，例如评估骨微观结构的完整性来确定。
一般的，GDF-9或BMP-15的调节剂可以在至少2、4、6、8、10、12、20或40周的时期内，或者在至少1、1.5或2年的时期内，或者在对象终生的时期内重复的施用。在一些实施方案中，可以施用单次推注剂量，例如通过施用如下文详细描述的可注射的或可移植的组合物。
一般的，用于本发明方法中的GDF-9或BMP-15的调节剂包括GDF-9的抑制剂或BMP-15的抑制剂，可以在10-8和10-7、10-7和10-6、10-6和10-5、10-5和10-4g/kg间的剂量施用。使用本领域已知的换算因子，在一个动物模型中实现的治疗上有效的剂量可以转化到另一种动物中使用，包括人(见例如，Freireich等人，(1966)Cancer Chemother.Reports，50(4)：219-244)。
本发明的方法中使用的调节剂的准确剂量是基于希望获得的效果凭经验确定的。示范性的效果包括：(a)治疗或预防骨退行性疾病；(b)减慢骨破坏；(c)重建缺失的骨；(d)形成新骨生长；和/或(e)维持骨量和/或骨质量。例如，施用调节剂的量可以有效的减慢骨破坏(例如，骨量和/或骨矿物质密度的减少)至少10、20、30、40、50、100、200、300、400或500％的量。
在本发明的一个实施方案中，调节剂能够在不穿越卵巢血卵泡屏障的条件下对骨密度实现希望获得的治疗效果，所述屏障既是电荷选择性也是尺寸选择性的(Hess等人，Biol.Reprod.58：705-711(1998))。调节剂的此类差分效应可以是它的尺寸、它的电荷和/或它在不同组织中的相对有效浓度的函数，例如在全身性给药之后。
涉及骨破坏的结果还可以通过GDF-9和BMP-15的调节剂对于骨小梁缺失(小梁板穿孔)；(干骺端的)骨皮质缺失；骨松质缺失；骨矿物质密度下降、降低的骨矿物质质量、降低的骨改建、升高的血清碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的水平；骨易碎(骨折率增加)，降低的骨折愈合的特定效果来评估。评估骨量和骨质量的方法是本领域已知的，包括但不限于X-射线衍射；DXA；DEQCT；pQCT、化学分析、密度分级分离法、组织光度测定法、组织形态测定术和组织化学分析，描述在例如Lane等人，J.Bone Min.Res.18：2105-2115(2003)中。确定骨皮质密度的一种检测是MicroCT检测。在pQCT测量后，可以实施microCT评估，例如，对股骨使用ScancomCT40(Scanco Medical AG)。
本发明还提供通过钙荧光素标记测量骨形成的方法。例如，在收集组织9天和2天前用钙荧光素(例如，15mg/kg，0.1ml/小鼠，皮下)注射小鼠。可以从股骨和胫骨，以及脊椎骨收集骨组织。测量钙荧光素标记的矿物质化骨层之间的距离，骨样品的组织学特征被用于评估骨形成。
本发明的其他应用包括GDF-9和/或BMP-15调节剂在包被或整合到骨移植物、基质和贮存系统中，从而促进骨整合的应用。此类移植物的实例包括牙移植和关节替代移植。
本发明还包括评估GDF-9或BMP-15调节剂用于骨退行性疾病治疗的功效的检测。
此类检测包含：
(1)在至少2、4、6或8周的时间向哺乳动物(例如，OVX大鼠)重复的施用调节剂；和
(2)确定调节剂对骨的效果，其中调节剂使骨破坏(例如，骨量和/或骨质量)减慢提示调节剂对骨退行性疾病的治疗是有效的；调节剂降低的骨密度提示调节剂对硬化性骨发育不良或不适当升高骨量的疾病治疗是有效的。
可以理解，可以在一个或多个骨疾病的动物模型和/或人类中评估GDF-9或BMP-15调节剂，所述骨疾病包括骨退行性疾病。例如不运动(immobilization)、低钙饮食、高磷饮食、长期使用皮质类固醇或GnRH激动剂或拮抗剂、卵巢功能停止，或衰老都可以诱导骨质减少。例如，卵巢切除术(OVX)-诱导的骨质减少是成熟的人闭经后骨质疏松的动物模型。另一个普遍验证的模型涉及皮质类固醇给药。此类模型包括：短尾猴、狗、小鼠、兔子、雪貂、荷兰猪、迷你猪和绵羊。对于骨质疏松的不同动物模型的综述，参见例如，Turner，Eur.Cells and Materials 1：66-81(2001)。
其他的体外测试包括在培养物中评估对成骨细胞的效果，例如对胶原和骨钙蛋白合成的效果，或者对碱性磷酸酶和cAMP诱导的效果。适当的体内和体外测试描述在，例如，美国专利号6,333,312。
GDF-9和BMP-15调节剂
GDF-9是以约454个氨基酸(aa)(SEQ ID NO：2)的前肽原合成的，包含27个氨基酸的信号序列和292个氨基酸的前肽。预测GDF-9的成熟C-端片段长度为135个氨基酸，通过核酸序列分析确定具有非糖基化分子量为约15.6kD。GDF-9信号发放是通过I型受体ALK5(Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18：653-665(2004))和II型受体BMPRII(Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002))介导的。SEQ ID NO：2(GeneBank登录号NPJ305251.1)中包含了成熟的人GDF-9的氨基酸序列。人GDF-9野生型基因的序列公开在例如，GeneBank登录号NM_005260、美国专利号5,821,056；6,191,261和6,365,402，以及美国专利公开号2002/0127612和2004/0152143中。小鼠GDF-9基因的核苷酸序列见于GeneBank登录号NM_008110；核苷酸29-1354编码小鼠GDF-9蛋白质(GeneBank登录号NP_032136.1)。大鼠GDF-9基因的核苷酸序列见于GeneBank登录号NM_021672；核苷酸1-1323编码大鼠GDF-9蛋白质(GeneBank登录号NP_067704.1)。
BMP-15是以约392个氨基酸(SEQ ID NO：4；GeneBank登录号NP_005439.1)的前肽原合成的，包含18个氨基酸的信号序列和249个氨基酸的前肽；核苷酸1-1179编码SEQ ID NO：4。预测BMP-15的成熟C-端片段长度为125个氨基酸，由前肽原的第268-392位氨基酸残基组成。BMP-15信号发放是通过I型受体ALK6和II型受体BMPRII(Moore等人，J.Biol.Chem.278：304-310(2003))介导的。SEQ ID NO：4中包含了成熟的人BMP-15的氨基酸序列。人BMP-15(GDF-9b)野生型基因的序列公开在例如，GeneBank登录号NM_005448、美国专利号5,728,679和5,635,372，以及美国专利公开号2004/0092007中。小鼠的BMP-15基因的核苷酸序列见于GeneBank登录号NM_009757；核苷酸358-1536编码小鼠BMP-15蛋白质(GeneBank登录号NP_033887)。大鼠BMP-15基因的核苷酸序列见于GeneBank登录号NM_021670；核苷酸247-1422编码大鼠BMP-15蛋白质(GeneBank登录号NP_067702.1)。
本文中使用的术语“GDF-9”和“BMP-15”分别指GDF-9或BMP-15的任何一种或多种同种型。该术语指GDF-9或BMP-15的全长未加工的前体形式，以及由翻译后切割获得的成熟的和前肽形式。术语“前肽”指从GDF-9或BMP-15前体蛋白质的氨基端结构域切割而来的多肽。术语“成熟的蛋白质”指从GDF-9或BMP-15前体蛋白质的羧基端结构域切割而来的蛋白质。成熟的GDF-9可以作为单体、同型二聚体或异型二聚体出现，例如和BMP-15一起。成熟的BMP-15可以作为单体、同型二聚体或异型二聚体出现。根据条件，成熟的蛋白质可以在任何或所有这些不同形式之间建立平衡。在其生物学活性形式中，成熟的GDF-9还指“活性GDF-9”，成熟的BMP-15还指“活性BMP-15”。该术语还指GDF-9或BMP-15的任何片段或变体，其可以维持至少一部分如本文中讨论的、与成熟的GDF-9或BMP-15相关的生物学活性，该术语包括经过修饰的序列。本发明可以使用从所有脊椎动物物种中获得的GDF-9和BMP-15的调节剂，所述脊椎动物包括但不限于人、牛、鸡、小鼠、大鼠、猪、绵羊、火鸡、狒狒和鱼。
术语“GDF-9受体”和“BMP-15受体”，除非另外提示，指分别与至少一种GDF-9或BMP-15同种型结合的任何受体。GDF-9和BMP-15，及其受体的结构和功能方面，是本领域普遍已知的(见例如，Chang等人，Endocrine Rev.23：787-823(2002)；Moore等人，Molec.Cell.Endocrinol.234：67-73(2005)；Juengel等人，Hum.Reprod.Update 11：144-161(2004))。
A.GDF-9和BMP-15抑制剂
术语“GDF-9抑制剂”及其同源词例如“拮抗剂”、“中和”和“减量调节”指作为GDF-9生物学活性抑制剂的化合物(或它的适当的性质)。GDF-9抑制剂可以，例如结合和中和GDF-9的活性；降低GDF-9的表达水平；影响稳定性或前体分子向活化的、成熟形式的转化；干扰GDF-9与一种或多种受体的结合；或者可以干扰GDF-9受体的胞内信号。术语“直接的GDF-9抑制剂”一般指任何直接减量调节GDF-9的生物学活性的化合物。如果分子通过与GDF-9基因、GDF-9转录产物、GDF-9配体或GDF-9受体相互作用来减量调节活性，则它“直接减量调节”GDF-9的生物学活性。术语“中和”、“中和的”、“抑制的”及其同源词指相对于没有相同抑制剂条件下的GDF-9活性，GDF-9抑制剂对GDF-9活性的降低。活性的降低优选的是至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。鉴别改变GDF-9活性的物质的方法描述在美国专利号6,680,174中，例如改变雌性的生育力。
可以阻断GDF-9活性的GDF-9抑制剂可用于本发明的方法中。此类抑制剂可以与GDF-9自身相互作用。可选的，抑制剂可以与GDF-9受体(例如ALK5或BMPRII)或其他的结合配偶体相互作用，例如，抑制剂可以降低或阻断GDF-9与其受体的结合和/或结合GDF-9后的受体的活性。当然，抑制剂可以同时与GDF-9和第二个因子，例如其受体相互作用。在这一方面，GDF-9抑制剂包括抗体(抗GDF-9和/或GDF-9受体)、修饰的可溶性受体、其他蛋白质(包括结合GDF-9和/或GDF-9受体的那些)、GDF-9的修饰的形式或其片段、前肽、肽，以及所有这些抑制剂的模拟物。非蛋白质抑制剂包括，例如，小分子和核酸。
术语“GDF-9活性”指与活化GDF-9蛋白质相关的一种或多种生理学上的生长调节或形态发生活性。在体内和体外测量GDF-9活性的检测是本领域已知的。一些更常用的生物检测的实例包括下列：
(1)在卵泡细胞中孕酮、前列腺素E2的合成(美国专利号6,680,174；Elvin等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA 97：10288-10293(2000))；
(2)GDF-9诱导的基因表达的诱导作用，包括乙酰透明质酸合成酶、环加氧酶2(COX2)、类固醇生成急性调节蛋白(StAR)、黄体生成素(LH)受体、激活蛋白/抑制素β、促滤泡素抑制素和gremlin(美国专利号6,680,174；Elvin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10288-10293(2000))；
(3)大鼠卵巢卵泡细胞增殖的诱导(Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002)；Liao等人，J.Biol.Chem.279：17391-17396(2004))；
(4)小鼠卵丘细胞的黏液化和增大(Buccione等人，Dev.Biol.138：16-25(1990)；Salustri等人，Dev.Biol.138：26-32(1990)；Elvin等人，Mol.Endocrinol.13：1035-1048(1999))；
(5)在P19癌细胞中融合至荧光素酶报道基因的CAGA启动子的诱导(Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18：653-665(2004))；
(6)对间充质干细胞向全能成骨细胞分化的影响(Jaiswal等人，J.Cell.Biochem.64：295-312(1997))；
(7)受体结合检测(Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002))；
(8)Smads蛋白质的磷酸化作用(Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18：653-665(2004))；和
(9)受体磷酸化作用(Boyle等人，Methods Enzymol.201 B：110-149(1991)；Luo等人，Methods Enzymol.201：149-152(1991)；Wrana等人，Mol.Cell.Biol.14：944-950(1994)；Weiser，等人，EMBO J.14：2199-2208(1995))。
术语“BMP-15抑制剂”及其同源词例如“拮抗剂”、“中和”和“减量调节”指作为BMP-15生物学活性抑制剂的化合物(或它的适当的性质)。BMP-15抑制剂可以，例如结合和中和BMP-15的活性；降低BMP-15的表达水平；影响稳定性或前体分子向活化的、成熟形式的转化；干扰BMP-15与一种或多种受体的结合；或者可以干扰BMP-15受体的胞内信号发放。术语“直接的BMP-15抑制剂”一般指任何直接减量调节BMP-15生物学活性的化合物。如果分子通过与BMP-15基因、BMP-15转录产物、BMP-15配体或BMP-15受体相互作用来减量调节活性，则它“直接减量调节”BMP-15的生物学活性。术语“中和”、“中和的”、“抑制的”及其同源词指相对于没有相同抑制剂条件下的BMP-15活性，BMP-15抑制剂对BMP-15活性的降低。活性的降低优选的是至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
可以阻断BMP-15活性的BMP-15抑制剂可用于本发明的方法中。此类抑制剂可以与BMP-15自身相互作用。可选的，抑制剂可以与BMP-15受体(例如ALK6或BMPRII)或其他的结合配偶体相互作用，例如，抑制剂可以降低或阻断BMP-15与其受体的结合和/或结合BMP-15后的受体的活性。当然，抑制剂可以同时与BMP-15和第二个因子，例如其受体相互作用。在这一方面，BMP-15抑制剂包括抗体(抗BMP-15和/或BMP-15受体)、修饰的可溶性受体、其他蛋白质(包括结合BMP-15和/或BMP-15受体的那些)、BMP-15的修饰的形式或其片段、前肽、肽，以及所有这些抑制剂的模拟物。非蛋白质抑制剂包括，例如，小分子和核酸。
术语“BMP-15活性”指与活化BMP-15蛋白质相关的一种或多种生理学上的生长调节或形态发生活性。在体内和体外测量BMP-15活性的检测是本领域已知的。一些更常用的生物检测的实例包括下列：
(1)大鼠卵巢卵泡细胞增殖的诱导(Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002)；Liao等人，J.Biol.Chem.279：17391-17396(2004))；
(2)对卵泡细胞kit配体表达的诱导(Otsuka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：8060-8065(2002))；
(3)抑制促卵泡激素(FSH)受体表达(Otsuka等人，J.Biol.Chem.276：11387-11392(2001))；
(4)抑制FSH-诱导的孕酮合成(Otsuka等人，J.Biol.Chem.275：39523-39528(2000))；
(5)抑制卵泡细胞中的FSH-诱导的类固醇生成急性调节蛋白(StAR)、P450侧链切割酶(P450sec)、3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)、LH受体的表达，以及抑制素/激活蛋白亚基(α、βA和βB)的表达(Moore等人，Mol.Cell.Endocrinol.234：67-73(2005))；
(6)对间充质干细胞向全能成骨细胞分化的影响(Jaiswal等人，J.Cell.Biochem.64：295-312(1997))；
(7)受体结合检测(Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002))；
(8)Smads蛋白质的磷酸化作用(Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18：653-665(2004))；和
(9)受体磷酸化作用(Boyle等人，Methods Enzymol.201 B：110-149(1991)；Luo等人，Methods Enzymol.201：149-152(1991)；Wrana等人，Mol.Cell.Biol.14：944-950(1994)；Weiser，等人，EMBO J.14：2199-2208(1995))。
GDF-9和BMP-15抑制剂任选是糖基化的、加入聚乙二醇的或连接另一个非蛋白质多聚物。可以修饰GDF-9或BMP-15的抑制剂使其具有改变的糖基化模式(即，与原始的或天然的糖基化模式不同)。如本文中使用的，“改变的”意指与原始的抑制剂相比，具有一种或多种碳水化合物部分被添加或删除，和/或具有一种或多种糖基化位点被添加或删除。可以通过改变氨基酸序列来含有本领域普遍已知的糖基化位点共同序列，从而实现向抑制剂添加糖基化位点。另一种增加碳水化合物部分数目的方式是将糖基与抑制剂的氨基酸残基化学连接或酶促连接。这些方法描述在WO87/05330，和Aplin等人.，Crit.Rev.Biochem.22：259-306(1981)中。可以通过化学的或酶促的实现去除受体上出现的任何碳水化合物部分，如Sojar等人，Arch.Biochem.Biophys.259：52-57(1987)；Edge等人，Anal.Biochem.118：131-137(1981)；和Thotakura等人，Meth.Enzymol.138：350-359(1987)中描述的。
在本发明的方法中使用的GDF-9和BMP-15抑制剂还可以用可检测的或功能性的标签标记。可检测的标签包括放射性标签例如125I、131I或99Tc，其可以使用本领域已知的常用化学方法连接至抑制剂上。标签还包括酶标签例如辣根过氧物酶或碱性磷酸酶。标签还包括化学部分例如生物素，其可以通过结合特殊关联的可检测部分，例如标记的抗生物素蛋白，来检测。
1.抗体
抑制GDF-9活性的抗体可用于本发明的方法。本发明的方法还可使用抑制BMP-15活性的抗体。
本文中使用的术语“抗体”意指免疫球蛋白或其部分，并且包括包含抗原结合位点的任意多肽，不论其来源、源头物种、生产方法和特征。作为非限制性实例，术语“抗体”包括人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、绵羊和鸡的抗体。该术语包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、骆驼源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体，和CDR-移植的抗体。出于本发明的目的，除非另外陈述，它还包括抗体片段例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb、VHH(也被称为纳米体)，和其他保留抗原结合功能的抗体片段。
例如，可以通过传统的杂交瘤技术(Kohler和Milstein，Nature 256：495-499(1975))、重组DNA方法(美国专利号4,816,567)或使用抗体文库的噬菌体展示技术(Clackson等人，Nature 352；624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222；581-597(1991))来制备抗体。对于其他不同的抗体产生技术，见Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人编著，ColdSpring Harbor Laboratory，1988。
术语“抗原-结合结构域”指抗体分子的部分，其包含与部分或全部抗原特异性结合或互补的区域。当抗原较大时，抗体可以只结合抗原的特定区域。“表位”或“抗原决定簇”是抗原分子的一部分，其负责与抗体的抗原结合结构域的特异性相互作用。可以通过一个或多个抗体可变结构域提供抗原结合结构域(例如，由VH结构域组成的所谓的Fd抗体片段)。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。来自骆驼和美洲驼(Camelidae，camelids)的抗体包含独特的抗体种类，只由重链形成，没有轻链。此类抗体的抗原结合位点是一个单结构域，被称为VHH。其被命名为“骆驼源化抗体”或“纳米体”。见例如美国专利号5,800,988、美国专利号6,005,079、国际申请号WO 94/04678，和国际申请号WO 94/25591，其引入本文作为参考。
术语“抗体库”指遗传上不同的核苷酸集合，例如，来自编码表达的免疫球蛋白序列的全部或部分的DNA序列。序列是通过例如H链的V、D和J区，以及例如L链的V和J区的体内重排产生的。可选的，序列可以通过体外刺激和对重排发生反应而从细胞系产生。可选的，通过核苷酸合成、随机突变和如美国专利号5,565,332中公开的其他方法，可以通过组合例如非重排的V区和D与J区来获得部分或全部序列。
术语“特异性相互作用”或“特异性结合”或诸如此类，意指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合体。该术语还可用于例如特异性针对特定表位的抗原结合结构域，所述表位由多种抗原携带，在此情况下，携带抗原结合结构域的抗体将能够结合多种携带了该表位的抗原。因此，抗体可以特异性的结合例如GDF-9和BMP-15，只要它与两种分子都携带的表位结合。
特异性的结合是以高亲和力以及低至中等的接受力(capcacity)为特征的。非特异性的结合通常具有低亲和力以及中等至高的接受力。典型的，当亲和力常数Ka大于106M-1时，或优选的大于108M-1时，认为结合是特异的。如果必须，可以通过改变结合条件在基本不影响特异结合的条件下降低非特异性结合。此类条件是本领域已知的，并且本领域技术人员使用常规技术可以选择适当的条件。通常用抗体的浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、无关分子的浓度(例如，血清白蛋白、牛奶酪蛋白)等定义条件。
短语“基本上如所示”意指相关的CDR、VH或VL结构域与本文中所示的序列的特定区域是相同或者高度相似的。例如，此类替代包括CDR序列(H1、H2、H3、L1、L2或L3)中任意5个氨基酸中的1个或2个。
术语“分离的”指分子基本上游离于其天然环境。例如，分离的蛋白质基本上不含来自其所衍生的细胞或组织源的细胞物质或其他蛋白质。该术语指制品，其中分离的蛋白质是基本上纯的、可以作为治疗组合物施用，或者至少70％至80％(w/w)纯，更优选的，至少80％-90％(w/w)纯，甚至更优选的，90％-95％纯；和，最优选的，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯。
A)抗GDF-9或BMP-15的抗体
根据上述方法，可以开发特异性的结合GDF-9蛋白质自身的抗体。如果这些抗体抑制GDF-9的活性，例如如果它们阻断GDF-9与其受体的结合，则它们在本发明的方法中是有效的。在本发明中最有效的抗体将具有与GDF-9/GDF-9受体复合体中的GDF-9特异性结合的性质。此类抗体能够以高亲和力结合成熟的GDF-9，并且可以结合成熟蛋白质的单体形式、同型二聚体形式，和/或异型二聚体形式，例如BMP-15的实例。
本领域中已经描述了抗GDF-9的抗体，并被认为可用于本发明，例如，美国专利号6,191,261中阐明的。
本领域中已经描述了用于GDF-9的中和化抗体，并且考虑将其用于本发明。mAb-GDF9-53是特异性的抗人GDF-9中和化单克隆抗体(Gilchrist等人，Biol.Reprod.71：732-739(2004))。该抗体的免疫的肽是合成的32个氨基酸的肽，对应于接近人GDF-9的C端的肽序列。表位定位揭示了mAb-GDF9-53识别短的4aa的肽序列，EPGD，其大致位于所免疫的肽的中段。比对来自一些脊椎动物物种的C-端GDF-9和BMP-15氨基酸序列提示，EPDG序列在物种之间是高度保守的，但是与BMP-15的相应区域只有较低水平的相似性。mAb-GDF9-53对重组的小鼠GDF-9表现出强的免疫亲和力，而对BMP-15则表现出极低的交叉反应性。Gilchrist等人描述的其他具有中和活性的抗人GDF-9抗体包括mAb-GDF9-22、mAb-GDF9-19、mAb-GDF9-37。
根据上述方法，还可以开发特异性结合BMP-15自身的抗体。如果它们抑制BMP-15的活性，例如阻断BMP-15与自身受体的结合，则这些抗体在本发明中将是有效的。本发明中最有效的抗体具有特异性结合BMP-15/BMP-15受体复合体中的BMP-15的性质。此类抗体能够高亲和力的结合成熟BMP-15，并可以结合单体、同型二聚体，和/或异型二聚体(例如与GDF-9结合的)形式的成熟蛋白质。
抗BMP-15抗体是本领域中已经描述的并可考虑在本发明中使用，例如，美国专利公开号2004/0267003和2004/0092007中阐明的。
B)抗GDF-9受体或BMP-15受体的抗体
根据上述方法，还可以开发结合GDF-9受体的抗体。如果它们阻断GDF-9与其受体的结合，或者如果它们阻断受体在结合GDF-9后的活性，则这些抗体在本发明中将是有效的。可以开发抗整个受体蛋白质的抗体，或者仅仅抗胞外结构域的抗体。可以开发抗ALK5(GeneBank登录号：NP_004603)、ALK5变体、BMPRII(GeneBank登录号：NP_001195)、BMPRII变体，以及GDF-9的其他受体的抗体。例如，可以从R和DSystems(Minneapolis，MN)获得小鼠ALK5的多克隆和单克隆(克隆141229)抗体，从R和D Systems获得小鼠、人BMPRII的多克隆和单克隆(克隆73805)抗体。
类似的，还可以开发结合BMP-15受体的抗体。如果它们阻断GDF-9与其受体的结合，或者如果它们阻断受体在结合BMP-15后的活性，则这些抗体在本发明中将是有效的。可以开发抗整个受体蛋白质的抗体，或者仅仅抗胞外结构域的抗体。可以开发抗ALK6(GeneBank登录号：NP_001194)、ALK6变体、BMPRII(GeneBank登录号：NP_001195)、BMPRII变体，以及BMP-15的其他受体的抗体。例如，可以从R和DSystems(Minneapolis，MN)获得小鼠ALK6的多克隆抗体，以及人的重组ALK-6/Fc嵌合抗体和小鼠的重组ALK-6/Fc嵌合抗体(R和D Systems(Minneapolis，MN))，人/小鼠ALK-6单克隆抗体(clone 88614；R和DSystems，Minneapolis，MN))。
2.修饰的可溶性受体
本发明可以使用GDF-9的修饰的可溶性受体。可溶性受体可以包含GDF-9受体胞外结构域(还被称为胞外结构域)的全部或部分，所述GDF-9受体例如ALK5或BMPRII。ALK5受体的氨基酸序列，包括对胞外结构域、受体的特定片段和变体的描述，其都在GeneBank登录号NP_004603中阐明。
在一个实施方案中，可溶性受体可以包含BMPRII的全部或部分胞外结构域，其既是GDF-9的受体，也是BMP-15的受体。BMPRII的氨基酸序列，包括胞外结构域、受体的特定片段和变体的描述都在GeneBank登录号NP_001195中阐明。抑制GDF-9的BMPRII胞外结构域-Fc融合蛋白在Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002)中阐明。
在另一实施方案中，本发明可以使用修饰的BMP-15可溶性受体。可溶性受体可以包含BMP-15受体例如ALK6或BMPRII的全部或部分胞外结构域。ALK6受体的氨基酸序列，包括胞外结构域、受体的特定片段和变体的描述都在例如GeneBank登录号NP_001194中阐明。ALK6胞外结构域-Fc融合蛋白在Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002)中胞外结构域。
可溶性受体可以重组产生、或通过化学或酶促切割完整受体来产生。本发明的修饰的可溶性受体在血流中结合GDF-9和/或BMP-15，降低GDF-9和/或BMP-15结合其体内天然受体的能力。在此方法中，这些修饰的可溶性受体抑制GDF-9和/或BMP-15的活性。
A)受体融合
可以通过与其他蛋白质或其他蛋白质的部分融合使本发明的修饰的可溶性受体更稳定。增加的稳定性对治疗是有利的，因为它们可以以更少的剂量或更低的频率间隔进行给药。与至少一部分免疫球蛋白融合，例如与抗体的恒定区融合，可选的免疫球蛋白的Fc片段融合，可以增加修饰的可溶性受体或本发明的其他蛋白质的稳定性(参见，例如Spiekermann等人，J.Exp.Med.196：303-310(2002))
3.其他蛋白质
本发明的方法中还可以使用其他抑制GDF-9活性的蛋白质。此类蛋白质可以与GDF-9本身相互作用，抑制它的活性，或者与其受体结合。可选的，抑制剂可以与GDF-9受体(例如ALK5或BMPIIR)相互作用，如果它们阻断GDF-9与其受体的结合，或者如果它们在与GDF-9结合后阻断受体的活性，则其在组合物或方法中是有效的。当然，抑制剂可以同时与GDF-9及其受体相互作用。本发明的方法还可以使用抑制BMP-15活性的蛋白质，所述蛋白质通过与BMP-15自身和/或其受体相互作用来抑制BMP-15的活性。
A)与GDF-9或BMP-15结合的蛋白质
本发明的方法中可以使用与GDF-9结合并抑制它的活性的蛋白质，包括与其受体结合的蛋白质。除了一些已知的蛋白质，还可以使用上述筛选技术、ALK5或BMPIIR结合检测，或者报道基因检测来分离其他的蛋白质。可以筛选蛋白质的样品，以及蛋白质文库。本发明的方法还可以使用结合BMP-15并抑制它的活性的蛋白质。
(1)GDF-9和BMP-15前肽
GDF-9前肽可以作为GDF-9的抑制剂使用。为了增加天然存在的GDF-9前肽的体内半衰期，本发明的前肽抑制剂可以经过修饰和/或稳定化，从而改善药物动力学性质，例如循环半衰期(Massague，J.，Ann.Rev.Cell Biol.，6：597-641(1990)；Jiang，等人，BBRC 315：525-531(2004)；Gregory等人，J.Biol.Chem.280：27970-27980(2005))。
在一个实施方案中，BMP-15前肽可以作为BMP-15的抑制剂使用。为了增加天然存在的BMP-15前肽的体内半衰期，本发明的BMP-15前肽抑制剂可以经过修饰和/或稳定化，从而改善药物动力学性质，例如循环半衰期。
此类经修饰的前肽包括包含前肽和IgG分子的Fc区(作为稳定化蛋白质)的融合蛋白。这些抑制剂可以包含GDF-9或BMP-15前肽，或所述前肽的片段或变体，所述片段或变体仍保留前肽的一种或多种生物学活性。本发明中使用的前肽可以是合成产生的、来自天然存在(天然的)的GDF-9或BMP-15前肽，或者使用遗传工程领域普遍已知的各种任意的试剂、宿主细胞和方法重组产生。在一个实施方案中，修饰的前肽包含与IgG分子或其片段共价相连的人前肽。前肽可以与IgG分子的Fc区直接相连，或者通过接头肽与IgG分子的Fc区相连(Jiang等人，BBRC 315：525-531(2004)；Gregory等人，J.Biol.Chem.280：27970-27980(2005))。在WO02/068650中描述了其他稳定化的修饰策略，该申请完整引入本文作为参考。
(2)显性失活的GDF-9和BMP-15蛋白质
BMP-15变体蛋白质可以在本发明的方法中作为抑制剂使用。天然存在的BMP-15变体，Y235C-BMP-15，在BMP-15的前(pro)区携带了非保守取代，并且在体内和体外对野生型BMP-15的活性都具有显性失活效应(Di Pasquale等人，Am.J.Hum.Genet.75：106-111(2004))。在本发明的方法中，本发明还考虑GDF-9变体蛋白质(包括显性失活的蛋白质)的使用。
(3)促滤泡素抑制素和含有促滤泡素抑制素-结构域的蛋白质
促滤泡素抑制素结合BMP-15，并且可用作BMP-15的抑制剂(Otsuka等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.289：961-966(2001))。因此，本发明提供了包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质，以调节BMP-15活性的水平，并可以用于治疗与BMP-15水平或活性的调节相关的疾病。
在本发明的组合物和方法中可以使用促滤泡素抑制素和含有促滤泡素抑制素结构域的蛋白质(在美国专利公开号2003/0162714和2003/0180306中描述的)。
含有至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质结合和抑制GDF-9。具有至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的实例包括但不限于促滤泡素抑制素、促滤泡素抑制素样相关基因(FLRG)、FRP(flik、tsc36)、集聚蛋白、骨粘连蛋白(SPARC、BM40)、hevin(SC1、mast9、QR1)、IGFBP7(mac25)和U19878。GASP1和GASP2是含有至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的其他实例。
如上所述的促滤泡素抑制素结构域被定义为氨基酸结构域或编码氨基酸结构域的核苷酸结构域，其特征是富含半胱氨酸的重复。促滤泡素抑制素结构域一般包含65-90个氨基酸区域，含有10个保守的半胱氨酸残基以及与Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域相似的区域。通常，促滤泡素抑制素结构域内的半胱氨酸残基间的环区具有序列变异性，但是某些保守性也是明显的。第4个和第5个半胱氨酸间的环通常小，仅含有1个或2个氨基酸。第7个和第8个半胱氨酸间的环通常最为高度保守，含有共有序列(G，A)-(S，N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)，后面是(T，S)-Y基序。第9个和第10个半胱氨酸间的区域通常含有包含由另外氨基酸分隔的两个疏水残基(具体是V、I或L)的基序。
含有促滤泡素抑制素结构域的蛋白质将包含至少(但可能超过)一个促滤泡素抑制素结构域。本术语还指此类蛋白质的任意变体(包括片段；带有取代、添加或缺失突变的蛋白质；和融合蛋白)，包括已经对氨基酸序列进行保守性或非保守性改变修饰序列，其中所示的变体保持了与天然蛋白质相关的已知生物学活性，尤其是与BMP-15结合活性有关的那些生物学活性。这些蛋白质可以自任意来源(天然来源或合成来源)衍生。蛋白质可以是人蛋白质或自动物来源，包括牛、鸡、鼠、大鼠、猪、羊、火鸡、狒狒和鱼衍生的蛋白质。
可以使用多种方法分离包含至少一个促滤泡素抑制素结构域、可以结合BMP-15的蛋白质。例如，可以采用利用BMP-15的亲和层析。此外，可以利用对cDNA文库的低严格性筛选和使用针对促滤泡素抑制素结构域的探针的简并PCR技术。因为可获得更多基因组数据，可以将使用众多序列谱和分析程序如MotifSearch(Genetics Computer Group，Madison，Wl)、ProfileSearch(GCG)和BLAST(NCBI)的相似性搜索用来发现与已知促滤泡素抑制素结构域具有显著同源性的新蛋白质。在本发明的一个实施方案中，该蛋白质包含与成熟的BMP-15或其片段特异性结合的至少一个促滤泡素抑制素结构域，不论所述蛋白质是单体形式、活性二聚体形式，或作为BMP-15潜伏复合体的部分，所述结合具有0.001和100nM之间的亲和力，或者0.01和10nM之间的亲和力，或者0.1和1nM之间的亲和力。
B)结合GDF-9或BMP-15受体的蛋白质
结合GDF-9受体(例如ALK5或BMPIIR)并且抑制GDF-9与受体结合或受体本身活性的蛋白质可在本发明的范围内使用。相似的，结合BMP-15受体(例如ALK6或BMPIIR)并且抑制BMP-15与受体结合或受体本身活性的蛋白质可在本发明的范围内使用。可以使用上述的筛选技术和检测或者报道基因检测来分离此类蛋白质。在一个实施方案中，受体结合蛋白是抗体。可以筛选蛋白质的样品，以及蛋白质文库。
C)与任何结合蛋白融合
可以通过与另一个蛋白质或另一个蛋白质的部分融合，使任何结合GDF-9、BMP-15、GDF-9受体或BMP-15受体的蛋白质的融合蛋白更加稳定。增加的稳定性对治疗是有利的，因为它们可以以更低剂量或更低频率间隔给药。与免疫球蛋白的至少一部分融合，例如恒定区，可选的免疫球蛋白的Fc片段，可以增加这些蛋白质的稳定性。此类融合蛋白的制备是本领域普遍已知的，并且可以方便的实施(见例如，Spiekermann等人，J.Exp.Med.，196：303-310(2002))。
D)GDF-9和BMP-15免疫肽
本文中使用的术语“疫苗”指诱导保护性免疫应答的组合物或化合物，所述保护性免疫应答包括抗体应答或者细胞应答。例如，GDF-9“疫苗”诱导拮抗GDF-9功能的免疫应答。在美国专利号6,030,617中描述了GDF-9疫苗。作为疫苗使用的GDF-9和BMP-15免疫原可以是同源的GDF-9或BMP-15蛋白质，其通过引入一个或一些外源的、免疫显性的和非种系选择性T细胞表位来修饰，同时基本上保留了蛋白质的四级结构；见例如，WO 01/05820，其引入本文作为参考。GDF-9和BMP-15肽已经在短期和长期免疫中向羊施用过(Juengel等人，Biol.Reprod.70：557-561(2003)；Juengel等人，Biol.Reprod.67：1777-1789(2002)；McNatty等人，Reprod.128：3790386(2004))。
4.GDF-9和BMP-15抑制剂的模拟物
本发明的方法中可以使用GDF-9抑制剂的模拟物。这些GDF-9抑制剂的任何合成性模拟物，尤其是具有改善的体外特性如具有较长半衰期或更不易受消化系统降解的那些的模拟物是有用的。
抗GDF-9抗体、抗GDF-9受体的抗体、修饰的可溶性受体和受体融合蛋白、以及结合GDF-9的其他蛋白质例如GDF-9前肽、突变的GDF-9前肽、促滤泡素抑制素和含有促滤泡素抑制素结构域的蛋白质，及其Fc融合蛋白的模拟物都可以在本发明中使用。
如果这些模拟物阻断GDF-9的活性，即如果它们阻断GDF-9与其受体的结合，则这些模拟物在本发明的方法中是有效的。在本发明中最有效的模拟物具有特异性结合GDF-9或GDF-9/GDF-9受体复合体的性质。此类模拟物能够以高亲和性结合成熟GDF-9，并可以结合单体形式、活性二聚体形式或作为GDF-9潜伏复合体部分的成熟蛋白质。在本发明的方法中有效的模拟物可以抑制GDF-9的体外和体内活性，例如，通过抑制ALK5或BMPIIR结合以及报道基因检测来证明。此外，公开的模拟物可以抑制与骨骼肌量和骨密度的负调节相关的GDF-9活性。
本发明的方法中还可以使用BMP-15的模拟物。这些BMP-15抑制剂的任何合成性模拟物，尤其是具有改善的体外特性如具有较长半衰期或更不易受消化系统降解的那些的模拟物是有用的。
抗BMP-15抗体、抗BMP-15受体的抗体、修饰的可溶性受体和受体融合蛋白、以及结合BMP-15的其他蛋白质例如BMP-15前肽、突变的BMP-15前肽、促滤泡素抑制素和含有促滤泡素抑制素结构域的蛋白质，及其Fc融合蛋白的模拟物都可以在本发明中使用。
如果这些模拟物阻断BMP-15的活性，即如果它们阻断BMP-15与其受体的结合，则这些模拟物在本发明的方法中是有效的。在本发明中最有效的模拟物具有特异性结合BMP-15或BMP-15/BMP-15受体复合体的性质。此类模拟物能够以高亲和性结合成熟BMP-15，并且可以结合单体形式、活性二聚体形式或作为BMP-15潜伏复合体部分的成熟蛋白质。在本发明的方法中有效的模拟物可以抑制BMP-15的体外和体内活性，例如，通过抑制ALK6或BMPIIR结合以及报道基因检测来证明。此外，BMP-15公开的模拟物可以抑制与骨骼肌量和骨密度的负调节相关的BMP-15活性。
5.非蛋白质抑制剂
在本发明的方法中还可以使用的非蛋白质抑制剂包括，例如小分子和核酸。
A)小分子
在本发明的方法中可以使用的GDF-9和BMP-15抑制剂包括小分子。小分子包括合成的和纯化的天然存在的GDF-9和BMP-15抑制剂。小分子可以是模拟物或促分泌素。
鉴别特异性靶向目标蛋白质例如GDF-9或BMP-15的小分子的方法是本领域普遍已知的。可以使用任何上述的GDF-9功能检测在小分子和/或肽文库中筛选GDF-9的抑制作用，所述检测包括但不限于CAGA-荧光素酶、MSXII-荧光素酶或BRE-荧光素酶在COS-7、CV-1、A204或卵泡细胞中的表达。可以在GDF-9与其受体(包括例如可溶性受体)的竞争性放射配体结合检测中筛选小分子和/或肽文库。荧光共振能量转移(FRET)检测的利用，例如放大发光最大同源性检测(还已知为“AlphaScreen”，PerkinElmer，Boston，MA)也被用于鉴别合适的小分子抑制剂。在该实施方案中，GDF-9肽或BMP-15肽与第一“供体”微珠群偶联，用于鉴别与第二“受体”微珠群偶联的群体中的相互作用分子。与GDF-9或BMP-15相互作用的肽还可以用于筛选检测。在此类检测中使用的一种GDF-9肽是：SQLKWDNWIVAPHRYNPRYCKGDC(SEQ ID NO：5)。其他基于FRET检测的实例包括时间解析FRET(例如，PerkinElmer的LANCE系统，Boston，MA)，用于筛选配体二聚化的抑制剂或鉴别与定义的GDF-9或BMP-15肽相互作用的小分子。在另一个实施方案中，还可以使用Biacore系统技术(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)实时分析小分子或肽与GDF-9或BMP-15的相互作用。本发明还考虑其他筛选检测的使用，例如，二次和三次检测，以进一步鉴别此类分子对骨细胞分化和功能的影响，以及对骨密度的影响，例如使用上文详细描述的检测。
B)核酸
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”指脱氧核糖核酸(DNA)并且根据需要指核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)。应当理解，该术语包括核苷酸类似物以及单链或双链多核苷酸(例如siRNA)。多核苷酸的实例包括但不限于质粒DNA或其片段、病毒DNA或RNA、RNAi等。术语“质粒DNA”指呈环状的双链DNA。术语“siRNA”和“RNAi”指具有诱导mRNA降解的能力因而使基因表达“沉默”的双链RNA核酸。
可以阻断GDF-9活性的核酸可用于本发明。此类抑制剂可以编码与GDF-9本身相互作用的蛋白质。可选的，此类抑制剂可以编码与GDF-9受体(例如ALK5或BMPIIR)相互作用的蛋白质，如果其编码的蛋白质阻断GDF-9与其受体的结合，或者如果在结合GDF-9后阻断受体的活性，则在本发明中是有效的。当然，抑制剂可以编码同时与GDF-9及其受体相互作用的蛋白质。可以使用此类核酸以便表达本发明的GDF-9抑制剂。
相似的，可以阻断BMP-15活性的核酸可用于本发明。此类抑制剂可以编码与BMP-15本身相互作用的蛋白质。可选的，此类抑制剂可以编码与BMP-15受体(例如ALK5或BMPIIR)相互作用的蛋白质，如果其编码的蛋白质阻断BMP-15与其受体的结合，或者如果在结合BMP-15后阻断受体的活性，则在本发明中是有效的。当然，抑制剂可以编码同时与BMP-15及其受体相互作用的蛋白质。可以使用此类核酸以便表达本发明的BMP-15抑制剂。
本发明的方法涵盖了使用RNA干扰(“RNAi”)降低GDF-9或GDF-9受体例如ALK5或BMPIIR的表达。通过引入核酸分子，例如合成的短干扰RNA(“siRNA”)或RNA干扰试剂，可以起始RNAi，从而抑制或沉默靶基因的表达。见例如，美国专利公开号2003/0153519和2003/01674901，以及美国专利号6,506,559，和6,573,099。
本文中使用的“RNA干扰试剂”是任何通过RNA干扰来干扰或抑制靶基因或基因组序列表达的试剂。此类RNA干扰试剂包括但不限于，包括与靶基因和靶基因组序列同源的RNA分子在内的核酸分子或其片段、短干扰RNA(siRNA)、短发夹或小发夹(shRNA)和通过RNA干扰来干扰或抑制靶基因表达的小分子。
如本文中使用的，“靶基因表达的抑制”包括靶基因或者由靶基因编码的蛋白质在表达或蛋白质活性或水平上的任何降低。与没有被RNA干扰试剂靶向的靶基因的表达，或者由该靶基因编码的蛋白质的活性或水平相比，降低可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。
SiRNA可以是化学合成的，可以是通过体外转录产生的，或者可以是在宿主细胞内产生的。一般的，siRNA长度为至少15-50个核苷酸，例如，长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA是长度为约15至约40个核苷酸的双链RNA(dsRNA)，例如，约15至约28个核苷酸长度，包括约19、20、21或22个核苷酸长度，并可以在每条链含有长度为约0、1、2、3、4、5或6个核苷酸的3’和/或5’overhand。在一个实施方案中，siRNA可以通过转录沉默抑制靶基因。优选的，siRNA能够通过靶信使RNA的降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)来促进RNA干扰。
在本发明的方法中可用的siRNA还包括小发夹RNA(shRNA)。ShRNA由短(例如，约19至约25个核苷酸)反义链组成，后接约5至约9个核苷酸的核苷酸环，以及类似的正义链。可选的，正义链可以在核苷酸环结构之前，反义链可以在其之后。这些shRNA可以包含在质粒和病毒载体中。
本发明的siRNA分子的靶向区域可以选自给定的靶序列。例如，核苷酸序列可以从起始密码子下游的约25-100个核苷酸开始。核苷酸序列可以含有5’或3’非翻译区，以及靠近起始密码子的区域。设计和制备siRNA分子的方法是本领域普遍已知的，包括多种选择序列作为RNAi试剂的规则(见例如，Boese等人，Methods Enzymol.392：73-96(2005))。
可以使用标准技术产生siRNA，如在Hannon，(2002)Nature，418：244-251(2002)；McManus等人，(2002)Nat.Reviews，3：737-747(2002)；Heasman，(2002)Dev.Biol.，243：209-214(2002)；Stein，(2001)J.Clin.Invest，108：641-644(2001)；以及Zamore，(2001)Nat.Struct.Biol.，8(9)：746-750(2001)中描述的。优选的siRNA是5-引物磷酸化的。
可以使用siRNA抑制剂靶向GDF-9、GDF-9受体(包括ALK5和BMPIIR)、BMP-15或BMP-15受体(包括ALK6和BMPIIR)。在Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18：653-665(2004)中阐明了ALK5的siRNA序列，其与GDF-9作用的剂量依赖性抑制有关。
可以使用反义寡核苷酸降低GDF-9、GDF-9受体、BMP-15或BMP-15受体的表达。本文中使用的“反义”指能够通过序列互补与mRNA的编码和/或非编码区杂交，从而干扰从mRNA的翻译的核酸。反义核酸可以使用标准技术产生，如在Antisense Drug Technology：Principles，Strategies，and Applications，第一版，Crooke，Marcel Dekker编著(2001)中描述的。在Vitt等人，Biol.Reprod.67：473-480(2002)中阐明了BMPIIR反义寡核苷酸的序列。
可以将核酸在从大约1μg/kg至大约20mg/kg的剂量施用，这取决于症状严重性和疾病进展。适宜的有效剂量通过进行治疗的临床医生从如下范围选择：大约1μg/kg至大约20mg/kg、大约1μg/kg至大约10mg/kg、大约1μg/kg至大约1mg/kg、大约10μg/kg至大约1mg/kg、大约10μg/kg至大约100μg/kg、大约100μg/kg至大约1mg/kg以及大约500μg/kg至大约1mg/kg。核酸抑制剂可以通过局部、口服、静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下或经皮的方法施用。
核酸可以从其天然环境，以基本纯的形式或均一形式得到、分离和/或纯化。用于在多种不同宿主细胞内克隆和表达多肽的系统众所周知。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域内可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞和众多其它细胞。常用的细菌宿主是大肠杆菌(E.coli)。对于适合从核酸产生蛋白质的其他细胞见Gene Expression Systems，Fernandez等编辑，Academic Press(1999)。
可以选择或构建合适的载体，其包含包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列在内的适宜调节序列、选择基因或标志基因以及根据需要的其他序列。根据需要载体可以是质粒或病毒载体，例如噬菌体或噬粒。对于其他细节，参见例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Sambrook等，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。众多用于操作核酸，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达以及蛋白质分析的已知技术和方案在CurrentProtocols in Molecular Biology，编者Ausubel等，第二版，John Wiley &Sons(1992)中详细描述。
可以将核酸与编码另外多肽序列，例如作为标志或报道分子起作用的序列的其他序列融合。标志或报告分子的实例包括内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(负责新霉素(G418)抗性)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、萤光素酶和本领域内众多其他标志或报告分子。
II.药物组合物和给药方法
施用药物组合物的方法是本领域已知的。“给药”不限于任何特定的递送系统，并可以包括而不限于，肠胃外的(包括皮下、静脉内、骨髓内、动脉内、肌内、髓内或腹腔内注射)、直肠的、局部的、经皮的或口服的(例如，以胶囊、悬浮液或片剂的形式)。向个体给药可以以单一剂量或以持续或间隔的重复给药的方式发生，并且以多种生理可接受的盐形式中的任一种形式，和/或具有可药用载体和/或添加剂作为药物组合物的一部分(如上述)。
可以将GDF-9和BMP-15的调节剂制成药物组合物。生理可接受的盐形式和标准的药物制剂技术和赋形剂是本领域技术人员普遍已知的(见例如，Physicians′Desk Reference(PDR)2003，第57版，Medical EconomicsCompany，2002；和Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Gennado等人编著，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins，2000)。
本发明的方法中可用的调节剂可以以从约1μg/kg至约20mg/kg的剂量施用，这取决于症状严重性和疾病进展。适宜的有效剂量通过进行治疗的临床医生从如下范围选择：例如，约1μg/kg至约20mg/kg、约1μg/kg至约10mg/kg、约1μg/kg至约1mg/kg、约10μg/kg至约1mg/kg、约10μg/kg至约100μg/kg、约100μg/kg至约1mg/kg，和约500μg/kg至约1mg/kg。
在一些实施方案中，本发明的方法使用的组合物还包含可药用赋形剂。如本文中使用的，词组“可药用赋形剂”指任何和所有的溶剂、分散基质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗的和吸收延迟试剂等等，其与药物施用相容的。此类基质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域普遍已知的。组合物还可以含有其他活性化合物，提供补充的、额外的或增强的治疗功效。还可以将药物组合物与施用说明书共同包括在容器、包装或分样器中。
将药物组合物制成符合其预期的给药途径。此类组合物的实例包括结晶蛋白质制剂、裸露的提供或结合生物可降解的多聚物(例如，PEG、PLGA)来提供。
本发明的调节剂可以作为药物组合物给药，联合载体凝胶、基质、赋形剂，或者其他用于指导骨再生和/或骨置换的组合物。此类基质的实例包括合成的聚乙二醇(PEG)-、羟磷灰石、基于胶原和纤维蛋白的基质、组织血纤蛋白胶等。赋形剂可以包括药物可接受的盐、多糖、肽、蛋白质、氨基酸、合成的多聚物、天然多聚物和表面活性剂。
在本发明的一些实施方案中，GDF-9调节剂和BMP-15调节剂可以配制成作为可注射的或可植入的组合物用于递送。组合物可以是适合注射或以固态植入体内的圆柱状。在一个实施方案中，可注射的制剂包括抑制剂和透明质酸酯，如美国专利公开号20050287135中详细描述的，其引入本文作为参考。例如，Hyaffi 1 p65可以作为透明质酸使用。在另一个实施方案中，可注射的制剂包括调节剂和磷酸钙物质，例如无定形磷灰石磷酸钙、结晶不好的磷灰石磷酸钙、羟磷灰石、磷酸三钙、氟磷灰石及其组合物，如美国专利公开号20050089579中详细描述的，其引入本文作为参考。
在一些实施方案中，GDF-9抑制剂和BMP-15抑制剂可以以与其他治疗性化合物联合或伴随给药，所述治疗性化合物例如，二膦酸盐(含氮和不含氮)、apomine、睾酮、雌激素、氟化钠、雷奈酸锶、维生素D及其类似物、降钙素、钙补充物、选择性雌激素受体调节剂(SERM，例如，雷洛昔芬)、成骨蛋白(例如，BMP-2)、他汀类、RANKL抑制剂、非基因引向雌激素-样信号发放的活化剂(ANGELS)，和甲状旁腺素(PTH)。(Apomine是新型1，1，-二膦酸酯，其激活farneion X活化受体，并加快HMG CoA(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A)还原酶的降解(见例如，美国专利公开号2003/0036537和其中引用的参考文献))。在一个优选的实施方案中，GDF-9或BMP-15的抑制剂是与二膦酸盐共同给药的，所述二膦酸盐包括但不限于阿伦膦酸盐、英卡膦酸、氯膦酸盐、EB-1053、羟乙二磷酸、伊班膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、帕米膦酸、利塞膦酸、替鲁膦酸盐、YH 529、唑仑西平和可药用盐、酯、酸，及其混合物。在另一个优选的实施方案中，GDF-9和/或BMP-15的抑制剂可以与一种或多种成骨蛋白共同给药，所述成骨蛋白包括但不限于BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10、BMP-12、BMP-13和MP52。在一个实施方案中，GDF-9的抑制剂与BMP-3的抑制剂共同给药。
还可以通过基因疗法的方式，根据本发明的方法向个体施用治疗剂，其中，编码调节剂的核酸序列是向患者体内施用或者在体外向细胞施用，然后再将所述细胞引入患者。对于具体的基因疗法方案，参见Morgan，Gene Therapy Protocols，第2版，Humana Press(2000)。
III.筛选和诊断的方法
本发明可以用于鉴别有遗传倾向于具有改变的骨密度的对象，或者目前已经具有改变的骨密度的对象。在一个实施方案中，为了筛选和/或诊断改变的骨密度，比较了来自对象的测试样品和对照样品中的GDF-9或BMP-15的相对水平。在测试样品中GDF-9或BMP-15的改变的水平的存在提示了改变的骨密度和/或在对象中发展出改变的骨密度的倾向。在另一个实施方案中，本发明提供了方法，其用于检测与具有野生型核酸序列的对象相比，在含有核酸的样品中，GDF-9或BMP-15变体核酸序列的存在。
在一个实施方案中，对象中GDF-9和/或BMP-15的水平相对于对照样品是升高的，而且对象具有降低的骨密度，或者增加的发展出降低的骨密度的风险。在另一个实施方案中，对象中GDF-9或BMP-15的水平相对于对照样品是降低的，对象具有增加的骨密度，或者增加的发展出增加的骨密度的可能性。
抗GDF-9或BMP-15的特异性抗体，或者抗GDF-9或BMP-15变体的特异性抗体可用于确定样品中的各蛋白质的水平。本发明提供了方法，其用于检测待筛选或诊断的对象中的GDF-9或BMP-15或其变体，其包括将抗GDF-9或BMP-15的抗体接触细胞或蛋白质，检测与抗体的结合。可以用化合物或可检测的标记直接标记抗体，允许检测与其抗原的结合。不同的标记和标记的方法是本领域普通技术人员已知的。本发明中可以使用的标记的类型的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物、发磷光的化合物，和生物发光化合物。可以检测从生物液体和组织中分离的样品中的GDF-9或BMP-15的水平。可以使用任何含有可检测量抗原的标本。本发明优选的样品是骨组织。可以将疑似细胞中的GDF-9或BMP-15的水平与普通细胞中的水平相比较，从而确定对象是否倾向于改变的骨密度。
本发明的抗体适合在例如免疫检测中使用，包括液相或与固相载体结合的本发明的抗体。使用抗体的免疫检测包括以直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫检测，例如放射免疫检测(RIA)和三明治夹心(免疫测定)检测。还可以使用抗体，利用免疫组织化学检测在生理样品上检测GDF-9或BMP-15。
在另一个实施方案中，本发明提供了方法，其用于检测与具有野生型核酸序列的对象相比，在从对象分离的含有核酸的测试样品中，GDF-9或BMP-15变体核酸序列的存在。
本文中使用的“变体”指任何GDF-9或BMP-15核酸序列，其不对应野生型GDF-9或BMP-15核酸序列，以及相应的氨基酸序列。本发明的方法包括GDF-9或BMP-15片段的变体，其与野生型GDF-9或BMP-15序列的相应片段不享有序列同一性。
在本发明的方法和检测中有用的变体包括通过天然发生的或人为操作的突变、限制性片段长度多态性、单核苷酸多态性(SNP)、核酸缺失，或核酸取代而产生的改变。“缺失”是核苷酸序列中的改变，其中，失去了一个或多个核苷酸残基。“取代”是用不同的核苷酸参见取代一个或多个核苷酸残基。
变体还包括肽，或全长蛋白质，其在蛋白质骨架中包含取代、缺失或插入，但仍然与原始的蛋白质在相应的部分保留了70％同源性。保守取代的实例涉及具有相同或相似性质的氨基酸。示例性的氨基酸保守取代包括以下改变：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸，谷氨酰胺，或谷氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸至异亮氨酸至亮氨酸
本文中使用的术语“分离的”包括基本上不含其他核酸、蛋白质；脂类、糖类或其他天然相关的物质的多核苷酸。本发明的多核苷酸序列包括编码GDF-9或BMP-15变体的DNA和RNA序列。可以理解，本文中还包括了编码全长或部分GDF-9或BMP-15变体的所有多核苷酸，例如天然存在的、合成的，和人为操作的多核苷酸。可用于本发明的方法和检测中的多核苷酸包括作为遗传密码结果的简并序列。互补序列可以包括反义核苷酸。还包括上述核酸序列的至少10-15个碱基长度的片段(部分)，其足以允许片段与变体核酸的DNA特异性杂交。
可用于本发明的方法和检测中的核酸序列可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，可以通过以下方法分离DNA：1)探针与基因组或cDNA文库杂交来检测同源的核苷酸序列，2)使用能够与目标DNA序列退火的引物，在基因组DNA或cDNA上进行聚合酶链式反应(PCR)，和3)抗体筛选表达文库来检测共享结构特征的克隆DNA片段。
编码GDF-9或BMP-15或其变体的特定的DNA序列的开发还可以通过以下方法获得：1)从基因组DNA中分离双链DNA序列；2)化学产生DNA序列，以提供目标多核苷酸必需的密码子；和3)通过逆转录从真核供体细胞中分离的mRNA，在体外合成双链DNA序列。在后一种情况下，形成的与mRNA互补的双链DNA，被称为cDNA。
在优选的实施方案中，本发明提供用于鉴别与改变的骨密度相关的核酸变体的方法，所述方法通过与具有正常骨密度和野生型GDF-9或BMP-15核酸序列的对象相比，检测从具有改变的骨密度的对象中分离的样品中的靶GDF-9或BMP-15变体核酸序列的存在。
本发明包括在对象中鉴别等位变体的方法。对象可以是GDF-9或BMP-15变体的纯合的或杂合的。如本文中使用的，“等位基因”是在基因组中以一种以上的形式(不同的序列)出现的基因或核苷酸序列，例如单核苷酸多态性(SNP)。根据本发明，“纯合的”表示基因或SNP的两份拷贝与其他等位基因在序列上是相同的。例如，野生型GDF-9或BMP-15基因是纯合的对象含有至少两份拷贝的GDF-9或BMP-15野生型序列。此类对象将不倾向于改变的骨密度。
如本文中使用的，“杂合的”表示在基因组中存在等位基因的两份不同的拷贝，例如一拷贝的野生型等位基因和一拷贝的变体等位基因。具有此类基因组的对象是杂合的。“杂合的”还包括在它的GDF-9或BMP-15等位基因中具有两个不同的突变的对象。
本发明的一个实施方案提供了开发对象的GDF-9或BMP-15基因的等位基因谱(allelic profile)的方法。如本文中使用的“等位基因谱”，是根据GDF-9或BMP-15等位基因或其变体的存在或缺失，以及拷贝数目，确定对象的基因组的组成。
在优选的实施方案中，本发明提供了确定对象改变的骨密度倾向的方法。该方法包括通过从包含GDF-9或BMP-15序列的对象中分离核酸标本，确定对象的GDF-9或BMP-15等位基因谱，并确定GDF-9或BMP-15核酸序列中突变的存在或缺失。本发明还提供了用于确定对象的GDF-9或BMP-15等位基因谱的诊断或预后方法，其包括从对象中分离核酸样品；使用与靶序列杂交的引物扩增核酸。
可以使用任何检测等位基因变体的方法。例如，等位基因特异的寡核苷酸(ASO’s)可以用作探针来鉴别此类变体。ASO探针可以是任何适合检测目标序列的长度。优选的此类探针是10-50个核苷酸长度，并将通过同位素或非同位素的方法可检测的标记。可以可选的扩增靶序列，并在Southern印迹固定之前通过凝胶电泳分离。可选的，可以将含有未扩增的核酸的提取物转移到硝化纤维素上，并用斑点印迹直接探测。
此外，可以通过相同限制性位点的改变鉴别等位基因特异的改变。突变有时改变限制性酶切位点，或者可选的，引入原先不存在的限制性位点。限制性酶识别位点的改变或增加可用于鉴别特定的变体。
在本发明的方法中使用的引物包括足够长度和合适序列的寡核苷酸，其在严格条件下，为使用引物的反应提供含有靶核酸的大量核酸分子聚合作用的特异起始。在该方法中，能够选择性的扩增含有目标核酸的特异的靶核酸序列。特别的，本文中使用的术语“引物”指包含两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列，优选至少八个，该序列能够起始引物延伸产物的合成，所述产物与靶核酸链基本互补。寡核苷酸引物一般含有15-22个或更多的核苷酸，但是，只要引物具有足够特异性以基本上只允许特定的理想靶核苷酸序列的扩增(即，引物是基本上互补的)，它可以含有更少的核苷酸。
根据本发明的方法使用的引物被设计为与所扩增的突变核苷酸序列的每条链“基本上”互补。基本上互补意指引物必须足够的互补，从而在允许聚合的物质发挥功能的条件下与它们各自的链杂交。换言之，引物应该与杂交的侧翼序列具有足够的互补性，以允许突变核苷酸序列的扩增。优选的，引物延伸的3’端延伸为与互补的侧翼链完全互补的碱基对。
寡核苷酸引物可用于任何产生增加的靶核酸的量的扩增方法，所述扩增方法包括聚合酶链式反应。一般的，一条引物与突变核苷酸序列的负(-)链互补，另一条与正(+)链互补。引物与变性的核酸退火，然后用酶延伸，例如DNA聚合酶I的大片段(Klenow)或Taq DNA聚合酶，以及核苷酸或连接酶，获得新合成的含有靶核酸的+链和-链。由于这些新合成的核酸也是模板，变性、引物退火和延伸的重复循环获得了由引物定义的区域(即，靶突变核苷酸序列)的指数产品。扩增反应的产物是分散的核酸双螺旋，具有与使用的特异引物的末端相应的末端。本领域技术人员已知其他的扩增方法学，其也可用于增加靶核酸的拷贝数。
来自任何组织标本纯化或非纯化形式的核酸都可以作为一个或多个起始核酸使用，如果它含有，或疑似含有包含靶核酸的特异的核酸序列。因此，该方法可以使用，例如，DNA或RNA，包括信使RNA(mRNA)，其中DNA或RNA可以是单链或双链。在使用RNA作为模板的情况下，应该使用适合将模板逆转录为DNA的酶和/或条件。此外，可以使用各含有一条链的DNA-RNA杂化物。采用相同或不同的引物还可以使用核酸的混合物，或者在本文中上述扩增反应中产生的核酸。被扩增的突变核苷酸序列可以是更大分子的一部分，或者开始可以作为分离的分子存在，从而特异的序列构成整个核酸。待扩增的序列开始以纯化的形式存在并不是必需的；它可以是复杂混合物的小部分，例如包含在整个人或动物DNA中。
可以通过Southern印迹分析检测扩增的产物，不需要使用放射性探针。在此类方法中，例如，扩增含有极低水平的突变核苷酸序列的DNA小样品，并通过Southern印迹技术分析。通过高水平的扩增信号方便非放射性探针或标记的使用。
当靶核酸没有扩增时，可以在分离的核酸上直接实施使用合适杂交探针的检测。在这些实例中，当靶核酸被扩增时，使用合适的杂交探针的检测将在扩增后实施。
本发明的探针可用于检查所检测的特异片段的分布，以及探针结合的定量(相对)程度，以用于确定特异性强结合(杂交)序列的存在。
本发明的探针可以用原子或无机基团可检测标记，最常使用放射性核素，但还可使用重金属。可以使用任何提供充足信号和具有足够半衰期的放射性标记。其他标记包括配体，标记的配体可以作为特异性结合对的成员等。可以使用在免疫检测中常规使用的多种标记。荧光化合物包括萤光素(fluorescein)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光物包括萤光素(luciferin)和2，3-二氢酞嗪二酮(2，3-dihydrophtha-lazinediones，例如，鲁米诺)。
通过本发明的方法检测的具有GDF-9或BMP-15变体的核酸可以在溶液中或者在与固体支持物结合后，通过通常用于特异性DNA序列检测的任何方法，例如PCR、寡聚体限制性酶消化(oligomer restriction，Saiki等人，Bio/Technology，3：1008-1012，1985)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：278，1983)、寡核苷酸连接检测(OLA)(Landegren等人，Science，241：1077，1988)等，进行进一步评估、检测、克隆、测序等等。
本发明还提供用于检测GDF-9和/或BMP-15中改变的水平或突变的试剂盒。此类试剂盒可包括可检测的或能够可检测标记的探针。此类探针可分别是特异性针对靶蛋白或其片段，或者靶核酸或其片段的抗体或核苷酸，其中靶是指定的，或者与GDF-9或BMP-15或其变体的存在相关。例如，本发明的寡核苷酸探针可以包括在试剂盒中，并用于检查GDF-9变体或BMP-15变体，以及探针结合的定量(相对)程度，以确定特异性强结合(杂交)序列的存在，从而提示对象具有或倾向具有改变的骨密度的可能性。
在一个实施方案中，试剂盒使用核酸杂交来检测靶核酸，试剂盒还可以具有容器，其含有用于靶核酸序列扩增的一个或多个核苷酸。当需要扩增靶核酸序列例如变体核酸序列时，其可以使用寡核苷酸来完成，所述寡核苷酸是用于扩增的引物。
在一个实施方案中，试剂盒可以提供含有抗体的容器，所述抗体与靶蛋白或其片段、或此类蛋白质或其片段的变体结合。因此，试剂盒可以含有与野生型GDF-9或BMP-15或其变体结合的抗体。此类抗体可用于区分特定的GDF-9或BMP-15变体的存在，或此类变体在标本中的表达水平。
下列实施例提供了本发明的示例性的实施方案。一个本领域的普通技术人员将认识到，在不改变本发明的精神或范围的条件下，可以进行大量的修饰和改变。此类修饰和改变都涵盖在本发明的范围内。实施例不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：在GDF-9敲除小鼠中的骨矿物质密度
在雌性小鼠中分析GDF-9无效突变对骨矿物质密度的影响。以前已经描述过GDF-9敲除小鼠(Dong等人，Nature 383：531-535(1996))。在16周龄(表1)和10月龄(表2)的雌性小鼠中如下确定总的、骨小梁的和皮质的容积骨矿物质密度(volumetric bone mineral density，vBMD)。使用XCT Research外周定量计算机化断层显像密度仪(pQCT；StratecMedizinetechnik，Pforzheim，德国)评估左侧股骨的容积骨矿物质密度(vBMD，mg/cm3)。从临近股骨远端2.5mm处获得了一份0.5mm厚的pQCT切片，并被用于计算股骨远端干骺端的总的和骨小梁的骨密度。使用临近股骨端6mm处获得的第二片切片评估皮质的密度。断层切片具有0.07mm的平面像素尺寸(in-plane pixel size)。在获取图像后，显示图像，并画出包含每次扫描的目标区域的整个股骨轮廓。使用迭代算法自动移去软组织，确定在第一份切片中的残留骨的密度(总密度)。然后，以同心螺旋剥去骨的外层55％，以mg/cm3公布第一个切片的残留骨(骨小梁密度)的密度。在第二个切片中，使用迭代算法确定骨皮质和骨小梁之间的边界，并确定骨皮质的密度。
表1：在16周龄的GDF-9敲除的雌性小鼠中的骨密度
  基因型   总密度a   小梁密度a   皮质密度a   皮质厚度b   骨长度b
  WT雌性   499.080±7.781   136.370±4.385   1190.030±7.111   0.259±0.004   14.92±0.190
  KO雌性   544.920±16.527   130.670±6.557   1219.010±10.145   0.278±0.005   15.080±0.166
  HET雌性 538.150±8.217 148.750±9.379 1195.080±9.352 0.277±0.003 15.410±0.110
N＝10；
a：平均值(mg/cms)±SEM；
b：平均值(mm)±SEM；
＊：p＜0.05vs.相应的野生型值(学生T检验)
＊＊：P＜0.01vs.相应的野生型值(学生T检验)
表2：在10月龄的雌性小鼠中GDF-9无效突变对骨矿物质密度的影响
参数   WT(sFRP)(均值±SEM)   GDF-9KO(均值±SEM)
  骨矿物质密度(g/cm3)
  总数   481.6±18.1   664.8±44.7a
  小梁   109.0±7.8   322.3±62.9a
  皮质   1229.2±12.1   1337.6±31.4a
N＝8只动物/组；
a.与各自的WT(sFRP)测量显著不同(P＜0.05；学生T检验)；sFRP动物短暂的暴露在高温。
根据本说明书中所引用参考文献的教导，对本说明书进行最彻底的理解。本说明书中的实施方案提供了对本发明实施方案的说明并且不应当被解释为限制本发明的范围。技术人员将容易地认识到在本发明所包含的众多其它实施方案。将本公开中所引用的全部出版物、专利和生物序列完整地引用作为参考。当参考文献所包括的材料有悖于本说明书或与本说明书不一致时，本说明书将优先于任何此类材料。引用本文中的任意参考文献并不承认此类参考文献是本发明的现有技术。
除非另外指出，在所有情况下，将本说明书(包括权利要求书)中所用的表示成分数量、细胞培养、治疗条件等的全部数字理解为由术语“大约”修饰。因此，除非另外相反地指出，数字性参数为近似值并且根据本发明所欲得到的目的特性而变化。除非另外指出，在一系列要素前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每一要素。本领域内技术人员将识别到，或使用不超过常规的实验法能够确定与本文所述的本发明特定实施方案的众多等效物。此类等效物将旨在包含于如下权利要求书中。
序列表
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taaggtgtta tcagctgctt gatatagagc tgataaaatc ttcagctagg catacttgag    120
gcctgattac agaagtgacc gtagtccacc cacacacctg aaatttattt aagagaccaa    180
gctaggctct tcctggcctt taggaagagg actggcatgg agaaatatgt tcctcactag    240
ttctcccaag ccatggcacg tcccaacaaa ttcctccttt ggttttgctg ctttgcctgg    300
ctgtgttttc ctattagcct tggttctcag gcttctgggg gagaagctca gattgctgct    360
agtgctgagt tggaatctgg ggctatgcct tggtccttgc tgcagcatat agatgagaga    420
gacagagctg gcctccttcc cgcgcttttc aaagttctat ctgttgggcg aggtgggtca    480
cctaggctgc agccagactc cagagctttg cactacatga agaagctcta taagacatat    540
gctaccaagg aagggattcc taaatccaat agaagtcacc tctacaacac tgttcggctc    600
ttcaccccct gtacccggca caagcaggct cctggagacc aggtaacagg aatccttcca    660
tcagtggaac tgctatttaa cctggatcgc attactaccg ttgaacactt actcaagtca    720
gtcttgctgt acaatatcaa caactcagtt tctttttcct ctgctgtcaa atgtgtgtgc    780
aatctaatga taaaggagcc aaagtcttct agcaggactc tcggcagagc tccatactca    840
tttaccttta actcacagtt tgaatttgga aagaaacaca aatggattca gattgatgtg    900
accagcctcc ttcaaccttt agtggcctcc aacaagagaa gtattcacat gtctataaat    960
tttacttgca tgaaagacca gctggagcat ccttcagcac agaatggttt gtttaacatg    1020
actctggtgt ccccctcact gatcttatat ttgaatgaca caagtgctca ggcttatcac    1080
agctggtatt cccttcacta taaaaggagg ccttcccagg gtcctgacca ggagagaagt    1140
ctgtctgcct atcctgtggg agaagaggct gctgaggatg ggagatcttc ccatcaccgt    1200
caccgcagag gtcaggaaac tgtcagttct gaattgaaga agcccttggg cccagcttcc    1260
ttcaatctga gtgaatactt cagacaattt cttcttcccc aaaatgagtg tgagctccat    1320
gactttagac ttagctttag tcagctgaag tgggacaact ggattgtggc tccgcacagg    1380
tacaaccctc gatactgtaa aggggactgt ccaagggcag ttggacatcg gtatggctct    1440
ccagttcaca ccatggtaca gaacatcatc tatgagaagc tggactcctc agtgccaaga    1500
ccgtcatgtg tacctgccaa atacagcccc ttgagtgttt tgaccattga gcccgatggc    1560
tcaattgcct ataaagagta cgaagatatg atagctacaa agtgcacctg tcgttaacaa    1620
atggtcctct taaaaccttg agcctatttg gcaaagtaac tactgtgtgc ctatgtgtgc    1680
cttcaagaga aagcttcata tattaagtct ctaaatgtag catatgttat ataaagagga    1740
gcctgtgtag gttagtacct tctatggcat ctatcaggat aaagggataa catcaattgt    1800
tgctacagag ccttttttta tttccaaatt taaatgaaat ataattattg tggagaactt    1860
tacatttttt tccttgagtg attttttttc ttttcatagg agtcttattc ttgataggga    1920
aaaaacctta attagcatca atcctggatg gacttgcagc tataaatagg caattcagat    1980
tgctgtagtc ttaatagaag aataaatttc tgtcaatggc                          2020
<210>2
<211>454
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ala Arg Pro Asn Lys Phe Leu Leu Trp Phe Cys Cys Phe Ala Trp
1               5                   10                  15
Leu Cys Phe Pro Ile Ser Leu Gly Ser Gln Ala Ser Gly Gly Glu Ala
            20                  25                  30
Gln Ile Ala Ala Ser Ala Glu Leu Glu Ser Gly Ala Met Pro Trp Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Gln His Ile Asp Glu Arg Asp Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ala
    50                  55                  60
Leu Phe Lys Val Leu Ser Val Gly Arg Gly Gly Ser Pro Arg Leu Gln
65                  70                  75                  80
Pro Asp Ser Arg Ala Leu His Tyr Met Lys Lys Leu Tyr Lys Thr Tyr
                85                  90                  95
Ala Thr Lys Glu Gly Ile Pro Lys Ser Asn Arg Ser His Leu Tyr Asn
            100                 105                 110
Thr Val Arg Leu Phe Thr Pro Cys Thr Arg His Lys Gln Ala Pro Gly
         115                 120                 125
Asp Gln Val Thr Gly Ile Leu Pro Ser Val Glu Leu Leu Phe Asn Leu
    130                 135                 140
Asp Arg Ile Thr Thr Val Glu His Leu Leu Lys Ser Val Leu Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Asn Ile Asn Asn Ser Val Ser Phe Ser Ser Ala Val Lys Cys Val Cys
                165                 170                 175
Asn Leu Met Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Ser Arg Thr Leu Gly Arg
            180                 185                 190
Ala Pro Tyr Ser Phe Thr Phe Asn Ser Gln Phe Glu Phe Gly Lys Lys
        195                 200                 205
His Lys Trp Ile Gln Ile Asp Val Thr Ser Leu Leu Gln Pro Leu Val
    210                 215                 220
Ala Ser Asn Lys Arg Ser Ile His Met Ser Ile Asn Phe Thr Cys Met
225                 230                 235                 240
Lys Asp Gln Leu Glu His Pro Ser Ala Gln Asn Gly Leu Phe Asn Met
                245                 250                 255
Thr Leu Val Ser Pro Ser Leu Ile Leu Tyr Leu Asn Asp Thr Ser Ala
            260                 265                 270
Gln Ala Tyr His Ser Trp Tyr Ser Leu His Tyr Lys Arg Arg Pro Ser
        275                 280                 285
Gln Gly Pro Asp Gln Glu Arg Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Val Gly Glu
    29                 0295                 300
Glu Ala Ala Glu Asp Gly Arg Ser Ser His His Arg His Arg Arg Gly
305                 310                 315                 320
Gln Glu Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Lys Pro Leu Gly Pro Ala Ser
                325                 330                 335
Phe Asn Leu Ser Glu Tyr Phe Arg Gln Phe Leu Leu Pro Gln Asn Glu
            340                 345                 350
Cys Glu Leu His Asp Phe Arg Leu Ser Phe Ser Gln Leu Lys Trp Asp
        355                 360                 365
Asn Trp Ile Val Ala Pro His Arg Tyr Asn Pro Arg Tyr Cys Lys Gly
    370                 375                 380
Asp Cys Pro Arg Ala Val Gly His Arg Tyr Gly Ser Pro Val His Thr
385                 390                 395                 400
Met Val Gln Asn Ile Ile Tyr Glu Lys Leu Asp Ser Ser Val Pro Arg
                405                 410                 415
Pro Ser Cys Val Pro Ala Lys Tyr Ser Pro Leu Ser Val Leu Thr Ile
            420                 425                 430
Glu Pro Asp Gly Ser Ile Ala Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile Ala
        435                 440                 445
Thr Lys Cys Thr Cys Arg
    450
<210>3
<211>1179
<212>DNA
<213>人
<400>3
atggtcctcc tcagtattct tagaattctt tttctttgtg aactcgtgct tttcatggaa    60
cacagggccc aaatggcaga aggagggcag tcctctattg cccttctggc tgaggcccct    120
actttgcccc tgattgagga gctgctagaa gaatcccctg gcgaacagcc aaggaagccc    180
cggctcctag ggcattcact gcggtacatg ctggagttgt accggcgttc agctgactcg    240
catgggcacc ctagagagaa ccgcaccatt ggggccacca tggtgaggct ggtgaagccc    300
ttgaccagtg tggcaaggcc tcacagaggt acctggcata tacagatcct gggctttcct    360
ctcagaccaa accgaggact ataccaacta gttagagcca ctgtggttta ccgccatcat    420
ctccaactaa ctcgcttcaa tctctcctgc catgtggagc cctgggtgca gaaaaaccca    480
accaaccact tcccttcctc agaaggagat tcctcaaaac cttccctgat gtctaacgct    540
tggaaagaga tggatatcac acaacttgtt cagcaaaggt tctggaataa caagggacac    600
aggatcctac gactccgttt tatgtgtcag cagcaaaaag atagtggtgg tcttgagctc    660
tggcatggca cttcatcctt ggacattgcc ttcttgttac tctatttcaa tgatactcat    720
aaaagcattc ggaaggctaa atttcttccc aggggcatgg aggagttcat ggaaagggaa    780
tctcttctcc ggagaacccg acaagcagat ggtatctcag ctgaggttac tgcctcttcc    840
tcaaaacata gcgggcctga aaataaccag tgttccctcc accctttcca aatcagcttc    900
cgccagctgg gttgggatca ctggatcatt gctccccctt tctacacccc aaactactgt    960
aaaggaactt gtctccgagt actacgcgat ggtctcaatt cccccaatca cgccattatt    1020
cagaacctta tcaatcagtt ggtggaccag agtgtccccc ggccctcctg tgtcccgtat    1080
aagtatgttc caattagtgt ccttatgatt gaggcaaatg ggagtatttt gtacaaggag    1140
tatgagggta tgattgctga gtcttgtaca tgcagatga                           1179
<210>4
<211>392
<212>PRT
<213>人
<400>4
Met Val Leu Leu Ser Ile Leu Arg Ile Leu Phe Leu Cys Glu Leu Val
1               5                   10                  15
Leu Phe Met Glu His Arg Ala Gin Met Ala Glu Gly Gly Gln Ser Ser
            20                  25                  30
Ile Ala Leu Leu Ala Glu Ala Pro Thr Leu Pro Leu Ile Glu Glu Leu
        35                  40                  45
Leu Glu Glu Ser Pro Gly Glu Gln Pro Arg Lys Pro Arg Leu Leu Gly
    50                  55                  60
His Ser Leu Arg Tyr Met Leu Glu Leu Tyr Arg Arg Ser Ala Asp Ser
65                  70                  75                  80
His Gly His Pro Arg Glu Asn Arg Thr Ile Gly Ala Thr Met Val Arg
                85                  90                  95
Leu Val Lys Pro Leu Thr Ser Val Ala Arg Pro His Arg Gly Thr Trp
            100                 105                 110
His Ile Gln Ile Leu Gly Phe Pro Leu Arg Pro Ash Arg Gly Leu Tyr
        115                 120                 125
Gln Leu Val Arg Ala Thr Val Val Tyr Arg His His Leu Gln Leu Thr
    130                 135                 140
Arg Phe Asn Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp Val Gln Lys Asn Pro
145                 150                 155                 160
Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Glu Gly Asp Ser Ser Lys Pro Ser Leu
                165                 170                 175
Met Ser Asn Ala Trp Lys Glu Met Asp Ile Thr Gln Leu Val Gln Gln
            180                 185                 190
Arg Phe Trp Asn Asn Lys Gly His Arg Ile Leu Arg Leu Arg Phe Met
        195                 200                 205
Cys Gln Gln Gln Lys Asp Ser Gly Gly Leu Glu Leu Trp His Gly Thr
    210                 215                 220
Ser Ser Leu Asp Ile Ala Phe Leu Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Thr His
225                 230                 235                 240
Lys Ser Ile Arg Lys Ala Lys Phe Leu Pro Arg Gly Met Glu Glu Phe
                245                 250                 255
Met Glu Arg Glu Ser Leu Leu Arg Arg Thr Arg Gln Ala Asp Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Ala Glu Val Thr Ala Ser Ser Ser Lys His Ser Gly Pro Glu Asn
        275                 280                 285
Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Ile Ser Phe Arg Gln Leu Gly
    290                 295                 300
Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro Pro Phe Tyr Thr Pro Asn Tyr Cys
305                 310                 315                 320
Lys Gly Thr Cys Leu Arg Val Leu Arg Asp Gly Leu Asn Ser Pro Asn
                325                 330                 335
His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Ile Asn Gln Leu Val Asp Gln Ser Val
            340                 345                 350
Pro Arg Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val Pro Ile Ser Val Leu
        355                 360                 365
Met Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met
    370                 375                 380
Ile Ala Glu Ser Cys Thr Cys Arg
385                 390
<210>5
<211>24
<212>PRT
<213>人
<400>5
Ser Gln Leu Lys Trp Asp Asn Trp Ile Val Ala Pro His Arg Tyr Asn
1               5                   10                  15
Pro Arg Tyr Cys Lys Gly Asp Cys
            20

Claims (121)

1、在哺乳动物中治疗或预防骨疾病的方法，所述方法包括在一段时间内向需要的哺乳动物施用一定量的GDF-9或BMP-15的调节剂，所述施用的量和时间足以治疗或预防骨疾病。
2、权利要求1的方法，其中GDF-9或BMP-15的调节剂是GDF-9或BMP-15的抑制剂，骨疾病是骨退行性疾病。
3、权利要求2的方法，其中抑制剂是GDF-9抑制剂。
4、权利要求2的方法，其中抑制剂是BMP-15抑制剂。
5、权利要求2的方法，其中骨疾病选自骨质减少、骨软化、骨质疏松、骨髓癌、骨营养不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障碍、骨髓癌高钙血症、多发性骨髓癌和转移后的骨薄化。
6、权利要求5的方法，其中疾病是骨质疏松。
7、权利要求6的方法，其中骨质疏松是闭经后的、类固醇诱导的、老年性的或甲状腺素使用诱导的。
8、权利要求1的方法，其中哺乳动物中的骨疾病与以下一种或多种情况相关：高血钙、慢性肾病、肾透析、原发性或继发性甲状旁腺机能亢进、炎症性肠病、克罗恩氏病，和长期使用皮质类固醇、GnRH激动剂或拮抗剂。
9、在哺乳动物中减慢骨破坏、维持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的方法，所述方法包括在一段时间内向需要的哺乳动物施用治疗有效量的GDF-9或BMP-15的调节剂，所述施用的量和时间足以减慢骨破坏、重建缺失的骨，或刺激新骨形成。
10、权利要求9的方法，其中调节剂是GDF-9抑制剂。
11、权利要求9的方法，其中调节剂是BMP-15抑制剂。
12、权利要求9的方法，其中骨破坏的特征是骨量的减少。
13、权利要求12的方法，其中骨量的减少是通过测量骨矿物质密度确定的。
14、权利要求9的方法，其中骨破坏的特征是骨质量的恶化。
15、权利要求14的方法，其中骨质量的恶化是通过评估骨的显微结构的完整性来确定的。
16、权利要求1或9的方法，其中哺乳动物是人类。
17、权利要求1或9的方法，其中调节剂选自化合物、抗体、蛋白质、肽、DNA、RNA和RNA干扰物质。
18、权利要求17的方法，其中调节剂是抗体。
19、权利要求18的方法，其中抗体选自抗GDF-9抗体、抗GDF-9受体抗体、抗BMP-15抗体，和抗BMP-15受体抗体。
20、权利要求18的方法，其中抗体是人抗体或其人源化衍生物。
21、权利要求18的方法，其中抗体是单克隆抗体。
22、权利要求18的方法，其中抗体特异性的结合成熟的GDF-9蛋白。
23、权利要求18的方法，其中抗体特异性的结合成熟的BMP-15蛋白。
24、权利要求17的方法，其中调节剂特异性的结合成熟的GDF-9蛋白或成熟的BMP-15蛋白。
25、权利要求17的方法，其中调节剂抑制GDF-9多肽与其受体之间相互作用介导的信号发放，或者调节剂抑制BMP-15多肽与其受体之间的相互作用介导的信号发放。
26、权利要求17的方法，其中调节剂选自可溶性GDF-9受体、结合GDF-9受体的蛋白质、可溶性BMP-15受体，和结合BMP-15受体的蛋白质。
27、权利要求17的方法，其中RNA干扰物质是双链的、短干扰RNA(siRNA)。
28、权利要求27的方法，其中siRNA通过转录沉默抑制GDF-9或BMP-15。
29、权利要求1或9的方法，其中调节剂是全身给药。
30、权利要求1或9的方法，其中调节剂以选自以下范围的有效剂量施用：1μg/kg和20mg/kg、1μg/kg和10mg/kg、1μg/kg和1mg/kg、10μg/kg和1mg/kg、10μg/kg和100μg/kg、100μg/kg和1mg/kg，和500μg/kg和1mg/kg。
31、权利要求1或9的方法，其中调节剂在至少两周的时间段内重复施用。
32、增加骨皮质密度的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的权利要求17的调节剂，从而增加骨皮质密度。
33、增加骨小梁密度的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的权利要求17的调节剂，从而增加骨小梁密度。
34、权利要求1或9的方法，所述方法还包括向哺乳动物施用一种或多种骨疾病治疗物质，所述治疗物质选自二膦酸盐、降钙素、雌激素、选择性雌激素受体调节剂、甲状旁腺激素、维生素及其组合。
35、权利要求34的方法，其中骨疾病治疗物质是选择性雌激素受体调节剂。
36、权利要求34的方法，其中骨疾病治疗物质是二膦酸盐。
37、权利要求1或9的方法，所述方法还包括向哺乳动物施用一种或多种成骨蛋白。
38、权利要求37的方法，其中成骨蛋白选自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10、BMP-12、BMP-13和MP52。
39、权利要求37的方法，其中成骨蛋白是BMP-3的抑制剂。
40、在哺乳动物中降低生育力，以及治疗或预防骨疾病的方法，所述方法包括在一段时间内向需要的哺乳动物施用一定量的GDF-9或BMP-15的抑制剂，所述施用的量和时间足以降低生育力，以及治疗或预防骨疾病。
41、权利要求40的方法，其中抑制剂是GDF-9抑制剂。
42、权利要求40的方法，其中抑制剂是BMP-15抑制剂。
43、权利要求40的方法，其中骨疾病选自骨质减少、骨软化、骨质疏松、骨髓癌、骨营养不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障碍、骨髓癌高钙血症、多发性骨髓癌和转移后的骨薄化。
44、权利要求43的方法，其中疾病是骨质疏松。
45、权利要求40的方法，其中哺乳动物中的骨疾病与以下一种或多种情况相关：高血钙、慢性肾病、肾透析、原发性或继发性甲状旁腺机能亢进，和长期使用皮质类固醇。
46、在哺乳动物中降低生育力，以及减慢骨破坏、维持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的方法，所述方法包括在一段时间内向向需要的哺乳动物施用治疗有效量的GDF-9或BMP-15的抑制剂，所述施用的量和时间足以降低生育力，以及减慢骨破坏、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的时间。
47、权利要求46的方法，其中抑制剂是GDF-9抑制剂。
48、权利要求46的方法，其中抑制剂是BMP-15抑制剂。
49、权利要求46的方法，其中骨破坏的特征是骨量的减少。
50、权利要求49的方法，其中骨量的减少是通过测量骨矿物质密度确定的。
51、权利要求46的方法，其中骨破坏的特征是骨质量的恶化。
52、权利要求51的方法，其中骨质量的恶化是通过评估骨的显微结构的完整性来确定的。
53、权利要求40或46的方法，其中哺乳动物是人类。
54、筛选和/或诊断对象中改变的骨密度的方法，其包括：a)确定来自对象的测试样品中的GDF-9或BMP-15的水平；和b)比较测试样品中的GDF-9或BMP-15的水平与对照样品中的GDF-9或BMP-15的水平，其中与对照样品相比，测试样品中的改变的GDF-9或BMP-15的水平提示对象中改变的骨密度，和/或发展出改变的骨密度的倾向。
55、权利要求54的方法，其中GDF-9或BMP-15的水平相对于对照样品是升高的，对象具有降低的骨密度或增加的发展出降低的骨密度的风险。
56、权利要求54的方法，其中GDF-9或BMP-15的水平相对于对照样品是降低的，并且对象具有增加的骨密度或增加的发展出增加的骨密度的可能性。
57、权利要求54的方法，其中使用捕获试剂确定GDF-9或BMP-15的水平。
58、权利要求57的方法，其中捕获试剂是抗体。
59、权利要求58的方法，其中抗体包含可检测的标记。
60、权利要求54的方法，其中可检测的标记选自放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物和化学发光化合物。
61、诊断试剂盒，其包括特异针对GDF-9多肽或BMP-15多肽的捕获试剂、试剂和使用说明书。
62、筛选对象中改变的骨密度的方法，所述方法包括确定在来自对象的测试样品中编码GDF-9或BMP-15的多核苷酸中至少一种核酸变化的存在或缺失，其中至少一种核酸变化的存在提示对象中改变的骨密度，和/或发展出改变的骨密度的倾向。
63、权利要求62的方法，其中通过将样品与寡核苷酸探针接触，检测至少一种核酸变化的存在或缺失，所述寡核苷酸探针与编码GDF-9或BMP-15的多核苷酸特异性杂交。
64、权利要求63的方法，其中寡核苷酸探针包含编码GDF-9或BMP-15的多核苷酸的至少约15个核苷酸的部分，所述多核苷酸选自SEQID NO：1，和SEQ ID NO：3所示的多核苷酸。
65、权利要求62的方法，其中多核苷酸选自DNA、基因组DNA、cDNA、RNA和mRNA。
66、权利要求62的方法，其中多核苷酸编码GDF-9或BMP-15变体。
67、权利要求62的方法，其中多核苷酸编码突变的GDF-9或BMP-15。
68、权利要求67的方法，其中突变的GDF-9或BMP-15是截短的GDF-9或BMP-15。
69、GDF-9或BMP-15的调节剂在产生用于治疗或预防所需哺乳动物中的骨疾病的药物中的用途。
70、权利要求1的用途，其中GDF-9或BMP-15的调节剂是GDF-9或BMP-15的抑制剂，骨疾病是骨退行性疾病。
71、权利要求70的用途，其中抑制剂是GDF-9抑制剂。
72、权利要求70的用途，其中抑制剂是BMP-15抑制剂。
73、权利要求70的用途，其中骨疾病选自骨质减少、骨软化、骨质疏松、骨髓癌、骨营养不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障碍、骨髓癌高钙血症、多发性骨髓癌和转移后的骨薄化。
74、权利要求73的用途，其中疾病是骨质疏松。
75、权利要求74的用途，其中骨质疏松是闭经后的、类固醇诱导的、老年性的或甲状腺素使用诱导的。
76、权利要求70的用途，其中哺乳动物中的骨疾病与以下一种或多种情况相关：高血钙、慢性肾病、肾透析、原发性或继发性甲状旁腺机能亢进、炎症性肠病、克罗恩氏病，和长期使用皮质类固醇、GnRH激动剂或拮抗剂。
77、GDF-9或BMP-15的调节剂在制备用于在所需哺乳动物中减慢骨破坏、维持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的药物中的用途。
78、权利要求77的用途，其中抑制剂是GDF-9抑制剂。
79、权利要求77的用途，其中抑制剂是BMP-15抑制剂。
80、权利要求77的用途，其中骨破坏的特征是骨量的减少。
81、权利要求80的用途，其中骨量的减少是通过测量骨矿物质密度确定的。
82、权利要求77的用途，其中骨破坏的特征是骨质的退化。
83、权利要求82的用途，其中骨质量的恶化是通过评估骨的显微结构的完整性来确定的。
84、权利要求70或77的用途，其中哺乳动物是人类。
85、权利要求70或77的用途，其中调节剂选自化合物、抗体、蛋白质、肽、DNA、RNA，和RNA干扰物质。
86、权利要求85的用途，其中调节剂是抗体。
87、权利要求86的用途，其中抗体选自抗GDF-9抗体、抗GDF-9受体的抗体、抗BMP-15抗体，和抗BMP-15受体的抗体
88、权利要求86的用途，其中抗体是人抗体或其人源化衍生物。
89、权利要求86的用途，其中抗体是单克隆抗体。
90、权利要求86的用途，其中抗体特异性的结合成熟的GDF-9蛋白。
91、权利要求86的用途，其中抗体特异性的结合成熟的BMP-15蛋白。
92、权利要求85的用途，其中调节剂特异性的结合成熟的GDF-9蛋白或成熟的BMP-15蛋白。
93、权利要求85的用途，其中调节剂抑制GDF-9多肽与其受体之间的相互作用介导的信号发放，或者调节剂抑制BMP-15多肽与其受体之间的相互作用介导的信号发放。
94、权利要求85的用途，其中调节剂选自可溶性GDF-9受体、结合GDF-9受体的蛋白质、可溶性BMP-15受体，和结合BMP-15受体的蛋白质。
95、权利要求85的用途，其中RNA干扰物质是双链的、短干扰RNA(siRNA)。
96、权利要求95的用途，其中siRNA通过转录沉默抑制GDF-9或BMP-15。
97、权利要求70或77的用途，其中调节剂全身给药。
98、权利要求70或77的用途，其中调节剂以选自以下范围的有效剂量给药：1μg/kg和20mg/kg、1μg/kg和10mg/kg、1μg/kg和1mg/kg、10μg/kg和1mg/kg、10μg/kg和100μg/kg、100μg/kg和1mg/kg，和500μg/kg和1mg/kg。
99、权利要求70或77的用途，其中调节剂在至少两周的时间段内重复施用。
100、GDF-9或BMP-15的调节剂在制备用于在所需哺乳动物中增加骨皮质密度的药物中的用途，其中调节剂选自化合物、抗体、蛋白质、肽、DNA、RNA，和RNA干扰物质。
101、GDF-9或BMP-15的调节剂在制备用于在所需哺乳动物中增加骨小梁密度的药物中的用途，其中调节剂选自化合物、抗体、蛋白质、肽、DNA、RNA，和RNA干扰物质。
102、权利要求70或77的用途，其中组合物还包含一种或多种骨疾病治疗物质，所述治疗物质选自二膦酸盐、降钙素、雌激素、选择性雌激素受体调节剂、甲状旁腺激素、维生素及其组合。
103、权利要求102的用途，其中骨疾病治疗物质是选择性雌激素受体调节剂。
104、权利要求34的用途，其中骨疾病治疗物质是二膦酸盐。
105、权利要求70或77的用途，其中组合物还包含一种或多种成骨蛋白。
106、权利要求105的用途，其中成骨蛋白选自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10、BMP-12、BMP-13和MP52。
107、权利要求105的用途，其中成骨蛋白是BMP-3的抑制剂。
108、GDF-9或BMP-15的调节剂在制备用于在所需哺乳动物中降低生育力，以及治疗或预防骨疾病的药物中的用途。
109、权利要求108的用途，其中抑制剂是GDF-9抑制剂。
110、权利要求108的用途，其中抑制剂是BMP-15抑制剂。
111、权利要求108的用途，其中骨疾病选自骨质减少、骨软化、骨质疏松、骨髓癌、骨营养不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障碍、骨髓癌高钙血症、多发性骨髓癌和转移后的骨薄化。
112、权利要求111的用途，其中疾病是骨质疏松。
113、权利要求108的用途，其中哺乳动物中的骨疾病与以下一种或多种情况相关：高血钙、慢性肾病、肾透析、原发性或继发性甲状旁腺机能亢进，和长期使用皮质类固醇。
114、GDF-9或BMP-15的调节剂在制备用于在所需哺乳动物中降低生育力和减慢骨破坏、维持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的药物中的用途。
115、权利要求114的用途，其中抑制剂是GDF-9抑制剂。
116、权利要求114的用途，其中抑制剂是BMP-15抑制剂。
117、权利要求114的用途，其中骨破坏的特征是骨量的减少。
118、权利要求117的用途，其中骨量的减少是通过测量骨矿物质密度确定的。
119、权利要求114的用途，其中骨破坏的特征是骨质量的恶化。
120、权利要求119的用途，其中骨质量的恶化是通过评估骨的显微结构的完整性来确定的。
121、权利要求108或114的用途，其中哺乳动物是人类。
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