BRPI0709267A2 - moduladores de gdf-9/bmp-15 para o tratamento de distúrbios ósseos - Google Patents

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BRPI0709267A2
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Emily Sheng-Ming Shen
Frederick J Bex Iii
Yogendra P Kharode
Varghesse M Chennathukuzhi
Murty V Chengalvala
Panayiotis E Stevis
Gregory S Kopf
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Wyeth Corp
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Abstract

MODULADORES DE GDF-9/BMP-15 PARA O TRATAMENTO DE DISTúRBIOS óSSEOS. A presente invenção refere-se a processos para o tratamento ou para a prevenção de distúrbios degenerativos dos ossos. Os distúrbios tratados ou prevenidos incluem, por exemplo, osteopenia, osteomalácia, osteoporose, osteomieloma, osteodistrofia, doença de Paget, osteogênese imperfeita e distúrbios degenerativos dos ossos associados com doença renal crónica, hiperparatireoidismo e uso em longo prazo de corticosteróides. Os processos terapêuticos divulgados incluem a administração a um mamífero de um inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 em uma quantidade eficiente para: (1) tratar ou prevenir um distúrbio degenerativo dos ossos; (2) retardar a deterioração óssea; (3) restaurar o osso perdido; (4) estimular a formação de osso novo; e/ou (5) manter a massa óssea e/ou a qualidade óssea. A invenção fornece ainda processos para a administração de um agonista de GDF-9 ou de um agonista de BMP-15 para tratar um distúrbio ósseo caracterizado pela maior densidade ou massa óssea.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"MODULADORES DE GDF-9/BMP-15 PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS ÓSSEOS".
PEDIDOS DE PATENTES ANTERIORES
Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Pa-tente U.S. Provisório N2 60/787.246, depositado em 28 de março de 2006,cuja divulgação é incorporada aqui como referência.
CAMPO TÉCNICO
O campo técnico da invenção refere-se aos usos terapêuticosde moduladores de GDF-9 e de BMP-15 no tratamento de distúrbios ósseostais como osteoporose, osteopenia, osteomalácia, osteodistrofia e fraturaóssea.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
Os membros da superfamília de fator beta de crescimento detransformação (TGF-β) possuem propriedades reguladoras do crescimento emorfogenéticas fisiologicamente importantes (Kingsley e outros, Genes Dev.8:133-146 (1994); Hoodless e outros, Curr. Topics Microbiol. Immunol.228:235-272 (1998)). Atenção considerável foi centralizada nos últimos anosna função de dois membros da superfamília de TGF-β na função ovariana ena fertilidade: o fator-9 de crescimento e diferenciação (GDF-9) e a proteína-15 morfogenética óssea (BMP-15, também conhecida como GDF-9b; Mc-Natty e outros, Reprod. 128:379-386 (2004); Juengel e outros, Hum Reprod.Upd. 11:144-161 (2005)).
O GDF-9 foi descrito primeiro em 1993 como um novo membroda superfamília de TGF-β que é especificamente expresso no ovário (Mc-Pherron e outros, J. Bioi Chem. 268:3444-3449 (1993)). Como outros mem-bros da família de TGF-β, o GDF-9 é codificado como um pré-pró-peptídeoque consiste de um peptídeo sinal, uma pró-região e uma região maduraC-terminal que é clivada partindo do peptídeo precursor por uma proteaseintracelular que pertence a um grupo de proteases similares à furina. O mR-NA do GDF-9 está presente em oócitos em todos os estágios de desenvol-vimento folucular e é expresso partindo do estágio de folículo primário atédepois da ovulação (McPherron e Lee, J. Biol. Chem. 268: 3444-3449(1993); McGrath e outros, Mol. Endocrinoi 9:131-136 (1995); Elvine outros,Mol. EndocrinoL 13:1035-1048 (1999)). Fêmeas de camundongos que nãopossuem GDF-9 não são férteis por causa da interrupção dos oócitos emdesenvolvimento no estágio de folículo primário (Dong e outros, Nature383:531-535 (1996); Carabatsos e outros, Dev. Biol. 204: 373-384 (1998)).
A BMP-15, também conhecida como GDF-9b, foi descobertacomo um gene ligado ao X que codifica um homólogo de GDF-9, comparti-lhando 52% de identidade de aminoácidos com o GDF-9 nas regiões madu-ras (Dube e outros, Mol. Endocrinol. 12:1809-1817 (1998); Laitinen e outros,Mech. Dev. 78:135-140 (1998)). Embora a expressão de BMP-15 seja idênti-ca à do GDF-9, não pode compensar a ausência de GDF-9 em um camun-dongo com nocaute de GDF-9. As fêmeas de camundongos que não possu-em BMP-15 são subférteis, demonstrando tamanhos de ninhadas reduzidose de ninhadas por mês (Yan e outros, Mol. Endocrinol. 15: 854-866 (2001)).
Em ovelhas, tanto GDF-9 quanto BMP-15 são essenciais para a fertilidade(Juengel e outros, Bio. Reprod. 67: 1777-1789 (2002)). As mutações deBMP-15 que ocorrem naturalmente em ovelhas causam infertilidade em fê-meas homozigotas. A BMP-15 também desempenha uma função crítica nafertilidade de fêmeas humanas, uma vez que uma mutação na BMP-15 foiassociada com a disgênese ovariana em mulheres (Di Pasquale e outros,Am. J. Hum. Genet. 75:106-111 (2004)).
O GDF-9 e a BMP-15 são únicos entre os membros da famíliade TGF-β descritos até agora no fato de que não possuem o quarto dos seteresíduos de cisteína conservados característicos na região madura (Dube eoutros, Mol. Endocrinol. 12:1809-1817 (1998); Laitinen e outros, Mech. Dev.78:135-140 (1998)). A quarta cisteína tem importância particular porque éresponsável pela formação da ponte dissulfeto entre as subunidades do dí-mero maduro de maior parte dos membros da família de TGF-β. Embora oGDF-9 e a BMP-15 não possuam esta cisteína e não formem dímeros liga-dos covalentemente, estudos descobriram que tanto o GDF-9 quanto aBMP-15 podem formar homodímeros assim como heterodímeros in vitro (Li-ao e outros, J. Biol. Chem. 278:3713-3719 (2003); Liao e outros, J. Biol.Chem. 279:17391-17396 (2004)).
A expressão tanto do GDF-9 quanto da BMP-15 é restrita prima-riamente aos oócitos de folículos em crescimento em mamíferos. De formacoerente com este padrão de expressão, nenhum efeito fora do ovário foiobservado em animais carregando mutações nestes genes, incluindo ove-lhas e camundongos, nem em ovelhas imunizadas com peptídeos de GDF-9ou de BMP-15 (Galloway e outros, Nat. Genet. 25:279-283 (2000); Hanrahane outros, Biol. Reprod. 121:843-852 (2004); Dong e outros, Nature 383:531-535 (1996); Yan e outros, Mol. Endocrinal. 15:854-866 (2001); Juengel e ou-tros, Biol. Reprod. 70:557-561 (2004); e Elvin e outros, Mol. Endocrinoi.13:1018-1034 (1999)). Assim, estes fatores foram considerados alvos atra-entes para manipular a fertilidade com um baixo risco de efeitos colateraissem ser nos ovários, incluindo a finalidade de desenvolver novos tratamen-tos clínicos para a infertilidade em fêmeas, para o desenvolvimento de novoscontraceptivos não esteroidais para mulheres e para a modulação da fertili-dade em unidades agrícolas (ver, por exemplo, a Patente U.S. N26.030.617).
Embora localizada primariamente no ovário, a expressão deGDF-9 e BMP-15 foi observada em tecidos sem ser de ovário, incluindo napituitária e nos testículos (Fitzpatrick e outros, Endocrinoi. 139:2571-2578(1998); Aaltonen e outros, J. Clin. Endocrinoi. Metab. 84:2744-2750 (1999);Eckery e outros, Mol. CeH Endocrinoi. 192:115-126 (2002); Otsuka e Shima-saki, Endocrinoi. 143:4938-4941 (2002)). Entretanto, devido ao fato de que aexpressão destas proteínas é enormemente limitada ao ovário, funções eusos não reprodutivos para GDF-9 e BMP-15 não receberam muita atenção.
Um número de estados de saúde está associado com uma per-da óssea, particularmente nas mulheres idosas e/ou pós-menopausa. Porexemplo, a osteoporose é uma doença debilitante caracterizada por um de-créscimo na massa óssea esquelética e na densidade de minerais, pela de-terioração estrutural do osso e aumentos correspondentes na fragilidade ós-sea e na susceptibilidade a fraturas. A osteoporose em seres humanos éprecedida por osteopenia clínica, um estado de saúde observado em apro-ximadamente 25 milhões de pessoas nos Estados Unidos da América.
Ao longo de toda a vida adulta, o osso sofre continuamente umacirculação através dos processos acoplados de formação e reabsorção ós-sea. A reabsorção óssea é mediada por células de reabsorção óssea, osteo-clastos, que são formadas por células fagocíticas mononucleares. O ossonovo que substitui o osso perdido é depositado pelas células formadoras deosso, osteoblastos, que são formadas por células do estroma mesenquimal.
Vários outros tipos de células que participam do processo de remodelagemsão fortemente controlados por fatores sistêmicos (por exemplo, hormônios,linfocinas, fatores de crescimento e vitaminas) e fatores locais (por exemplo,citocinas, moléculas de adesão, linfocinas e fatores de crescimento). A coor-denação espaço temporal apropriada do processo de remodelagem óssea éessencial para a manutenção da massa e da integridade óssea. Um númerode distúrbios degenerativos dos ossos está ligado a um desequilíbrio no ciclode remodelagem óssea que resulta na perda anormal de massa óssea (os-teopenia) incluindo doenças ósseas metabólicas, tais como osteoporose,osteoplasia (osteomalácia), osteodistrofia e doença de Paget.
Há atualmente dois tipos principais de terapia farmacêutica dis-ponível para o tratamento de osteoporose. A primeira abordagem e a maiscomum é o uso de terapia hormonal para reduzir a reabsorção do tecido ós-seo. A terapia de reposição de estrogênio ("ERT") é conhecida por prevenira deterioração adicional e reduz assim a probabilidade de fraturas. Entretan-to, o uso de estrogênio como um tratamento é limitado, uma vez que se a-credita que a terapia com estrogênio em longo prazo pode estar associadacom o risco de câncer uterino, câncer endometrial, câncer de mama, san-gramento vaginal freqüente e trombose. Devido a estes efeitos colateraisgraves, muitas mulheres escolhem evitar este tratamento. Ainda, poucoshomens concordam com este tipo de terapia. A segunda abordagem tera-pêutica principal para a osteoporose é o uso de bisfosfonatos, particularmen-te alendronato, risedronato e ibandronato. Embora estes testes tenham mos-trado que estes compostos aumentam coerentemente a densidade mineraldos ossos em pacientes com osteoporose, há ainda problemas significativoscom o tratamento da osteoporose pelos bisfosfonatos, incluindo irritação doesôfago e do trato gastrointestinal superior.
Portanto, existe uma necessidade de desenvolver novos méto-dos terapêuticos para o tratamento e para a prevenção de distúrbios ósseos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
O GDF-9 afeta a densidade óssea, incluindo a densidade mine-ral óssea tanto cortical quanto trabecular. Conseqüentemente, a invençãofornece métodos para a modulação do GDF-9 para tratar ou para prevenirdistúrbios ósseos através da administração de um modulador de GDF-9. Ainvenção fornece ainda métodos para o tratamento ou para a prevenção dedistúrbios ósseos através da administração de um modulador de BMP-15. Ainvenção fornece ainda usos de uma composição que compreende umaquantidade terapeuticamente eficiente de um modulador de GDF-9 ou deBMP-15 para a produção de um medicamento para o tratamento ou para aprevenção de um distúrbio ósseo em um mamífero.
Em uma modalidade, um inibidor de GDF-9 é administrado paratratar ou para prevenir distúrbios degenerativos dos ossos. Em uma modali-dade alternativa, um inibidor de BMP-15 é administrado para tratar ou paraprevenir distúrbios degenerativos dos ossos. Em algumas modalidades, ummodulador de GDF-9 ou de BMP-15 é utilizado para a produção de um me-dicamento para o tratamento ou para a prevenção de distúrbios degenerati-vos dos ossos. Os distúrbios tratados ou prevenidos podem incluir, por e-xemplo, osteopenia, osteomalácia, osteoporose, osteomieloma, osteodistro-fia, doença de Paget, osteogênese imperfeita, esclerose óssea, distúrbioósseo aplásico, mieloma hipercalcêmico humoral, mieloma múltiplo e afina-mento ósseo após a metástase. Os distúrbios tratados ou prevenidos podemincluir ainda distúrbios degenerativos dos ossos associados com hipercal-cemia, doença renal crônica (incluindo doença renal em estágio terminal),diálise renal, hiperparatiroidismo primário ou secundário, doença intestinalinflamatória, doença de Crohn e uso em longo prazo de corticosteróides ouagonistas ou antagonistas de GnRH.Os métodos da invenção incluem a administração a um mamífe-ro de um inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 em uma quantidade eficiente para:
tratar ou prevenir um distúrbio degenerativo dos ossos;
retardar a deterioração óssea;
restaurar o osso perdido;
estimular a formação de osso novo; e/ou;
manter o osso (massa óssea e/ou qualidade óssea).
A invenção fornece ainda usos de composições que compreen-dem um inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 para a produção de um medica-mento eficiente para:
tratar ou prevenir um distúrbio degenerativo dos ossos;
retardar a deterioração óssea;
restaurar o osso perdido;
estimular a formação de osso novo; e/ou;
manter o osso (massa óssea e/ou qualidade óssea).
Em algumas modalidades, o modulador é um inibidor de GDF-9ou de BMP-15, que inclui, por exemplo, um anticorpo anti-GDF-9, um anti-corpo anti-BMP-15, um anticorpo anti-receptor de GDF-9, um anticorpo anti-receptor de BMP-15, um receptor solúvel de GDF-9, um receptor solúvel deBMP-15, um polipeptídeo de GDF-9 negativo dominante ou um peptídeo deBMP-15 negativo dominante. Em certas modalidades, o inibidor diminui aexpressão de GDF-9 ou BMP-15, incluindo, por exemplo, um siRNA.
A invenção fornece ainda ensaios para avaliar a eficiência deum inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 para o tratamento de um distúrbio de-generativo dos ossos. Os métodos de administração, as composições e osdispositivos utilizados nos métodos da invenção também são fornecidos.
A invenção fornece ainda métodos para diminuir a densidadeóssea através da administração de um agonista de GDF-9 ou de BMP-15 eusos de agonistas de GDF-9 ou de BMP-15 para a produção de um medi-camento para diminuir a densidade óssea. Os distúrbios que podem ser tra-tados incluem, por exemplo, displasias ósseas esclerosantes, displasias ós-seas esqueléticas, tal como osteopetrose ou osteosclerose e hiperostoseendosteal; doença de Camurati-Engelmann (associada com a sinalizaçãoaumentada de TGF-β); doença de Van Buchen e esclerosteose (resultandona sinalização aumentada de BMP); osteosclerose dominante autossômica;osteopetrose dominante autossômica do tipo I; e doença de Worth. Conse-qüentemente, os métodos e os usos da invenção incluem a administração aum mamífero de um agonista de GDF-9 ou de BMP-15 em uma quantidadeeficiente para tratar ou para prevenir um distúrbio de displasia óssea.
Os objetivos e as vantagens adicionais da invenção serão apre-sentados em parte na descrição a seguir e em parte serão óbvios partindoda descrição ou podem ser aprendidos através da prática da invenção. Osobjetivos e as vantagens da invenção serão imaginados e atingidos atravésdos elementos e das combinações particularmente indicados nas reivindica-ções em anexo.
Deve ser entendido que tanto a descrição geral anterior quantoa descrição detalhada a seguir são apenas exemplos e explicações e nãorestringem a invenção, como reivindicado.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
A SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de nucleotídeos do geneGDF-9 humano (ver também o N- de Acesso do Genbank NM_005260).
A SEQ ID NO: 2 é uma seqüência de aminoácidos do GDF-9humano (ver também o Ns de Acesso do Genbank NP_005251.1).
A SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de nucleotídeos do geneBMP-15 humano (ver também o Ns de Acesso do Genbank NM_005448).
A SEQ ID NO: 4 é uma seqüência de aminoácidos da BMP-15humana (ver também o No de Acesso do Genbank NP_005439).
A SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de aminoácidos de um peptí-deo GDF-9.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção fornece métodos de administração de ummodulador de GDF-9 ou de BMP-15 a mamíferos para tratar ou para preve-nir distúrbios ósseos.Os métodos da invenção podem ser utilizados para tratar ou pa-ra prevenir um distúrbio ósseo em quaisquer mamíferos que necessitam detal tratamento, incluindo especificamente seres humanos, primatas, maca-cos, roedores, ovelhas, coelhos, cães, porquinhos da índia, cavalos, vacas egatos.
Em certas modalidades, um inibidor de GDF-9 ou um inibidor deBMP-15 é administrado para tratar ou para prevenir um distúrbio degenerati-vo dos ossos. Os distúrbios tratados ou prevenidos através da administraçãode um inibidor de GDF-9 ou de um inibidor de BMP-15 incluem, por exemplo,osteopenia, osteomalácia, osteoporose (por exemplo, pós-menopausa, indu-zida por esteróides, senil ou induzida pelo uso de tiroxina), osteomieloma,osteodistrofia, doença de Paget, osteogênese imperfeita, mieloma hipercal-cêmico humoral, mieloma múltiplo e afinamento ósseo após a metástase. Osdistúrbios tratados ou prevenidos incluem ainda distúrbios degenerativos dosossos associados com hipercalcemia, doença renal crônica, hiperparatiroi-dismo primário ou secundário, doença intestinal inflamatória, doença deCrohn, uso em longo prazo de corticosteróides ou agonistas ou antagonistasde GnRH e deficiências nutricionais.
Em outras modalidades, um agonista de GDF-9 ou um agonistade BMP-15 é administrado para tratar ou para prevenir um distúrbio ósseoincluindo, por exemplo, um distúrbio caracterizado pelo crescimento ósseoexcessivo ou pelo supercrescimento esquelético, tal como displasias ósseasesclerosantes. Este distúrbio, denominado "esclerosteose" é um distúrbioprogressivo caracterizado pelo supercrescimento esquelético geral, gigan-tismo, contenção de nervos cranianos, maior pressão intracraniana causadapela ampliação do calvário do crânio e maior espessura e densidade de os-sos tanto trabeculares quanto corticais. Os distúrbios caracterizados pelocrescimento ósseo excessivo ou pelo supercrescimento esquelético incluem,mas não estão limitados a displasias ósseas esclerosantes, displasias ós-seas esqueléticas, tais como osteosclerose, osteopetrose e hiperostose en-dosteal; doença de Camurati-Engelmann; doença de Van Buchen e escle-rosteose; osteosclerose dominante autossômica; osteopetrose dominanteautossômica do tipo I; e doença de Worth. Ver Wesenbeck e outros, Am. J.Human Genet. 72: 763-771 (2003) e referências citadas no mesmo.
Em uma modalidade, a invenção fornece métodos para tratar oupara prevenir um distúrbio degenerativo dos ossos em uma mulher pós-menopausa. Uma modalidade da invenção fornece métodos para tratar oupara prevenir um distúrbio degenerativo dos ossos em um indivíduo com os-teoporose induzida por esteróides. A invenção fornece ainda métodos paratratar ou para prevenir osteoporose senil em um indivíduo. Uma outra moda-lidade da invenção fornece métodos para tratar ou para prevenir osteoporo-se induzida pelo uso de tiroxina ou pelo uso de glucocorticóide em um indivíduo.
A presente invenção fornece métodos para diminuir a fertilidadee retardar simultaneamente a deterioração óssea, manter o osso, restaurar oosso perdido ομ estimular a formação de osso novo em um mamífero. Emuma outra modalidade, a invenção fornece métodos para diminuir a fertilida-de e para tratar ou para prevenir simultaneamente um distúrbio degenerativodos ossos em uma mulher.
A invenção fornece ainda métodos para tratar ou para prevenirum distúrbio degenerativo dos ossos em um homem.
Os métodos divulgados incluem a administração a um mamíferode um inibidor de GDF-9 ou de um inibidor de BMP-15 em uma quantidadeeficiente para:
tratar ou prevenir um distúrbio degenerativo dos ossos;retardar a deterioração óssea;
restaurar o osso perdido;
estimular a formação de osso novo; e/oumanter o osso (massa óssea e/ou qualidade óssea).
Os métodos da invenção podem ser utilizados para tratar micro-defeitos nos ossos trabeculares e corticais. A qualidade óssea pode ser de-terminada, por exemplo, através da avaliação da integridade microestruturaldo osso.
Geralmente, um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 é adminis-trado repetidamente durante um período de pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 20ou 40 semanas ou durante pelo menos 1, 1,5 ou 2 anos ou até a vida todado indivíduo. Em certas modalidades, uma única dose em bolo pode ser ad-ministrada, por exemplo, através da administração de uma composição inje-tável ou que pode ser implantada, como é descrito em detalhes abaixo.
Geralmente, os moduladores de GDF-9 e de BMP-15 úteis nosmétodos da invenção, incluindo inibidores de GDF-9 ou inibidores de BMP-15, podem ser administrados em uma dose entre 10-8 e 10-7; 10-7 e 10-6;10-6 e 10-5; ou 10-5 e 10-4 g/kg. As dosagens terapeuticamente eficientesatingidas em um modelo animal podem ser convertidas para uso em um ou-tro animal, incluindo seres humanos, utilizando fatores de conversão conhe-cidos na arte (ver, por exemplo, Freireich e outros (1966) Câncer Chemo-ther. Reports, 50(4):219-244).
A dosagem exata de um modulador utilizado em um método dainvenção é determinada empiricamente com base no(s) resultado(s) deseja-do(s). Os exemplos de resultados incluem: (a) o distúrbio degenerativo dosossos é tratado ou prevenido, (b) a deterioração óssea é retardada; (c) oosso perdido é restaurado; (d) o crescimento de novo osso é realizado; e/ou(e) a massa óssea e/ou a qualidade óssea é mantida. Por exemplo, um mo-dulador é administrado em uma quantidade eficiente para retardar a deterio-ração óssea (por exemplo, perda de massa óssea e/ou de densidade mine-ral óssea) em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 ou 500%.
Em uma modalidade da invenção, o modulador é capaz de e-xercer o efeito terapêutico desejado sobre a densidade óssea sem cruzar abarreira folículo sangue ovário, que é tanto seletiva em relação à cargaquanto em relação ao tamanho (Hess e outros, Biol. Reprod. 58:705-711(1998)). Tal efeito diferencial para um modulador pode ser uma função deseu tamanho, sua carga e/ou sua concentração eficiente relativa em tecidosdiferentes, por exemplo, após a administração sistêmica.
O(s) resultado(s) relacionado(s) com a deterioração óssea tam-bém pode(m) ser avaliado(s) através de um efeito específico dos modulado-res de GDF-9 e de BMP-15 em relação à perda de osso trabecular (perfura-ção da placa trabecular); à perda de osso cortical (metafiseal); à perda deosso canceloso; à diminuição na densidade mineral óssea, à qualidade mi-neral óssea reduzida, à remodelagem óssea reduzida; ao maior nível de fos-fatase alcalina e de fosfatase ácida no soro; à fragilidade óssea (maior taxade fraturas), à menor capacidade de cicatrização de fraturas. Os métodospara a avaliação da massa e da qualidade óssea são conhecidos na arte eincluem, mas não estão limitados a difração por raios X; DXA; DEQCT;pQCT, análise química, fracionamento por densidade, histofotometria, his-tomorfometria e análise histoquímica que são descritos, por exemplo, emLane e outros, J. Bone Min. Res. 18:2105-2115 (2003). Um ensaio para adeterminação da densidade óssea cortical é o ensaio MicroCT. Após a me-dida de pQCT, a avaliação de microCT pode ser realizada, por exemplo, uti-lizando um Scanco mCT40 (Scanco Medicai AG) em um fêmur.
A invenção fornece ainda métodos para a medida da formaçãoóssea através da marcação com calceína. Por exemplo, os camundongospodem receber injeções com calceína (por exemplo, 15 mg/kg, 0,1 mL/ ca-mundongo, s.c.) 9 e 2 dias antes da coleta de tecido. Os tecidos ósseos po-dem ser coletados tanto dos fêmures quanto das tíbias, assim como da es-pinha. A caracterização histológica de amostras de osso para medir a dis-tância entre as camadas ósseas mineralizadas marcadas com a calceína éutilizada para avaliar a formação óssea.
Aplicações adicionais da presente invenção incluem o uso demoduladores de GDF-9 e/ou de BMP-15 para o revestimento ou para a in-corporação em osteoimplante, matrizes e sistemas de depósito de forma apromover a osteointegração. Os exemplos de tais implantes incluem implan-tes dentários e implantes de reposição de juntas.
A invenção compreende ainda ensaios para a avaliação da efi-ciência de um modulador de GDF-9 ou de um modulador de BMP-15 para otratamento de um distúrbio degenerativo dos ossos.
Tal ensaio compreende:
a administração do modulador repetidamente a um mamífero(por exemplo, um rato OVX) durante um período de pelo menos 2, 4, 6 ou 8semanas; e
a determinação do efeito do modulador sobre o osso,em que um retardo da deterioração óssea (por exemplo, damassa óssea e/ou da qualidade óssea) que pode ser atribuído ao moduladorindica que o modulador é eficiente para o tratamento de um distúrbio dege-nerativo dos ossos; e a densidade óssea diminuída que pode ser atribuídaao modulador indica que o modulador é eficiente para o tratamento de umadisplasia óssea esclerosante ou distúrbios de massa óssea elevada inapro-priadamente.
Será entendido que um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 po-de ser avaliado em um ou mais modelos animais de distúrbios ósseos, inclu-indo distúrbios degenerativos dos ossos e/ou em seres humanos. A osteo-penia pode ser induzida, por exemplo, através da imobilização, da dieta combaixo teor de cálcio, da dieta com alto teor de fósforo, do uso em longo prazode corticosteróide ou de agonista ou antagonista de GnRH, da interrupçãoda função ovariana ou do envelhecimento. Por exemplo, a osteopenia indu-zida por ovariectomia (OVX) é um modelo animal bem estabelecido de oste-oporose pós-menopausa humana. Um outro modelo bem validado envolve aadministração de corticosteróides. Tais modelos incluem: macacos cinomol-gos, cães, camundongos, coelhos, furões, porquinhos da índia, mini porcose ovelhas. Para uma revisão de vários modelos animais de osteoporose, ver,por exemplo, Turner, Eur. Cells and Materials 1:66-81 (2001).
Os testes in vitro adicionais podem incluir a avaliação do efeitosobre os osteoblastos em cultura tal como o efeito sobre a síntese de colá-geno ou de osteocalcina ou o efeito sobre o nível de fosfatase alcalina e in-dução de cAMP. Os testes in vivo e in vitro apropriados são descritos, porexemplo, na Patente U.S. N2 6.333.312.Moduladores de GDF-9 e de BMP-15
O GDF-9 é sintetizado na forma de um pré-pró-polipeptídeo deaproximadamente 454 aminoácidos (aa) (SEQ ID NO: 2), incluindo uma se-qüência sinal de 27 aminoácidos e um pró-peptídeo de 292 aminoácidos. Ofragmento C-terminal maduro do GDF-9 é previsto como tendo 135 aminoá-cidos de comprimento e como possuindo um peso molecular não glicosiladode aproximadamente 15,6 kD, que é determinado através da análise de se-qüência de nucleotídeos. A sinalização do GDF-9 é mediada através do re-ceptor ALK5 do tipo I (Mazerbourg e outros, Mol. Endocrinol. 18:653-665(2004)) e do receptor BMPRII do tipo Il (Vitt e outros, Biol. Reprod. 67:473-480 (2002)). A seqüência de aminoácidos do GDF-9 humano maduro ficacontida dentro da SEQ ID NO: 2 (N2 de Acesso do GenBank NP_005251.1).
A seqüência do gene GDF-9 humano do tipo selvagem é divulgada, por e-xemplo, no Ns de Acesso do GenBank NM_005260, nas Patentes U.S. N2s5.821.056; 6.191.261; e 6.365.402, assim como nas Publicações de Paten-tes U.S. N— 2002/0127612 e 2004/0152143. A seqüência de nucleotídeos dogene GDF-9 de camundongo é encontrada no N2 de Acesso do GenBankNM_008110; os nucleotídeos 29-1354 codificam a proteína GDF-9 de ca-mundongo (N2 de Acesso do GenBank NP_032136.1). A seqüência de nu-cleotídeos do gene GDF-9 de rato é encontrada no N2 de Acesso do Gen-Bank NM_021672; os nucleotídeos 1-1323 codificam a proteína GDF-9 derato (N2 de Acesso do GenBank NP_067704.1).
A BMP-15 é sintetizada na forma de um pré-pró-polipeptídeo deaproximadamente 392 aminoácidos (SEQ ID NO: 4; N2 de Acesso do Gen-Bank NP_005439.1), incluindo uma seqüência sinal de 18 aminoácidos e umpró-peptídeo de 249 aminoácidos; os resíduos de nucleotídeos 1 até 1179codificam a SEQ ID NO: 4. O fragmento C-terminal maduro de BMP-15 éprevisto como tendo 125 aminoácidos de comprimento e consiste dos resí-duos de aminoácidos 268-392 do pré-pró-polipeptídeo. A sinalização daBMP-15 é mediada através do receptor ALK6 do tipo I e do receptor BMPRIIdo tipo Il (Moore e outros, J. Biol. Chem. 278:304-310 (2003)). A seqüênciade aminoácidos da BMP-15 humana madura está contida dentro da SEQ IDNO: 4. A seqüência do gene do tipo selvagem BMP-15 (GDF-9b) humano édivulgada, por exemplo, no N2 de Acesso do GenBank NM 005448, nas Pa-tentes U.S. N- 5.728.679 e 5.635.372 e na Publicação de Patente U.S. N22004/0092007. A seqüência de nucleotídeos do gene BMP-15 de camun-dongo é encontrada no N2 de Acesso do GenBank NM_009757; os nucleotí-deos 358-1536 codificam a proteína BMP-15 de camundongo (N- de Acessodo GenBank NP_033887). A seqüência de nucleotídeos do gene BMP-15 derato é encontrada no N2 de Acesso do GenBank NM_021670; os nucleotí-deos 247-1422 codificam a proteína BMP-15 de rato (N2 de Acesso do Gen-Bank NP_067702.1).
Os termos "GDF-9" e "BMP-15", como utilizados aqui, referem-se a qualquer uma ou mais isoformas de GDF-9 ou de BMP-15, respectiva-mente. Os termos referem-se à forma precursora não processada de com-primento completo de GDF-9 ou de BMP-15, assim como às formas madura e de pró-peptídeo que resultam da clivagem pós-tradução. O termo "pró-peptídeo" refere-se ao polipeptídeo que é clivado partindo do domínio ami-no-terminal da proteína precursora de GDF-9 ou de BMP-15. O termo "prote-ína madura" refere-se à proteína que é clivada partindo do domínio carbóxi-terminal da proteína precursora de GDF-9 ou de BMP-15. O GDF-9 maduropode estar presente na forma de um monômero, de um homodímero ou emum heterodímero, por exemplo, com BMP-15. A BMP-15 madura pode estarpresente na forma de um monômero, de um homodímero ou em um hetero-dímero. Dependendo das condições, a proteína madura pode estabelecerequilíbrio entre qualquer uma ou todas estas formas diferentes. Em sua for-ma biologicamente ativa, o GDF-9 maduro é também referido como "GDF-9ativo" e a BMP-15 madura é também referida como "BMP-15 ativa". Os ter-mos referem-se ainda a quaisquer fragmentos e variações de GDF-9 ou deBMP-15 que mantêm pelo menos algumas atividades biológicas associadascom o GDF-9 ou com a BMP-15 madura, como discutido aqui, incluindo se-qüências que foram modificadas. A presente invenção pode empregar modu-ladores de GDF-9 e de BMP-15 de todas as espécies de vertebrados, inclu-indo, mas não limitados a humanos, bovinos, frango, camundongo, rato, suí-nos, ovinos, peru, babuíno e peixes.
Os termos "receptor de GDF-9" e "receptor de BMP-15", a nãoser que seja indicado de outra maneira, referem-se a qualquer receptor quese liga a pelo menos uma isoforma de GDF-9 ou de BMP-15, respectivamen-te. Os aspectos estruturais e funcionais de GDF-9 e de BMP-15, assim comoseus receptores, são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Chang eoutros, Endocrine Rev. 23:787-823 (2002); Moore e outros, Molec. Cell. En-docrinol. 234:67-73 (2005); Juengel e outros, Hum. Reprod. Update 11:144-161 (2004)).
Inibidores de GDF-9 e de BMP-15
O termo "inibidor de GDF-9" e seus cognatos tais como "anta-gonista", "neutralizador" e "regulador para menos" referem-se a um compos-to (ou a sua propriedade quando apropriado), que atua como um inibidor daatividade biológica de GDF-9. Um inibidor de GDF-9 pode, por exemplo, seligar e neutralizar a atividade de GDF-9; diminuir os níveis de expressão deGDF-9; afetar a estabilidade ou a conversão da molécula precursora na for-ma madura ativa; interferir na ligação de GDF-9 a um ou mais receptores; oupode interferir com a sinalização intracelular de um receptor de GDF-9. Otermo "inibidor direto de GDF-9" refere-se geralmente a qualquer compostoque regula para menos diretamente a atividade biológica de GDF-9. Umamolécula "regula para menos diretamente" a atividade biológica de GDF-9 seesta regular para menos a atividade através da interação com um geneGDF-9, um produto da transcrição de GDF-9, um Iigante de GDF-9 ou umreceptor de GDF-9. Os termos "neutralizar", "neutralizador", "inibidor" e seuscognatos referem-se a uma redução na atividade de GDF-9 através de uminibidor de GDF-9, em relação à atividade de GDF-9 na ausência do mesmoinibidor. A redução na atividade é preferencialmente de pelo menos aproxi-madamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou maior. Osmétodos para a identificação de agentes que alteram a atividade de GDF-9são descritos na Patente U.S. N2 6.680.174, por exemplo, para alterar a ferti-lidade do sexo feminino.
Os inibidores de GDF-9 que podem bloquear a atividade deGDF-9 são úteis nos métodos da invenção. Tais inibidores podem interagircom o próprio GDF-9. Alternativamente, os inibidores podem interagir comum receptor de GDF-9 (tal como ALK5 ou BMPRII) ou outro parceiro de liga-ção, por exemplo. Os inibidores podem reduzir ou bloquear a ligação deGDF-9 ao seu receptor e/ou a atividade do receptor após a ligação de GDF-9. Os inibidores, evidentemente, podem interagir tanto com GDF-9 quantocom um segundo fator, tal como seu receptor. Sob este aspecto, os inibido-res de GDF-9 incluem anticorpos (contra GDF-9 e/ou um receptor de GDF-9), receptores solúveis modificados, outras proteínas (incluindo aquelas quese ligam com GDF-9 e/ou um receptor de GDF-9), formas modificadas deGDF-9 ou fragmentos das mesmas, pró-peptídeos, peptídeos e imitadoresde todos estes inibidores. Os inibidores não proteináceos incluem, por e-xemplo, moléculas pequenas e ácidos nucléicos.
O termo "atividade de GDF-9" refere-se a uma ou mais ativida-des reguladoras do crescimento fisiologicamente ou morfogenéticas associ-adas com a proteína GDF-9 ativa. Os ensaios para medir a atividade deGDF-9 in vivo e in vitro são conhecidos na arte. Os exemplos de alguns dosensaios biológicos mais freqüentemente utilizados incluem os seguintes:
síntese de progestérona, prostaglandina E2, em células da gra-nulosa (Patente U.S. N2 6.680.174; Elvin e outros, Proc. Nati Acad. Sei.USA 97:10288-10293 (2000));
indução da expressão de um gene induzido por GDF-9, incluin-do hialurona sintase, ciclooxigenase 2 (COX2), proteína reguladora agudaesteroidogênica (StAR), receptores do hormônio Iuteinizante (LH), activi-na/inibina β, folistatina e gremlina (Patente U.S. N- 6.680.174; Elvin e outros,Proc. Nati Acad. Sei. USA 97:10288-10293 (2000));
indução da proliferação de células da granulosa de ovário de ra-to (Vitt e outros, Bioi Reprod. 67:473-480 (2002); Liao e outros, J. BioiChem. 279:17391-17396 (2004));
mucificação e expansão de células do cúmulo de camundongo(Buccione e outros, Dev. Bioi 138:16-25 (1990); Salustri e outros, Dev. Bioi138:26-32 (1990); Elvin e outros, Mol. Endocrinoi 13:1035-1048 (1999));
indução do promotor CAGA fundido com uma gene repórter deluciferase em células de carcinoma P19 (Mazerbourg e outros, Mol. Endocri-nol. 18:653-665 (2004));
efeito sobre a diferenciação de células tronco mesenquimais emosteoblastos funcionalmente competentes (Jaiswal e outros, J. Cell. Bio-chem. 64:295-312 (1997));
ensaio de ligação ao receptor (Vitt e outros, Biol. Reprod.67:473-480 (2002));
fosforilação de proteínas Smads (Mazerbourg e outros, Mol. En-docrinol. 18:653-665 (2004)); e
fosforilação do receptor (Boyle e outros, Methods EnzymoK201B:110-149 (1991); Luo e outros, Methods Enzymol. 201:149-152 (1991);Wrana e outros, Mol. Cell. Biol. 14:944-950 (1994); Weiser, e outros, EMBOJ. 14:2199-2208 (1995)).
O termo "inibidor de BMP-15" e seus cognatos tais como "anta-gonista", "neutralizador" e "regulador para menos" referem-se a um compos-to (ou a sua propriedade quando apropriado), que atua como um inibidor daatividade biológica de BMP-15. Um inibidor de BMP-15 pode, por exemplo,se ligar e neutralizar a atividade de BMP-15; diminuir os níveis de expressãode BMP-15; afetar a estabilidade ou a conversão da molécula precursora naforma madura ativa; interferir na ligação de BMP-15 a um ou mais recepto-res; ou pode interferir na sinalização intracelular de um receptor de BMP-15.O termo "inibidor direto de BMP-15" geralmente refere-se a qualquer com-posto que regula para menos diretamente a atividade biológica de BMP-15.Uma molécula "regula para menos diretamente" a atividade biológica deBMP-15 se regular para menos a atividade através da interação com um ge-ne BMP-15, um produto da transcrição de BMP-15, um Iigante de BMP-15ou um receptor de BMP-15. Os termos "neutralizar", "neutralizador", "inibi-dor" e seus cognatos referem-se a uma redução na atividade de BMP-15através de um inibidor de BMP-15, em relação à atividade de BMP-15 naausência do mesmo inibidor. A redução na atividade é preferencialmente depelo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,90% ou maior.
Os inibidores de BMP-15 que podem bloquear a atividade deBMP-15 são úteis na invenção. Tais inibidores podem interagir com a própriaBMP-15. Alternativamente, os inibidores podem interagir com um receptor deBMP-15 (tal como ALK6 ou BMPRII) ou outro parceiro de ligação, por exem-pio. Os inibidores podem reduzir ou bloquear a ligação de BMP-15 ao seureceptor e/ou a atividade do receptor após a ligação de BMP-15. Os inibido-res, evidentemente, podem interagir tanto com BMP-15 quanto com um se-gundo fator, tal como seu receptor. Sob este aspecto, os inibidores de BMP-15 incluem anticorpos (contra BMP-15 e/ou um receptor de BMP-15), recep-tores solúveis modificados, outras proteínas (incluindo aquelas que se ligama BMP-15 e/ou um receptor de BMP-15), formas modificadas de BMP-15 oufragmentos das mesmas, pró-peptídeos, peptídeos e imitadores de todosestes inibidores. Os inibidores não proteináceos incluem, por exemplo, mo-léculas pequenas e ácidos nucléicos.
O termo "atividade de BMP-15" refere-se a uma ou mais ativida-des reguladoras do crescimento fisiologicamente ou morfogenéticas associ-adas com a proteína BMP-15 ativa. Os ensaios para medir a atividade deBMP-15 in vivo e in vitro são conhecidos na arte. Os exemplos de algunsdos ensaios biológicos mais freqüentemente utilizados incluem os seguintes:
indução da proliferação de células da granulosa de ovário de ra-to (Vitt e outros, Biol. Reprod. 67:473-480 (2002); Liao e outros, J. BioLChem. 279:17391-17396 (2004));
indução da expressão do Iigante kit de células da granulosa (Ot-suka e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:8060-8065 (2002));
inibição da expressão do receptor do hormônio estimulador defolículos (FSH) (Otsuka e outros, J. BioL Chem. 276:11387-11392 (2001));
(4) supressão of FSH-induced progesterone synthesis (Otsuka eoutros, J. BioL Chem. 275:39523-39528 (2000));
supressão da expressão induzida pelo FSH da proteína regula-dora aguda esteroidogênica (StAR), enzima de clivagem da cadeia lateralP450 (P450scc), 3p-hidroxisteróide desidrogenase (3p-HSD), receptor de LHe subunidades de inibina/activina (β, βΑ e βΒ) nas células da granulosa(Moore e outros, MoL CeiL EndocrinoL 234:67-73 (2005));
efeito sobre a diferenciação de células tronco mesenquimais emosteoblastos funcionalmente competentes (Jaiswal e outros, J. Cell. Bio-chem. 64:295-312 (1997);ensaio de ligação ao receptor (Vitt e outros, Biol. Reprod.67:473-480 (2002));
fosforilação de proteínas Smads (Mazerbourg e outros, Mol. En-docrinol. 18:653-665 (2004)); e
fosforilação do receptor (Boyle e outros, Methods Enzymol.201B: 110-149 (1991); Luo e outros, Methods Enzymol. 201:149-152 (1991);Wrana e outros, Mol. Cell. Biol. 14:944-950 (1994); Weiser1 e outros, EMBOJ. 14:2199-2208 (1995)).
Os inibidores de GDF-9 e de BMP-15 são opcionalmente glicosi-lados, peguilados ou ligados a um outro polímero não proteináceo. Os inibi-dores de GDF-9 ou de BMP-15 podem ser modificados para possuírem umpadrão de glicosilação alterado (isto é, alterado do padrão de glicosilaçãooriginal ou nativo). Como utilizado aqui, "alterado" significa que possui um oumais grupamentos de carboidratos adicionados ou deletados e/ou que pos-sui um ou mais sítios de glicosilação adicionados ou deletados quando com-parado com o inibidor original. A adição de sítios de glicosilação aos inibido-res pode ser realizada através da alteração da seqüência de aminoácidospara conter seqüências consenso de sítios de glicosilação bem conhecidasna arte. Um outro meio de aumentar o número de grupamentos de carboi-dratos é através do acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos aosresíduos de aminoácidos do inibidor. Estes métodos são descritos emWO 87/05330 e em Aplin e outros, Crit. Rev. Biochem. 22:259-306 (1981). Aremoção de qualquer um dos grupamentos de carboidratos presentes noreceptor pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente como descri-to por Sojar e outros, Arch. Biochem. Biophys. 259:52-57 (1987); Edge e ou-tros, Anal. Biochem. 118:131-137 (1981); e por Thotakura e outros, Meth.Enzymol. 138:350-359 (1987).
Os inibidores de GDF-9 e de BMP-15 úteis nos métodos da in-venção também podem ser marcados com uma marcação detectável ou fun-cional. Os marcadores detectáveis incluem marcações radioativas tais como125|, 1311 ou 99jCi que podem ser ligadas aos inibidores utilizando químicaconvencional conhecida na arte. As marcações também incluem marcaçõesde enzimas tal como peroxidase de raiz forte ou fosfatase alcalina. As mar-cações incluem adicionalmente grupamentos químicos tal como a biotina,que pode ser detectados através da ligação com um grupamento detectávelcognato específico, por exemplo, marcado com avidina.
ANTICORPOS
Os anticorpos que inibem a atividade de GDF-9 podem ser utili-zados nos métodos da invenção. São também úteis nos métodos da inven-ção os anticorpos que inibem a atividade de BMP-15.
O termo "anticorpo", como utilizado aqui, refere-se a uma imu-noglobulina ou uma parte da mesma e abrange qualquer polipeptídeo quecompreende um sítio de ligação ao antígeno independente da origem, daespécie de origem, do método de produção e das características. Como umexemplo não limitante, o termo "anticorpo" inclui anticorpos humanos, deorangotango, de camundongo, de rato, de cabra, de ovelha e de frango. Otermo inclui, mas não está limitado a anticorpos policlonais, monoclonais,monoespecíficos, poliespecíficos, não específicos, humanizados, cameliza-dos, de cadeia isolada, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mu-tados e com enxerto de CDR. Para as finalidades da presente invenção, in-clui ainda, a não ser que seja citado de outra maneira, fragmentos de anti-corpos tais como Fab1 F(ab')2> Fv, scFv, Fd, dAb, VHh (também referidoscomo nanocorpos) e outros fragmentos de anticorpos que mantêm a funçãode ligação ao antígeno.
Os anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, através detécnicas de hibridoma tradicionais (Kohler e Milstein, Nature 256: 495-499(1975)), métodos do DNA recombinante (Patente U.S. N2 4.816.567) ou téc-nicas de exibição por fago utilizando bibliotecas de anticorpos (Clackson eoutros, Nature 352: 624-628 (1991); Marks e outros, J. Moi Biol. 222:581-597 (1991)). Para várias outras técnicas de produção de anticorpos, verAntibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow e outros, Cold Spring HarborLaboratory, 1988.
O termo "domínio de ligação ao antígeno" refere-se à parte deuma molécula de anticorpo que compreende a área que se liga especifica-mente a ou complementar a uma parte ou a todo um antígeno. Quando umantígeno for grande, um anticorpo pode se ligar apenas a uma parte particu-lar do antígeno. O "epítopo" ou o "determinante antigênico" é uma parte deuma molécula de antígeno que é responsável por interações específicascom o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Um domínio de liga-ção ao antígeno pode ser fornecido por um ou mais domínios variáveis do
anticorpo (por exemplo, um assim chamado fragmento de anticorpo Fd queconsiste de um domínio Vh). Um domínio de ligação ao antígeno pode com-preender uma região variável de cadeia leve do anticorpo (Vl) e uma regiãovariável de cadeia pesada do anticorpo (Vh). Os anticorpos de camelos eIhamas (Camelidae, camelídeos) incluem um tipo exclusivo de anticorpo,que é formado apenas por cadeias pesadas e é desprovido de cadeias le-ves. O sítio de ligação ao antígeno de tais anticorpos é um único domínio,referido como VHh· Estes foram denominados de "anticorpos camelizados"ou "nanocorpos". Ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 5.800.988, a PatenteU.S. N2 6.005.079, o Pedido de Patente Internacional N- WO 94/04678 e oPedido de Patente Internacional N-WO 94/25591, que são incorporados a-qui como referência.
O termo "repertório" refere-se a uma coleção geneticamente di-versa de nucleotídeos, por exemplo, DNA, seqüências derivadas totalmenteou parcialmente de seqüências que codificam imunoglobulinas expressas.As seqüências são geradas através do rearranjo in vivo de, por exemplo,segmentos V, D e J para as cadeias H e, por exemplo, segmentos VeJ paraas cadeias L. Alternativamente, as seqüências podem ser geradas partindode uma linhagem de células através do estímulo in vitro e em resposta aqual rearranjo ocorre. Alternativamente, parte ou todas as seqüências po-dem ser obtidas através da combinação, por exemplo, de segmentos V nãorearranjados com segmentos D e J, através da síntese de nucleotídeos, damutagênese aleatória e de outros métodos que são divulgados na PatenteU.S. N2 5.565.332.
O termo "interação específica" ou "se liga especificamente" ousimilar, significa que duas moléculas formam um complexo que é relativa-mente estável sob condições fisiológicas. O termo é também aplicável quan-do, por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno é específico para umepítopo particular, que é carregado por um número de antígenos, em cujocaso o anticorpo que carrega o domínio de ligação ao antígeno será capazde se ligar a vários antígenos que carregam o epítopo. Assim, um anticorpopode se ligar especificamente, por exemplo, com GDF-9 e com BMP-15,contanto que se ligue a um epítopo que é carregado por ambos.
A ligação específica é caracterizada por uma alta afinidade euma capacidade baixa a moderada. A ligação inespecífica possui geralmen-te uma baixa afinidade com uma capacidade moderada a alta. Tipicamente,a ligação é considerada específica quando a constante de afinidade Ka émaior que 106 M-1 ou preferencialmente maior que 108 M-1. Se necessário,a ligação inespecífica pode ser reduzida sem afetar substancialmente a liga-ção específica variando as condições de ligação. Tais condições são conhe-cidas na arte e um perito na arte que utiliza técnicas de rotina pode selecio-nar as condições apropriadas. As condições são geralmente definidas emtermos de concentração de anticorpos, força iônica da solução, temperatura,tempo permitido para ligação, concentração de moléculas não relacionadas(por exemplo, albumina do soro, caseína do leite) etc.
A expressão "substancialmente como delimitado" significa que odomínio CDR, Vh ou Vl relevante será idêntico ou altamente similar às regi-ões específicas cuja seqüência é delimitada aqui. Por exemplo, tais substitu-ições incluem 1 ou 2 de quaisquer 5 aminoácidos na seqüência de uma CDR(Η1.H2, H3, L1, L2 ou L3).
O termo "isolado" refere-se a uma molécula que está substanci-almente livre de seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína isoladaestá substancialmente livre de material celular ou outras proteínas da célulaou da fonte de tecido da qual é derivada. O termo refere-se a preparaçõesem que a proteína isolada é suficientemente pura para ser administrada co-mo uma composição terapêutica ou pelo menos 70% até 80% (p/p) pura,mais preferencialmente, pelo menos 80%-90% (p/p) pura, ainda mais prefe-rencialmente, 90-95% pura; e, mais preferencialmente, pelo menos 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (p/p) pura.
ANTICORPOS CONTRA GDF-9 OU BMP-15
De acordo com os métodos descritos anteriormente, podem serdesenvolvidos anticorpos que se ligam especificamente à própria proteínaGDF-9. Estes anticorpos serão eficientes nos métodos da invenção se exibi-rem uma atividade de GDF-9, por exemplo, se bloquearem a ligação deGDF-9 ao seu receptor. Os anticorpos que são mais eficientes nesta inven-ção terão a propriedade de se ligarem especificamente a GDF-9 do comple-xo GDF-9/receptor de GDF-9. Tais anticorpos podem ser capazes de se ligarao GDF-9 maduro com alta afinidade e podem se ligar com a proteína madu-ra na forma monomérica, na forma de homodímero e/ou na forma de hetero-dímero, por exemplo, com BMP-15.
Os anticorpos contra GDF-9 foram descritos na arte e são con-siderados para uso na invenção, por exemplo, como apresentado na PatenteU.S. N- 6.191.261.
Os anticorpos neutralizadores para GDF-9 foram descritos naarte e são considerados para uso na presente invenção. O mAb-GDF9-53 éum anticorpo monoclonal neutralizador anti-GDF-9 humano específico (Gilc-hrist e outros, Biol. fíeprod. 71 -.732-739 (2004)). O peptídeo de imunizaçãopara este anticorpo era um peptídeo sintético de 32 aminoácidos correspon-dendo a uma seqüência peptídica próxima ao C-terminal do GDF-9 humano.
O mapeamento de epítopos revelou que o mAb-GDF9-53 reconhece umaseqüência peptídica curta de 4-aa, EPGD, que fica localizada aproximada-mente no meio do peptídeo de imunização. O alinhamento das seqüênciasde aminoácidos C-terminais de GDF-9 e de BMP-15 de várias espécies devertebrados indicou que a seqüência EPDG é altamente conservada entreas espécies, mas possui um baixo nível de similaridade com a região cor-respondente em BMP-15. O mAB-GDF9-53 exibe forte afinidade imunológicapelo GDF-9 de camundongo recombinante e reatividade cruzada muito baixacom BMP-15. Outros anticorpos anti-GDF-9 humano com atividade neutrali-zadora descritos em Gilchrist e outros incluem o mAb-GDF9-22, o mAb-GDF9-19, o mAb-GDF9-37.De acordo com os métodos descritos anteriormente, tambémpodem ser desenvolvidos anticorpos que se ligam especificamente com aprópria proteína BMP-15. Estes anticorpos serão eficientes na invenção seinibirem uma atividade de BMP-15, por exemplo, se bloquearem a ligação deBMP-15 com seu receptor. Os anticorpos que são mais eficientes nesta in-venção terão a propriedade de se ligarem especificamente com BMP-15 docomplexo ΒΜΡ-15/receptor de BMP-15. Tais anticorpos podem ser capazesde se ligar à BMP-15 madura com alta afinidade e podem se ligar com a pro-teína madura na forma monomérica, na forma de homodímero e/ou na formade heterodímero, por exemplo, com GDF-9.
Os anticorpos contra BMP-15 foram descritos na arte e são con-siderados para uso na invenção, por exemplo, como apresentado nas Publi-cações de Patentes U.S. N2s 2004/0267003 e 2004/0092007.
ANTICORPOS CONTRA O RECEPTOR DE GDF-9 OU O RECEPTOR DE BMP-15
De acordo com os métodos descritos anteriormente, podem serdesenvolvidos anticorpos que se ligam ao receptor de GDF-9. Estes anticor-pos serão eficientes na invenção se bloquearem a ligação de GDF-9 ao seureceptor ou se bloquearem a atividade do receptor após a ligação de GDF-9.Os anticorpos podem ser desenvolvidos contra a proteína receptora inteiraou apenas contra o domínio extracelular. Os anticorpos podem ser desen-volvidos contra ALK5 (N2 de Acesso do GenBank NP_004603), variações deALK5, BMPRII (N2 de Acesso do GenBank NP_001195), variações de BM-PRII e outros receptores para GDF-9. Por exemplo, anticorpos policlonais emonoclonais (Clone 141229) para ALK5 de camundongo estão disponíveisna R and D Systems (Minneapolis, MN); os anticorpos policlonais e mono-clonais (Clone 73805) para BMPRII humana e de camundongo estão dispo-níveis na R and D Systems.
Similarmente, podem ser desenvolvidos anticorpos que se ligamao receptor de BMP-15. Estes anticorpos serão eficientes na invenção sebloquearem a ligação de BMP-15 com seu receptor ou se bloquearem a ati-vidade do receptor após a ligação de BMP-15. Os anticorpos podem ser de-senvolvidos contra a proteína receptora inteira ou apenas contra o domínioextracelular. Os anticorpos podem ser desenvolvidos contra ALK6 (N2 deAcesso do GenBank NP_001194), variações de ALK6, BMPRII (N2 de Aces-so do GenBank NP_001195), variações de BMPRII e outros receptores paraBMP-15. Por exemplo, um anticorpo policlonal para ALK6 de camundongoestá disponível na R and D Systems (Minneapolis, MN), assim como estãoos anticorpos de quimera para ALK-6/Fc recombinante humano e de quime-ra para ALK-6/Fc recombinante de camundongo (R and D Systems, Minnea-polis, MN) e anticorpos monoclonais para ALK-6 humano/de camundongo(clone 88614; R and D Systems, Minneapolis, MN)).
RECEPTORES SOLÚVEIS MODIFICADOS
Os receptores solúveis modificados de GDF-9 podem ser utili-zados na invenção. Os receptores solúveis podem compreender todo ou par-te do domínio extracelular (também referido como o ectodomínio) de um re-ceptor de GDF-9, tal como ALK5 ou BMPRII. A seqüência de aminoácidosdo receptor ALK5, incluindo a descrição do domínio extracelular, fragmentosespecíficos e variações do receptor, são apresentados no N2 de Acesso doGenBank NP_004603.
Em uma modalidade, os receptores solúveis podem compreen-der todo ou parte do domínio extracelular de BMPRII, que é um receptor tan-to para GDF-9 assim como para BMP-15. A seqüência de aminoácidos deBMPRII, incluindo descrições do domínio extracelular, fragmentos específi-cos e variações do receptor, são apresentados no N2 de Acesso do Gen-Bank NP_001195. Uma proteína de fusão ectodomínio de BMPRII-Fc queinibe GDF-9 é apresentada em Vitt e outros, Biol. Reprod. 67:473-480(2002).
Em uma outra modalidade, os receptores solúveis modificadosde BMP-15 podem ser utilizados na invenção. Os receptores solúveis podemcompreender todo ou parte do domínio extracelular de um receptor de BMP-15, tal como ALK6 ou BMPRII. As seqüências de aminoácidos do receptorALK6, incluindo a descrição do domínio extracelular, fragmentos específicose variações do receptor, são apresentados no N2 de Acesso do GenBankΝΡ_001194, por exemplo. Uma proteína de fusão ectodomínio ALK6-Fc éapresentada em Vitt e outros, Biol. Reprod. 67:473-480 (2002).
Os receptores solúveis podem ser produzidos de forma recom-binante ou através de clivagem química ou enzimática do receptor intacto.
Os receptores solúveis modificados da invenção se ligarão com GDF-9 e/oucom BMP-15 na corrente sangüínea, reduzindo a capacidade de GDF-9 e/oude BMP-15 de se ligar ao(s) seu(s) receptor(es) nativo(s) no corpo. De talmaneira, estes receptores solúveis modificados inibem a atividade de GDF-9e/ou de BMP-15.
FUSÕES DE RECEPTORES
Os receptores solúveis modificados da invenção podem ser fei-tos mais estáveis através da fusão com uma outra proteína ou outra parte deuma outra proteína. A maior estabilidade é vantajosa para produtos terapêu-ticos uma vez que podem ser administrados em uma dose menor ou em in-tervalos menos freqüentes. A fusão com pelo menos uma parte de uma imu-noglobulina, tal como a região constante de um anticorpo, opcionalmente umfragmento Fc de uma imunoglobulina, pode aumentar a estabilidade de umreceptor solúvel modificado ou de outras proteínas da invenção. (Ver, porexemplo, Spiekermann e outros, J. Exp. Med. 196:303-310 (2002)).
OUTRAS PROTEÍNAS
Outras proteínas que inibem a atividade de GDF-9 podem ser u-tilizadas nos métodos da invenção. Tais proteínas podem interagir com opróprio GDF-9, inibindo sua atividade ou se ligando ao seu receptor. Alterna-tivamente, os inibidores podem interagir com um receptor de GDF-9 (tal co-mo ALK5 ou BMPIIR) e podem ser eficientes em composições ou métodosse bloquearem a ligação de GDF-9 ao seu receptor ou se bloquearem a ati-vidade do receptor após a ligação de GDF-9. Os inibidores, evidentemente,podem interagir tanto com GDF-9 quanto com seu receptor. As proteínasque inibem a atividade de BMP-15 também podem ser utilizadas nos méto-dos da invenção, através da interação com a própria BMP-15 e/ou seus re-ceptores.
PROTEÍNAS QUE SE LIGAM COM GDF-9 OU COM BMP-15As proteínas que se ligam com GDF-9 e inibem sua atividade,incluindo a ligação ao seu receptor, são aceitáveis para uso nos métodos dainvenção. Embora algumas proteínas sejam conhecidas, proteínas adicio-nais podem ser isoladas utilizando técnicas de seleção, um ensaio de liga-ção de ALK5 ou de BMPIIR ou ensaios com genes repórteres descritos ante-riormente. As amostras de proteínas podem ser verificadas, assim como bi-bliotecas de proteínas. As proteínas que se ligam com BMP-15 e inibem suaatividade também podem ser utilizadas nos métodos da invenção.
Pró-peptídeos de GDF-9 e de BMP-15
O pró-peptídeo de GDF-9 pode ser utilizado como um inibidorde GDF-9. Para aumentar a meia-vida in vivo de pró-peptídeos de GDF-9que ocorrem naturalmente, na invenção um inibidor de pró-peptídeo deGDF-9 pode ser modificado e/ou estabilizado para aumentar as proprieda-des farmacocinéticas, tal como a meia-vida circulatória (Massague, J., Ann.Rev. Cell Biol., 6:597-641 (1990); Jiang, e outros, BBRC 315:525-531(2004); Gregory e outros, J. Biol. Chem. 280:27970-27980 (2005)).
Em uma modalidade, o pró-peptídeo de BMP-15 pode ser utili-zado como um inibidor de BMP-15. Para aumentar a meia-vida in vivo depró-peptídeos de BMP-15 que ocorrem naturalmente, na invenção um inibi-dor de pró-peptídeo de BMP-15 pode ser modificado e/ou estabilizado paraaumentar as propriedades farmacocinéticas, tal como a meia-vida circulatória.
Tais pró-peptídeos modificados incluem proteínas de fusão quecompreendem um pró-peptídeo e uma região Fc de uma molécula de IgG(como uma proteína estabilizadora). Estes inibidores podem compreenderum pró-peptídeo de GDF-9 ou de BMP-15 ou um fragmento ou uma variaçãodo dito pró-peptídeo que mantém uma ou mais atividades biológicas do pró-peptídeo. Os pró-peptídeos utilizados na invenção podem ser produzidos deforma sintética, derivados de pró-peptídeos de GDF-9 ou de BMP-15 queocorrem naturalmente (nativos) ou podem ser produzidos de forma recombi-nante, utilizando qualquer um de uma variedade de reagentes, células hos-pedeiras e métodos que são bem conhecidos na arte de engenharia genéti-ca. Em uma modalidade, o pró-peptídeo modificado compreende um pró-peptídeo humano ligado de forma covalente com uma molécula de IgG ouum fragmento da mesma. O pró-peptídeo pode estar ligado diretamente àregião Fc da molécula de IgG ou ligado à região Fc da molécula de IgG atra-vés de um peptídeo Iigante (Jiang, e outros, BBRC 315:525-531 (2004);Gregory e outros, J. Biol. Chem. 280:27970-27980 (2005)). Outras estraté-gias de modificação de estabilização são descritas na WO 02/068650, que éincorporada aqui como referência em sua totalidade.
Proteínas GDF-9 e BMP-15 Dominantes Negativas
As proteínas mutantes de BMP-15 podem ser utilizadas comoum inibidor nos métodos da invenção. A variação de BMP-15 que ocorre na-turalmente, Y235C-BMP-15, carrega uma substituição não conservativa napró-região de BMP-15 e possui um efeito negativo dominante sobre a ativi-dade de BMP-15 do tipo selvagem tanto in vivo quanto in vitro (Di Pasqualee outros, Am. J. Hum. Genet. 75:106-111 (2004)). A presente invenção tam-bém considera o uso de proteínas mutantes de GDF-9, incluindo proteínasnegativas dominantes, nos métodos da invenção.
Proteínas Contendo Folistatina e Domínio de Folistatina
A folistatina se liga com BMP-15 e pode ser utilizada como uminibidor de BMP-15 (Otsuka e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun.289:961-966 (2001)). Conseqüentemente, a invenção fornece proteínas quecompreendem pelo menos um domínio de folistatina para modular o nível oua atividade de BMP-15 e podem ser utilizadas para tratar distúrbios que sãorelacionados com a modulação do nível ou da atividade de BMP-15.
Tanto a própria folistatina quanto o domínio de folistatina con-tendo proteínas (descritos nas Publicações de Patentes U.S. N—2003/0162714 e 2003/0180306) podem ser utilizados nas composições enos métodos da invenção.
As proteínas que contêm pelo menos um domínio de folistatinase ligarão com e inibirão GDF-9. Os exemplos de proteínas que possuempelo menos um domínio de folistatina incluem, mas não estão limitados àfolistatina, ao gene relacionado similar à folistatina (FLRG), FRP (flik, tsc 36),agrinas, osteonectina (SPARC, ΒΜ40), hevina (SC1, mast9, QR1), IGFBP7(mac25) e U19878. GASP1 e GASP2 são outros exemplos de proteínas quecompreendem pelo menos um domínio de folistatina.
Um domínio de folistatina, como citado anteriormente, é definidocomo um domínio de aminoácidos ou um domínio de nucleotídeos que codi-fica um domínio de aminoácidos, caracterizado por repetições ricas em ciste-rna. Um domínio de folistatina abrange tipicamente uma extensão de 65-90aminoácidos e contém 10 resíduos de cisteína conservados e uma regiãosimilar à dos domínios de inibidor de serina protease Kazal. Em geral, asregiões de alça entre os resíduos de cisteína exibem variabilidade de se-qüência nos domínios de folistatina, mas alguma conservação é evidente. Aalça entre a quarta e a quinta cisteínas é geralmente pequena, contendo a-penas 1 ou 2 aminoácidos. Os aminoácidos na alça entre a sétima e a oitavacisteínas são geralmente os mais altamente conservados contendo uma se-qüência consenso de (G,A)-(S,N)-(S,N,T)-(D,N)-(G,N) seguida por um motivo(T1S)-Y. A região entre a nona e a décima cisteínas contém geralmente ummotivo que contém dois resíduos hidrofóbicos (especificamente V, I ou L)separados por um outro aminoácido.
Uma proteína contendo domínio de folistatina compreenderá pe-lo menos um, mas possivelmente mais de um, domínio de folistatina. O ter-mo refere-se ainda a quaisquer variações de tais proteínas (incluindo frag-mentos; proteínas com mutações de substituição, adição ou deleção; e pro-teínas de fusão) que mantêm as atividades biológicas conhecidas associa-das com as proteínas nativas, especialmente as que referem-se à atividadede ligação de BMP-15, incluindo seqüências que foram modificadas comalterações conservativas e não conservativas na seqüência de aminoácidos.Estas proteínas podem ser derivadas de qualquer origem, natural ou sintéti-ca. A proteína pode ser humana ou derivada de origens animais, incluindobovinas, de frango, murinas, de rato, suínas, ovinas, de peru, de babuíno ede peixe.
As proteínas que compreendem pelo menos um domínio de fo-listatina, que pode se ligar com BMP-15, podem ser isoladas utilizando umavariedade de métodos. Por exemplo, pode-se utilizar a purificação por afini-dade utilizando BMP-15. Em adição, pode-se utilizar uma seleção de baixorigor de uma biblioteca de cDNA ou utilizar técnicas de PCR degeneradasutilizando uma sonda direcionada para um domínio de folistatina. À medidaque mais dados genômicos se tornam disponíveis, a busca por similaridadeutilizando um número de programas de obtenção de perfis e de análise deseqüências, tais como MotifSearch (Genetics Computer Group, Madison,Wl), ProfileSearch (GCG) e BLAST (NCBI) poderia ser utilizada para encon-trar novas proteínas contendo homologia significativa com domínios de folis-tatina conhecidos. Em uma modalidade da invenção, as proteínas que com-preendem pelo menos um domínio de folistatina se ligam especificamente àBMP-15 madura ou a um fragmento da mesma, esteja esta na forma mono-mérica, na forma de dímero ativo ou complexada em um complexo latentede BMP-15, com uma afinidade entre 0,001 e 100 nM ou entre 0,01 e 10 nMou entre 0,1 e 1 nM.
PROTEÍNAS QUE SE LIGAM COM RECEPTORES DE GDF-9 OU DE BMP-15
As proteínas que se ligam a um receptor de GDF-9 (tal comoALK5 ou BMPIIR) e inibem a ligação de GDF-9 ao receptor ou a atividade dopróprio receptor são aceitáveis para uso dentro do âmbito da invenção. Simi-larmente, as proteínas que se ligam a um receptor de BMP-15 (tal comoALK6 ou BMPRII) e inibem a ligação de BMP-15 com o receptor ou a ativi-dade do próprio receptor são aceitáveis para uso dentro do âmbito da inven-ção. Tais proteínas podem ser isoladas utilizando técnicas de seleção e oensaio ou ensaios com genes repórteres descritos anteriormente. Em umamodalidade, as proteínas de ligação ao receptor são anticorpos. As amos-tras de proteínas podem ser verificadas, assim como bibliotecas de proteínas.
FUSÕES COM QUALQUER UMA DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO
As proteínas de fusão de qualquer uma das proteínas que se li-gam com GDF-9, com BMP-15, com um receptor de GDF-9 ou com um re-ceptor de BMP-15 podem ser feitas mais estáveis através da fusão com umaoutra proteína ou uma parte de uma outra proteína. A maior estabilidade évantajosa para produtos terapêuticos uma vez que podem ser administradosem uma dose menor ou em intervalos menos freqüentes. A fusão com pelomenos uma parte de uma imunoglobulina, tal como a região constante, op-cionalmente um fragmento Fc de uma imunoglobulina, pode aumentar a es-tabilidade destas proteínas. A preparação de tais proteínas de fusão é bemconhecida na arte e pode ser realizada facilmente. (Ver, por exemplo, Spie-kermann e outros, J. Exp. Med., 196:303-310 (2002)).
PEPTÍDEOS DE IMUNIZAÇÃO DE GDF-9 E DE BMP-15
O termo "vacina" como utilizado aqui refere-se a uma composi-ção ou a um composto que induz uma resposta imunológica protetora, inclu-indo uma resposta de anticorpo ou uma resposta celular. Por exemplo, uma"vacina" de GDF-9 induz uma resposta imunológica que antagoniza a funçãode GDF-9. As vacinas de GDF-9 são apresentadas na Patente U.S. N26.030.617. Os agentes imunogênicos de GDF-9 e de BMP-15 para uso comovacinas podem ser proteínas homólogas de GDF-9 ou de BMP-15 que forammodificadas através da introdução de um único ou alguns epítopos de célu-las T imunodominantes ou promíscuos estranhos, enquanto a estrutura ter-ciária da proteína é substancialmente preservada; ver, por exemplo, a WO01/05820, que é incorporada aqui como referência. Os peptídeos de GDF-9e de BMP-15 foram administrados a ovelhas em imunizações em curto prazoe em longo prazo (Juengel e outros, Biol. Reprod. 70:557-561 (2003); Juen-gel e outros, Biol. Reprod. 67:1777-1789 (2002); McNatty e outros, Reprod.128:3790386 (2004)).
IMITADORES DE INIBIDORES DE GDF-9 E DE BMP-15
Os imitadores de inibidores de GDF-9 podem ser utilizados nosmétodos da invenção. Qualquer análogo sintético destes inibidores de GDF-9, especialmente aqueles com características in vitro melhoradas tais comoos que possuem uma meia-vida mais longa ou que são menos facilmentedegradados pelo sistema digestivo, são úteis.
Os imitadores de anticorpos contra GDF-9, de anticorpos contrao receptor de GDF-9, receptores solúveis modificados e fusões de recepto-res e outras proteínas que se ligam ao GDF-9 tal como o pró-peptídeo deGDF-9, o pró-peptídeo de GDF-9 mutado, as proteínas contendo folistatina edomínio de folistatina e fusões Fc dos mesmos podem ser todos utilizadosna invenção.
Estes imitadores serão eficientes nos métodos da invenção sebloquearem a atividade de GDF-9, isto é, se bloquearem a ligação de GDF-9com seu receptor. Os imitadores que são mais eficientes nesta invenção te-rão a propriedade de se ligar especificamente com GDF-9 ou com o comple-xo GDF-9/receptor de GDF-9. Tais imitadores podem ser capazes de se ligarcom GDF-9 maduro com alta afinidade e podem se ligar com a proteína ma-dura seja na forma monomérica, na forma de dímero ativo ou complexadacom um complexo latente de GDF-9. Os imitadores úteis nos métodos dainvenção podem inibir a atividade de GDF-9 in vitro e in vivo como demons-trado, por exemplo, através da inibição da ligação de ALK5 ou BMPIIR e deensaios de genes repórteres. Ainda, os imitadores divulgados podem inibir aatividade de GDF-9 associada com a regulação negativa da massa muscularesquelética e da densidade óssea.
Os imitadores de inibidores de BMP-15 também podem ser utili-zados nos métodos da invenção. Qualquer análogo sintético destes inibido-res de BMP-15, especialmente aqueles com características in vitro melhora-das tal como possuindo meia-vida mais longa ou sendo menos facilmentedegradados pelo sistema digestivo, são úteis.
Os imitadores de anticorpos contra BMP-15, anticorpos contra oreceptor de BMP-15, receptores solúveis modificados e fusões de receptorese outras proteínas que se ligam com BMP-15 tal como o pró-peptídeo deBMP-15, o pró-peptídeo de BMP-15 mutado, as proteínas contendo folistati-na e domínio de folistatina e fusões Fc dos mesmos podem ser todos utiliza-dos na invenção.
Estes imitadores serão eficientes na invenção se bloquearem aatividade de BMP-15, isto é, se bloquearem a ligação de BMP-15 com seureceptor. Os imitadores que são mais eficientes nesta invenção terão a pro-priedade de se ligar especificamente com BMP-15 ou com o complexo BMP-15/receptor de BMP-15. Tais imitadores podem ser capazes de se ligar coma BMP-15 madura com alta afinidade e podem se ligar com a proteína madu-ra seja na forma monomérica, na forma de dímero ativo ou complexada emum complexo latente de BMP-15. Os imitadores úteis nos métodos da inven-ção podem inibir a atividade de BMP-15 in vitro e in vivo como demonstrado,por exemplo, através da inibição da ligação de ALK6 ou BMPIIR e de ensai-os de genes repórteres. Ainda, os imitadores adequados podem inibir a ati-vidade de BMP-15 associada com a regulação negativa da massa muscularesquelética e da densidade óssea.
INIBIDORES NÃO PROTEINÁCEOS
Os inibidores não proteináceos incluindo, por exemplo, molécu-las pequenas e ácidos nucléicos, também podem ser utilizados nos métodosda invenção.
MOLÉCULAS PEQUENAS
Os inibidores de GDF-9 e de BMP-15 úteis nos métodos da in-venção incluem moléculas pequenas. As moléculas pequenas incluem inibi-dores de GDF-9 e de BMP-15 sintéticos e que ocorrem naturalmente purifi-cados. As moléculas pequenas podem ser imitadores ou secretagogos.
Os métodos para a identificação de moléculas pequenas que sedirecionam especificamente a uma proteína alvo de interesse tal como GDF-9 ou BMP-15 são bem conhecidos na arte. As bibliotecas de moléculas pe-quenas e/ou de peptídeos podem ser verificadas em relação à inibição deGDF-9 utilizando qualquer um dos ensaios funcionais de GDF-9 descritosanteriormente, incluindo, mas não limitados à expressão de CAGA-luciferase, MSXII-Iuciferase ou BRE-Iuciferase em células COS-7, CV-1,A204 ou da granulosa. As bibliotecas de moléculas pequenas e/ou de peptí-deos também podem ser verificadas em um ensaio de ligação competitiva deIigante radioativo de GDF-9 com seu receptor, incluindo, por exemplo, umreceptor solúvel. O uso de ensaios baseados na transferência de energia deressonância fluorescente (FRET), tal como o ensaio homogêneo de proximi-dade Iuminescente amplificada (também conhecido como "AlphaScreen",PerkinEImer, Boston, MA) pode ser feito para a identificação de inibidores demoléculas pequenas adequados. Nesta modalidade, um peptídeo de GDF-9ou um peptídeo de BMP-15 é acoplado com uma primeira população "doa-dora" de esferas e utilizado para a identificação de moléculas de interaçãodentro de uma população acoplada com uma segunda população "recepto-ra" de esferas. Os peptídeos que interagem com GDF-9 ou com BMP-15também podem ser utilizados para ensaios de seleção. Um peptídeo deGDF-9 para uso em tal ensaio é: SQLKWDNWIVAPHRYNPRYCKGDC(SEQ ID NO: 5). Outros exemplos de ensaios baseados em FRET incluemFRET resolvido com o tempo (por exemplo, o sistema LANCE da PerkinEI-mer, Boston, MA) para selecionar inibidores de dimerização de Iigantes oupara identificar moléculas pequenas que interagem com peptídeos de GDF-9ou de BMP-15 definidos. Em uma outra modalidade, as interações comGDF-9 ou BMP-15 de moléculas pequenas ou peptídeos podem ser analisa-das em tempo real utilizando a tecnologia de sistemas Biacore (Biacore In-ternational AB, Uppsala, Suécia). A invenção considera ainda o uso de en-saios de seleção adicionais, por exemplo, ensaios secundários e terciários,para a identificação adicional do efeito de tais moléculas sobre a diferencia-ção e a função de células ósseas e sobre a densidade óssea, por exemplo,utilizando os ensaios descritos em detalhes anteriormente.
ÁCIDOS NUCLÉICOS
Os termos "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo" e "ácido nucléi-co" referem-se ao ácido desoxirribonucléico (DNA) e, quando apropriado, aoácido ribonucléico (RNA) ou ácido nucléico peptídico (PNA). O termo devetambém ser entendido como incluindo análogos de nucleotídeos e polinucle-otídeos de filamento simples ou duplo (por exemplo, siRNA). Os exemplosde polinucleotídeos incluem, mas não estão limitados a DNA plasmideal oufragmentos do mesmo, DNA ou RNA viral, RNAi etc. O termo "DNA plasmi-deal" refere-se ao DNA de filamento duplo que é circular. Os termos "siRNA"e "RNAi" referem-se a um ácido nucléico que é um RNA de filamento duploque possui a capacidade de induzir a degradação de mRNA "silenciando"assim a expressão gênica.
Os ácidos nucléicos que podem bloquear a atividade de GDF-9são úteis nesta invenção. Tais inibidores podem codificar proteínas que inte-ragem com o próprio GDF-9. Alternativamente, tais inibidores podem codifi-car proteínas que podem interagir com um receptor de GDF-9 (tal comoALK5 ou BMPIIR) e podem ser eficientes na invenção se as proteínas codifi-cadas bloquearem a ligação de GDF-9 com seu receptor ou se bloquearema atividade do receptor após a ligação de GDF-9. Os inibidores, evidente-mente, podem codificar proteínas que interagem tanto com GDF-9 quantocom seu receptor. Tais ácidos nucléicos podem ser utilizados para expressaros inibidores de GDF-9 da invenção.
Similarmente, os ácidos nucléicos que podem bloquear a ativi-dade de BMP-15 são úteis nesta invenção. Tais inibidores podem codificarproteínas que interagem com a própria BMP-15. Alternativamente, tais inibi-dores podem codificar proteínas que podem interagir com um receptor deBMP-15 (tal como ALK5 ou BMPIIR) e podem ser eficientes na invenção seas proteínas codificadas bloquearem a ligação de BMP-15 com seu receptorou se bloquearem a atividade do receptor após a ligação de BMP-15. Osinibidores, evidentemente, podem codificar proteínas que interagem tantocom BMP-15 quanto com seu receptor. Tais ácidos nucléicos podem ser uti-lizados para expressar os inibidores de BMP-15 da invenção.
Os métodos da invenção abrangem o uso da interferência deRNA ("RNAi") para reduzir a expressão de GDF-9 ou de um receptor deGDF-9 tal como ALK5 ou BMPIIR. A RNAi pode ser iniciada através da in-trodução de moléculas de ácidos nucléicos, por exemplo, RNAs interferentescurtos sintéticos ("siRNAs") ou agentes de interferência de RNA, para inibirou silenciar a expressão de genes alvos. Ver, por exemplo, as Publicaçõesde Patentes U.S. N2s 2003/0153519 e 2003/01674901 e as Patentes U.S.Nes 6.506.559 e 6.573.099.
Um "agente de interferência de RNA" como utilizado aqui équalquer agente que interfere com ou inibe a expressão de um gene ou umaseqüência genômica alvo através da interferência de RNA. Tais agentes deinterferência de RNA incluem, mas não estão limitados a moléculas de áci-dos nucléicos incluindo moléculas de RNA que são homólogas ao gene ou àseqüência genômica alvo ou a um fragmento da mesma, RNA interferentepequeno (siRNA), grampos curtos ou grampos pequenos (shRNA) e molécu-las pequenas que interferem com ou inibem a expressão de um gene alvoatravés da interferência de RNA.
Como utilizado aqui, "inibição da expressão de gene alvo" incluiqualquer decréscimo na expressão ou na atividade de proteína ou no níveldo gene ou da proteína alvo codificada pelo gene alvo. O decréscimo podeser de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% oumais quando comparado com a expressão de um gene alvo ou com a ativi-dade ou o nível da proteína codificada por um gene alvo que não era o alvodo agente de interferência de RNA.
Um siRNA pode ser sintetizado quimicamente, pode ser produ-zido através da transcrição in vitro ou pode ser produzido dentro de uma cé-lula hospedeira. Tipicamente, um siRNA tem pelo menos 15-50 nucleotídeosde comprimento, por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, o siRNA é um RNA defilamento duplo (dsRNA) de aproximadamente 15 até aproximadamente 40nucleotídeos de comprimento, por exemplo, aproximadamente 15 até apro-ximadamente 28 nucleotídeos de comprimento, incluindo aproximadamente19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento e pode conter uma pontapendurada a 3' e/ou a 5' em cada filamento que possui um comprimento deaproximadamente 0, 1,2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos. Em uma modalidade, osiRNA pode inibir um gene alvo através do silenciamento da transcrição.
Preferencialmente o siRNA é capaz de promover a interferência de RNA a-través da degradação ou do silenciamento gênico pós-transcrição específico(PTGS) do RNA mensageiro alvo.
Os siRNAs úteis nos métodos da invenção incluem ainda RNAsde grampo pequeno (shRNAs). Os shRNAs são compostos de um filamentoanti-senso curto (por exemplo, de aproximadamente 19 até aproximadamen-te 25 nucleotídeos), seguido por uma alça de nucleotídeos de aproximada-mente 5 até aproximadamente 9 nucleotídeos e o filamento senso análogo.
Alternativamente, o filamento senso pode preceder a estrutura em alça denucleotídeos e o filamento anti-senso pode vir a seguir. Estes shRNAs po-dem estar contidos em plasmídeos e vetores virais.
A região alvo das moléculas de siRNA da presente invençãopode ser selecionada de uma certa seqüência alvo. Por exemplo, as se-qüências de nucleotídeos podem começar partindo de aproximadamente 25- 100 nucleotídeos a jusante do códon de início. As seqüências de nucleotí-deos podem conter regiões não traduzidas a 5' ou a 3', assim como regiõespróximas ao códon de início. Os métodos para o planejamento e para a pre-paração de moléculas de siNRA são bem conhecidos na arte, incluindo umavariedade de regras para a seleção de seqüências como reagentes de RNAi(ver, por exemplo, Boese e outros, Methods Enzymol. 392:73-96 (2005)).
O siRNA pode ser produzido utilizando técnicas padronizadasque são descritas em Hannon, (2002) Nature, 418:244-251 (2002); McManuse outros, (2002) Nat. Reviews, 3:737-747 (2002); Heasman, (2002) Dev. Bi-ol., 243:209-214 (2002); Stein, (2001) J. Clin. Invest., 108:641-644 (2001); eZamore, (2001) Nat. Struct. Biol., 8(9):746-750 (2001). Os siRNAs preferidossão fosforilados a 5 primo.
Os inibidores de siRNA podem ser utilizados para se direciona-rem ao GDF-9, a um receptor de GDF-9 (incluindo ALK5 e BMPRII), à BMP-15 ou a um receptor de BMP-15 (incluindo ALK6 e BMPRII). A seqüência deum siRNA para ALK5, que está associada à supressão dependente da dosede ações de GDF-9, é apresentada em Mazerbourg e outros, Mol. Endocri-nol. 18:653-665 (2004)).
Os oligonucleotídeos anti-senso também podem ser utilizadospara reduzir a expressão de GDF-9, de um receptor de GDF-9, de BMP-15ou de um receptor de BMP-15. "Anti-senso", como utilizado aqui, refere-se aum ácido nucléico capaz de se hibridizar com uma parte de uma região codi-ficadora e/ou não codificadora de mRNA em virtude da complementaridadede seqüência, interferindo assim na tradução partindo do mRNA. Os ácidosnucléicos anti-senso podem ser produzidos utilizando técnicas padronizadasque são descritas em Antisense Drug Technology: Principies, Strategies andApplications, 1â ed., eEd. Crooke, Mareei Dekker (2001). A seqüência de umoligonucleotídeo anti-senso de BMPRII é apresentada em Vitt e outros, Biol.Reprod. 67:473-480 (2002)).
Os ácidos nucléicos podem ser administrados em uma dosagemde aproximadamente 1 pg/kg até aproximadamente 20 mg/kg, dependendoda gravidade dos sintomas e da progressão da doença. A dose eficiente a-propriada é selecionada por um médico que está fazendo o tratamento dasfaixas a seguir: aproximadamente 1 pg/kg até aproximadamente 20 mg/kg,aproximadamente 1 pg/kg até aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamen-te 1 pg/kg até aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 10 pg/kg atéaproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 10 pg/kg até aproximadamen-te 100 pg/kg, aproximadamente 100 pg até aproximadamente 1 mg/kg e a-proximadamente 500 pg/kg até aproximadamente 1 mg/kg. Os inibidores deácidos nucléicos podem ser administrados através de meios tópicos, orais,intravenosos, intraperitoneais, intramusculares, intracavidades, subcutâneosou transdermais.
Os ácidos nucléicos podem ser obtidos, isolados e/ou purifica-dos do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogê-nea. Os sistemas para a clonagem e a expressão de um polipeptídeo emuma variedade de células hospedeiras são bem conhecidos. As células hos-pedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamífero e levedura esistemas de baculovírus. As linhagens de células de mamífero disponíveisna arte para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células deovário de hamster chinês, células HeLa1 células renais de hamster bebê,células de melanoma NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano co-mum é E. coli. Para outras células adequadas para a produção de proteínaspartindo de ácidos nucléicos ver Gene Expression Systems, eEds. Fernan-dez e outros, Academic Press (1999).
Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos,contendo seqüências reguladoras apropriadas, incluindo seqüências promo-toras, seqüências terminadoras, seqüências de poliadenilação, seqüênciasintensificadoras, genes de seleção ou marcadores e outras seqüênciasquando apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos ou virais, por exem-pio, fago ou fagemídeo, quando apropriado. Para detalhes adicionais ver,por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook e outros,2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Muitas técnicas e pro-tocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucléico, por exemplo, napreparação de construções de ácidos nucléicos, mutagênese, seqüencia-mento, introdução de DNA em células e expressão gênica e análise de pro-teínas, são descritos em detalhes em Current Protocols in Molecular Biology1eEds. Ausubel e outros, 2- ed., John Wiley & Sons (1992).
Um ácido nucléico pode ser fundido com outras seqüências quecodificam seqüências polipeptídicas adicionais, por exemplo, seqüênciasque funcionam como um marcador ou um repórter. Os exemplos de genesmarcadores ou repórteres incluem lactamase, cloranfenicol acetiItransferase(CAT), adenosina desaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase(responsável pela resistência à neomicina (G418)), dihidrofolato redutase(DHFR)1 higromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina quinase (TK), IacZ(que codifica galactosidase), xantina guanina fosforribosiltransferase (XG-PRT), Iuciferase e muitos outros conhecidos na arte.Composições Farmacêuticas e Métodos de Administração
Os métodos de administração de composições farmacêuticassão conhecidos na arte. "Administração" não é limitada a qualquer sistemade fornecimento particular e pode incluir, sem limitação, parenteral (incluindoinjeção subcutânea, intravenosa, intramedular, intraarticular, intramuscular,intracavidade ou intraperitoneal), retal, tópica, transdermal ou oral (por e-xemplo, em cápsulas, suspensões ou tabletes). A administração a um indiví-duo pode ocorrer em uma dose única ou em administrações contínuas oucom repetições intermitentes e qualquer uma de uma variedade de formasde sais fisiologicamente aceitáveis e/ou com um carreador e/ou aditivo far-macêutico aceitável como parte de uma composição farmacêutica (descritoanteriormente).
Os moduladores de GDF-9 e de BMP-15 podem ser formuladosna forma de composições farmacêuticas. As formas de sais fisiologicamenteaceitáveis e as técnicas de formulação farmacêutica padronizadas e excipi-entes são bem conhecidos pelos peritos na arte (ver, por exemplo, Physici-ans' Desk Reference (PDR) 2003, 57â ed., Medicai Economics Company,2002; e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado eoutros, 20r ed, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000).
Os moduladores úteis nos métodos da invenção podem ser ad-ministrados em uma dosagem de aproximadamente 1 pg/kg até aproxima-damente 20 mg/kg, dependendo da gravidade dos sintomas e da progressãoda doença. A dose eficiente apropriada é selecionada por um médico queestá fazendo o tratamento das faixas a seguir: aproximadamente 1 pg/kg atéaproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 pg/kg até aproximadamen-te 10 mg/kg, aproximadamente 1 pg/kg até aproximadamente 1 mg/kg, apro-ximadamente 10 pg/kg até aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 10pg/kg até aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 100 pg até apro-ximadamente 1 mg/kg e aproximadamente 500 pg/kg até aproximadamente1 mg/kg. por exemplo.
Em algumas modalidades, as composições utilizadas nos méto-dos da invenção compreendem ainda um excipiente farmaceuticamente a-ceitável. Como utilizado aqui, a expressão "excipiente farmaceuticamenteaceitável" refere-se a qualquer e a todos os solventes, meios de dispersão,revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos ede retardo da absorção e similares, que são compatíveis com a administra-ção farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farma-ceuticamente ativas são bem conhecidos na arte. As composições podemconter ainda outros compostos ativos que fornecem funções terapêuticas desuplementação, adicionais ou melhoradas. As composições farmacêuticastambém podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou dispensadorjunto com instruções para administração.
Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatívelcom sua rota de administração pretendida. Os exemplos de tais composi-ções incluem formulações de proteínas cristalinas, fornecidas puras ou emcombinação com polímeros biodegradáveis (por exemplo, PEG, PLGA).
Um modulador da invenção pode ser administrado na forma deuma composição farmacêutica em associação com géis carreadores, matri-zes, excipientes ou outras composições utilizadas para a regeneração ósseae/ou para a substituição óssea guiada. Os exemplos de tais matrizes incluempolietileno glicol (PEG) sintético, hidroxiapatita, colágeno e matrizes à basede fibrina, cola de fibrina tisseel etc. Os excipientes podem incluir sais, polis-sacarídeos, peptídeos, proteínas, aminoácidos, polímeros sintéticos, políme-ros naturais e tensoativos farmaceuticamente aceitáveis.
Em certas modalidades da invenção, os moduladores de GDF-9e os moduladores de BMP-15 são formulados para o fornecimento na formade composições injetáveis ou implantáveis. A composição pode estar naforma de um bastão cilíndrico adequado para injeção ou para implantaçãono estado sólido em um corpo. Em uma modalidade, a formulação injetávelinclui o inibidor e um éster do ácido hialurônico, como descrito em detalhesna Publicação de Patente U.S. N2 20050287135, que é incorporada aquicomo referência. Por exemplo, o Hyaffl 1 p65 pode ser utilizado como o ácidohialurônico. Em uma outra modalidade, a formulação injetável inclui o modu-Iador e um material de fosfato de cálcio, tal como fosfato de cálcio apatíticoamorfo, fosfato de cálcio apatítico fracamente cristalino, hidroxiapatita, fosfa-to tricálcico, fluorapatita e combinações dos mesmos, que são descritos emdetalhes na Publicação de Patente U.S. N2 20050089579, que é incorporadaaqui como referência.
Em certas modalidades, os inibidores de GDF-9 e/ou os inibido-res de BMP-15 podem ser administrados ém combinação ou concomitante-mente com outros compostos terapêuticos tais como, por exemplo, bisfosfo-nato (contendo nitrogênio e não contendo nitrogênio), apomina, testosterona,estrogênio, fluoreto de sódio, ranelato de estrôncio, vitamina D e seus aná-logos, calcitonina, suplementos de cálcio, moduladores de receptores seleti-vos de estrogênio (SERMs, por exemplo, raloxifeno), proteínas osteogênicas(por exemplo, BMP-2), estatinas, inibidores de RANKL, Ativadores da Sinali-zação Similar ao Estrogênio Não Genotrópicos (ANGELS) e hormônio parati-reóide (PTH). (A apomina é o novo éster de 1,1,-bisfosfonato, que ativa oreceptor ativado por X de farneion e acelera a degradação de HMG CoA(3-hidróxi-3-metilglitaril-coenzima A) redutase (ver, por exemplo, a Publica-ção de Patente U.S. N2 2003/0036537 e referências citadas na mesma). Emuma modalidade preferida, os inibidores de GDF-9 ou de BMP-15 são co-administrados como um bisfosfonato, incluindo, mas não limitado a alendro-nato, cimadronato, clodronato, EB-1053, etidronatos, ibandronato, neridrona-to, olpadronato, pamidronato, risedronato, tiludronato, YH 529, zolendronatoe sais, ésteres, ácidos e misturas farmaceuticamente aceitáveis dos mes-mos. Em uma outra modalidade preferida, os inibidores de GDF-9 e/ou deBMP-15 podem ser co-administrados com uma ou mais proteínas osteogêni-cas, incluindo, mas não limitadas a BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7,BMP-9, BMP-10, BMP-12, BMP-13 e MP52. Em uma modalidade, um inibi-dor de GDF-9 é co-administrado com um inibidor de BMP-3.
A administração de um agente terapêutico a um indivíduo deacordo com os métodos da invenção também pode ser feita através de tera-pia gênica, em que uma seqüência de ácido nucléico que codifica o modula-dor é administrada ao paciente in vivo ou às células in vitro, que são entãointroduzidas em um paciente. Para protocolos de terapia gênica específicos,ver Morgan, Gene Therapy Protocols, 2- ed., Humana Press (2000).
Métodos de Detecção e Diagnóstico
A presente invenção pode ser utilizada para identificar indiví-duos que são geneticamente pré-dispostos a possuírem densidade ósseaalterada ou que possuem atualmente densidade óssea alterada. Em umamodalidade, para detectar e/ou diagnosticar a densidade óssea alterada, onível relativo de GDF-9 ou de BMP-15 em uma amostra de teste do indivíduoe uma amostra de controle é comparado. A presença de um nível alteradode GDF-9 ou de BMP-15 na amostra de teste é indicativo de uma densidadeóssea alterada e/ou de uma pré-disposição para o desenvolvimento de umadensidade óssea alterada no indivíduo. Em uma outra modalidade, a presen-te invenção fornece um método para detectar a presença de uma seqüênciade ácido nucléico variante de GDF-9 ou de BMP-15 em uma amostra con-tendo ácido nucléico, comparada com a de um indivíduo que possui umaseqüência de ácido nucléico do tipo selvagem.Em uma modalidade, o nível de GDF-9 e/ou de BMP-15 em umindivíduo é elevado em relação a uma amostra de controle e ao indivíduoque teve a densidade óssea diminuída ou com um risco maior de desenvol-vimento de densidade óssea diminuída. Em uma outra modalidade, o nívelde GDF-9 ou de BMP-15 em um indivíduo é menor em relação a uma amos-tra de controle e ao indivíduo que possui densidade óssea aumentada ouuma probabilidade maior de desenvolver densidade óssea aumentada.
Os anticorpos específicos anti-GDF-9 ou BMP-15 ou os anticor-pos específicos variantes anti-GDF-9 ou BMP-15 podem ser utilizados paradeterminar o nível das proteínas respectivas em uma amostra. A invençãofornece um método para a detecção de GDF-9 ou de BMP-15 ou de varia-ções dos mesmos em um indivíduo que será verificado ou diagnosticado queinclui o contato de um anticorpo anti-GDF-9 ou BMP-15 com uma célula ouuma proteína e a detecção da ligação com o anticorpo. O anticorpo pode sermarcado diretamente com um composto ou uma marcação detectável quepermite a detecção da ligação ao seu antígeno. As marcações diferentes eos métodos de marcação são conhecidos pelos peritos comuns na arte. Osexemplos dos tipos de marcações que podem ser utilizadas na presente in-venção incluem enzimas, radioisótopos, compostos fluorescentes, metaiscoloidais, compostos quimioluminescentes, compostos fosforescentes ecompostos bioluminescentes. O nível de GDF-9 ou de BMP-15 pode ser de-tectado em amostras isoladas de fluidos biológicos e tecidos. Qualquer es-pécime que contenha uma quantidade detectável de antígeno pode ser utili-zado. Uma amostra preferida desta invenção é o tecido ósseo. O nível deGDF-9 ou de BMP-15 na célula suspeita pode ser comparado com o nívelem uma célula normal para determinar se o indivíduo é pré-disposto à den-sidade óssea alterada.
Os anticorpos da invenção são adequados para uso, por exem-plo, em ensaios imunológicos, incluindo em fase líquida ou ligados a um car-reador em fase sólida. Os ensaios imunológicos que utilizam anticorpos in-cluem ensaios imunológicos competitivos e não competitivos em um formatodireto ou indireto, tais como radioimunoensaios (RIA) e ensaios em sanduí-che (imunométricos). Os anticorpos também podem ser utilizados para de-tectar GDF-9 ou BMP-15 utilizando ensaios imunohistoquímicos em amos-tras fisiológicas.
Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um mé-todo para a detecção da presença de uma seqüência de ácido nucléico vari-ante de GDF-9 ou de BMP-15 em uma amostra de teste contendo ácido nu-cléico isolada de um indivíduo, que é comparada com uma amostra de con-trole que possui uma seqüência de ácido nucléico do tipo selvagem.
"Variação", como utilizado aqui, refere-se a qualquer seqüênciade ácido nucléico de GDF-9 ou de BMP-15 que não corresponde à seqüên-cia de ácido nucléico de GDF-9 ou de BMP-15 do tipo selvagem, assim co-mo à seqüência de aminoácidos correspondente. Os métodos da invençãoincluem variações de segmentos de GDF-9 ou de BMP-15 que não comparti-lham identidade de seqüência com o segmento correspondente da seqüên-cia de GDF-9 ou de BMP-15 do tipo selvagem.
As variações úteis nos métodos e nos ensaios da invenção in-cluem alterações geradas por uma mutação, um polimorfismo de compri-mento de fragmento de restrição, um polimorfismo de um único nucleotídeo(SNP), uma deleção de ácido nucléico ou uma substituição de ácido nucléicoque ocorre naturalmente ou intencionalmente manipulada. Uma "deleção" éuma alteração na seqüência de nucleotídeos em que um ou mais resíduosde nucleotídeos estão ausentes. Uma "substituição" resulta da reposição deum ou mais resíduos de nucleotídeos com resíduos de nucleotídeos não i-dênticos.
As variações incluem ainda peptídeos ou proteínas de compri-mento completo, que contêm substituições, deleções ou inserções na estru-tura da proteína, que ainda deixarão uma homologia de 70% com a proteínaoriginal ao longo da parte correspondente. Os exemplos de substituiçõesconservativas envolvem aminoácidos que possuem as mesmas ou proprie-dades similares. As substituições conservativas de aminoácidos ilustrativasincluem as modificações de: alanina para serina; arginina para lisina; aspa-ragina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína paraserina; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina paraprolina; histidina para asparagina ou glutamina: isoleucina para leucina ouvalina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina, glutamina ouglutamato; metionina para Ieucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina,leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofanopara tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; valina para isoleucinapara leucina.
O termo "isolado" como utilizado aqui inclui polinucleotídeossubstancialmente livres de outros ácidos nucléicos, proteínas, lipídeos, car-boidratos ou outros materiais com os quais estão naturalmente associados.As seqüências de polinucleotídeos da invenção incluem seqüências de DNAe de RNA que codificam variações de GDF-9 ou de BMP-15. É entendidoque todos os polinucleotídeos que codificam todas ou uma parte das varia-ções de GDF-9 ou de BMP-15 são também incluídos aqui, tais como os poli-nucleotídeos que ocorrem naturalmente, sintéticos e manipulados intencio-nalmente. Os polinucleotídeos úteis nos métodos e nos ensaios da invençãoincluem seqüências que são degeneradas como um resultado do código ge-nético. Uma seqüência complementar pode incluir um nucleotídeo anti-senso. São também incluídos os fragmentos (partes) das seqüências de áci-dos nucléicos descritas anteriormente que possuem pelo menos 10-15 ba-ses de comprimento, que é suficiente para permitir que o fragmento se hibri-dize especificamente com o DNA do ácido nucléico variante.
As seqüências de ácidos nucléicos úteis nos métodos e nos en-saios da invenção podem ser obtidas através de qualquer método conhecidona arte. Por exemplo, o DNA pode ser isolado através de: 1) hibridização debibliotecas genômicas ou de cDNA com sondas para detectar seqüências denucleotídeos homólogas, 2) reação em cadeia da polimerase (PCR) no DNAgenômico ou no cDNA utilizando iniciadores capazes de se anelar com aseqüência de DNA de interesse e 3) seleção de anticorpos de bibliotecas deexpressão para detectar fragmentos de DNA clonados com característicasestruturais compartilhadas.
O desenvolvimento de seqüências de DNA específicas que codi-ficam GDF-9 ou BMP-15 ou variações dos mesmos, também pode ser reali-zado através de: 1) isolamento de seqüências de DNA de filamento duplopartindo do DNA genômico; 2) produção química de uma seqüência de DNApara fornecer os códons necessários para o polipeptídeo de interesse; e 3)síntese in vitro de uma seqüência de DNA de filamento duplo através detranscrição inversa do mRNA isolado de uma célula doadora eucariótica. Noúltimo caso, um complemento de DNA de filamento duplo do mRNA é for-mado, referido como cDNA.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece mé-todos para a identificação de variações de ácidos nucléicos associadas coma densidade óssea alterada através da detecção da presença de uma se-qüência de ácido nucléico variante de GDF-9 ou de BMP-15 alvo na amostraisolada de um indivíduo que possui densidade óssea alterada quando com-parado com um indivíduo que possui densidade óssea normal e uma se-qüência de ácido nucléico de GDF-9 ou de BMP-15 do tipo selvagem.
A presente invenção inclui métodos para a identificação de vari-ações alélicas em um indivíduo. O indivíduo pode ser homozigoto ou hetero-zigoto em relação a uma variação de GDF-9 ou de BMP-15. Como utilizadoaqui, um "alelo" é um gene ou uma seqüência de nucleotídeos, tal como umpolimorfismo de um único nucleotídeo (SNP), presente em mais de uma for-ma (seqüência diferente) em um genoma. "Homozigoto", de acordo com apresente invenção, indica que as duas cópias do gene ou do SNP são idên-ticas em seqüência ao outro alelo. Por exemplo, um indivíduo homozigotopara o gene GDF-9 ou BMP-15 do tipo selvagem contém pelo menos duascópias da seqüência de GDF-9 ou de BMP-15 do tipo selvagem. Tal indiví-duo não seria pré-disposto a uma densidade óssea alterada.
"Heterozigoto", como utilizado aqui, indica que duas cópias dife-rentes do alelo estão presentes no genoma, por exemplo, uma cópia do alelodo tipo selvagem e uma cópia do alelo variante. Um indivíduo que possui talgenoma é heterozigoto. "Heterozigoto" também abrange um indivíduo quepossui duas mutações diferentes em seus alelos GDF-9 ou BMP-15.
Uma modalidade da invenção fornece métodos para o desen-volvimento de um perfil alélico de um indivíduo para um gene GDF-9 ouBMP-15. "Perfil alélico", como utilizado aqui, é uma determinação da compo-sição do genoma de um indivíduo em relação à presença ou à ausência e aonúmero de cópias, do alelo GDF-9 ou BMP-15 ou de variações do mesmo.
Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um métodode determinação da pré-disposição de um indivíduo à densidade óssea alte-rada. O método inclui a determinação do perfil alélico de GDF-9 ou de BMP-15 de um indivíduo através do isolamento do espécime de ácido nucléico doindivíduo que inclui a seqüência de GDF-9 ou de BMP-15 e a determinaçãoda presença ou da ausência de uma mutação na seqüência de ácido nucléi-co de GDF-9 ou de BMP-15. A invenção fornece ainda um método de diag-nóstico ou prognóstico para a determinação do perfil alélico de GDF-9 ou deBMP-15 de um indivíduo incluindo o isolamento de uma amostra de ácidonucléico do indivíduo; a amplificação do ácido nucléico com iniciadores quese hibridizam com as seqüências alvos.
Qualquer método que detecta as variações alélicas pode ser uti-lizado. Por exemplo, os oligonucleotídeos específicos ao alelo (ASO's) po-dem ser utilizados como sondas para a identificação de tais variações. Assondas ASO podem ter qualquer comprimento adequado para a detecção daseqüência de interesse. Preferencialmente tais sondas possuem 10-50 nu-cleotídeos de comprimento e serão marcadas de forma detectável atravésde métodos isotópicos ou não isotópicos. As seqüências alvos podem seropcionalmente amplificadas e separadas através da eletroforese em gel an-tes da imobilização por Southern blotting. Alternativamente, os extratos con-tendo o ácido nucléico não amplificado podem ser transferidos para nitroce-Iulose e submetidos às sondas na forma de dot blots.
Em adição, as alterações específicas ao alelo podem ser identi-ficadas através da alteração de sítios de restrição coincidentes. As mutaçõesmuitas vezes alteram os sítios de clivagem de enzimas de restrição ou, al-ternativamente, introduzem sítios de restrição onde nenhum existia anterior-mente. A alteração ou a adição de um sítio de reconhecimento de enzima derestrição pode ser utilizada para identificar uma variação particular.Os iniciadores utilizados nos métodos da invenção incluem oli-gonucleotídeos de comprimento suficiente e seqüência apropriada que for-necem início específico da polimerização de um número significativo de mo-léculas de ácidos nucléicos contendo o ácido nucléico alvo sob as condiçõesde rigor para a reação utilizando os iniciadores. Dessa maneira, é possívelamplificar seletivamente a seqüência de ácido nucléico alvo específica con-tendo o ácido nucléico de interesse. Especificamente, o termo "iniciador"como utilizado aqui refere-se a uma seqüência que compreende dois oumais desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, preferencialmente pelomenos oito, cuja seqüência é capaz de iniciar a síntese de um produto daextensão do iniciador que é substancialmente complementar a um filamentode ácido nucléico alvo. O iniciador de oligonucleotídeo contém tipicamente15-22 ou mais nucleotídeos, embora possa conter menos nucleotídeos con-tanto que o iniciador tenha especificidade suficiente para permitir essencial-mente apenas a amplificação da seqüência de nucleotídeos alvo especifica-mente desejada (isto é, o iniciador é substancialmente complementar).
Os iniciadores utilizados de acordo com o método da invençãosão planejados para serem "substancialmente" complementares a cada fila-mento de seqüência de nucleotídeos mutante que será amplificado. Subs-tancialmente complementar significa que os iniciadores têm que ser suficien-temente complementares para se hibridizarem seus respectivos filamentossob condições que permitem que o agente para a polimerização funcione.Em outras palavras, os iniciadores devem ter complementaridade suficientecom as seqüências flanqueadoras para se hibridizarem com as mesmas epermitir a amplificação da seqüência de nucleotídeos mutante. Preferencial-mente, o terminal a 3' do iniciador que é estendido possui complementarida-de de bases pareadas perfeitamente com o filamento flanqueador comple-mentar. Os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser utilizados em qualquerprocesso de amplificação que produza maiores quantidades do ácido nucléi-co alvo, incluindo a reação em cadeia da polimerase. Tipicamente, um inici-ador é complementar ao filamento negativo (-) da seqüência de nucleotídeosmutante e o outro é complementar ao filamento positivo (+). O anelamentodos iniciadores com o ácido nucléico desnaturado seguido pela extensãocom uma enzima, tal como o fragmento grande da DNA Polimerase I (Kle-now) ou Taq DNA polimerase e nucleotídeos ou Iigases1 resulta em filamen-tos + e - recém-sintetizados contendo o ácido nucléico alvo. Devido ao fatode que estes ácidos nucléicos recém-sintetizados são também moldes, ci-clos repetidos de desnaturação, anelamento dos iniciadores e extensão re-sultam na produção exponencial da região (isto é, da seqüência de nucleotí-deos mutante alvo) definida pelo iniciador. O produto da reação de amplifi-cação é um duplex de ácido nucléico distinto com terminais correspondendoàs extremidades dos iniciadores específicos empregados. Os peritos na arteconhecerão outras metodologias de amplificação que também podem serutilizadas para aumentar o número de cópias do ácido nucléico alvo.
O ácido nucléico de qualquer espécime de tecido, na forma puri-ficada ou não purificada, pode ser utilizado como o ácido nucléico ou os áci-dos nucléicos de partida, contanto que contenha ou seja suspeito de conter,a seqüência de ácido nucléico específica contendo o ácido nucléico alvo.Assim, o processo pode empregar, por exemplo, DNA ou RNA, incluindoRNA mensageiro (mRNA), em que o DNA ou o RNA pode ter filamento sim-ples ou filamento duplo. No evento que o RNA será utilizado como um mol-de, as enzimas e/ou as condições ótimas para transcrever inversamente omolde em DNA seriam utilizadas. Em adição, um híbrido de DNA-RNA quecontém um filamento de cada pode ser utilizado. Uma mistura de ácidos nu-cléicos também pode ser empregada ou os ácidos nucléicos produzidos emuma reação de amplificação anterior aqui, utilizando os mesmos ou iniciado-res diferentes também podem ser assim utilizados. A seqüência de nucleotí-deos mutante que será amplificada pode ser uma fração de uma moléculamaior ou pode estar presente inicialmente como uma molécula distinta, deforma que a seqüência específica constitua o ácido nucléico inteiro. Não énecessário que a seqüência que será amplificada esteja presente inicialmen-te em uma forma pura; esta pode ser uma fração menor de uma misturacomplexa, tal como contida no DNA humano ou animal total.
O produto amplificado pode ser detectado através da análise deSouthern blot, sem utilizar sondas radioativas. Em tal processo, por exemplo,uma pequena amostra de DNA contendo um nível muito baixo de seqüênciade nucleotídeos mutante é amplificada e analisada através de uma técnicade Southern blotting. O uso de sondas ou marcações não radioativas é facili-tado pelo alto nível do sinal amplificado.
Quando o ácido nucléico alvo não for amplificado, a detecção u-tilizando uma sonda de hibridização apropriada pode ser realizada direta-mente sobre o ácido nucléico separado. Nos casos em que o ácido nucléicoalvo é amplificado, a detecção com a sonda de hibridização apropriada seriarealizada após a amplificação.
As sondas da presente invenção podem ser utilizadas para veri-ficar a distribuição dos fragmentos específicos detectados, assim como ograu quantitativo (relativo) de ligação da sonda para a determinação da ocor-rência de seqüências de ligação (hibridização) fortemente específicas.
As sondas da invenção podem ser marcadas de forma detectá-vel com um átomo ou um radical inorgânico, mais comumente utilizando ra-dionuclídeos, mas também metais pesados podem ser utilizados. Pode serempregada qualquer marcação radioativa que forneça um sinal adequado eque possua meia-vida suficiente. Outras marcações incluem ligantes, quepodem servir como um membro do par de ligação específica para o Iigantemarcado e similar. Uma ampla variedade de marcações empregadas rotinei-ramente em ensaios imunológicos pode ser utilizada. Os compostos fluores-centes incluem fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados,dansila, umbeliferona e outros. Os agentes de quimioluminescência incluemluciferina e 2,3-dihidrofta-lazinedionas (por exemplo, luminol).
Os ácidos nucléicos que possuem uma variação de GDF-9 oude BMP-15 detectados através dos métodos da invenção podem ser adicio-nalmente avaliados, detectados, clonados, seqüenciados e similares, emsolução ou após a ligação a um suporte sólido, através de qualquer métodogeralmente aplicado para a detecção de uma seqüência de DNA específicatal como PCR, restrição de oligômero (Saiki e outros, Bio/Technology,3:1008-1012, 1985), análise de sondas de oligonucleotídeos específicas aoateio (ASO) (Conner e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:278, 1983),ensaios de ligação de oligonucleotídeos (OLAs) (Landegren e outros, Scien-ce, 241:1077, 1988) e similares.
A presente invenção fornece ainda kits para a detecção de ní-veis alterados ou de variações em GDF-9 e/ou em BMP-15. Tal kit podecompreender uma sonda que é ou pode ser marcada de forma detectável.Tal sonda pode ser um anticorpo ou um nucleotídeo específico para umaproteína alvo ou fragmentos da mesma ou um ácido nucléico alvo ou umfragmento do mesmo, respectivamente, em que o alvo é indicativo ou se cor-relaciona com a presença de GDF-9 ou de BMP-15 ou variações dos mes-mos. Por exemplo, as sondas de oligonucleotídeo da presente invenção po-dem ser incluídas em um kit e utilizadas para a verificação da presença devariações de GDF-9 ou de BMP-15, assim como do grau quantitativo (relati-vo) de ligação da sonda para a determinação da ocorrência de seqüênciasde ligação (hibridização) fortemente específicas, indicando assim a probabi-lidade de um indivíduo possuir ou ser pré-disposto a possuir densidade ós-sea alterada.
Em uma modalidade, o kit utiliza a hibridização de ácidos nu-cléicos para detectar o ácido nucléico alvo, o kit também pode ter recipientescontendo nucleotídeo(s) para a amplificação da seqüência de ácido nucléicoalvo. Quando for desejável amplificar a seqüência de ácido nucléico alvo, talcomo uma seqüência de ácido nucléico variante, isto pode ser realizado utili-zando oligonucleotídeo(s) que é(são) iniciador(es) para a amplificação.
Em uma modalidade, o kit pode fornecer um recipiente contendoanticorpos que se ligam a uma proteína alvo ou fragmentos da mesma ouvariações de tal proteína ou fragmentos da mesma. Assim, um kit pode con-ter anticorpos que se ligam com GDF-9 ou com BMP-15 do tipo selvagem ousuas variações. Tais anticorpos podem ser utilizados para distinguir a pre-sença de uma variação de GDF-9 ou de BMP-15 particular ou o nível de ex-pressão de tais variações em um espécime.
Os exemplos a seguir fornecem modalidades ilustrativas da in-venção. Um perito comum na arte reconhecerá as várias modificações e va-riações que podem ser realizadas sem alterar o espírito ou o âmbito da pre-sente invenção. Tais modificações e variações são abrangidas dentro doâmbito da invenção. Os Exemplos não limitam de forma alguma a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Densidade Mineral Óssea em Camundonaos Nocauteados emRelação a GDF-9
O efeito de uma mutação nula para GDF-9 sobre a densidademineral óssea foi analisado em fêmeas de camundongos. Os camundongosnocauteados em relação a GDF-9 foram descritos anteriormente (Dong eoutros, Nature 383:531-535 (1996)). A densidade mineral óssea volumétrica(vBMD) total, trabecular e cortical foi determinada em fêmeas de camundon-gos com 16 semanas de idade (Tabela 1) e com 10 meses de idade (Tabela2) como a seguir. A densidade mineral óssea volumétrica (vBMD, mg/cm3)do fêmur direito foi avaliada utilizando um XCT Research peripheral Quanti-tative Computed Tomography densitometer (pQCT; Stratec Medizinetechnik,Pforzheim, Alemanha). Uma fatia de pQCT com 0,5 mm de espessura obtida2,5 mm proximais da extremidade distai do fêmur foi utilizada para computara densidade óssea total e trabecular para a metáfise femoral distai. Uma se-gunda fatia adquirida 6 mm proximais da extremidade do fêmur foi utilizadapara avaliar a densidade cortical. As fatias tomográficas tinham um tamanhode pixel em plano de 0,07 mm. Após a aquisição, as imagens foram exibidase a região de interesse incluindo o fêmur inteiro para cada varredura foi deli-neado. O tecido mole foi removido automaticamente utilizando um algoritmoiterativo e a densidade do osso remanescente (densidade total) na primeirafatia foi determinada. Os 55% externos do osso foram então descarnadosem uma espiral concêntrica e a densidade do osso remanescente (densida-de trabecular) da primeira fatia foi relatada em mg/cm3. Na segunda fatia, olimite entre o osso cortical e trabecular foi determinado utilizando um algo-ritmo iterativo e a densidade do osso cortical foi determinada.Tabela 1: Densidade Óssea em Fêmeas de Camundongos Nocauteadas emRelação a GDF-9 com 16 semanas de idade
<table>table see original document page 54</column></row><table>
N = 10
a : Média (mg/cm3) ± SEM
b : Média (mm) ± SEM
: ρ < 0,05 vs. valor do tipo selvagem correspondente (Teste T de Student)
**: ρ < 0,01 vs. valor do tipo selvagem correspondente (Teste T de Student)
Tabela 2: Efeito da Densidade Mineral Óssea com Mutação Nula para GDF-9 em Fêmeas de Camundongos com 10 Meses de Idade
<table>table see original document page 54</column></row><table>
N = 8 animais/grupo
a Significativamente diferente da medida de WT (sFRP) respectiva (P < 0,05;teste t de Student); os animais sFRP foram expostos de forma transitória atemperaturas altas
O relatório descritivo é mais completamente entendido à luz dosensinamentos das referências citadas dentro do relatório descritivo. As mo-dalidades dentro do relatório descritivo fornecem uma ilustração das modali-dades da invenção e não devem ser interpretadas como Iimitantes do âmbitoda invenção. O perito na arte reconhece facilmente que muitas outras moda-lidades são abrangidas pela invenção. Todas as publicações, patentes e se-qüências biológicas citadas nesta divulgação são incorporadas como refe-rência em sua totalidade. Até a extensão de que o material incorporado co-mo referência contradiz ou é incoerente com o presente relatório descritivo,o presente relatório descritivo substituirá qualquer tal material. A citação dequaisquer referências contidas aqui não é uma admissão de que tais refe-rências constituem a arte anterior da presente invenção.
A não ser que seja indicado de outra maneira, todos os númerosque expressam quantidades de ingredientes, cultura de células, condiçõesde tratamento e outros utilizados no relatório descritivo, incluindo as reivindi-cações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casospelo termo "aproximadamente". Conseqüentemente, a não ser que seja indi-cado de outra maneira o contrário, os parâmetros numéricos são aproxima-ções e podem variar dependendo das propriedades desejadas que são bus-cadas para serem obtidas pela presente invenção. A não ser que seja indi-cado de outra maneira, o termo "pelo menos" que precede uma série de e-Iementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento na série.
Os peritos na arte reconhecerão ou serão capazes de determinar utilizandonão mais que experimentos de rotina, muitos equivalentes para as modali-dades específicas da invenção descritas aqui. É pretendido que tais equiva-lentes sejam abrangidos pelas reivindicações a seguir.

Claims (121)

1. Processo de tratamento ou de prevenção de um distúrbioósseo em um mamífero, o processo compreendendo a administração a ummamífero que necessita do mesmo de um modulador de GDF-9 ou de BMP-15em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para tratarou para prevenir o distúrbio ósseo.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o modu-lador de GDF-9 ou de BMP-15 é um inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 e odistúrbio ósseo é um distúrbio degenerativo dos ossos.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o inibidoré um inibidor de GDF-9.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o inibidoré um inibidor de BMP-15.
5. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o distúr-bio ósseo é selecionado do grupo que consiste de osteopenia, osteomalácia,osteoporose, osteomieloma, osteodistrofia, doença de Paget, osteogêneseimperfeita, esclerose óssea, distúrbio ósseo aplásico, mieloma hipercalcêmi-co humoral, mieloma múltiplo e afinamento ósseo após a metástase.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o distúr-bio é osteoporose.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que a osteo-porose é pós-menopausa, induzida por esteróides, senil ou induzida pelouso de tiroxina.
8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o distúr-bio ósseo no mamífero está associado com um ou mais de: hipercalcemia,doença renal crônica, diálise renal, hiperparatireoidismo primário e secundá-rio, doença intestinal inflamatória, doença de Krohn e uso em longo prazo decorticosteróides ou agonistas ou antagonistas de GnRH.
9. Processo de retardo da deterioração óssea, de manutençãoóssea, de restauração do osso perdido ou de estímulo da formação de ossonovo em um mamífero, o processo compreendendo a administração a ummamífero que necessita do mesmo de uma quantidade terapeuticamenteeficiente de um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 em uma quantidade edurante um período de tempo suficiente para retardar a deterioração, restau-rar o osso perdido ou estimular a formação de osso novo.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o modu-Iador é um inibidor de GDF-9.
11. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o modu-lador é um inibidor de BMP-15.
12. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a dete-rioração óssea é caracterizada por uma perda de massa óssea.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que a per-da de massa óssea é determinada através da medida da densidade mineralóssea.
14. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a dete-rioração óssea é caracterizada pela degeneração da qualidade óssea.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a de-generação da qualidade óssea é determinada através da avaliação da inte-gridade microestrutural do osso.
16. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 9, em que omamífero é humano.
17. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 9, em que omodulador é selecionado do grupo que consiste de um composto, um anti-corpo, uma proteína, um peptídeo, DNA, RNA e um agente de interferênciade RNA.
18. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o mo-dulador é um anticorpo.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o anti-corpo é selecionado do grupo que consiste de um anticorpo anti-GDF-9, umanticorpo anti-receptor de GDF-9, um anticorpo anti-BMP-15 e um anticorpoanti-receptor de BMP-15.
20. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o anti-corpo é um anticorpo humano ou um derivado humanizado do mesmo.
21. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o anti-corpo é monoclonal.
22. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o anti-corpo se liga especificamente a uma proteína GDF-9 madura.
23. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o anti-corpo se liga especificamente a uma proteína BMP-15 madura.
24. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o mo-dulador se liga especificamente a uma proteína GDF-9 madura ou a umaproteína BMP-15 madura.
25. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o mo-dulador inibe a sinalização mediada pela interação entre um polipeptídeo deGDF-9 e seu receptor ou o modulador inibe a sinalização mediada pela inte-ração entre um polipeptídeo de BMP-15 e seu receptor.
26. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o mo-dulador é selecionado do grupo que consiste de um receptor solúvel deGDF-9, uma proteína de ligação ao receptor de GDF-9, um receptor solúvelde BMP-15 e uma proteína de ligação ao receptor de BMP-15.
27. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o a-gente de interferência de RNA é um RNA interferente curto de filamento du-plo (siRNA).
28. Processo de acordo com a reivindicação 27, em que o siR-NA inibe GDF-9 ou BMP-15 através do silenciamento da transcrição.
29. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 9, em que omodulador é administrado de forma sistêmica.
30. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 9, em que omodulador é administrado em uma dose eficiente escolhida das faixas de 1pg/kg e 20 mg/kg, 1 pg/kg e 10 mg/kg, 1 pg/kg e 1 mg/kg, 10 pg/kg e 1mg/kg, 10 pg/kg e 100 pg/kg, 100 pg/kg e 1 mg/kg e 500 pg/kg e 1 mg/kg.
31. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 9, em que omodulador é administrado repetidamente ao longo de um período de tempode pelo menos duas semanas.
32. Processo de aumento da densidade óssea cortical, o pro-cesso compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficiente do modu-lador de acordo com a reivindicação 17 a um mamífero, aumentando assima densidade óssea cortical.
33. Processo de aumento da densidade óssea trabecular, oprocesso compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficiente domodulador de acordo com a reivindicação 17 a um mamífero, aumentandoassim a densidade óssea trabecular.
34. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 9, que com-preende ainda a administração ao mamífero de um ou mais agentes de tra-tamento de distúrbios ósseos selecionados do grupo que consiste de bisfos-fonatos, calcitonina, estrogênios, moduladores de receptores de estrogênioseletivos, hormônio paratireóide, vitaminas e combinações dos mesmos.
35. Processo de acordo com a reivindicação 34, em que o a-gente de tratamento de distúrbios ósseos é um modulador de receptor deestrogênio seletivo.
36. Processo de acordo com a reivindicação 34, em que o a-gente de tratamento de distúrbios ósseos é um bisfosfonato.
37. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 9, que com-preende ainda a administração ao mamífero de uma ou mais proteínas oste-ogênicas.
38. Processo de acordo com a reivindicação 37, em que a pro-teína osteogênica é selecionada do grupo que consiste de BMP-2, BMP-4,BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12, BMP-13 e MP52.
39. Processo de acordo com a reivindicação 37, em que a pro-teína osteogênica é um inibidor de BMP-3.
40. Processo de diminuição da fertilidade e de tratamento e deprevenção de um distúrbio ósseo em um mamífero, o processo compreen-dendo a administração a um mamífero que necessita do mesmo de um inibi-dor de GDF-9 ou de BMP-15 em uma quantidade e durante um período detempo suficiente para diminuir a fertilidade e tratar ou prevenir o distúrbiodegenerativo dos ossos.
41. Processo de acordo com a reivindicação 40, em que o inibi-dor é um inibidor de GDF-9.
42. Processo de acordo com a reivindicação 40, em que o inibi-dor é um inibidor de BMP-15.
43. Processo de acordo com a reivindicação 40, em que o dis-túrbio ósseo é selecionado do grupo que consiste de osteopenia, osteomalá-cia, osteoporose, osteomieloma, osteodistrofia, doença de Paget, osteogê-nese imperfeita, esclerose óssea, distúrbio ósseo aplásico, mieloma hiper-calcêmico humoral, mieloma múltiplo e afinamento ósseo após a metástase.
44. Processo de acordo com a reivindicação 43, em que o dis-túrbio é osteoporose.
45. Processo de acordo com a reivindicação 40, em que o dis-túrbio ósseo no mamífero está associado com um ou mais de: hipercalcemi-a, doença renal crônica, diálise renal, hiperparatireoidismo primário e secun-dário e uso em longo prazo de corticosteróides.
46. Processo de diminuição da fertilidade e de retardo da dete-rioração óssea, mantendo o osso, restaurando a perda óssea ou estimulan-do a formação de osso novo em um mamífero, o processo compreendendo aadministração a um mamífero que necessita do mesmo de uma quantidadeterapeuticamente eficiente de um inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 em umaquantidade e durante um período de tempo suficiente para diminuir fertilida-de e retardar a deterioração, restaurar o osso perdido ou estimular a forma-ção de osso novo.
47. Processo de acordo com a reivindicação 46, em que o inibi-dor é um inibidor de GDF-9.
48. Processo de acordo com a reivindicação 46, em que o inibi-dor é um inibidor de BMP-15.
49. Processo de acordo com a reivindicação 46, em que a dete-rioração óssea é caracterizada por uma perda de massa óssea.
50. Processo de acordo com a reivindicação 49, em que a per-da de massa óssea é determinada através da medida da densidade mineralóssea.
51. Processo de acordo com a reivindicação 46, em que a dete-rioração óssea é caracterizada pela degeneração da qualidade óssea.
52. Processo de acordo com a reivindicação 51, em que a de-generação da qualidade óssea é determinada através da avaliação da inte-gridade microestrutural do osso.
53. Processo de acordo com a reivindicação 40 ou 46, em queo mamífero é humano.
54. Processo de verificação em relação a e/ou de diagnósticoda densidade óssea alterada em um indivíduo que compreende: a) a deter-minação do nível de GDF-9 ou de BMP-15 em uma amostra de teste do indi-víduo; e b) a comparação do nível de GDF-9 ou de BMP-15 na amostra deteste com o nível de GDF-9 ou de BMP-15 em uma amostra de controle, emque a presença de um nível alterado de GDF-9 ou de BMP-15 na amostra deteste comparada com a amostra de controle é indicativo de uma densidadeóssea alterada e/ou uma pré-disposição ao desenvolvimento de uma densi-dade óssea alterada no indivíduo.
55. Processo de acordo com a reivindicação 54, em que o nívelde GDF-9 ou de BMP-15 é elevado em relação à amostra de controle e oindivíduo possui densidade óssea diminuída ou um maior risco de desenvol-ver densidade óssea diminuída.
56. Processo de acordo com a reivindicação 54, em que o nívelde GDF-9 ou de BMP-15 é menor em relação à amostra de controle e o indi-víduo possui maior densidade óssea ou uma maior probabilidade de desen-volver maior densidade óssea.
57. Processo de acordo com a reivindicação 54, em que o nívelde GDF-9 ou de BMP-15 é determinado utilizando um reagente de captura.
58. Processo de acordo com a reivindicação 57, em que o rea-gente de captura é um anticorpo.
59. Processo de acordo com a reivindicação 58, em que o anti-corpo compreende uma marcação detectável.
60. Processo de acordo com a reivindicação 54, em que a mar-cação detectável é selecionada do grupo que consiste de um radioistótopo,um composto fluorescente, um composto bioluminescente e um compostoquimioluminescente.
61. Kit de diagnóstico que compreende um reagente de capturaespecífico para um polipeptídeo de GDF-9 ou um polipeptídeo de BMP-15,reagentes e instruções para uso.
62. Processo de verificação em relação à densidade óssea alte-rada em um indivíduo que compreende a determinação da presença ou daausência de pelo menos uma variação de ácido nucléico em um polinucleo-tídeo que codifica GDF-9 ou BMP-15 em uma amostra de teste do indivíduo,em que a presença de pelo menos uma variação de ácido nucléico é indica-tiva de uma densidade óssea alterada e/ou de uma pré-disposição ao de-senvolvimento de uma densidade óssea alterada no indivíduo.
63. Processo de acordo com a reivindicação 62, em que a pre-sença ou a ausência de pelo menos uma variação de ácido nucléico é detec-tada através do contato da amostra com uma sonda de oligonucleotídeo quese hibridiza especificamente com um polinucleotídeo que codifica GDF-9 ouBMP-15.
64. Processo de acordo com a reivindicação 63, em que a son-da de oligonucleotídeo compreende pelo menos aproximadamente uma par-te de 15 nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo deGDF-9 ou de BMP-15 selecionado do grupo de polinucleotídeos apresentadocomo as SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3.
65. Processo de acordo com a reivindicação 62, em que o poli-nucleotídeo é selecionado do grupo que consiste de DNA, DNA genômico,cDNA, um RNA e um mRNA.
66. Processo de acordo com a reivindicação 62, em que o poli- nucleotídeo codifica uma variação de GDF-9 ou de BMP-15.
67. Processo de acordo com a reivindicação 62, em que o poli-nucleotídeo codifica um GDF-9 ou uma BMP-15 mutante.
68. Processo de acordo com a reivindicação 67, em que oGDF-9 ou a BMP-15 mutante é um GDF-9 ou uma BMP-15 truncada.
69. Uso de um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 para a pro-dução de um medicamento para o tratamento ou para a prevenção de umdistúrbio ósseo em um mamífero que necessita do mesmo.
70. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o moduladorde GDF-9 ou de BMP-15 é um inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 e o distúrbioósseo é um distúrbio degenerativo dos ossos.
71. Uso de acordo com a reivindicação 70, em que o inibidor éum inibidor de GDF-9.
72. Uso de acordo com a reivindicação 70, em que o inibidor éum inibidor de BMP-15.
73. Uso de acordo com a reivindicação 70, em que o distúrbioósseo é selecionado do grupo que consiste de osteopenia, osteomalácia,osteoporose, osteomieloma, osteodistrofia, doença de Paget, osteogêneseimperfeita, esclerose óssea, distúrbio ósseo aplásico, mieloma hipercalcêmi-co humoral, mieloma múltiplo e afinamento ósseo após a metástase.
74. Uso de acordo com a reivindicação 73, em que o distúrbioósseo é osteoporose.
75. Uso de acordo com a reivindicação 74, em que a osteopo-rose é pós-menopausa, induzida por esteróides, senil ou induzida pelo usode tiroxina.
76. Uso de acordo com a reivindicação 70, em que o distúrbioósseo no mamífero está associado com um ou mais de: hipercalcemia, do-ença renal crônica, diálise renal, hiperparatireoidismo primário e secundário,doença intestinal inflamatória, doença de Krohn e uso em longo prazo decorticosteróides ou agonistas ou antagonistas de GnRH.
77. Use de um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 para a pro-dução de um medicamento para retardar a deterioração óssea, manter oosso, restaurar o osso perdido ou estimular a formação de osso novo em ummamífero que necessita do mesmo.
78. Uso de acordo com a reivindicação 77, em que o moduladoré um inibidor de GDF-9.
79. Uso de acordo com a reivindicação 77, em que o moduladoré um inibidor de BMP-15.
80. Uso de acordo com a reivindicação 77, em que a deteriora-ção óssea é caracterizada por uma perda de massa óssea.
81. Uso de acordo com a reivindicação 80, em que a perda demassa óssea é determinada através da medida da densidade mineral óssea.
82. Uso de acordo com a reivindicação 77, em que a deteriora-ção óssea é caracterizada através da degeneração da qualidade óssea.
83. Uso de acordo com a reivindicação 82, em que a degenera-ção da qualidade óssea é determinada através da avaliação da integridademicroestrutural do osso.
84. Uso de acordo com a reivindicação 70 ou 77, em que omamífero é humano.
85. Uso de acordo com a reivindicação 70 ou 77, em que o mo·dulador é selecionado do grupo que consiste de um composto, um anticorpo,uma proteína, um peptídeo, DNA, RNA e um agente de interferência de RNA.
86. Uso de acordo com a reivindicação 85, em que o moduladoré um anticorpo.
87. Uso de acordo com a reivindicação 86, em que o anticorpoé selecionado do grupo que consiste de um anticorpo anti-GDF-9, um anti-corpo anti-receptor de GDF-9, um anticorpo anti-BMP-15 e um anticorpo an-ti-receptor de BMP-15.
88. Uso de acordo com a reivindicação 86, em que o anticorpoé um anticorpo humano ou um derivado humanizado do mesmo.
89. Uso de acordo com a reivindicação 86, em que o anticorpoé monoclonal.
90. Uso de acordo com a reivindicação 86, em que o anticorpose liga especificamente a uma proteína GDF-9 madura.
91. Uso de acordo com a reivindicação 86, em que o anticorpose liga especificamente a uma proteína BMP-15 madura.
92. Uso de acordo com a reivindicação 85, em que o moduladorse liga especificamente a uma proteína GDF-9 madura ou a uma proteínaBMP-15 madura.
93. Uso de acordo com a reivindicação 85, em que o moduladorinibe a sinalização mediada pela interação entre um polipeptídeo de GDF-9e seu receptor ou o modulador inibe a sinalização mediada pela interaçãoentre um polipeptídeo de BMP-15 e seu receptor.
94. Uso de acordo com a reivindicação 85, em que o moduladoré selecionado do grupo que consiste de um receptor solúvel de GDF-9, umaproteína de ligação ao receptor de GDF-9, um receptor solúvel de BMP-15 euma proteína de ligação ao receptor de BMP-15.
95. Uso de acordo com a reivindicação 85, em que o agente deinterferência de RNA é um RNA interferente curto de filamento duplo (siR-NA).
96. Uso de acordo com a reivindicação 95, em que o siRNA ini-be o GDF-9 ou a BMP-15 através do silenciamento da transcrição.
97. Uso de acordo com a reivindicação 70 ou 77, em que o mo-dulador é administrado de forma sistêmica.
98. Uso de acordo com a reivindicação 70 ou 77, em que o πιο-dulador deve ser administrado em uma dose eficiente escolhida das faixasde 1 Mg/kg e 20 mg/kg, 1 pg/kg e 10 mg/kg, 1 pg/kg e 1 mg/kg, 10 pg/kg e 1mg/kg, 10 μ g/kg e 100 μ g/kg, 100 μ g/kg e 1 mg/kg e 500 μ g/kg e 1 mg/kg.
99. Uso de acordo com a reivindicação 70 ou 77, em que o mo-dulador é administrado repetidamente ao longo de um período de tempo depelo menos duas semanas.
100. Uso de um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 para aprodução de um medicamento para aumentar a densidade óssea cortical emum mamífero que necessita do mesmo, em que o modulador é selecionadodo grupo que consiste de um composto, um anticorpo, uma proteína, umpeptídeo, DNA, RNA e um agente de interferência de RNA.
101. Uso de um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 para aprodução de um medicamento para aumentar a densidade óssea trabecularem um mamífero que necessita do mesmo, em que o modulador é selecio-nado do grupo que consiste de um composto, um anticorpo, uma proteína,um peptídeo, DNA, RNA e um agente de interferência de RNA.
102. Uso de acordo com a reivindicação 70 ou 77, em que acomposição compreende ainda um ou mais agentes de tratamento de dis-túrbios ósseos selecionados do grupo que consiste de bisfosfonatos, calcito-nina, estrogênios, moduladores de receptores de estrogênio seletivos, hor-mônio paratireóide, vitaminas e combinações dos mesmos.
103. Uso de acordo com a reivindicação 102, em que o agentede tratamento de distúrbios ósseos é um modulador de receptor de estrogê-nio seletivo.
104. Uso de acordo com a reivindicação 34, em que o agentede tratamento de distúrbios ósseos é um bisfosfonato.
105. Uso de acordo com a reivindicação 70 ou 77, em que acomposição compreende ainda uma ou mais proteínas osteogênicas.
106. Uso de acordo com a reivindicação 105, em que a proteínaosteogênica é selecionada do grupo que consiste de BMP-2, BMP-4, BMP-5,BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12, BMP-13 e MP52.
107. Uso de acordo com a reivindicação 105, em que a proteínaosteogênica é um inibidor de BMP-3.
108. Uso de um modulador de GDF-9 ou de BMP-15 para aprodução de um medicamento para diminuir a fertilidade e tratar ou prevenirum distúrbio ósseo em um mamífero que necessita do mesmo.
109. Uso de acordo com a reivindicação 108, em que o inibidoré um inibidor de GDF-9.
110. Uso de acordo com a reivindicação 108, em que o inibidoré um inibidor de BMP-15.
111. Uso de acordo com a reivindicação 108, em que o distúr-bio ósseo é selecionado do grupo que consiste de osteopenia, osteomalácia,osteoporose, osteomieloma, osteodistrofia, doença de Paget, osteogêneseimperfeita, esclerose óssea, distúrbio ósseo aplásico, mieloma hipercalcêmi-co humoral, mieloma múltiplo e afinamento ósseo após a metástase.
112. Uso de acordo com a reivindicação 111, em que o distúr-bio é osteoporose.
113. Uso de acordo com a reivindicação 108, em que o distúr-bio ósseo no mamífero está associado com um ou mais de: hipercalcemia,doença renal crônica, diálise renal, hiperparatireoidismo primário e secundá-rio e uso em longo prazo de corticosteróides.
114. Uso de um inibidor de GDF-9 ou de BMP-15 para a produ-ção de um medicamento para diminuir a fertilidade e para retardar a deterio-ração óssea, manter o osso, restaurar o osso perdido ou estimular a forma-ção de osso novo em um mamífero que necessita do mesmo.
115. Uso de acordo com a reivindicação 114, em que o inibidoré um inibidor de GDF-9.
116. Uso de acordo com a reivindicação 114, em que o inibidoré um inibidor de BMP-15.
117. Uso de acordo com a reivindicação 114, em que a deterio-ração óssea é caracterizada por uma perda de massa óssea.
118. Uso de acordo com a reivindicação 117, em que a perdade massa óssea é determinada através da medida da densidade mineralóssea.
119. Uso de acordo com a reivindicação 114, em que a deterio-ração óssea é caracterizada pela degeneração da qualidade óssea.
120. Uso de acordo com a reivindicação 119, em que a degene-ração da qualidade óssea é determinada através da avaliação da integridademicroestrutural do osso.
121. Uso de acordo com a reivindicação 108 ou 114, em que omamífero é humano.
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