JP2003528611A - β様糖タンパク質ホルモンのポリペプチドおよびヘテロ二量体 - Google Patents

β様糖タンパク質ホルモンのポリペプチドおよびヘテロ二量体

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Abstract

(57)【要約】 新規なβ１０ポリペプチドおよびそのヘテロ二量体、ならびにそれをコードする核酸分子が本明細書において開示される。本発明によってまた、ベクター、宿主細胞、選択的結合因子、ならびにβ１０ポリペプチドおよびそのヘテロ二量体形態、特にα２／β１０を生成する方法が提供される。β１０ポリペプチドおよびα２／β１０ヘテロ二量体またはその各々の結合因子を用いた疾患の処置、診断、改善または予防のための方法がまた、本発明によって提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は、２０００年４月２４日付け出願の米国仮特許出願番号６０／１９９，
２１１および２０００年３月２８日付け出願の米国仮特許出願番号６０／１９２
，６５４の利益を主張する、２０００年１１月２７日付出願の米国特許出願番号
０９／７２３，９７０の一部継続出願である。これらは、本明細書中において参
考として援用される。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、糖タンパク質ホルモンファミリーの新規なβ様メンバー（本明細書
中において、「ベータ（β）−１０」または「β１０」という）およびこのメン
バーをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、サブユニットとしてβ−１
０およびα−２を含む、新規なヘテロ二量体性糖タンパク質ホルモンに関する。
本発明はまた、β−１０ポリペプチドおよび開示されたβ−１０ヘテロ二量体を
産生するためのベクター、宿主細胞、選択的結合因子（例えば、抗体）および方
法に関する。また、β−１０およびβ−１０ヘテロ二量体、ならびに選択的にβ
−１０およびβ−１０ヘテロ二量体に結合する因子を使用する方法を提供する。
この方法は、β−１０またはそのβ−１０ヘテロ二量体に関連した障害の診断お
よび処置のための方法を含む。
【０００３】 （発明の背景） 一般的に当該分野で認知されているものとして、現在、ヒトにおいて産生され
る５つの糖タンパク質ホルモンポリペプチドが公知である：α−サブユニット、
ＴＳＨ−（甲状腺刺激ホルモン）−β−サブユニット、ＦＳＨ−（卵胞刺激ホル
モン）−β−サブユニット、ＬＨ−（黄体化ホルモン）−β−サブユニット、お
よびＣＧ−（絨毛性ゴナドトロピン）−β−サブユニット；Ｔｈｏｔａｋｕｒａ
およびＢｌｉｔｈｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５巻，第３−１０頁（１９
９５）；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら，第１巻，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（Ｌ．
ＤｅＧｒｏｏｔ編），第２０８−２１７頁，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９５）；ＭｏｙｌｅおよびＣ
ａｍｐｂｅｌｌ，第１巻，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（Ｌ．ＤｅＧｒｏｏｔ編
），第２３０−２４１頁，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉ
ｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９５）。第１９染色体上の単一のＬＨ−β−サ
ブユニット遺伝子に連結した、６つの相同な配列からなる多重遺伝子クラスター
によってコードされるＣＧ−β−サブユニットの例外を除き、これらのポリペプ
チドは、単一の遺伝子によって産生される；ＢｏおよびＢｏｉｍｅ，Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６７巻，３１７
９−３１８４頁（１９９２）。
【０００４】 単量体α−サブユニット（ＦＡＳ、または遊離α−サブユニット）は、ホルモ
ン活性を有し、そして下垂体および胎盤によって分泌される。ＦＡＳは、下垂体
および胎盤におけるプロラクチン産生細胞の分化において役割を果たすことが見
出されている；Ｂｅｇｅｏｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２２６巻，５６６−５６８
頁（１９８４），Ｖａｎ−ＢａｅｌおよびＤｅｎｅｆ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，第８巻，９９−１０２頁（１９９６）
，およびＭｏｙら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，第１３７巻，１３３２−１３
３９頁（１９９６）を参照のこと。そしてＦＡＳはまた、胎盤でのプロラクチン
分泌を刺激することが見出された；Ｂｌｉｔｈｅら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ，第１２９巻，２２５７−２２５９頁（１９９１）を参照のこと。
【０００５】 α−サブユニットはまた、４つのβ−サブユニットの各々とヘテロ二量体化し
て、４つのヘテロ二量体性ホルモン（ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨおよびＣＧ）を形成
する。ＴＳＨ、ＦＳＨおよびＬＨは、下垂体において産生され、分泌顆粒におい
て貯蔵され、そして適切な放出ホルモンが視床下部によって産生される場合に分
泌される。ＣＧは、胎盤において産生され、そして構成的に分泌される（これは
、分泌顆粒中に貯蔵されない）ようである；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら，第１巻，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（Ｌ．ＤｅＧｒｏｏｔ編），２０８−２１７頁，前
出，ならびに、ＨａｌｌおよびＣｒｏｗｌｅｙ，Ｊｒ．第１巻，Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ（Ｌ．ＤｅＧｒｏｏｔ編），２４２−２５８頁，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎ
ｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９５）を参
照のこと。
【０００６】 ＴＳＨは、甲状腺ホルモンの産生を調節することによって、基礎代謝に影響を
及ぼし、そして甲状腺癌の検出および処置を増強するために、臨床的に使用され
ている；ＭｃＥｖｏｙ，Ｇ．（編），ＡＨＦＳ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ，２０４１−２０４２頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅ
ａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，ＭＤ（１９９８）を参照のこと。さらに、血中のＴＳＨレベルを測定するた
めの診断試験は、甲状腺障害が疑われる場合に、甲状腺の機能的状態を決定する
ために一般的に使用されている。
【０００７】 ＦＳＨおよびＬＨは、雄性および雌性における生殖機能の維持（すなわち、性
腺の成熟および性腺でのステロイド産生）において重要な役割を果たす。ＣＧは
、最初のトリメスターの間、ステロイドホルモンを産生するために黄体を刺激す
ることによって、妊娠の維持に関与する。ＦＳＨ、ＬＨおよびＣＧは、不妊症を
処置するため、そしてまた、体外受精（ＩＶＦ）のような介助生殖手順（ａｓｓ
ｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）における試薬と
して、臨床的に使用されている；ＭｃＥｖｏｙ，Ｇ．（編），ＡＨＦＳ Ｄｒｕ
ｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２５６４−２５６７頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏ
ｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９８）を参照のこと。ＦＳＨ、ＬＨおよ
びＣＧのレベルを測定するための診断試験は、受胎能障害の診断のため、および
妊娠について試験するために使用されている。
【０００８】 上述の糖タンパク質ホルモンポリペプチドの天然に存在する代謝産物（例えば
、ＣＧのβサブユニットに由来するβ−コアフラグメント）が記載されているが
、未だ、如何なる機能もこれらの代謝産物に割り当てられていない；Ｍｏｙｌｅ
およびＣａｍｐｂｅｌｌ，第１巻，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（Ｌ．ＤｅＧｒ
ｏｏｔ編），２３０−２４１頁，前出。
【０００９】 １９９４年に、この５つの公知の糖タンパク質ホルモンポリペプチドは、ヒト
ＣＧの結晶構造に基づいて、シスチン−ノット（ｋｎｏｔ）増殖因子構造のスー
パーファミリーに配置された；Ｌａｐｔｈｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ，第３６９巻
，４５５−６１頁（１９９４）。このスーパーファミリーは、ＴＧＦ−β（トラ
ンスフォーミング増殖因子β）、ＮＧＦ（神経発育因子）およびＰＤＧＦ（血小
板由来増殖因）の遺伝子ファミリーを含む。シスチン−ノットは、３つの分子内
ジスルフィド結合によって形成され、非常に特徴的な構造を有し、そしてこのス
ーパーファミリーのすべてのメンバーの全体的な三次元構造を担う；Ｉｓａａｃ
ｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，第５巻，３９１−３９５頁（１９９５）。近年公開された特許出願は、
シスチン−ノットファミリーの新規なメンバー（ｚｓｉｇ５１）を記載している
；ＳｈｅｐｐａｒｄおよびＬｏｋ，（１９９９）ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ９９／４
１３７７。ｚｓｉｇ５１は、実際に、糖タンパク質ホルモンファミリーの新規な
α様メンバーであることが決定されている。従って、本明細書中では、これを「
α２」または「アルファ（α）−２」という［Ｐａｓｚｔｙら，（２０００）Ｗ
ＩＰＯ特許出願ＷＯ００／７８９６４］。
【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、一部分において、単離された分泌可能なヒトポリペプチド（配列番
号１）を提供する。このヒトポリペプチドは、糖タンパク質ホルモンファミリー
の新規なβ様メンバーであり、そして本明細書中では、「ベータ（β）−１０」
または「β１０」と称される。
【００１１】 本発明に従う、ヒトβ１０の全長アミノ酸配列を、図１に示す。β１０ポリペ
プチドについて予測されるＮ末端シグナルペプチドは、下線で示される。配列番
号１の８７位にあるアスパラギン（Ｎ）は、古典的なＮｘＴグリコシル化モチー
フ（ここでｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸を示し、そしてＴは、スレオニ
ンを示す）内に位置し、そしてグリコシル化される可能性がある。β１０アミノ
酸配列におけるシグナルペプチド切断部位は、図１において四角で示される８つ
のアミノ酸の領域内であることが予期される。真のインビボ切断部位である可能
性が最も高い部位でのシグナルペプチド切断を、「成熟」β１０ポリペプチドの
配列において反映させる（配列番号３）。
【００１２】 β１０ポリペプチドの最も可能性が高い「成熟」形態（すなわち、シグナルペ
プチドを除去するように、インサイチュでプロセスされた）を、ＢＬＡＳＴとし
て公知のコンピューター分析プログラムを使用して、ＮｏｎＲｅｄｕｎｄａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースに対して実行して、既知のタンパク質に対する相
同性（詳細には、共通して存在するアミノ酸残基または「保存された」アミノ酸
残基）を試験した。上位１１２個の「ヒット」は、種々の哺乳動物種、鳥類種、
および魚類種由来の種々の糖タンパク質ホルモンβ−サブユニットであることが
見出された。これらの相同性は、β１０が、糖タンパク質ホルモンファミリーの
新規なβ様メンバーであることを明確に示した。
【００１３】 さらにＧＡＰ分析によって、４つの公知のヒト糖タンパク質ホルモンβ−サブ
ユニット（上述）に対するβ１０の相同性は、３１〜３７％同一性および４２〜
４８％類似性であることが示された（本明細書中以降において言及される、図２
Ａ〜Ｄを参照のこと）。４つの公知のヒトβ糖タンパク質ホルモンポリペプチド
の成熟形態は、１２個のシステイン残基を含み、これらのシステイン残基は、６
つの分子内ジスルフィド結合を形成する。本発明のヒトβ１０ポリペプチドの成
熟形態は、１０個のシステイン残基を含み、これらのシステイン残基は、５個の
分子内ジスルフィド結合を形成する可能性がある。ＣＧ−βのジスルフィド結合
システイン対形成をモデルとして使用すると、本発明のβ１０ポリペプチドにお
ける５つの推定ジスルフィド結合について、最も可能性が高いジスルフィド結合
システイン対形成は、以下の通りである：配列番号３のＣ１２−Ｃ６０、Ｃ２６
−Ｃ７５、Ｃ３６−Ｃ９１、Ｃ４０−Ｃ９３およびＣ９６−Ｃ１０３（図３もま
た参照のこと）。
【００１４】 マウスβ１０ポリペプチドの全長アミノ酸配列を、配列番号１１に示す。そし
てマウスβ１０ ｃＤＮＡの完全コード領域のヌクレオチド配列を、配列番号１
２に示す。真のインビボ切断部位である可能性が最も高い部位でのシグナルペプ
チド切断を、「成熟」形態のマウスβ１０ポリペプチドの配列において反映させ
る（配列番号１３）。ＢｅｓｔＦｉｔ分析によって、成熟形態マウスβ１０ポリ
ペプチドと比較した場合の成熟形態ヒトβ１０ポリペプチドのアミノ酸相同性は
、９３．４％同一性および９７．２％類似性であることが示された（本明細書中
以降において言及される、図４を参照のこと）。
【００１５】 本発明のβ１０ポリペプチドが、糖タンパク質ホルモンファミリーに論理的に
内包されることに基づくと、このポリペプチドは、単量体（ＦＡＳおよびβ−コ
アフラグメントに対して類似する）であり得、および／または１以上の糖タンパ
ク質ホルモンファミリーポリペプチドとヘテロ二量体を形成し得る（例えば、二
量体α／β１０、β１０／ＴＳＨ−β、β１０／ＬＨ−β）。β１０ポリペプチ
ドはまた、既知の糖タンパク質ホルモンポリペプチドとは異なるポリペプチドと
ヘテロ二量体を形成し得る。これらの種々の可能性に基づき、β１０ポリペプチ
ドは、１つより多くのホルモン（すなわち、β１０ホルモン）を形成し得る。
【００１６】 ヘテロ二量体化アッセイを使用して、ヒトβ１０が、上述のＷＯ９９／４１３
７７およびＷＯ００／７８９６４特許出願に記載のヒトα２ポリペプチドとヘテ
ロ二量体を形成することを決定した。従って、新規なヘテロ二量体性糖タンパク
質ホルモンであるα２／β１０が発見され、そして規定された。
【００１７】 糖タンパク質ホルモンのような分泌タンパク質についてのヘテロ二量体化アッ
セイの原則は、哺乳動物細胞中への２つの異なる遺伝子の同時トランスフェクシ
ョン、馴化培地の収集、その遺伝子産物の１つに特異的に結合する抗体での免疫
沈降、および他方の遺伝子産物に特異的に結合する抗体での免疫沈降物のウェス
タンブロッティングである。適所での適切なコントロール実験を使用して、ウェ
スタンにおいて正確なサイズのバンドが存在することは、アッセイの実験条件下
での２つの遺伝子産物のヘテロ二量体化を示し、一方、ウェスタンにおいて正確
なサイズのバンドが存在しないことは、そのアッセイの実験条件下において２つ
の遺伝子産物がヘテロ二量体化しなかったことを示す。公知のヘテロ二量体性糖
タンパク質（ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＣＧ）は、適切な遺伝子での哺乳動
物細胞の同時トランスフェクションによって容易に産生され得るので、同時トラ
ンスフェクションヘテロ二量体化アッセイに基づいたこの型の哺乳動物細胞は、
糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーに適切である。
【００１８】 ヒトα２−ポリＨｉｓ−タグ哺乳動物発現ベクターおよびヒトβ１０−ＦＬＡ
Ｇ−タグ哺乳動物発現ベクターを、２９３細胞中に同時トランスフェクトし、そ
して無血清馴化培地を７２時間後に収集した。免疫沈降を、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２
−Ａｇａｒｏｓｅアフィニティービーズ（Ｃａｔ＃Ａ１２０５，Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して実施した。この免疫沈降物のウェスタンブロ
ットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｌｉｎｘ ＨＲＰ Ｒａｐｉｄ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｃａｔ＃８０５０−０１，Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に結合体化された、ア
フィニティー精製抗α２ウサギポリクローナル抗体（実施例４）でプローブした
。強いα２−ポリＨｉｓ−タグバンドが、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｃａｔ＃ＲＰＮ ２１０６，Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用し
て観察された。コントロール実験により、ウェスタンブロットにおける強いα２
−ポリＨｉｓ−タグバンドの存在は、ヒトβ１０−ＦＬＡＧ−タグ哺乳動物発現
ベクターとの同時トランスフェクションおよび抗ＦＬＡＧ Ｍ２−Ａｇａｒｏｓ
ｅアフィニティービーズの使用に、完全に依存することが示された。これらの２
つの要素のいずれかが実験から外された場合またはそのままのアガロースビーズ
（すなわち、抗ＦＬＡＧ抗体を有さない）が、免疫沈降工程に使用された場合に
は、α２−ポリＨｉｓ−タグバンドは観察されなかった。
【００１９】 公知のヘテロ二量体性糖タンパク質ホルモン（ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨおよびＣ
Ｇ）と同様に、α２／β１０は、α様糖タンパク質ホルモンポリペプチドとβ様
糖タンパク質ホルモンポリペプチドとのヘテロ二量体である。
【００２０】 これらのデータはまた、組換えの分泌α２／β１０ヘテロ二量体（ポリＨｉｓ
アフィニティータグも、ＦＬＡＧアフィニティータグも有さない）が、種々の治
療的用途および診断的用途（以下にさらに記載される）のために哺乳動物細胞に
おいて産生され得ることを示す。
【００２１】 ＣＧのようなヘテロ二量体性糖タンパク質ホルモンはまた、例えば、適切な条
件下における単離されたα−サブユニットと単離されたＣＧ−βサブユニットと
の同時インキュベーションに際して、インビトロでアセンブルされ得る［Ｂｌｉ
ｔｈｅおよびＩｌｅｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１３６巻、９０３−９
１０頁（１９９５）を参照のこと］。α２／β１０ヘテロ二量体も同様に、単離
されたα２ポリペプチドと単離されたβ１０ペプチドとの同時インキュベーショ
ンに際して、インビトロでアセンブルされ得る。このようなアセンブルされたα
２／β１０ヘテロ二量体は、種々の治療的用途および診断的用途（以下にさらに
記載される）のために使用され得る。
【００２２】 マウスα２単独、マウスβ１０単独またはマウスα２／β１０ヘテロ二量体を
過剰発現する、トランスジェニックマウスを作製した（実施例６を参照のこと）
。α２／β１０ヘテロ二量体を過剰発現するそれらのトランスジェニックのみが
、コントロールマウスと比較した場合に、明確な表現型的差異を示した。このα
２／β１０を過剰発現するトランスジェニックマウスは、血清Ｔ４レベルの上昇
によって示されるように、多発性の濾胞性乳頭状腺腫による両方の甲状腺肥大お
よび生じた甲状腺機能亢進症によって特徴付けられる表現型を示した。他の表現
型変化は、全身性の甲状腺機能亢進状態に関連すると思われ、そしてこれらには
、中程度の肝腫、肝細胞過形成、および血清コレステロールレベルのわずかな上
昇、両側の腎肥大、および穏やか〜中程度の白血球増加症（リンパ球の優性を伴
う）が含まれた（実施例６を参照のこと）。従って、正常なマウス設定において
、α２／β１０は、明らかに、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）様活性を有する。
マウスα２とヒトα２との間の高いレベルのアミノ酸保存［推定成熟形態（すな
わち、シグナルペプチドを有さない）について、８８．５％の同一性および９０
．４％の類似性］、マウスβ１０とヒトβ１０との間の高いレベルのアミノ酸保
存［推定成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを有さない）について、９３．
４％の同一性および９７．２％の類似性］、およびマウス甲状腺の生物学とヒト
甲状腺の生物学との間の非常に高い類似性に起因して、ヒトα２／β１０ヘテロ
二量体は、マウスα２／β１０ヘテロ二量体に見出された活性と同じ甲状腺刺激
ホルモン（ＴＳＨ）様活性を有することが予測される。ＴＳＨ様活性に加えて、
α２／β１０は、本明細書中以下により詳細に記載するように、異なる生理学的
設定（すなわち、疾患状態）における、他の明確な生物学的効果を有し得る。
【００２３】 ＴＳＨは、甲状腺ホルモンの産生を調節することによって基礎代謝に影響し、
そして甲状腺癌の検出および処置を増強するために臨床的に使用される；ＭｃＥ
ｖｏｙ，Ｇ．（編）、ＡＨＦＳ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０４１
−２０４２頁、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙ
ｓｔｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９
９８）を参照のこと。さらに、血液中のＴＳＨレベルを測定するための診断試験
が、甲状腺障害が予測される場合の甲状腺の機能的状態を決定するために、一般
的に使用される。ヒトα２／β１０は、ＴＳＨと同様の臨床的有用性を有し、そ
して甲状腺に関連する疾患および障害の処置および診断に有用であるようである
。さらに、ヒトα２／β１０は、他の治療的用途および診断用途を有し得、これ
らを、本明細書中に記載する。ヒトα２／β１０選択的結合因子（例えば、抗体
）が、ＴＳＨ選択的結合因子と類似の臨床的有用性を有し、そして従って、甲状
腺に関連する疾患および障害の処置および診断に有用であると推測することは妥
当である。さらに、ヒトα２／β１０選択的結合因子は、本明細書中に記載され
るような、他の治療的用途および診断的用途を有し得る。
【００２４】 本発明はまた、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離
された核酸分子を提供する： （ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号１に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条
件下で（ａ）または（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であ
って、ここで、そのコードされるポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテ
ロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレ
オチド配列；および （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２５】 本発明はまた、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離
された核酸分子を提供する： （ａ）配列番号１に示されるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、こ
こで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合
、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプ
ライス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、そのコードされ
るポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα
２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードす
る、配列番号２、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列であって、ここで、こ
のポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα
２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号２また
は（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列； （ｅ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条
件下で（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオ
チド配列であって、ここで、そのコードされるポリペプチドは、ヒトα２ポリペ
プチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有
する、ヌクレオチド配列；および （ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２６】 本発明はさらに、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単
離された核酸分子を提供する： （ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号１に示されるポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチド
は、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテ
ロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号１に示されるポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒ
トα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量
体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号１に示されるポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒ
トα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量
体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号１に示されるポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチド
は、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテ
ロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端
短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号１に示さ
れるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペ
プチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１
０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）の
ヌクレオチド配列； （ｇ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条
件下で（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配
列であって、ここで、そのコードされるポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチド
にヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、
ヌクレオチド配列；および （ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２７】 本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離され
たポリペプチドを提供する： （ａ）配列番号３に示される成熟アミノ酸配列であって、必要に応じて、アミ
ノ末端メチオニンをさらに含む、アミノ酸配列； （ｂ）配列番号３のオルソログのアミノ酸配列であって、ここで、そのコード
されるポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒ
トα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列； （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
パーセント同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒ
トα２ポリペプチドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量
体の活性を有する、アミノ酸配列； （ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号３に示されるアミノ酸
配列のフラグメントであって、ここで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプ
チドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有す
る、フラグメント； （ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列または（ａ）〜（ｃ）の少なくとも
１つのいずれかの、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列で
あって、ここで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ二量体化
された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列。
【００２８】 本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離さ
れたポリペプチドを提供する： （ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号３に示される
アミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに
ヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ア
ミノ酸配列； （ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号３に示されるアミノ
酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ
二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸
配列； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号３に示されるアミノ
酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドにヘテロ
二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸
配列； （ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号３に示される
アミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに
ヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ア
ミノ酸配列；および （ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端
短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号３に示
されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、ヒトα２ポリペプ
チドにヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有す
る、アミノ酸配列。
【００２９】 上記の（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供さ
れる。
【００３０】 本発明はまた、本明細書中に示される単離された核酸分子を含む、発現ベクタ
ー、本明細書中に示される組換え核酸分子を含む、組換え宿主細胞、および本発
明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を産生するための方法
を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、こ
のようにして産生されたβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を
単離する工程、を包含する。
【００３１】 本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体をコードする核
酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明に包含される。こ
れらの核酸分子は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の発現
およびそのレベルの増加（循環中のレベルの増加を含み得る）を可能にする様式
で、その動物に導入される。このトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは
、哺乳動物である。
【００３２】 本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の誘導体もまた
、提供される。
【００３３】 さらに、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を特異
的に結合し得る、抗体およびペプチドのような選択的結合因子が提供される。こ
のような抗体およびペプチドは、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ
二量体の活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００３４】 本発明のヌクレオチド、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
、または選択的結合因子と、１以上の薬学的に受容可能な処方剤とを含む、薬学
的組成物もまた、本発明に包含される。これらの薬学的組成物は、本発明のヌク
レオチドまたはポリペプチドの治療有効量を提供するように使用される。本発明
はまた、これらの核酸分子、β１０ポリペプチド、α２／β１０ヘテロ二量体お
よび選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００３５】 本発明の核酸分子、β１０ポリペプチド、α２／β１０ヘテロ二量体および選
択的結合因子は、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む疾患および障害
を、処置、予防、改善および／または検出するために使用され得る。
【００３６】 本発明はまた、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体に結合す
る試験分子を同定するための、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方
法は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体に試験分子を接触さ
せる工程、およびβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体への試験
分子の結合の程度を試験する工程を包含する。この方法はさらに、このような試
験分子が、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体のアゴニストま
たはアンタゴニストであるか否かを決定する工程を包含する。本発明はさらに、
β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の発現あるいはβ１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の活性に対する、分子の影響を試験す
る方法を提供する。
【００３７】 本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の発現を調節す
る方法およびレベルをモジュレート（すなわち、増加または減少）する方法もま
た、本発明に包含される。１つの方法は、このようなβ１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体をコードする核酸分子を、動物に投与する工程を包含
する。別の方法において、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体の発現を調節またはモジュレートするエレメントを含む核酸分子が、投
与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載するような、
遺伝子治療、細胞療法、およびアンチセンス療法が挙げられる。
【００３８】 （発明の詳細な説明） 本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして
記載される主題を限定することとして解釈されるべきではない。本願において引
用される全ての参考文献は、明示的に本明細書中に参考として援用される。
【００３９】 （定義） 用語「β１０遺伝子」または「β１０核酸分子」また「ポリヌクレオチド」と
は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列、配列番号１に示されるポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１０における
ＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子
を含むかまたはこれらからなる、核酸分子をいう。
【００４０】 用語「β１０ポリペプチド」とは、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、および関連するポリペプチドをいう。関連するポリペプチドとしては、以
下が挙げられる：β１０ポリペプチド対立遺伝子改変体、β１０ポリペプチドオ
ルソログ、β１０ポリペプチドスプライス改変体、β１０ポリペプチド改変体、
およびβ１０ポリペプチド誘導体。β１０ポリペプチドは、本明細書中に定義さ
れるような、成熟ポリペプチドであり得、そして調製される方法に依存して、ア
ミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００４１】 用語「β１０ポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物または生物の集団の
染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの
代替形態のうちの１つをいう。
【００４２】 用語「β１０ポリペプチド誘導体」とは、化学的に改変された、本明細書中に
定義されるような、配列番号３に示されるポリペプチド、そのポリペプチド対立
遺伝子改変体、そのポリペプチドオルソログ、そのポリペプチドスプライス改変
体、またはそのポリペプチド改変体をいう。
【００４３】 用語「β１０ポリペプチドフラグメント」とは、以下のポリペプチドのアミノ
酸末端での短縮（リーダー配列を含むか、または含まない）および／またはカル
ボキシ末端での短縮を含むポリペプチドをいう：配列番号３に示されるポリペプ
チド、そのポリペプチド対立遺伝子改変体、そのポリペプチドオルソログ、その
ポリペプチドスプライス改変体、および／または配列番号３に示されるβ１０ポ
リペプチドアミノ酸配列と比較した場合に１つ以上のアミノ酸の付加もしくは置
換もしくは内部欠失を有するそのポリペプチド改変体（生じるポリペプチドが、
少なくとも６アミノ酸以上の長さである）。ポリペプチドフラグメントは、選択
的ＲＮＡスプライシングからか、またはインビボプロテアーゼ活性から、生じ得
る。好ましい実施形態において、短縮は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ
酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、
または約１００より多くのアミノ酸を含む。そのように生成されたポリペプチド
フラグメントは、約２５個連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約
７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２
００アミノ酸を含む。このようなポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、
アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、β
１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を生成するために、使用され
得ることが、理解される。
【００４４】 用語「β１０融合ポリペプチド」とは、以下のポリペプチドのアミノ末端また
はカルボキシ末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種ペプチドまたは異種ポ
リペプチド）の融合物をいう：配列番号３に示されるポリペプチド、ポリペプチ
ド対立遺伝子改変体、ポリペプチドオルソログ、ポリペプチドスプライス改変体
、または配列番号３に示されるβ１０ポリペプチドアミノ酸配列と比較した場合
に、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、または内部付加を有する、ポリペプチド
改変体。
【００４５】 用語「β１０ポリペプチドオルソログ」とは、配列番号３に示されるβ１０ポ
リペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば
、マウスβ１０ポリペプチドとヒトβ１０ポリペプチドとは、互いにオルソログ
であると見なされる。
【００４６】 用語「β１０ポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号３に示されるβ
１０ポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロ
セシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００４７】 用語「β１０ポリペプチド改変体」とは、配列番号３に示されるβ１０ポリペ
プチドアミノ酸配列と比較した場合、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例
えば、内部欠失および／もしくはポリペプチドフラグメント）、ならびに／また
は付加（例えば、内部付加および／もしくは融合ポリペプチド）を有するアミノ
酸配列を含む、β１０様ポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在し得る（例
えば、β１０様ポリペプチド対立遺伝子改変体、β１０様ポリペプチドオルソロ
グ、およびβ１０様スプライス改変体）か、または人工的に構築され得る。この
ようなポリペプチド改変体は、配列番号２に示されるＤＮＡ配列からしかるべく
変動するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実
施形態において、この改変体は、１〜３個、または１〜５個、または１〜１０個
、または１〜１５個、または１〜２０個、または１〜２５個、または１〜５０個
、または１〜７５個、または１〜１００個、または１００個よりも多いアミノ酸
の置換、挿入、付加および／もしくは欠失を有し、ここでその置換は、保存的で
あっても、または非保存的であってもよいし、あるいはその組み合わせであって
もよい。
【００４８】 用語「α２／β１０ヘテロ二量体」とは、β１０ポリペプチドとα２ポリペプ
チドとのヘテロ二量体をいう。
【００４９】 用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そし
てさらに、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するために動物におい
て用いられ得る、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープ
を有し得る。
【００５０】 用語「生物学的に活性なβ１０ポリペプチド」とは、ヒトα２ポリペプチドと
ヘテロ二量体形成した場合に、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、
β１０様ポリペプチドをいう。
【００５１】 用語「有効量」および「治療的に有効な量」とは、各々、本明細書中に記載さ
れるα２／β１０ヘテロ二量体の観察可能なレベルの１つ以上の生物学的活性を
支持するために使用される、本発明のβ１０核酸分子またはβ１０ポリペプチド
またはα２／β１０ヘテロ二量体の量をいう。
【００５２】 用語「発現ベクター」は、宿主細胞において使用するのに適切であり、そして
異種核酸配列の発現を指向および／または制御する核酸配列を含む、ベクターを
いう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが
存在する場合）のようなプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】 用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたかまたは形質転換され得、次
いで目的の選択された遺伝子を発現し得る、細胞をいうために用いられる。この
用語は、この選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝的構成
においてもとの親と同一であってもなくても、この親細胞の子孫を含む。
【００５４】 用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、当該分野で公知のように、２つ以上
のポリペプチド分子、または２つ以上の核酸分子の配列の間にある、これらの配
列を比較することによって決定される、関係をいう。当該分野では、「同一性」
はまた、核酸分子またはポリペプチドの間の配列関連性の程度（場合によっては
、２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列のストリングの間
の一致により決定され得る）を意味する。「同一性」は、特定の算術モデルまた
はコンピュータープログラム（すなわち、アルゴリズム）によって位置付けられ
る、ギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの短
い方の間の同一適合のパーセントを測定する。
【００５５】 用語「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、関連する概念であるが、「同一
性」とは対照的に、「類似性」とは、同一適合および保存的置換適合の両方を含
む関連性の尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一
のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換であるならば、同一性パーセ
ントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％である。同じ例で、保存的置換
が存在するさらに５つの位置が存在するならば、同一性パーセントは、５０％の
ままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）である。従って、保存
的置換が存在する場合、２つのポリペプチドの間の類似性パーセントは、これら
の２つのポリペプチドの間の同一性パーセントよりも高い。
【００５６】 用語「単離された核酸分子」とは、天然で結合している少なくとも１つの夾雑
核酸分子を含まない、本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離され
た核酸分子は、ポリペプチド産生における使用、または治療的使用、診断的使用
、予防的使用、または研究的使用を妨げる、その天然の環境において見出される
他のいかなる夾雑核酸分子も他の夾雑物も、実質的には含まない。
【００５７】 用語「単離されたポリペプチド」とは、その天然の環境において見出される少
なくとも１つの夾雑ポリペプチドも他の夾雑物も含まない、本発明のポリペプチ
ドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、その治療用途、診断用
途、予防用途または研究用途を妨害する、その天然の環境において見出されるい
かなる他の夾雑ポリペプチドも他の夾雑物も実質的に含まない。
【００５８】 用語「成熟β１０ポリペプチド」とは、リーダー配列を欠くβ１０ポリペプチ
ドをいう。成熟β１０ポリペプチドはまた、アミノ末端（リーダー配列を有する
か、または有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロ
セシング、より大きい前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、Ｎ結合型グ
リコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化などのような、他の改変を含み
得る。
【００５９】 用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう
。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのうちのいずれかから
形成される分子を含み、この塩基アナログは、例えば、以下であるがこれらに限
定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン
、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキ
シルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カル
ボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメ
チルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン
、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１
−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチ
ルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン
、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ
−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ
−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウ
ラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニ
ン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オ
キシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２
−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオ
ウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル
、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉ
ｎｅ）、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００６０】 用語「天然に存在する」または「ネイティブ」は、生物学的材料（例えば、核
酸分子、ポリペプチド、宿主細胞など）に関して使用される場合、天然に見出さ
れかつ人工的に操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」ま
たは「非ネイティブ」は、本明細書中において使用される場合、天然には見出さ
れないか、または人工的に構造改変されたかもしくは合成された、材料をいう。
【００６１】 用語「作動可能に連結された」は、隣接配列の配置方法をいうために本明細書
中に使用される。ここで、このように記載される隣接配列は、その有用な機能を
実行するように構成されるかまたは組立てられる。従って、コード配列に作動可
能に連結された隣接配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳をもた
らし得る。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指向し得る場合、このコ
ード配列は、このプロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、正確に機
能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、翻訳され
ないが転写される介在配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得
、そして、このプロモーター配列はなお、このコード配列に「作動可能に連結さ
れた」とみなされ得る。
【００６２】 本明細書中に使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「
生理学的に受容可能なキャリア」は、薬学的組成物としてβ１０核酸分子、β１
０ポリペプチド、α２／β１０ヘテロ二量体または本発明の選択的結合因子の送
達を、達成するかまたは増強するために適切な１つ以上の処方材料をいう。
【００６３】 用語「選択的結合因子」は、本発明のβ１０ポリペプチドおよび／またはα２
／β１０ヘテロ二量体に対して特異性を有する分子をいう。本明細書中に使用さ
れる場合、用語「特異的」および「特異性」は、ヒトβ１０ポリペプチドおよび
／またはα２／β１０ヘテロ二量体に結合するがヒト非β１０ポリペプチドおよ
び／または非α２／β１０ヘテロ二量体に結合しない、選択的結合因子の能力を
いう。しかし、選択的結合因子が、配列番号３に示されるようなポリペプチドの
オルソログおよび／またはヒトα２／β１０ヘテロ二量体のオルソログ（すなわ
ち、その種間のバージョン（例えば、マウスポリペプチドおよびラットポリペプ
チド））もまた結合し得ることが、理解される。
【００６４】 用語「形質導入」は、１つの細菌から別のものへの（通常、ファージによる）
遺伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスに
よる真核生物細胞配列の獲得および移入をいう。
【００６５】 用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡ
の取り込みをいうために使用される。そして、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の
内側に導入された場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェ
クション技術は、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に開示される。例
えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，１９７３；Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９
８６；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ，１３：１９７，１９８１を参照のこと。この
ような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために
使用され得る。
【００６６】 用語「形質転換」は、本明細書中に使用される場合、細胞の遺伝特徴における
変化をいい、そして細胞は、新たなＤＮＡを含むように変更された場合、形質転
換されている。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に変更された
場合、形質転換されている。トランスフェクションおよび形質導入に続いて、形
質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に介入させることによって、細胞のＤＮ
Ａと組み換わり得、これは、複製されることなくエピソームエレメントとして一
過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製され得る。細胞は
、ＤＮＡが細胞の分裂を伴って複製される場合、安定に形質転換されているとみ
なされる。
【００６７】 用語「ベクター」は、コード情報を宿主細胞へ移入させるために使用される、
任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用さ
れる。
【００６８】 （核酸分子および／またはポリペプチドの関連性） 関連する核酸分子が、配列番号２の核酸分子の対立遺伝子またはスプライス改
変体を含み、そして上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を含
むことが、理解される。関連する核酸分子はまた、配列番号１のポリペプチドと
比較して、１つ以上のアミノ酸残基の置換、変更、付加、および／または欠失を
含むか、またはこれらから本質的になるポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を含む。
【００６９】 フラグメントは、配列番号１のポリペプチドの、少なくとも約２５アミノ酸残
基、または約５０、または約７５、または約１００、または約１００より多いア
ミノ酸残基のポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００７０】 さらに、関連するβ１０核酸分子としては、本明細書中に規定されるような中
程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件下で、配列
番号２の核酸分子の完全な相補配列、または配列番号１のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードする分子の完全な相補配列、または本明細書中に規定される
ような核酸フラグメントの完全な相補配列、または本明細書中に規定されるよう
なポリペプチドをコードする核酸フラグメントの完全な相補配列とハイブリダイ
ズするヌクレオチド配列を含む分子が挙げられる。ハイブリダイゼーションプロ
ーブは、本明細書中に提供されるβ１０配列を用いて調製されて、関連する配列
に関して、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、または合成ＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングし得る。既知の配列と有意な同一性を示すβ１０ポリ
ペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載
されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そして
このような領域は、スクリーニングのためのプローブを設計するために使用され
得る。
【００７１】 用語「高度にストリンジェントな条件」は、配列が高度に相補的であるＤＮＡ
鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして有意に不一致な（ｍｉｓｍａｔ
ｃｈｅｄ）ＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件を
いう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強
度、およびホルムアミドのような変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０
．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６
８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリ
ウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
．Ｙ．１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｓａｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照の
こと。
【００７２】 よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、
より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよいが、ハイブリダ
イゼーションの速度は、影響を受ける。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼ
ーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する
目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。例とし
ては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１
％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４ すなわちＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子Ｄ
ＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適
切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダ
イゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更さ
れ得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施され
るが、代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほ
とんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章
、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参
照のこと。
【００７３】 ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび
塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によ
って調整され得、これらの変数を適合させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡが
ハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温
度は、以下の式によって概算され得る： Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ
）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド） ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼ
ーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃ
は、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不
完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致に対して約１
℃ずつ減少する。
【００７４】 用語「中程度にストリンジェントな条件」は、「高度にストリンジェントな条
件」下で生じ得るよりもより大きい程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が
、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は
、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０
〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナ
トリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０
１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は
、約２１％の不一致を許容する。
【００７５】 「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件と
の間に完全な区別は存在しないことが、当業者によって理解される。例えば、０
．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した
長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄
において、これは、約６％の不一致を許容する。より離れた関連する配列を捕獲
するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し
得る。
【００７６】 約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ＊における融解温度の適切な概算は、以下： Ｔｍ＝１つのＡ−Ｔ塩基対につき２℃＋１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃ によって提供される。
【００７７】 ＊６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１
Ｍである。Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓ
ｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（
編）（１９８１）を参照のこと。
【００７８】 オリゴヌクレオチドに対して高度にストリンジェンシーな洗浄条件は、通常、
６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて、このオリゴヌクレオチドのＴｍより０〜
５℃低い温度である。
【００７９】 別の実施形態において、関連する核酸分子は、配列番号２に示されるようなヌ
クレオチド配列に約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしく
はこれからなるか、または配列番号１に示されるポリペプチドに約７０パーセン
ト同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはこれ
から本質的になる。好ましい実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列
番号２に示されるヌクレオチド配列に、約７０パーセント、７５パーセント、８
０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９
５、９６、９７、９８または９９パーセント同一であるか、あるいは、このヌク
レオチド配列は、配列番号１に示されるポリペプチド配列に、約７０パーセント
、７５パーセント、８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パ
ーセント、または約９５、９６、９７、９８、または９９パーセント同一である
ポリペプチドをコードする。
【００８０】 核酸配列における差異は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配
列の保存的変更および／または非保存的変更を生じ得る。
【００８１】 配列番号１のアミノ酸配列に対して保存的な変更（およびコードするヌクレオ
チドに対する対応する変更）は、天然に存在するβ１０ポリペプチドに類似した
機能的特徴および化学的特徴を有する、本発明によるβ１０様ポリペプチドを生
成する。対照的に、β１０ポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴
における実質的な変更は、配列番号１のアミノ酸配列において置換を選択するこ
とによって達成され得、これは、（ａ）置換領域における分子骨格の構造（例え
ば、シートコンフォメーションまたはらせんコンフォメーションのような）、（
ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）大部分の側鎖、
の維持に対するその影響がかなり異なる。
【００８２】 例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性ま
たは電荷にほとんど影響がないか、またはこれらの影響がないような、ネイティ
ブなアミノ酸残基の非ネイティブな残基を用いた置換を含み得る。さらに、ポリ
ペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニン走査変異誘発」に関し
て以前に記載されたように、アラニンで置換され得る。
【００８３】 保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学
的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸
残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転
形態または反転形態が挙げられる。
【００８４】 天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてグループに分けられ得る
： １）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ； ２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ； ３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ； ４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ； ５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および ６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００８５】 例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のク
ラス由来のメンバーへの交換を含み得る。このような置換された残基は、非ヒト
β１０ポリペプチドオルソログと相同性であるヒトβ１０ポリペプチドの領域、
またはこの分子の非相同性領域に導入され得る。
【００８６】 このような変更を作製する場合、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐ
ａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）が、考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性特徴
および荷電特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。これらは、
イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェ
ニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（
＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０
．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．
３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．
５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（
−３．５）；リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。
【００８７】 タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるハイド
ロパシーアミノ酸指標の重要性は、当該分野において理解されている（Ｋｙｔｅ
ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１（１９８２））。特定のアミ
ノ酸が類似のハイドロパシー指標またはハイドロパシースコアを有する他のアミ
ノ酸に代わって置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得る
ことが、公知である。ハイドロパシー指標に基づいて変化を起こす際に、ハイド
ロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるもの
が特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００８８】 類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これに
よって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場
合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）
こともまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性
によって支配される、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性は、その免疫原
性および抗原性に、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に、相関する。
【００８９】 以下の親水性の値が、以下のアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン
（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタ
ミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グ
ルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（
−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン
（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１
．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン
（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づい
て変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１
以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特
に好ましい。一次アミノ酸配列から、エピトープを、親水性に基づいて同定もし
得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００９０】 所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、そ
のような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用し
て、β１０ポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載
されるβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の親和性を増加もし
くは減少させ得る。
【００９１】 例示的なアミノ酸置換は、表Ｉに記載される。
【００９２】 （表１） （アミノ酸置換）
【００９３】
【表１】 当業者は、配列番号１または配列番号３のポリペプチドの適切な改変体を、周
知の技術を使用して、決定し得る。活性を破壊することなく変化され得る分子の
適切な領域を同定するために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられ
ない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活
性を有する類似のポリペプチドが公知である場合には、当業者は、β１０ポリペ
プチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このよ
うな比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を
同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、β１０
ポリペプチドの領域における変化が、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体の生物学的活性および／または構造に不利に影響を与える可能性はさ
ほどないことが、理解される。当業者はまた、比較的保存された領域においてさ
え、活性を維持しながら、天然に存在する残基を化学的に類似するアミノ酸に置
換し得ることを知っている（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性
または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することな
く、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置
換に供され得る。
【００９４】 さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチド
における残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較を考
慮して、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残
基に対応するβ１０ポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を予測し得る
。当業者は、β１０ポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基に
代わる化学的に類似するアミノ酸での置換を、選択し得る。
【００９５】 当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造、およびその構造に関
連するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報を考慮して、当業者は、β１
０ポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測
し得る。当業者は、そのタンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残
基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような
残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者
は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。次
いで、これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニ
ングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために
使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、
望ましくなく減少した活性、または適切でない活性を生じたことを発見した場合
には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような
慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でか
または他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を
、容易に決定し得る。
【００９６】 多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，Ｊ．，
Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７（４）：４２２−４２７（１９９６
）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３（２）：２２２−２４５（１
９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３（２）：２１１−２
２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅ
ａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６（１９７８）；およびＣｈ
ｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照のこ
と。さらに、コンピュータープログラムが、二次構造の予測を補助するために現
在利用可能である。二次構造を推測する１つの方法は、相同性モデリングに基づ
く。例えば、３０％よりも大きい配列同一性、または４０％よりも大きい配列類
似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構
造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長に
より、二次構造の推測可能性（ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在
的な折り畳みの数を含む）の促進がもたらされた。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄ．Ｒｅｓ．２７（１）：２４４−４７（１９９９）を参照のこと。所定のポ
リペプチドもしくはタンパク質において限定された数の折り畳みが存在すること
、および一旦臨界数の構造が決定されると、構造予測が劇的により正確になるこ
と、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂ
ｉｏｌ．７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【００９７】 二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ
）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：
３７７−３８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４（１）：
１５−９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ Ｅ
ｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７
））、および「進化学的連鎖」（Ｈｏｍｅら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、
前出を参照のこと）を包含する。
【００９８】 本発明に従う好ましいβ１０ポリペプチド改変体またはα２／β１０ヘテロ二
量体改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号１に記
載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。
１つの実施形態において、本発明に従うβ１０ポリペプチド改変体またはα２／
β１０ヘテロ二量体改変体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列より多いかまた
はより少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、
配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここ
で、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得
る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖の付加のた
めの潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存
在するＮ結合型糖鎖を除去する。１つ以上のＮ結合グリコシル化部位（代表的に
は、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ
結合部位が作製される、Ｎ結合型糖鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好
ましいβ１０ポリペプチド改変体またはα２／β１０ヘテロ二量体改変体として
は、１つ以上のシステイン残基が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と比較して
欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、シ
ステイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、β１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体が、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に
活性な立体構造へとリフォールディングされなければならない場合に、有用であ
る。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン
残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシ
ステインから生じる相互作用を最小にする。
【００９９】 さらに、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのポリペプチ
ド改変体は、異種ポリペプチド（例えば、限定しないが、α２）に融合されてヘ
テロ二量体を形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が
挙げられるが、それらに限定されない：β１０融合ポリペプチドまたはα２／β
１０ヘテロ二量体の検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レ
セプタータンパク質またはその部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメ
インおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガン
ドまたはその部分；触媒的に活性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を
促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；
β１０が正常に二量体化するポリペプチド（例えば、α２）；安定性を増加させ
るポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはそのポリペプチド
改変体とは異なる治療活性を有する、ポリペプチド。
【０１００】 融合は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいはポリ
ペプチド改変体の、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、な
され得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接であっても、リン
カーもしくはアダプター分子を使用して間接的であってもよい。リンカーまたは
アダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５
０アミノ酸残基であり得る。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合した部
分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアー
ゼについての切断部位を有して設計され得る。一旦構築されると、融合ポリペプ
チドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される
。
【０１０１】 本発明のさらなる実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペ
プチド、またはポリペプチド改変体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメ
インに融合される。抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む；抗原を
結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに補体活性化および食作
用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の
定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である
。Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−３１（１９８９）。治療タン
パク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し
得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合のような機能
、および恐らく、胎盤移入のような機能さえも、組み込み得る（同書）。表ＩＩ
は、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【０１０２】
【表２】 一つの例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域の全てま
たは一部は、当業者に公知の方法を使用してβ１０ポリペプチドのＮ末端または
Ｃ末端のいずれかに融合され得る。得られるβ１０融合ポリペプチドまたはα２
／β１０融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によっ
て精製され得る。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、融合され
ていない対応物よりも実質的に長い半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ
領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域
は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または特定の質（例えば、治療的質
、循環時間、凝集の減少など）を改善するために変更され得る。
【０１０３】 関連する核酸分子およびペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によっ
て容易に計算され得る。このような方法としては、以下が挙げられるがこれらに
限定されない：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａ
ｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編
，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，
Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ
，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，
Ｊ．編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；な
らびにＣａｒｉｌｌｏ編，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：
１０７３，（１９８８）に記載される方法。
【０１０４】 同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配
列間に最も大きな一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定す
るための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに記載される。２つの
配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム
方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧＣＧプログラムパ
ッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２
：３８７，１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む
）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸプ
ログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ
Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，上記）から公に入手可能である。
周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた同一性を決定するため
に使用され得る。
【０１０５】 ２つのアミノ酸配列を整列させるための特定の整列スキームは、２つの配列の
短い領域のみの一致を生じ得、この小さな整列された領域は、２つの全長配列間
に有意な関係がないとしても非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好まし
い実施形態においては、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリ
ペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【０１０６】 例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の割合が決定される２つのポリペプチ
ドは、それらのそれぞれのアミノ酸の最適の一致（アルゴリズムによって決定さ
れる「一致したスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）について整列される。
ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ
）（これは、平均ダイアゴナルの３倍として計算され；「平均ダイアゴナル」は
、使用される比較マトリクスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は
、特定の比較マトリクスによってそれぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられ
るスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（これ
は、通常ギャップオープニングペナルティーの１／１０である）、ならびにＰＡ
Ｍ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリクスがアルゴリズムととも
に使用される。標準比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスのついてＤａ
ｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５巻、補遺３（１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マ
トリクスについてＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９、１９９２）もまたアルゴリズムによ
って使用される。
【０１０７】 ポリペプチド配列の比較に好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる
： アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリクス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ ６
２（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）より） ギャップペナルティー（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２ ギャップレングスペナルティー（Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）：
４ 類似性の閾値：０。
【０１０８】 ＧＡＰプログラムは、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメータ
ーは、ＧＡＰアルゴリズムを使用してポリペプチド比較についてのデフォルトパ
ラメーター（末端ギャップについてペナルティーなしで）である。
【０１０９】 核酸分子配列比較についての好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられ
る： アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３
−４，１９７０ 比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップレングスペナルティー：３。
【０１１０】 ＧＡＰプログラムはまた、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメ
ーターは、核酸分子比較についてのデフォルトパラメーターである。
【０１１１】 他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエ
クステンションペナルティー、比較マトリクス、類似性の閾値などが使用され得
、これには、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａ
ｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを
含む。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、なされる特定の比較（例
えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ間、タンパク質−タンパク質間、タンパク質−ＤＮＡ間）
；さらに、比較が配列の対間である（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが
一般的に好ましい）か、一つの配列と配列の大きなデータベースとの間（この場
合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか）に依存する。
【０１１２】 （合成） 本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が組換え手段および他の
手段によって作製され得ることが当業者に理解される。
【０１１３】 （核酸分子） 核酸分子は、本発明のβ１０ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードし、種々の方法（化学合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリ
ーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増
幅を含むがこれらに限定されない）で容易に得られ得る。
【０１１４】 本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））および／ま
たはＡｕｓｕｂｅｌら編（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．
ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４））に記載される方
法である。本発明は、本明細書中に記載されるような核酸分子、およびその分子
を得るための方法を提供する。
【０１１５】 β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が一つの種から同定さ
れた場合、その遺伝子の全てまたは一部は、同じ種からのオーソログ遺伝子また
は関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。プローブまたはプ
ライマーは、β１０ポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源から
のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。さらに、配
列番号２に記載される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用してゲノム
ライブラリーをスクリーニングし、β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度または高いストリンジ
ェンシーの条件は、スクリーニングのために使用されてスクリーニングから得ら
れた偽陽性の数を最小にする。
【０１１６】 β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現クロー
ニング（これは、発現されたタンパク質の性質に基づく陽性クローンの検出を使
用する）によって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、宿主細胞表
面において発現されそして示されるクローン化タンパク質への抗体または他の結
合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）の結合によってスクリーニ
ングされる。抗体または結合パートナーは、検出可能な標識を用いて修飾されて
所望のクローンを発現するそれらの細胞を同定する。
【０１１７】 以下に記載される説明に従って行われる組換え発現技術は、これらのポリヌク
レオチドを作製し、そしてコードされるポリペプチドを発現するために従われ得
る。例えば、β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切な
ベクターに挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を
容易に作製し得る。次いで、この配列を使用して検出プローブまたは増幅プライ
マーを作製し得る。あるいは、β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導
入することによって、コードされるβ１０ポリペプチドは、大量に作製され得る
。
【０１１８】 適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で
ある。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用してポリ（Ａ）＋
ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には
、β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド）の２つの別の領域に相補的である）を、Ｔａｑポリメラーゼのようなポリメ
ラーゼとともにｃＤＮＡに加え、そしてポリメラーゼは、２つのプライマー間の
ｃＤＮＡ領域を増幅する。
【０１１９】 β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の方法
は、Ｅｎｇｅｌｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６
−７３４，１９８９に記載されるような当業者に周知の方法を使用する化学合成
による。これらに方法には、特に、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホス
ホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート法が挙げられる。このような化学合成
のための好ましい方法は、標準的なホスホラミダイト化学を使用するポリマー支
持合成である。代表的には、β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡは、数百個のヌクレオチドの長さである。約１００個のヌクレオチドよりも
大きい核酸は、この方法を使用していくつかのフラグメントとして合成され得る
。次いでこのフラグメントは、β１０ポリペプチドの全長ヌクレオチド配列を形
成するために一緒に連結され得る。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードす
るＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧ（これは、メチオニン残基をコードする）を有
する。このメチオニンは、宿主細胞から産生されるポリペプチドが、宿主細胞か
ら分泌されるように設計されるか否かに依存して、β１０ポリペプチドの成熟形
態に存在してもよいし存在しなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に
使用され得る。
【０１２０】 特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるβ１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の最適な発現のために変更されている
コドンを含む。特定のコドンの改変は、発現について選択されるβ１０ポリペプ
チドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法（
例えば、所与の宿主細胞において高度に発現された遺伝子における使用に好まし
いコドンを選択すること）によって行われ得る。高度に発現された細菌遺伝子の
コドンの性能について「Ｅｃｏｈｉｇｈ．ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み
込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって提供されて
いる。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｈｉｇｈ．ｃｏ
ｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｉ
ｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ ｈｉｇｈ
．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が挙げられる。
【０１２１】 （ベクターおよび宿主細胞） α２／β１０ヘテロ二量体の発現を意図する場合、β１０ポリペプチド発現ベ
クターならびにα２ポリペプチドをコードする発現ベクターの両方が、宿主細胞
、細胞株、組織、器官、動物または植物に導入され得る（例えば、形質転換、同
時形質転換、トランスフェクション、同時トランスフェクション、形質導入、同
時形質導入）ことが理解されるべきである。β１０ポリペプチド発現ベクターの
みの、すでにα２ポリペプチドを産生する宿主細胞、細胞株、組織、器官、動物
または植物への導入は、α２／β１０ヘテロ二量体の新たなまたは増大した産生
を生じ得ることもまた理解される。上記のように、ヘテロ二量化アッセイにおい
て、組換えポリＨｉｓおよびＦＬＡＧでタグ化したα２／β１０ヘテロ二量体を
、哺乳動物細胞の同時トランスフェクションによって産生した。ヘテロ二量体糖
タンパク質ホルモン（例えば、ＣＧ）はまた、例えば、単離されたαサブユニッ
トおよび単離されたＣＧ−βサブユニットの、適切な条件下における同時インキ
ュベーションの際にインビトロで構築され得る（ＢｌｉｔｈｅおよびＩｌｅｓ、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１３６巻、９０３〜９１０頁（１９９５）を参
照のこと）。同様に、α２／β１０ヘテロ二量体は、単離されたα２ポリペプチ
ドおよび単離されたβ１０ポリペプチドのインキュベーションの際にインビトロ
で構築され得る。この結果は、α２ポリペプチド、β１０ポリペプチドおよびα
２／β１０ヘテロ二量体の混合物であり得る。これらの産物の各々を、従来の方
法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または免疫親和性クロマト
グラフィー）を使用して精製形態で単離し得る。この点において、α２ポリペプ
チド単独およびβ１０ポリペプチド単独は、下記のように、哺乳動物細胞から別
々に産生および分泌され得る。ヒトα２−ポリＨｉｓタグ化哺乳動物発現ベクタ
ーを、２９３細胞にトランスフェクトし、そして血清を含まない馴化培地を、７
２時間後に収集した。この馴化培地のウエスタンブロットを、ホースラディッシ
ュペルオキシダーゼに結合した親和性精製した抗α２ウサギポリクローナル抗体
（Ｌｉｎｘ ＨＲＰ Ｒａｐｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ，カタログ番号Ｋ８０５０−０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（実施例４）でプローブした。ＥＣＬウエスタンブロ
ット検出キット（カタログ番号ＲＰＮ ２１０６、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、強い
バンドが観察され、このことは、ヒトα２ポリペプチドがβ１０ポリペプチドの
非存在下で分泌され得たことを示す。ヒトβ１０−ＦＬＡＧ−タグ化哺乳動物発
現ベクターを、２９３細胞にトランスフェクトし、そして血漿を含まない馴化培
地を７２時間後に収集した。この馴化培地のウエスタンブロットを、ビオチン化
した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（カタログ番号ｆ９２９１、Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｓｏｕｉｓ，ＭＯ）でプローブし、次いで、ストレプトアビジン結合
型ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＲＰＮ １２３１，Ａｍｅｒｓｈａｍ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）でプローブした。ＥＣＬウエスタンブロット検出
キット（カタログ番号ＲＰＮ ２１０６、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、強いバンドが
観察され、このことは、ヒトβ１０ポリペプチドがα２ポリペプチドの非存在下
で分泌され得たことを示す。
【０１２２】 β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技
術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用され
る特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクター
は、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構
と適合性である）。β１０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は
、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞およ
び／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、
β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体が翻訳後修飾（例えば、グ
リコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。その場
合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベ
クターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，第１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。
【０１２３】 代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のた
めの配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配
列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」という）は、特定の実施形
態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモータ
ー、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアク
セプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のため
のリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、
発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、
ならびに選択可能マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論
される。
【０１２４】 必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、β１０ポリペプ
チドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子
）を含み得；このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉ
ｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエ
ンザウイルス）またはｍｙｃ（これに対して、市販の抗体が存在する）をコード
する。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合
され、宿主細胞からの、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の
アフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例
えば、アフィニティーマトリクスとして、タグに対する抗体を使用するカラムク
ロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、引き続いて、
切断のために特定のペプチダーゼを使用するような、種々の手段によって、精製
されたβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体から除去され得る。
【０１２５】 隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）であ
り得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）であり得るか、
ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）
であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、β１０ポリペプ
チド発現を調節するために通常機能するネイティブな配列であり得る。このよう
に、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物また
は無脊椎生物、または任意の植物であり得るが但し、隣接配列は、この宿主細胞
の機構において機能的であり、そしてこの宿主細胞の機構によって活性化され得
る。
【０１２６】 本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のい
くつかの方法によって得られ得る。代表的には、β１０遺伝子の隣接配列以外の
、本発明で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアー
ゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼ
を使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣
接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合
成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され
得る。
【０１２７】 隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、これは、ＰＣＲを使用して
、および／または適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同種もしくは別の種
由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングする
ことによって得られ得る。隣接配列が公知ではない場合、隣接配列を含むＤＮＡ
のフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子さえも含み得る大きな
ＤＮＡ片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するため
の制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉ
ａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ
）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成する
ための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１２８】 複製起点は、代表的に、市販から購入された原核生物発現ベクターの一部であ
り、この起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。特定のコピー数
までのベクターの増幅は、いくつかの場合において、β１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体の最適な発現のために重要であり得る。選択されたベ
クターが複製起点部位を含まない場合、複製起点は、既知の配列に基づいて化学
的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３
２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から
の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起源（例え
ば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞
におけるベクターのクローニングのために有用である。一般的に、複製起点の成
分は、哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起源は、それが初
期プロモーターを含むという理由のみによって、しばしば使用されている）。
【０１２９】 転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の３’ 末端に配置され、
そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列
は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントと、続くポリ−Ｔ配列である。この配列はライブ
ラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部としての市販から
の購入ですらあるが、これはまた、本明細書中に記載された核酸合成のための方
法を使用して容易に合成され得る。
【０１３０】 選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞
の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝
子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、ア
ンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか
；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは、（ｃ）複合培地から入手
可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マ
ーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサ
イクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞
および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１３１】 他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は
、増殖に重要なタンパク質の産生のために大いに要求されている遺伝子が、組換
え細胞の継続世代の染色体内でタンデムに反復されているプロセスである。哺乳
動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体
は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが固有に、ベクターに存在する
選択遺伝子によって生存するように適応される。選択圧を、培地中の選択因子の
濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とβ１０ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養するこ
とによって課される。結果として、増加した量のβ１０ポリペプチドまたはα２
／β１０ヘテロ二量体が、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１３２】 リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈ
ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核性物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）
によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるβ１０ポリ
ペプチドのプロモーターに対して３’側およびコード配列に対して５’側に配置
される。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、可変であるが、代表的には、ポ
リプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのＳｈｉｎｅ−
Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方
法を使用して、容易に合成され得、原核生物ベクターにおいて使用され得る。
【０１３３】 リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からβ１０ポリペプチドまた
はα２／β１０ヘテロ二量体を指向させるために使用され得る。代表的には、シ
グナル配列をコードするヌクレオチド配列は、β１０核酸分子のコード領域に位
置するか、または直接β１０ポリペプチドコード領域の５’側に位置する。多く
のシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能的である任
意のシグナル配列が、β１０核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シ
グナル配列は、β１０核酸分子に対して同種（天然に存在する）または異種であ
り得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学
的に合成され得る。大半の場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からの
β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の分泌は、分泌されたβ１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体からのシグナルペプチドの除去
を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿
入されたβ１０核酸分子の一部であり得る。
【０１３４】 β１０ポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなβ１０ポリペプチド
シグナル配列をコードするヌクレオチド配列、または、β１０ポリペプチドコー
ド領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれか
の使用は本発明の範囲内である。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によ
って認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断
される）ものであるべきである。ネイティブなβ１０ポリペプチドシグナル配列
を認識せず、そしてプロセスもしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列
は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロ
トキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換さ
れる。酵母分泌のために、ネイティブなβ１０ポリペプチドシグナル配列は、酵
母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され
得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列で十分であるが、
他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１３５】 真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望されるような、いくつか
の場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列（ｐ
ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペ
プチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ
）を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、
１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸と相対的に）、発現に付随する１つ以
上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全には除去されない可能性がある。
例えば、最終のタンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断
部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、
いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域
で切断する場合に所望のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の
わずかに短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅ）形態を生じ得る。
【０１３６】 多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロン
の存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺
乳動物宿主細胞）において産生される場合に特に当てはまる。使用されるイント
ロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである
場合にβ１０遺伝子内に天然に存在するものであり得る。イントロンが遺伝子内
に天然に存在しない場合（大部分のｃＤＮＡについて）、イントロンは、別の供
給源から得られ得る。隣接配列およびβ１０遺伝子に関するイントロンの位置は
、イントロンが有効に転写されなければならないので、一般的に重要である。従
って、β１０ ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、
転写開始部位に対して３’側であり、かつポリ−Ａ転写終止配列に対して５’側
である。好ましくは、イントロンは、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡ
の１つの側または他の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意
の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来
のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入
される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。
必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１３７】 本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、各々、代表的には、宿
主生物によって認識され、β１０ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連
結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構
造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンに対して上流
（すなわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、従来、
２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）のうちの１つにグル
ープ化されている。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例
えば、栄養素の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、それらの
制御下でＤＮＡからの転写の増加したレベルを開始する。他方、構成プロモータ
ーは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対してほ
とんど制御しないかまたは全く制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的
な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源
のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロ
モーター配列をベクターに挿入することによって、β１０ポリペプチドをコード
するＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなβ１０プロモーター配列は、
β１０核酸分子の増幅および／または発現を指示するために使用され得る。しか
し、ネイティブなプロモーターと比較して多い転写および発現タンパク質のより
高い産生を可能とし、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である
場合には異種プロモーターが好ましい。
【０１３８】 原核生物宿主での使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよ
びラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモ
ーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた適切である。これら
の配列は公開されており、これらの配列により、当業者は、任意の有用な制限部
位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤ
ＮＡ配列にそれらの配列を連結し得る。
【０１３９】 酵母宿主での使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である
。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿
主細胞での使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマ
ウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）
、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいシミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられ
る。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例
えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１４０】 β１０遺伝子の転写を制御する際に目的となり得るさらなるプロモーターとし
ては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒ
ｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−
１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長末端反復に含ま
れるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７，１９
８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４−１４４５，１
９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２
，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２，１９８２）；β−ラクタマーゼプロモー
ターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３７２７−３７３１，１９７
８）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５，１９８３）。組織特異性を示し、そ
してトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域
もまた関心が高い：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域
（Ｓｗｉｆｔら，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚら，
１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂ
ｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔ
ｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５，１９８７）；膵臓β細胞において活性なイン
シュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：
１１５−２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（
Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８（１９８４）；Ａｄａ
ｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−１４４４（１９８７
））；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウ
ス哺乳動物腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４
９５，１９８６）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅ
ｒｔら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６，１９８７）；
肝臓において活性なα−フェトタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら
，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８，１９８５；Ｈａｍ
ｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８，１９８７）；肝臓において活
性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１，１９８７）；骨髄性細胞において活性なβ
−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−
３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４，１９８６
）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御
領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２，１９８７）；骨
格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ
３１４：２８３−８６，１９８５）；ならびに視床下部において活性なゴナド
トロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４
：１３７２−１３７８，１９８６）。
【０１４１】 エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のβ１０ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エン
ハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３
００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、比較
的方向および位置に非依存性である。これらは、転写ユニットに対して５’側お
よび３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサ
ー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェ
トタンパク質およびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエン
ハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントで
ある。エンハンサーは、β１０核酸分子に対して５’側の位置または３’側の位
置でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’
側に配置される。
【０１４２】 本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され
得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まな
くても良い。所望の隣接配列の１つ以上が予めベクター内に存在しない場合、こ
れらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得る
ために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１４３】 本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、
および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとして
は、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ
Ｊ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐ
ＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ
公開番号ＷＯ ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１４４】 さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、ま
たは改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞
と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、
限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー
数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクロー
ニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プ
ラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ならびに
バキュロウイルス発現系のような哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイル
スベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。
【０１４５】 ベクターが構築され、そしてβ１０ポリペプチドをコードする核酸分子がベク
ターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリ
ペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。β１０ポリペプチドについての
発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感
染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リ
ポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方
法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、使用される宿主
細胞の種類にいくぶん関連する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者
に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載される。
【０１４６】 宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主
細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細
胞は、適切な条件下で培養される場合にβ１０ポリペプチドまたはα２／β２ヘ
テロ二量体を合成し、これは、続いて、培養培地から（宿主細胞がそのポリペプ
チドを培地に分泌する場合）収集され得るか、または直接そのポリペプチドを産
生する宿主細胞から収集される（そのポリペプチドが分泌されない場合）。適切
な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペ
プチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な
分子へと折り畳まれる容易さなどの種々の因子に依存する。
【０１４７】 多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８
０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ
２０１１０−２２０９から入手可能である。例としては、限定しないが、チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ Ｄ
ＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９７：４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９
３または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（
ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）のような哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物
宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、およ
び精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株
は、サルＣＯＳ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７細
胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号Ｃ
ＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞
株およびげっ歯類細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体
細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞株、ならびに初代外植片
もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠失し得るか、また
は優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、
限定しないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細
胞、Ｓｗｉｓｓから誘導された３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、Ｂ
ＨＫまたはＨａｋハムスター細胞株が挙げられ、これらは、ＡＴＣＣから入手可
能である。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現に関する分野の当業者
にとって公知であり入手可能である。
【０１４８】 同様に、本発明に適切な宿主細胞として有用なのは細菌細胞である。例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５α、Ｄ
Ｈ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））の種々の菌株は、生
物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の菌株もまた、本方法において使用され得
る。
【０１４９】 当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のβ１０ポリペプチドま
たはα２／β１０ヘテロ二量体の発現のための宿主細胞として利用可能である。
好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖ
ｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１５０】 さらに、望ましい場合には、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得
る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１
４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−５７２（１９９３）；およびＬｕｃｋｌｏｗら
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９（１９９３）に記載される。好
ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１５１】 グリコシル化β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を発現する
ために、トランスジェニック動物がまた使用され得る。例えば、トランスジェニ
ック乳汁産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用し、グルコシル化β１０
ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を動物の乳汁中に得ることができ
る。β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を産生するために、植
物もまた使用し得るが、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動
物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療の用途に適切ではないグリ
コシル化産物を生じ得る。
【０１５２】 （ポリペプチド産生） β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体発現ベクターを含む宿主
細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通
常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培
養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）お
よび／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細
胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏ
ｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０
）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／ま
たはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ
ＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株によって示され
る血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫培養物についての適切な培
地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブ
ミン加水分解産物、および／または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である
。
【０１５３】 代表的に、形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化
合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形
質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって検出される
。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に
加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物とし
ては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１５４】 宿主細胞によって産生されるβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二
量体の量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。こ
のような方法としては、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／または
ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙げられるがこれらに限
定されない。
【０１５５】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体が宿主細胞から分泌され
るように設計される場合、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
の大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、β１０ポリペプチドまた
はα２／β１０ヘテロ二量体が宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／
または核（真核生物宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（細菌宿主細
胞について）に存在する。
【０１５６】 宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置する
かまたは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するβ１０ポリペプチドま
たはα２／β１０ヘテロ二量体について、細胞内物質（グラム陰性細菌について
の封入体を含む）は、当業者に公知の任意の標準的な技術を使用して宿主細胞か
ら抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、均質化、および／また
は超音波処理、続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の含有物を放出す
るように溶解され得る。
【０１５７】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体が細胞質ゾル内に封入体
を形成した場合、この封入体は、しばしば、細胞内皮および／または細胞該膜に
結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次
いで、ペレット材料は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイト
ールのような還元剤の存在下アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチ
ルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導
体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放
出させ、分断させ、そして溶解させ得る。次いで、ここで溶解形態のβ１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使
用して分析され得る。β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を単
離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）に記載される方法のよう
な標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１５８】 いくつかの場合、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、単
離の際、生物学的に活性でなくても良い。β１０ポリペプチドまたはα２／β１
０ヘテロ二量体を「再折り畳みする」かまたはその三次構造に変換し、ジスルフ
ィド結合を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。
このような方法は、溶解されたβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二
量体をあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａ
ｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、
封入体溶解に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は
低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではな
い。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元
剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシ
ステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャッフリングを可能にする。通常使
用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオ
ン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチ
オ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。再折り畳みの効率を増加するために共溶媒が使用
され得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール
、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１５９】 封入体がβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の発現において
有意な程度まで形成されない場合、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体は、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。β１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、さらに、本明細書中に記載
されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１６０】 溶液からのβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の精製は、種
々の技術を使用して達成され得る。β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体が、ヘキサヒスチジン（β１０ポリペプチド−ｈｅｘａＨｉｓ、α２／
β１０−ｈｅｘａＨｉｓヘテロ二量体）のようなタグまたは他の小さなペプチド
（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅ
ｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））
をそのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成され
た場合、カラムマトリクスがタグについて高い親和性を有するアフィニティーカ
ラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【０１６１】 例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性を伴
って結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅ
ｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、β１０ポリペプチド−ｐｏｌｙＨＩＳまた
はα２／β１０−ｈｅｘａＨｉｓヘテロ二量体の精製のために使用され得る。例
えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，節１０．１１．８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。
【０１６２】 さらに、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、β１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を特異的に認識し得、そして結合し得
るモノクローナル抗体の使用を介して精製され得る。
【０１６３】 したがって、精製のための適切な手段はとしては、アフィニティークロマトグ
ラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、モ
レキュラーシーブクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）、電気泳動（ネイティブなゲル電気泳動を含む）、続くゲル溶出、および分取
用等電集束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈ
ｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙
げられるがこれらに限定されない。いくつかの場合において、２つ以上の精製技
術が、増加した純度を達成するために組み合わされ得る。
【０１６４】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体はまた、Ｍｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｈｏｕ
ｇｈｔｅｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３
２（１９８５）；およびＳｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐ
ｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）に記載されるような当該分
野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって
調製され得る。このようなβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
は、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さないで合成され得る。化学的
に合成されたβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、これらの
参考文献に記載される方法を使用して酸化されて、ジスルフィド結合を形成し得
る。化学的に合成されたβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は
、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製される対応するβ１０ポ
リペプチド（α２にヘテロ二量体化する場合）またはα２／β１０ヘテロ二量体
に匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のβ１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と相互交換可能に使用され得る
。
【０１６５】 本発明に従うβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を得る別の
手段は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体が天然に見出され
る供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による
。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方
法を使用して行われ得る。精製の間、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体の存在が、例えば、対応する組換え的に産生されたβ１０ポリペプチ
ドもしくはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体、または組換え的
に産生されたα２／β１０ヘテロ二量体またはそのペプチドフラグメントに対し
て調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１６６】 核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野に
おいて公知であり、この方法は、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１
０ヘテロ二量体に対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され
得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
９４：１２２９７−１２３０３（１９９７）を参照のこと。これは、ｍＲＮＡと
そのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。米国特許
第５，８２４，４６９号もまた参照のこと。これは、特定の生物学的機能を実行
し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、オリゴヌ
クレオチドの異種プールを生成する工程を包含し、それぞれが、５’ランダム化
配列、中心予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プ
ールは、所望の生物学的活性を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞
の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その
亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される
。
【０１６７】 米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２
３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチ
ドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフ
ラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタ
ンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成され
る。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産
生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１６８】 （化学的誘導体） 本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の化学的に改変
された誘導体は、本明細書中以下に記載されるこの開示を考慮して、当業者によ
って調製され得る。このようなβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二
量体誘導体は、このβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体に天然
で結合した分子の型または位置のいずれかで異なる様式で改変される。誘導体は
、１以上の天然で結合した化学的な基の欠失によって形成される分子を含み得る
。配列番号３、そのβ１０様ポリペプチド改変体またはα２／β１０ヘテロ二量
体のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって
改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結
果、結合するタンパク質は、水環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない
。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終
産物調製物の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である
。
【０１６９】 このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であ
り得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間の
平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製にお
いて、いくつかの分子の質量が、示される分子量より多く、いくらかが少ないこ
とを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤ
ａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ま
しくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７０】 適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、ま
たはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導するた
めに使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシポリエチレングリコール、
デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤ）のデキストラン）、セル
ロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン
）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレ
ンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例
えば、グリセロール）、およびビニルアルコール。配列番号３、そのポリペプチ
ド改変体、またはα２／β１０ヘテロ二量体のアミノ酸配列を含むポリペプチド
の共有結合した多量体を調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた
、本発明に含まれる。
【０１７１】 一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させ
るために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチド誘導体
またはヘテロ二量体の化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工
程を包含する：（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、もしくは
それらのポリペプチド改変体もしくはα２／β１０ヘテロ二量体が１つ以上のポ
リマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分
子の反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体）とポリペプチドまたはヘテロ二
量体を反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は
、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー
分子のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も
大きくなる。１つの実施形態において、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０
ヘテロ二量体誘導体は、アミノ末端で単一ポリマー分子部分を有し得る。例えば
、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７２】 ポリペプチドまたはヘテロ二量体のペグ化は、当該分野で公知の任意のペグ化
反応によって特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文
献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒｓ、３：４−１０（１９９２）；欧州特許第０１５４３１６号；欧州
特許第０４０１３８４号および米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ
化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（ま
たは、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を
介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反
応性エステル基を有するべきである。還元アルキル化について、選択されたポリ
マーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。例えば、反応性アルデ
ヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である
）、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導
体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７３】 別の実施形態において、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
は、ビオチンに化学的に連結され得、そして、結合体化されたビオチン−β１０
ポリペプチド分子またはビオチン−α２／β１０ヘテロ二量体分子は、次いでア
ビジンに結合され得、４価のアビジン／ビオチン／β１０ポリペプチド分子また
はアビジン／ビオチン／α２／β１０ヘテロ二量体分子を生じる。β１０ポリペ
プチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体はまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）
またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合
体は、抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭと共に沈殿して、１０価の十量体の
結合体を形成する。
【０１７４】 一般に、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体誘導体
の投与によって、緩和または調節され得る状態は、β１０ポリペプチドまたはα
２／β１０ヘテロ二量体について本明細書中に記載された状態を含む。しかし、
本明細書中に開示されるβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体誘
導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増大または減少した生
物学的活性、または他の特性（例えば、増加もしくは減少した半減期）を有し得
る。
【０１７５】 （遺伝子操作した非ヒト動物） マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、またはヒツジ、または
他の家畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、ネイ
ティブのβ１０ポリペプチドをコードする遺伝子は分裂（「ノックアウト」）さ
れ、その結果、この遺伝子の発現レベルは、有意に減少するか、または完全に消
滅される。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるよ
うな技術および方法を使用して調製され得る。
【０１７６】 本発明は、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ま
たは他の家畜のような非ヒト動物をさらに含み、ここで、この動物のβ１０遺伝
子または異種β１０遺伝子のネイティブの形態のいずれかが、この動物によって
過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このよ
うなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ
出願番号ＷＯ９４／２８１２２号に記載されるような周知の方法を使用して調製
され得る。
【０１７７】 本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、β１０ポリペプチドの１つ以上
に対するプロモーターは、（例えば、相同組換え方法を使用することによって）
活性化されるか、または不活化されるかのいずれかであり、ネイティブβ１０ポ
リペプチドの発現のレベルを変更する。
【０１７８】 これらの非ヒト動物は、薬物候補物スクリーニングのために使用され得る。こ
のようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補物の影響が測定され得
る。例えば、薬物候補物は、β１０遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特
定の実施形態において、産生されるβ１０ポリペプチドの量は、動物を薬物候補
物に曝露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対す
る薬物候補物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、
疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連し得る。このよ
うな場合において、遺伝子の発現を減少させる薬物候補物の能力または病理学的
状態を予防または阻害するその能力を試験し得る。別の例において、ポリペプチ
ドのフラグメントのような特定の代謝産物の産生は、疾患状態または病理学的状
態を生じ得るか、またはそれらに関連し得る。このような場合において、このよ
うな代謝産物の産生を減少させる薬物候補物の能力または病理学的状態を予防ま
たは阻害するその能力を試験し得る。
【０１７９】 （マイクロアレイ） ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される
。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された核酸
の小型高密度アレイである。このアレイ内の各細胞またはエレメントは、その同
族ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするための標的として作用する、単一のＤ
ＮＡ種の多数のコピーを有する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロ
フィールにおいて、ｍＲＮＡは、最初に、細胞または組織サンプルから抽出され
、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この材料は、マイク
ロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡは、洗浄により除去さ
れる。次いで、このアレイ上に示された別々の遺伝子の発現は、各々の標的ＤＮ
Ａに特異的に結合した標識ｃＤＮＡの量を定量することによって視覚化される。
この方法において、数千の遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、
高スループットの並行様式で定量され得る。
【０１８０】 この高スループット発現プロフィールは、本発明のβ１０分子に関連して広範
の適用を有し、これには、以下が挙げられるが、これに限定されない：治療のた
めの標的としてのβ１０疾患関連遺伝子の同定および確認；β１０分子およびそ
のインヒビターの分子毒性；臨床試験のための集団の階層化および代替マーカー
の産生；ならびに高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）において、選択化合
物の同定を援助することによって、β１０関連低分子薬物の発見を増強すること
。
【０１８１】 （選択的結合因子） 本明細書中で使用される場合、用語「選択的結合因子」とは、１つ以上のβ１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体に対して特異性を有する分子を
いう。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、
ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子
は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なβ１０ポ
リペプチド選択的結合因子またはα２／β１０ヘテロ二量体選択的結合因子は、
β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の特定の部分を結合し得、
これにより、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体のβ１０ポリ
ペプチドレセプターまたはα２／β１０ヘテロ二量体レセプターへの結合を阻害
する。
【０１８２】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を結合する抗体および抗
体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は
、単一特異的なポリクローナルを含むポリクローナル、モノクローナル（ＭＡｂ
）、組換え、キメラ、ヒト化（例えば、ＣＤＲ移植化）、ヒト、単鎖、および／
または二重特異的、ならびにそれらのフラグメント、改変体、または誘導体であ
り得る。抗体フラグメントとしては、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体上のエピトープに結合する抗体のこれらの部分を含む。このようなフ
ラグメントの例としては、全長抗体の酵素的切断によって産生されたＦａｂおよ
びＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組
換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプ
ラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１８３】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体に対するポリクローナル
抗体は、一般に、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体およびア
ジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギ
またはマウス）において産生される。β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体を、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサ
イログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのような、免疫化される
種において免疫原性であるキャリアタンパク質に結合体化することは、有用であ
り得る。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用
される。免疫化後、この動物は採血され、そしてその血清を、抗β１０ポリペプ
チド抗体力価または抗α２／β１０ヘテロ二量体抗体力価についてアッセイする
。
【０１８４】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体に対するモノクローナル
抗体は、培地中の連続的細胞株によって抗体分子を産生するために提供される、
任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために適切な
方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７
５）のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅ
ｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７））が挙げられる。
本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と反応するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明によって提供され
る。
【０１８５】 本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る
。１つの実施形態は、「キメラ」抗体であり、重鎖および／または軽鎖の一部が
、特定の種由来であるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属す
る抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である一方で、この鎖の
残りは、別の種由来であるか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属
する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である。このような抗
体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメン
トもまた含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１−６８５５（１９８５
）を参照のこと。
【０１８６】 別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体であ
る。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第
５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、
ヒト化した抗体は、非ヒトである供給源からヒト化した抗体に導入された１つ以
上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載される方法（Ｊ
ｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈ
ｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９９８）；Ｖｅｒｈｏ
ｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を使
用して、げっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトの抗体の
対応する領域に置換することによって、実施され得る。
【０１８７】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を結合するヒト抗体がま
た、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、
ヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス
）を使用して、このような抗体が、β１０ポリペプチド抗原またはα２／β１０
ヘテロ二量体抗原（すなわち、少なくとも６個の連続アミノ酸を有する）を用い
て免疫化し、必要に応じてキャリアに結合体化することによって産生される。例
えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９０
：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ
３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）を参照のこと。１つの方法におい
て、このようなトランスジェニック動物は、その重免疫グロブリン鎖および軽免
疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖タン
パク質および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入すること
によって産生される。次いで、部分的に改変された動物（この動物は、完全未満
の相補体の改変を有するものである）は、所望の免疫系の改変の全てを有する動
物を得るために交雑育種される。免疫原が投与される場合、これらのトランスジ
ェニック動物は、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列（このアミノ酸
配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む）を有する抗体
を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ
９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０
７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０
７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１および欧州特許第５４６０７３Ａ１に
記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載されるような宿主細胞中の組換
えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１８８】 代替の実施形態において、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリから
産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８
１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９
９１））。これらのプロセスは、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパ
ートリーの表示を介した免疫選択、および選択した抗原への結合によるファージ
の引き続く選択を模倣する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／
ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使
用して、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−レセプターについて、高親和性でありかつ機能
的なアゴニスト抗体の単離が記載される。
【０１８９】 キメラ抗体、ＣＤＲ移植化抗体、およびヒト化抗体は、代表的に組換え方法に
よって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本
明細書中に記載される物質および手順を使用して発現される。好ましい実施形態
において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生され
る。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、
宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によっ
て産生され得る。
【０１９０】 本発明の抗−β１０ポリペプチド抗体または抗−α２／β１０ヘテロ二量体抗
体は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の検出および定量の
ために、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および
間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ １４７−１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）））に
おいて使用され得る。この抗体は、使用されるアッセイ方法に対して、適切であ
る親和性でβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と結合する。
【０１９１】 診断適用のために、特定の実施形態において、抗−β１０ポリペプチド抗体ま
たは抗−α２／β１０ヘテロ二量体抗体は、検出可能な部分で標識され得る。こ
の検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを
産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（
例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ）、蛍光化合物または
化学的蛍光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくは
ルシフェリン）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３（１９９０））。
【０１９２】 競合結合アッセイは、標識した標準（例えば、β１０ポリペプチドまたはα２
／β１０ヘテロ二量体、またはその免疫学的に活性な部分）の限定された量の抗
−β１０ポリペプチド抗体または抗−α２／β１０ヘテロ二量体抗体との結合に
関して、試験サンプル検体（β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量
体）と競合する能力に依存する。試験サンプル中のβ１０ポリペプチドまたはα
２／β１０ヘテロ二量体の量は、抗体と結合する標準の量と反比例する。結合す
る標準の量を決定するのを容易にするために、この抗体は、競合前または後に、
代表的に免疫化され、その結果、この抗体と結合する標準および検体は、結合し
ないままの標準および検体から好都合に分離され得る。
【０１９３】 サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用に代表的に関連し、各々は、決定
および／または定量されるべきタンパク質の異なる免疫部分またはエピトープに
結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル検体は、固体支
持体上に免疫化される第１抗体によって代表的に結合され、その後、第２抗体が
、この検体に結合され、不溶性の３つの部分からなる複合体を形成する。例えば
、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２抗体自体は、検出可能な
部分で標識され得るか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部
分で標識される抗−免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサン
ドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアセイの１つの型は、酵素結合イム
ノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素である
）である。
【０１９４】 抗−β１０ポリペプチド抗体または抗−α２／β１０ヘテロ二量体抗体を含む
、選択的結合剤はまた、インビボイメージングのために有用である。検出可能な
部分で標識した抗体は、動物に、好ましくは、血流に投与され得、宿主中で標識
した抗体の存在および位置がアッセイされる。この抗体は、核磁気共鳴、放射線
学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物中で検出可
能である任意の部分で標識され得る。
【０１９５】 抗体を含む、本発明の選択的結合剤は、治療剤として使用され得る。これらの
治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらは、本発明
に従うβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の少なくとも１つの
生物学的活性を、それぞれ増強または減少させるかのいずれかである。１実施形
態中で、本発明のアンタゴニスト抗体は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１
０ヘテロ二量体に特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでβ１０
ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の機能活性を阻害または排除し得
る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択
的結合剤（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、および好ま
しくは、少なくとも約８０％まで、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体の機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合剤は、β１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合パートナー（リガンドまた
はレセプター）と相互作用し得る抗体であり得、これにより、インビトロまたは
インビボにおいてβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体活性を阻
害または排除する。アゴニストおよびアンタゴニスト抗−β１０ポリペプチド抗
体またはα２／β１０ヘテロ二量体抗体を含む、選択的結合剤は、当該分野で周
知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１９６】 本発明はまた、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体選択的結
合剤（例えば、抗体）および生物学的サンプル中でβ１０ポリペプチドまたはα
２／β１０ヘテロ二量体レベルを検出するために有用である他の試薬を含むキッ
トに関する。このような試薬はまた、血清を遮断する検出可能な標識、ポジティ
ブおよびネガティブコントロールサンプル、および検出試薬を含み得る。
【０１９７】 本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体はまた、「発現
クローニング」ストラテジーを使用して、β１０ポリペプチドまたはα２／β１
０ヘテロ二量体レセプターをクローニングするために使用され得る。放射性標識
した（１２５ヨウ素）β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体また
は「アフィニティー／活性タグ化」β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体（例えば、Ｆｃ融合体またはアルカリホスファターゼ融合体）が、β１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体レセプターを発現する細胞型ま
たは細胞株または組織を同定するための結合アッセイにおいて使用され得る。こ
のような細胞または組織から単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、哺乳動物
発現ベクターにクローニングし、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたは２
９３）にトランスフェクトして、発現ライブラリーを作製し得る。次いで、放射
標識化またはタグ化β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を、親
和性リガンドとして使用し、このライブラリーから、β１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体レセプターをその表面上で発現する細胞のサブセット
を同定および単離し得る。ＤＮＡを、これらの細胞から単離しそして哺乳動物細
胞にトランスフェクトして、二次発現ライブラリーを作製し得る。このライブラ
リーでは、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体レセプターを発
現する細胞の割合が、元のライブラリーにおける割合よりも、数倍高い。この富
化プロセスは、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を含む単一
の組換えクローンが単離されるまで、反復的に繰り返され得る。このβ１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の単離は、β１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体シグナル伝達経路の新規アゴニストおよびアンタゴニ
ストを同定または開発し得るという点で有用である。このようなアゴニストおよ
びアンタゴニストとしては、可溶性β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体レセプター、抗β１０ポリペプチドまたは抗α２／β１０ヘテロ二量体
レセプター抗体、小分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、そ
してこれらは、以下に列挙される疾患／障害の１以上を診断および／または処置
するために使用され得る。
【０１９８】 （β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の活性の他の修飾因子
についてのアッセイ） いくつかの状態において、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体の活性の修飾因子である分子（例えば、アゴニストまたはアンタゴニ
スト）を同定することが所望され得る。β１０ポリペプチドまたはα２／β１０
ヘテロ二量体を調節する天然または合成分子は、本明細書中に記載されるように
、１以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は
、エキソビボ様式またはインビトロ様式のいずれかで、注射、または経口送達、
移植デバイスなどによって投与され得る。
【０１９９】 「試験分子」とは、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二
量体の活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）ための能力について
評価される分子を言う。最も一般的に、試験分子は、ポリペプチドまたはヘテロ
二量体と直接的に相互作用する。しかし、試験分子はまた、例えば、β１０遺伝
子発現に影響を与えることによって、またはβ１０ポリペプチドまたはα２／β
１０ヘテロ二量体結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合
することによって、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体活性を
間接的に調節し得ることも企図する。１実施形態において、試験分子は、少なく
とも約１０−６Ｍ、好ましくは、約１０−８Ｍ、より好ましくは、約１０−９Ｍ
、そしてさらにより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ
ｃｏｎｓｔａｎｔ）でβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と
結合する。
【０２００】 本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と相互作用する
化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態に
おいて、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、試験分子とβ
１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体との相互作用が可能な条件下
で、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定される。
試験分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物中でスクリーニングさ
れ得る。
【０２０１】 特定の実施形態において、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量
体アゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質
、または低分子量の分子であり得、これらは、β１０ポリペプチドまたはα２／
β１０ヘテロ二量体と相互作用して、その活性を調節する。β１０ポリペプチド
またはα２／β１０ヘテロ二量体の発現を調節する分子は、本発明のβ１０ポリ
ペプチドをコードする核酸と相補的であるか、またはβ１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体の発現を指向するか制御するか、またはそれに影響を
与える核酸配列に対して相補的である核酸分子、および発現のアンチセンス制御
因子として作用する核酸分子を含む。
【０２０２】 一旦、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と相互作用すると
、一組の試験化合物が、同定されると、これらの分子は、β１０ポリペプチドま
たはα２／β１０ヘテロ二量体活性を増加または減少させる能力についてさらに
評価され得る。試験分子とβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
との相互作用の測定は、いくつかの形態で実施され得、これには、細胞ベースの
結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられ
る。一般に、試験分子は、特定の期間、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０
ヘテロ二量体と共にインキュベートされ、そしてβ１０ポリペプチドまたはα２
／β１０ヘテロ二量体の活性が、生物学的活性を測定するために１以上のアッセ
イによって決定される。
【０２０３】 試験分子と本発明に従うβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
との相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載さ
れるようなエピトープタグを含むβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ
二量体の改変形態は、免疫アッセイにおいて使用され得る。
【０２０４】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体が、結合パートナー（例
えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す
場合において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（選択的
結合因子、レセプター、またはリガンド）へのβ１０ポリペプチドまたはα２／
β１０ヘテロ二量体の結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは
、結合パートナーに対するβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
の結合の速度および／または程度を増加または減少させる能力について、試験分
子をスクリーニングするために使用され得る。１アッセイにおいて、β１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、マイクロタイタープレートのウェ
ル中に固定化される。次いで、放射標識したβ１０ポリペプチドまたはα２／β
１０ヘテロ二量体結合パートナー（例えば、ヨウ素化したβ１０ポリペプチドま
たはα２／β１０ヘテロ二量体結合パートナー）および試験化合物は、このウェ
ルに、一時に一方を（いずれかの順序で）または同時にのいずれかで添加され得
る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計
数器を使用して、放射活性を計数して、結合パートナーがβ１０ポリペプチドま
たはα２／β１０ヘテロ二量体に結合する程度を決定し得る。代表的に、分子は
、ある濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上のエレメント
を欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る
。この方法の代わりは、タンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイ
クロタイタープレートウェルに対してβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体結合パートナーを固定化し、試験分子および放射標識したβ１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体をインキュベートし、そしてβ１０ポ
リペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合の程度を決定する工程）を包含
する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照のこと。
【０２０５】 放射性標識に対する代替として、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体またはその各々の結合パートナーは、ビオチンと結合され得、そしてビ
オチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、わさびペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））（これらは、比色定
量的に検出される）に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、
またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。β１０ポリペプ
チドまたはα２／β１０ヘテロ二量体あるいはβ１０ポリペプチドまたはα２／
β１０ヘテロ二量体結合パートナー（これらは、ビオチンに結合されている）に
対する抗体がまた、使用され得、そしてＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ス
トレプトアビジンとのインキュベーションに続いて、検出され得る。
【０２０６】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体またはβ１０ポリペプチ
ドまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合パートナーはまた、アガロースビーズ、
アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固相基材への付着によって
固定され得る。基材−タンパク質複合体は、相補性タンパク質および試験化合物
を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心
分離によって沈殿され得、そしてβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ
二量体とその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使
用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体はカラム内に固定化さ
れ得、試験分子および相補性タンパク質はカラムを通過する。次いで、β１０ポ
リペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体とその結合パートナーとの間の複合
体の形成が、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）の
いずれかを使用して評価され得る。
【０２０７】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と対応するβ１０ポリペ
プチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合パートナーとの間の複合体の形成を
増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイ
は、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシス
テム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃ
ｏｒｅシステムは、製造業者によって特定されるように利用される。このアッセ
イは、本質的に、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体またはβ
１０ポリペプチド結合パートナーまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合パートナ
ーのいずれかの、デキストランコーティングセンサーチップ（これは、検出器に
存在する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補性タン
パク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャ
ンバーに注入され得る。結合する相補性タンパク質の量は、センサーチップのデ
キストランコーティング側に物理的に関連付けられる分子量の変化に基づいて評
価され得、この分子量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０２０８】 いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、β１０ポリペプチ
ドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と対応するβ１０ポリペプチドまたはα２／
β１０ヘテロ二量体結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させ
るそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、
本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続
いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易
に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載される
。
【０２０９】 インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、β１０ポリ
ペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と対応するβ１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果に
ついて、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これ
らのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブ
ラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る
。
【０２１０】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体と対応するβ１０ポリペ
プチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合パートナーとの間の複合体の形成を
増加または減少される化合物はまた、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体および対応するβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
結合パートナーＦのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養
物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から
得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌまたはげっ歯類の供
給源由来である。β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の、対応
するβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合パートナーを発現
する細胞表面への結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結
合の程度が、例えば、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体結合
パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決
定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッ
セイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有
利に使用され得る。
【０２１１】 細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る
。例えば、薬物候補は、β１０遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の
実施形態において、生成されるβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二
量体の量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形
態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響が検出され得る。例えば
、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。この
ような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細
胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他
の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメントなど）の
生成が、疾患または病的状態を引き起こし得るか、またはそれらと関連付けられ
得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少す
る薬物候補の能力が試験され得る。
【０２１２】 （β１０ポリペプチド、α２／β１０ヘテロ二量体および核酸の治療的／診断
的適用） β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体についての生物学的機能
は、プロラクチン生成細胞、甲状腺、および生殖腺の発達（増殖、分化）の促進
における、とりわけ成長因子として作用することが知られている糖タンパク質ホ
ルモンであるＦＡＳ、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、およびＣＧの機能と類似している
ことが、予想される。これらの糖タンパク質もまた、胎盤、甲状腺、および生殖
腺の機能の調節因子としての役割において内分泌ホルモンとして作用する。ＦＡ
Ｓは、胎盤における脱落膜の細胞からプロラクチン分泌を刺激することにおいて
役割を果たし、ＴＳＨは、甲状腺を介する基礎代謝の調節において主要な役割を
果たし、そしてＦＳＨ、ＬＨ、およびＣＧは、男性および女性の受精能（ｆｅｒ
ｔｉｌｉｔｙ）ならびに妊娠において重要な役割を果たす。したがって、β１０
ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体もまた、基礎代謝の調節、生殖腺
の発達／機能、受精能および妊娠において役割を果たす。
【０２１３】 さらに以下の実施例に示されるように、β１０ポリペプチドは、脳、肝臓、胎
児肝臓、胃、下垂体、結腸、小腸、甲状腺、副腎、膵臓、皮膚、末梢血白血球、
脾臓、精巣、および胎盤において発現される。β１０が内分泌系を造る器官およ
び組織の多くにおいて発現されるという事実は、１つ以上の内分泌系機能の調節
および協調におけるβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体につい
ての重要な役割を示唆する。内分泌系は、代謝、ストレスに対する生理学的応答
、および生殖器官の発達および機能に対する主要な制御を発揮することが知られ
ている。
【０２１４】 下垂体、膵臓、副腎、甲状腺、胃、小腸、結腸、および肝臓におけるβ１０の
発現は、これらの器官または組織の共通の機能、すなわち、代謝およびエネルギ
ー／栄養恒常性（すなわち、エネルギーバランス、基礎代謝速度、消化、グルコ
ース恒常性、体脂肪の分布、一般的な成長）における、β１０ポリペプチドまた
はα２／β１０ヘテロ二量体についての可能な役割を示す。
【０２１５】 下垂体および副腎におけるβ１０の発現は、これらの２つの重要な器官によっ
て補助される重要な機能の１つ、すなわち、種々の環境ストレスおよび生理学的
ストレス（例えば、感染、発熱、炎症、飢餓、高血圧および低血圧、不安、ショ
ック）に対処する体の能力における、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体についての可能な役割を示す。β１０ポリペプチドまたはα２／β１
０ヘテロ二量体についてのこれらの可能な機能と一致しているのは、免疫系の重
要な成分であることが知られている細胞および器官（末梢血白血球、脾臓、小腸
）におけるβ１０の発現である。
【０２１６】 さらに、下垂体、精巣、および胎盤におけるβ１０の発現は、これらの器官の
共有する機能、特に、受精能および妊娠におけるβ１０ポリペプチドまたはα２
／β１０へテロ二量体についての可能な役割を示す。
【０２１７】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体もまた、脳、肝臓、胃、
下垂体、結腸、小腸、甲状腺、副腎、膵臓、皮膚、末梢血白血球、脾臓、精巣、
および胎盤に存在する組織または特異化した細胞型の再生（増殖および分化）に
関与する成長因子として作用し得る。
【０２１８】 潜在的β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体機能の３つの主要
な領域、すなわち、（１）代謝およびエネルギー／栄養恒常性、（２）ストレス
に対する生理学的応答（免疫系機能を含む）、および（３）受精能および妊娠と
一致しているのは、β１０とヘテロ二量体を形成するα２が、これらの３つの主
要な領域において重要な役割を果たす多くの同様の器官／組織（下垂体前葉、胎
盤、膵臓、副腎皮質、腸の陰窩、および胆嚢粘膜）において発現される（以下の
実施例２を参照のこと）という事実である。
【０２１９】 上記の潜在的な機能に基づいて、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体は、代謝またはエネルギー／栄養恒常性障害の処置および／または診断
のために有用であり得る。このような障害の例には、肥満、るいそう症候群（例
えば、癌関連悪液質）、筋障害、胃腸障害、糖尿病、成長障害、高コレステロー
ル血症、アテローム性動脈硬化症、および老化が含まれるが、これらに限定され
ない。代謝またはエネルギー／栄養恒常性障害を含む他の疾患は、本発明の一部
である治療および診断的用途の中に含まれる。
【０２２０】 上記の潜在的機能に基づいて、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ
二量体は、ストレスに対する生理学的応答に関連する障害（免疫系機能を含む）
の処置および／または診断のために有用であり得る。このような障害の例には、
高血圧、免疫系不全（例えば、過剰炎症、自己免疫疾患、ＡＩＤＳのような感染
に対する感受性、不良な創傷治癒、乾癬、喘息、関節炎、およびアレルギー）、
ショック、不安、および高血圧もしくは低血圧が含まれるが、これらに限定され
ない。免疫系機能が含まれるが、これに限定されないストレスに対する生理学的
応答が関与する他の疾患もまた、本発明の一部である治療および診断的用途の中
に含まれる。
【０２２１】 上記の潜在的機能に基づいて、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ
二量体は、妊娠および／または生殖器官の発達および機能に関連する障害の処置
および／または診断のために有用であり得る。このような障害の例には、不妊、
受精能（避妊）、インポテンス、子宮内膜症、閉経、流産、早産（ｐｒｅ−ｔｅ
ｒｍ ｌａｂｏｒ）、未熟分娩（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）が含ま
れるが、これらに限定されない。妊娠および／または生殖器官の発達および機能
に関連する他の疾患もまた、本発明の一部である治療および診断的用途の中に包
含される。
【０２２２】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０へテロ二量体がホルモン／成長因子活
性を有するようであるという事実に基づいて、β１０ポリペプチドまたはα２／
β１０ヘテロ二量体は、細胞増殖および／または分化を増大させることによって
処置され得る障害の処置および／または診断のために有用である。このような障
害の例には、組織損傷／変性（例えば、癌治療、感染、自己免疫疾患によって引
き起こされるようなもの）、老化、および創傷治癒が含まれるが、これらに限定
されない。細胞増殖および／または分化を増大することによって処置され得る他
の疾患もまた、本発明の一部である治療および診断的用途の中に含まれる。
【０２２３】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０へテロ二量体がホルモン／成長因子活
性を有するようであるという事実に基づいて、β１０ポリペプチドまたはα２／
β１０へテロ二量体は細胞増殖および／または分化を減少させることによって処
置され得る障害の処置および／または診断のために有用であり得る。このような
障害の例には、癌、過形成、および肥大が含まれるが、これらに限定されない。
細胞増殖および／または分化を減少させることによって処置され得る他の疾患も
また、本発明の一部である治療および診断的用途の中に含まれる。
【０２２４】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０へテロ二量体の所望でないレベルによ
って引き起こされるかまたは媒介される他の疾患は、本発明の一部である治療お
よび診断的用途の中に含まれる。例として、このような所望でないレベルには、
過剰に上昇したレベルおよび正常以下のレベルが含まれる。
【０２２５】 マウスα２単独、マウスβ１０単独、またはマウスα２／β１０ヘテロ二量体
を過剰発現したトランスジェニックマウスが作製された（実施例６を参照のこと
）。α２／β１０ヘテロ二量体を過剰発現するトランスジェニックのみが、コン
トロールマウスと比較して明確な表現型の差異を示した。α２／β１０過剰発現
トランスジェニックマウスは、多数の小胞乳頭状腺腫を伴う両側性の甲状腺肥大
および結果としての甲状腺機能亢進（上昇した血清Ｔ４レベルによって示される
）によって特徴付けられる表現型を示した。他の表現型の変化は、全身性甲状腺
機能亢進状態に関連することが感じられ、そして穏やかな肝腫、肝細胞性の過形
成、およびわずかに減少した血清コレステロールレベル、両側性の腎肥大、およ
び軽度から中程度の白血球増加症（リンパ球が優勢）（実施例６を参照のこと）
が含まれていた。したがって、正常マウスの設定において、α２／β１０は明ら
かに甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）様の活性を有する。マウスα２とヒトα２と
の間の高レベルのアミノ酸保存（推定成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを
含まない）について、８８．５％同一性および９０．４％類似性）、マウスβ１
０とヒトβ１０との間の高レベルのアミノ酸保存（推定成熟形態（すなわち、シ
グナルペプチドを含まない）について、９３．４％同一性および９７．２％類似
性）、ならびにマウス甲状腺生物学とヒト甲状腺生物学との間の類似性の非常に
高いレベルのために、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体が、マウスα２／β１０ヘ
テロ二量体について見出された活性と同じ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）様活性
を有することが予想される。ＴＳＨ様活性に加えて、α２／β１０は、本明細書
中以下でより詳細に記載するように、異なる生理学的設定（すなわち、疾患状態
）における、他の、明確な、生物学的効果を有し得る。
【０２２６】 ＴＳＨは、甲状腺ホルモンの産生を制御することにより基礎代謝に影響し、甲
状腺癌の検出および処置を増強するため臨床的に用いられる；ＭｃＥｖｏｙ、Ｇ
．（編）、ＡＨＦＳ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ｐｐ．２０４１〜２
０４２、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９８）
を参照のこと。さらに、血中ＴＳＨレベルを測定するための診断テストは、甲状
腺障害が疑われる場合、甲状腺の機能状態を決定するために通常に使用される。
ヒトα２／β１０は、ＴＳＨと同様の臨床的有用性を有し、甲状腺に関する疾患
および障害の処置および診断に対して有用であるようである。さらに、ヒトα２
／β１０は、本明細書で記載される他の治療的および診断的用途を有し得る。ヒ
トα２／β１０選択的結合因子（例えば、抗体）がＴＳＨ選択的結合因子と同様
の臨床的有用性を有し、したがって、甲状腺に関する疾患および障害の処置およ
び障害に対して有用であることが推測されることは、合理的である。さらに、ヒ
トα２／β１０選択的結合因子は、本明細書で記載されるような他の治療的およ
び診断的用途を有し得る。
【０２２７】 （組成物および投与） 治療組成物は、本発明の範囲内である。このような薬学的組成物は、治療有効
量のβ１０ポリペプチド、α２／β１０ヘテロ二量体、またはβ１０核酸分子を
、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な
処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のβ
１０ポリペプチド選択的結合因子またはα２／β１０ヘテロ二量体選択的結合因
子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可
能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０２２８】 受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシ
ピエントに対して非毒性である。
【０２２９】 薬学的組成物は、例えば、その組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等
張性、におい、無菌性、安定性、解離または放出の速度、吸着、または浸透を改
変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料として
は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン
、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤
（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム）
、緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リ
ン酸塩、または他の有機酸）、バルキング剤（例えば、マンニトールまたはグリ
シン）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、複合体化剤（
例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、または
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、フィラー、単糖類、二糖類、
および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、
タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着
色剤、味付け剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピ
ロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、
保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール
、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジ
ン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレン
グリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニ
トールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プル
ロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート
（例えば、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）；
トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル（ｔｙ
ｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトール）、張度増
強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩
化カリウム）、マンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤
および／または薬学的なアジュバント（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編
，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ ［１９９０］）。
【０２３０】 最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達
形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。
このような組成物は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体分子
の、物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの
速度に影響し得る。
【０２３１】 薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本来水性または非水
性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水
、生理学的生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、おそらく非経口投与
のための組成物において一般的な他の材料で補充されている。中性の緩衝化生理
食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒ
クルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩
衝液または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビ
トールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、β１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体組成物は、所望の程度の純度を
有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、
凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、β
１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体産物は、スクロースのような
適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２３２】 本発明の薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これ
らの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的に）のために、
選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術
内にある。
【０２３３】 処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、生
理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には、約５〜約８のｐＨ範囲内にこ
の組成物を維持するために使用される。
【０２３４】 非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬
学的に受容可能なビヒクルに所望のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態で
あり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、この
滅菌蒸留水中に、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体分子が、
滅菌等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物は、所望の分
子と、産物の制御されたまたは持続された放出を提供する薬剤（例えば、注入可
能なミクロスフィア、生体侵食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー
化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、またはビーズまたはリポソーム）との
処方物を含み得、これは、次いで蓄積注射として送達され得る。ヒアルロン酸が
また、使用され得、そしてこれは、循環において、維持された持続時間を促進す
る効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬
物送達デバイスを含む。
【０２３５】 １つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例え
ば、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体分子は、吸入のための
乾燥粉末として処方され得る。β１０ポリペプチド、α２／β１０ヘテロ二量体
、またはβ１０核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧体と共
に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が
、ＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載され、これは化
学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２３６】 特定の処方物が、経口投与され得ることがまた意図される。本発明の１つの実
施形態において、このよう様式で投与されるβ１０ポリペプチドまたはα２／β
１０ヘテロ二量体分子が、固体投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）の調合
において慣用的に使用されるキャリアを伴うか、または伴わず処方され得る。例
えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身分解
が最小化される場合、胃腸管内での点で処方物の活性部分を放出するように設計
され得る。さらなる薬剤が、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量
体分子の吸収を容易にするために含まれうる。希釈剤、味付け剤、低融点ワック
ス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、およびバインダーがまた、使用され
得る。
【０２３７】 別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効
量のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体分子を含み得る。錠剤
を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量
形態で調製され得る。適切な賦形剤は以下を含むが、これらに限定されない：不
活性な希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラ
クトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼ
ラチンまたはアラビアゴム）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシ
ウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２３８】 さらなる薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続または制御送達処方物
中にβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を含む処方物を含む。
種々の他の持続または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体侵食マ
イクロスフィアあるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術は
また、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、
薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性ミクロ粒子の制御放出を記載する
）を参照のこと。徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（
例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリックス
を含む。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチ
ド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−
グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，
１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロ
キシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ
．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，
Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａ
ｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１
３３９８８号）。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野
で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔ
ｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
３６８８−９２；および欧州特許第３６６７６号、同第８８０４６号、および同
第１４３９４９号を参照のこと。
【０２３９】 インビボ投与のために使用される薬学的組成物は、代表的に滅菌でなければな
らない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が
、凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前
に、またはそれに続いてのいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物
は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、
一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮
下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２４０】 一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液
、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉末または凍結乾燥粉末として保存
され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成
を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２４１】 特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキッ
トに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水
性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単
一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび
分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
【０２４２】 治療的に使用される薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的
に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、従って、送達される
分子、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体分子が使用されてい
る指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ
）および状態（年齢および一般的な健康）に、部分的に依存して変化することを
理解する。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定
し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依
存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。
他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで
；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１０
０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２４３】 投薬の頻度は、使用される処方物中でのβ１０ポリペプチドまたはα２／β１
０ヘテロ二量体分子の薬物動態学的パラメーターに依存する。典型的に、臨床家
は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成
物は、単回用量として、長期にわたって２回以上の用量（これは、同じ量の所望
の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカ
テーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる
改良は、当業者によって慣用的になされ、そして当業者によって慣用的に実施さ
れる作業の範囲内にある。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介
して確認され得る。
【０２４４】 薬学的組成物の投与の経路は、公知の方法に従い、例えば、経口的にか、静脈
内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内もしく
は病巣内の経路による注入を介するか、徐放系によるか、または移植デバイスに
よる。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得る
か、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって
投与され得る。
【０２４５】 あるいは、またはさらに、組成物は、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収
されるかまたはカプセル化される他の適切な材料の移植を介して局所的に投与さ
れ得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織ま
たは器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスま
たは連続的な投与を介し得る。
【０２４６】 いくつかの場合において、エキソビボ様式において、本発明による薬学的組成
物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から取り出され
た細胞、組織または器官は、これらの細胞、組織、および／または器官が、その
後、患者に移植し戻された後に、薬学的組成物に曝露される。
【０２４７】 他の場合において、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二
量体は、本明細書中に記載されるような方法を使用して遺伝子操作されて、ポリ
ペプチドまたはヘテロ二量体を発現および分泌する特定の細胞を移植することに
よって送達され得る。このような細胞は、動物またはヒト細胞であり得、そして
自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、または異種間（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉ
ｃ）であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会
を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するようにカプセル化され
得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半透性ポリマーの包囲物また
は膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系に
よるかまたは周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２４８】 本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子
治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための
、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に
関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写的にサイレ
ントなβ１０遺伝子（すなわち、過少発現される遺伝子）を含む細胞を改変し得
、これによって、治療有効量のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二
量体を発現する細胞を産生し得る。
【０２４９】 相同組換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または矯正するよう
に遺伝子を標的化するために元々開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａ
ｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
，３６：３０１，１９８９）。この基本的技術は、特定の変異を、哺乳動物ゲノ
ムの特定の領域へ導入するための方法として（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ，４４
：４１９−４２８，１９８６；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ
，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８５８３−８５８７，１９８８）、または欠
損遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら
、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）開発された。例示的な相
同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号、欧州特許番号第９１３０５
１号、同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開第ＷＯ
９１／０９９５５に記載される。
【０２５０】 相同組換えを介して、ゲノム中に挿入されるべきＤＮＡ配列は、標的化ＤＮＡ
にこのＤＮＡ配列を結合することによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向さ
れ得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ領域に相補的である（相同である）
ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である標的化ＤＮＡの小
片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親鎖との接触下に置かれる。共有される相同領
域を介して内因性ＤＮＡの他の小片とハイブリダイズし、そして従って、組み換
わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的な特性である。この相補鎖が、
変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに
結合された場合、これもまた、新たに合成された鎖に組換えの結果として組み込
まれる。プルーフリーディング機能の結果として、この新たなＤＮＡ配列が、テ
ンプレートとして作用することが可能である。このように、この移入されたＤＮ
Ａは、ゲノム内に組み込まれる。
【０２５１】 β１０ポリペプチドと相互作用し得るかまたはβ１０ポリペプチドの発現を制
御し得るＤＮＡ領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれらの小片に結
合される。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサーまた
は外因性転写調節エレメントが、所望のβ１０ポリペプチドをコードするＤＮＡ
の転写に影響を与えるに十分に近位でかつ十分な方向で、その意図される宿主細
胞のゲノムに挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮ
Ａの一部を制御する。従って、所望のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘ
テロ二量体の発現は、β１０遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクシ
ョンによってではなく、むしろＤＮＡ調節セグメントと結合された標的化ＤＮＡ
（その目的の内因性遺伝子と相同な領域を含む）の使用によって達成され得、こ
の調節セグメントは、β１０遺伝子の転写について認識可能なシグナルを、その
内因性遺伝子配列に提供する。
【０２５２】 例示的な方法において、細胞内の所望の標的化された遺伝子（すなわち、所望
の内因性の細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプラ
イスドナー部位を含むＤＮＡの導入による、予め選択された部位でのその細胞ゲ
ノムへの相同組換えを介して変更される。これらの成分は、実際には、これらの
成分が、新たな転写単位の産生を生じる（ここで、そのＤＮＡ構築物中に存在す
る調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位が、内因性遺伝子に作動的に
連結される）様式で染色体（ゲノム）ＤＮＡ中に導入される。染色体ＤＮＡへの
これらの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
【０２５３】 本明細書中に記載されるように、変更された遺伝子発現は、得られたような細
胞において通常サイレントな（発現されない）遺伝子を活性化すること（または
発現されるのを引き起こすこと）、ならびに得られたような細胞において生理学
的に重要なレベルで発現されない遺伝子の発現を増大させることを包含する。こ
の実施形態はさらに、得られたような細胞において生じる調節または誘導のパタ
ーンとは異なるように調節または誘導のパターンを変更すること、ならびに得ら
れたような細胞において発現される遺伝子の発現を減少させること（除去するこ
とを含む）を包含する。
【０２５４】 相同組換えを用いて、細胞の内因性β１０遺伝子からのβ１０ポリペプチドま
たはα２／β１０ヘテロ二量体の産生を増大させ得るかまたは生じさせ得る１つ
の方法は、第１に、相同組換えを用いて部位特異的組換え系（例えば、Ｃｒｅ／
ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：５２１−５２７，１９９４；Ｓａｕｅ
ｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．２２５：８９０−９００，
１９９３）由来の組換え配列を、細胞の内因性ゲノムβ１０ポリペプチドコード
領域の上流に（すなわち、５’側に）配置することを含む。ゲノムβ１０ポリペ
プチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に相同な組換え部位を含むプラス
ミドは、この改変された細胞株に、適切なリコンビナーゼ酵素と共に導入される
。このリコンビナーゼは、このプラスミドを、プラスミドの組換え部位を介して
、その細胞株におけるゲノムβ１０ポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置す
る組換え部位に組み込ませる（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９，１９９３；Ｏ’Ｇｏ
ｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５，１９９１）。転写
を増大させることが公知の任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモータ
ー、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド内に適切に配置された
場合に、新たな転写単位または改変された転写単位を作製するような様式で組み
込み、この細胞の内因性β１０遺伝子からのデノボまたは増大したβ１０ポリペ
プチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の産生をもたらす。
【０２５５】 部位特異的な組換え配列が、その細胞の内因性ゲノムβ１０ポリペプチドコー
ド領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するためのさらなる方法は、相同組
換えを使用して、第２の組換え部位を、この細胞株のゲノムの他の箇所に導入す
ることである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、これら２つの組換え部位
の細胞株に導入されて、これが、組換え事象（欠失、反転、転移）を引き起こす
。この組換え事象は、新たな転写単位または改変された転写単位を作製し、この
転写単位が、この細胞の内因性β１０遺伝子からのデノボまたは増加したβ１０
ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の産生を生じる（Ｓａｕｅｒ，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，前出，１
９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，前出，１
９９３）。
【０２５６】 細胞の内因性β１０遺伝子からのβ１０ポリペプチドの発現を増加させるかま
たは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内因性β１０遺伝子からの
デノボβ１０ポリペプチド産生または増加したβ１０ポリペプチド産生を生じる
様式で、ある遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増加させ
るかもしくは引き起こすこと、および／またはある遺伝子（単数または複数）（
例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを包含する。この方法は、
細胞の内因性β１０遺伝子からのデノボまたは増加したβ１０ポリペプチドまた
はα２／β１０ヘテロ二量体の産生が生じるように、天然には存在しないポリペ
プチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを
含むポリペプチド）をその細胞に導入することを包含する。
【０２５７】 本発明は、さらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ
構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含
む：（ａ）１つ以上の標的化配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソン；および（
ｄ）不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）スプライスドナー部位。このＤＮＡ構築物におけ
る標的化配列は、細胞中の標的遺伝子へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の取り込み
を、エレメント（ｂ）〜（ｄ）がその内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結
されるように、指向する。別の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、以下を含
む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）ス
プライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター
部位；ここで、この標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の取り込みを、（
ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるように、指向
する。この標的化配列は、相同組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡにおける予め選
択された部位に相同である。この構築物において、エキソンは、一般に、調節配
列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、エキソンの３’側である。
【０２５８】 特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中に提示されるβ１０遺伝子の核酸配
列）が既知である場合には、この遺伝子の選択された領域に相補的なＤＮＡ小片
は、合成され得るか、またはさもなければ、例えば、その目的の領域に結合する
特異的な認識部位でのネイティブＤＮＡの適切な制限処理によって、得られ得る
。この小片は、細胞への導入時に標的化配列として作用し、そしてゲノム内のそ
の相同領域とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の
間に起こる場合、このＤＮＡ小片およびこのＤＮＡ小片に結合した任意のさらな
る配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そして新たに合成されたＤＮＡの娘
鎖に組み込まれる。従って、本発明は、β１０ポリペプチドをコードするヌクレ
オチドを包含し、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
【０２５９】 β１０ポリペプチド細胞治療またはα２／β１０ヘテロ二量体細胞治療（例え
ば、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を産生する細胞の移植
）もまた意図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のβ１０ポリペプ
チドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を合成および分泌し得る細胞を移植するこ
とを包含する。このようなβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体
の産生細胞は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体の天然の産
生者である細胞であり得るか、あるいは所望のβ１０ポリペプチドをコードする
遺伝子またはβ１０ポリペプチドもしくはα２／β１０ヘテロ二量体の発現を増
強する遺伝子で形質転換することによって、そのβ１０ポリペプチドまたはα２
／β１０ヘテロ二量体を産生する能力が増強された、組換え細胞であり得る。こ
のような改変は、その遺伝子を送達するため、ならびにその発現および分泌を促
進するのに適したベクターによって、達成され得る。β１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体を投与される患者において、外来種のポリペプチドの
投与によって生じ得るような潜在的な免疫学的反応を最小化するためには、β１
０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を産生する天然の細胞が、ヒト
起源でありかつヒトβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を産生
することが、好ましい。同様に、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ
二量体を産生する組換え細胞が、ヒトβ１０ポリペプチドをコードする遺伝子を
含む発現ベクターで形質転換されることが、好ましい。
【０２６０】 移植される細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る
。ヒトまたは非ヒト動物の細胞は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体の放出を可能にするが患者の免疫系によるかまたは周囲の組織からの他
の有害な因子による細胞の破壊を防止する、生体適合性の半透過性のポリマー包
皮または膜内で、患者に移植され得る。あるいは、β１０ポリペプチドまたはα
２／β１０ヘテロ二量体を産生するようエキソビボで形質転換された患者自身の
細胞が、このようなカプセル化なしに、患者に直接移植され得る。
【０２６１】 生存細胞をカプセル化するための技術は、当該分野において公知であり、そし
てカプセル化された細胞の調製およびこれらの患者への移植は、慣例的に達成さ
れ得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２；ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のための
、遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。これらのカプセルは生体
適合性であり、そして容易に回収可能である。これらのカプセルは、プロモータ
ーに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む
組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化し、これらの細胞
は、哺乳動物宿主への移植の際に、インビボでのダウンレギュレーションに供さ
れない。このデバイスは、生存細胞からレシピエント内の特異的な部位への分子
の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，０１１
，４７２号、および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞をカプセ
ル化するための系は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５７（Ａｅｂｉ
ｓｃｈｅｒら）に記載されている。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５
５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．，１１３：３２２−３２９，Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ
．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２
，ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２６２】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体のインビボおよびインビ
トロ遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の１つの例は、構成的プ
ロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得るβ１０ポリペプ
チドをコードするβ１０遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成
ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することで
ある。このプロモーターは、内因性遺伝子に対して同種であっても異種であって
もよいが、但し、この構築物が挿入される細胞または組織型において、このプロ
モーターは、活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて
、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのた
めに有用な内因性配列）、組織特異的なプロモーター、エンハンサーまたはサイ
レンサー、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換され
た細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞
特異的結合因子（例えば、細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーシ
ョン因子、ベクターによる発現を増強するための転写因子、およびベクターの産
生を可能にする因子を含み得る。
【０２６３】 次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベク
ターを使用して、細胞に（エキソビボまたはインビボでのいずれかで）導入され
得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記
載されるようなウイルスベクターによる手段である。特定のベクター（例えば、
レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そ
してこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソー
ムとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質内に残る。
【０２６４】 なお別の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるβ１０遺伝
子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切なエフ
ェクターに対する応答の際に、オンにされる。この様式で、治療ポリペプチドは
、所望のときに発現され得る。１つの従来の制御手段は、小分子結合ドメインお
よび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、
ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量体化するために使用
される、小分子二量体化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包含する
（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／４１８６５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６）
、ＷＯ ９７／３１８９８（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７）、およびＷＯ ９
７／３１８９９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７）に記載されるように）。この
タンパク質の二量体化を使用して、導入遺伝子の転写を開始し得る。
【０２６５】 代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、その細胞の内
側で凝集体またはクラスターとして貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、
融合タンパク質として発現され、この融合タンパク質は、条件的凝集ドメインを
含み、このドメインは、小胞体内での凝集したタンパク質の保持を生じる。貯蔵
されたタンパク質は、細胞内で安定でありそして不活性である。しかし、これら
のタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去し、これによってこの凝集体または
クラスターを特異的に破壊する薬物（例えば、小分子リガンド）を投与すること
によって、放出され得、その結果、これらのタンパク質は、その細胞から分泌さ
れ得る。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８１６−８１７および８２６−８３０（２０
００）を参照のこと。
【０２６６】 他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、以下の系が挙げられるが
、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）が、プロゲステロン
アンタゴニストとして使用される。プロゲステロンアンタゴニストに対する、改
変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインの結合は、２つの転写
因子の二量体を形成し、次いで、これらの転写因子が、核を通ってＤＮＡに結合
することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、そのレセ
プターがその天然のリガンドに結合する能力を排除するよう改変される。改変さ
れたステロイドホルモンレセプター系は、米国特許第５，３６４，７９１号なら
びにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に、さら
に記載されている。
【０２６７】 なお別の制御系は、エクジソン（ショウジョウバエのステロイドホルモン）を
使用し、これは、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そして
このレセプターを活性化する。次いで、このレセプターは、核に転移して、特定
のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）を結合
する。エクジソンレセプターは、転写を開始するための、トランス活性化ドメイ
ン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、米国
特許第５，５１４，５７８号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７、Ｗ
Ｏ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２にさらに記載されている。
【０２６８】 別の制御手段は、ポジティブなテトラサイクリン制御可能トランスアクチベー
ターを使用する。この系は、転写を活性化させるポリペプチドに連結された、変
異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節
トランスアクチベータータンパク質（すなわち、これは、テトラサイクリンの存
在下で、ｔｅｔオペレーターに結合する）を生じる変異ｔｅｔ Ｒ−４アミノ酸
変化）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６
５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載されている。
【０２６９】 さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｉｎｃ．に対する米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８
３４，１８６号に記載されている。
【０２７０】 インビボ遺伝子治療は、β１０ポリペプチドをコードする遺伝子を、β１０核
酸分子の局所的注射を介してかまたは他の適切なウイルス送達ベクターもしくは
非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る（Ｈ
ｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５）
。例えば、本発明のβ１０ポリペプチドをコードする核酸分子は、標的化された
細胞への送達のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（
例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番
号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは、代表的に、機能的
プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたβ１０ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０２７１】 代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、肝
炎ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポッ
クスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、コロナウイルスベクター、
ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、およびパピローマウイ
ルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，
３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボウイルス媒
介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク
質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようインビトロで処理されたヒト細
胞の送達による、患者に治療タンパク質を提供するためのプロセスの例を、提供
する。遺伝子治療技術の実施のさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３
１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１
０号（レトロウイルスベクターを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９
号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている
。
【０２７２】 非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注
入）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーショ
ン、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃
）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法として
はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特
異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞より優れた選択的利点を提
供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選
択系および発現制御系（安全性の尺度）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のた
め）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増
強するための転写因子、ならびにベクター作製の方法が挙げられ得る。遺伝子治
療技術の実施のための、このようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，
９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ
９６／４０９５８（核リガンドを含む）、米国特許第５，６７９，５５９号（遺
伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、米国特許第５，６７６，
９５４号（リポソームキャリアを含む）、米国特許第５，５９３，８７５号（リ
ン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）、および米国特
許第４，９４５，０５０号（ここで、生物学的に活性な粒子が、細胞において、
この粒子がこの細胞の表面を貫通しそしてこの細胞の内側に取り込まれる速度で
推進されるプロセス、を記載する）、およびに記載されている。
【０２７３】 β１０遺伝子治療または細胞治療が、同じまたは異なる細胞における１つ以上
のさらなるポリペプチドの送達をさらに含み得ることがまた意図される。このよ
うな細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一の移植
可能なデバイス（例えば、上記のカプセル化膜）内に含まれ得るか、または細胞
は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２７４】 遺伝子治療を介して細胞における内因性β１０ポリペプチド発現を増加させる
ための手段は、１つ以上のエンハンサーエレメントをβ１０ポリペプチドプロモ
ーターに挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、β１０
遺伝子の転写活性を増加させるよう作用し得る。使用されるエンハンサーエレメ
ントは、遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される；この
組織においてプロモーター活性化を与えることが既知であるエンハンサーエレメ
ントが、選択される。例えば、β１０ポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞
において「オンにされる」場合には、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメン
トが使用され得る。ここで、負荷される転写エレメントの機能性部分は、標準的
なクローニング技術を使用して、β１０ポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡ
のフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターおよび／または
５’および／または３’隣接配列などに挿入され得る）。次いで、この構築物（
「相同組換え構築物」として公知）が、エキソビボでかまたはインビボでのいず
れかで、所望の細胞に導入され得る。
【０２７５】 遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することに
よって、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体発現を減少させる
ために、使用され得る。このような改変は、代表的に、相同組換え法を介して達
成される。例えば、不活化について選択されたβ１０遺伝子のプロモーターの全
てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーター片を除去および
／または置換するように、操作され得る。例えば、プロモーターの転写アクチベ
ーターのＴＡＴＡボックスおよび／または結合部位が、標準的な分子生物学の技
術を使用して、欠失され得る；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得
、これによって、対応するβ１０遺伝子の転写を抑制する。プロモーターにおけ
るＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、（調節される
β１０遺伝子と同じ種かまたは関連する種由来の）β１０ポリペプチドプロモー
ターの全てまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成
され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベータ
ー結合部位のヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／ま
たは挿入を介して変異される。その結果、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアク
チベーター結合部位は、活性が減少されているか、または完全に不活性にされて
いる。この構築物はまた、代表的に、その改変されたプロモーターセグメントに
隣接するネイティブな（内因性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する、少な
くとも約５００塩基のＤＮＡを含む。この構築物は、直接的にかまたは本明細書
中に記載されるようなウイルスベクターを介して、適切な細胞に（エキソビボで
かまたはインビボでかのいずれかで）導入され得る。代表的に、細胞のゲノムＤ
ＮＡへのこの構築物の組み込みは、相同組換えを介し、ここで、このプロモータ
ー構築物における５’および３’ＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションを介す
るその内因性染色体ＤＮＡへの改変されたプロモーター領域の組み込みを補助す
るよう作用し得る。
【０２７６】 （本発明の核酸およびポリペプチドの他の使用） 本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない
核酸分子を含む）を使用して、β１０遺伝子および関連する遺伝子の染色体上の
位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣ
Ｒ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。
【０２７７】 β１０核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核
酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のβ１０ＤＮＡまたは対
応するＲＮＡの存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための
、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る
。
【０２７８】 β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体は、処置される適応症に
とって適切な１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／
または化学療法剤と組合せて（同時に、または連続的に）使用され得る。
【０２７９】 他の方法もまた、本発明の１つ以上のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０
ヘテロ二量体の活性を阻害することが所望される場合に、使用され得る。このよ
うな阻害は、発現制御配列（三重へリックス形成）またβ１０ｍＲＮＡに対して
相補的でありそしてそれにまたはハイブリダイズする、核酸分子によってもたら
され得る。例えば、選択されたβ１０遺伝子の少なくとも部分と相補的な配列を
有するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子が細胞中に導入され得る。アンチセ
ンスプローブは、本明細書中で開示されたβポリペプチドの配列を使用して、利
用可能な技術により設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の
各々は、各選択されたβ１０遺伝子の開始部位（５’末端）と相補的である。次
いで、このアンチセンス分子が、対応するβ１０ｍＲＮＡにハイブリダイズする
場合、このｍＲＮＡの翻訳が、妨げられるかまたは減少する。アンチセンスイン
ヒビターは、細胞または生物中の、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体の減少または不在に関連する情報を提供する。
【０２８０】 あるいは、遺伝子療法が、１つ以上のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０
ヘテロ二量体のドミナントネガティブインヒビターを作製するために使用され得
る。この状況において、各選択されたβ１０ポリペプチドの変異ポリペプチドを
コードするＤＮＡが調製され得、そして本明細書中に記載のウイルス的方法また
は非ウイルス的方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このよ
うな変異体の各々は、代表的には、その生物学的役割において内因性ポリペプチ
ドまたはヘテロ二量体と競合するように設計される。
【０２８１】 さらに、本発明のβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体（生物
学的に活性であっても、またはそうでなくても）は、免疫原として使用され得、
すなわち、このポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトー
プを含む。（本明細書中に記載の）β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテ
ロ二量体に結合する選択的結合因子は、インビボ診断およびインビトロ診断の目
的で使用され得、この目的としては、体液または細胞サンプル中のβ１０ポリペ
プチドもしくはα２／β１０ヘテロ二量体を存在を検出するための標識形態での
使用が挙げられるが、これに限定されない。この抗体はまた、本明細書中で列挙
された疾患および障害を含む、多くの疾患および障害を、予防、処置、または診
断するために使用され得る。この抗体は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１
０ヘテロ二量体を特徴づける少なくとも１つの活性を減少させるかまたは遮断す
るようにβ１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体に結合し得るか、
あるいは、この抗体は、β１０ポリペプチドまたはα２／β１０ヘテロ二量体を
特徴づける少なくとも１つの活性を増大するように（β１０ポリペプチドまたは
α２／β１０ヘテロ二量体の薬物動態を増大することによるものを含む）、ポリ
ペプチドに結合し得る。
【０２８２】 Ｅ．ｃｏｌｉ中のヒトβ１０ポリペプチドコードするｃＤＮＡを、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０
８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉ
ｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９へ、１９９９年１２月２８日に、登録番号
ＰＴＡ−１２１０のもと寄託した。
【０２８３】 以下の実施例は、例示目的のみが意図され、いかなる様式においても本発明の
範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２８４】 （実施例１：ヒトβ１０をコードするＤＮＡ） ＣＧ−（絨毛性生殖腺刺激ホルモン）−β−サブユニットのアミノ酸配列で、
社内製作した、ＧｅｎＢａｎｋに存在する公開されたヒトゲノム配列から導出し
たＶｉｒｔｕａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースに対して、ＢＬＡＳＴを実行し
た。ＣＧ−βのＣ末端側半分と有意な相同性を有する４５アミノ酸領域を含む仮
想タンパク質を、同定した。この４５アミノ酸ストレッチをコードするヒトゲノ
ム配列の短い（１３５塩基対）領域は、１６０キロ塩基対を超えるＧｅｎＢａｎ
ｋのヒトゲノムＤＮＡ配列（登録番号ＡＬ０４９８７１）に由来した。この１３
５塩基対の配列のすぐ５’側のゲノム配列の８キロ塩基対ストレッチを解析する
ことによって、ＣＧ−βのＮ末端側半分に対して有意な相同性を有する（かつフ
レームシフトを含む）領域を同定した。この新規遺伝子のヌクレオチド配列を、
このゲノム配列から編成した。この編成した遺伝子のアミノ酸配列は、４つの既
知のヒト糖タンパク質ホルモンのβサブユニットポリペプチドに対して有意な相
同性を有し、そしてＮ末端推定シグナルペプチドを有し、これは、糖タンパク質
ホルモンファミリーの新しいβ様メンバーである新規のヒト遺伝子と一致した。
Ｎ末端側半分とＣ末端側半分の２つの推定コードエキソンの間に位置する４．５
ｋｂのイントロンが存在した。種々の組織供給源由来のｃＤＮＡのイントロンス
パニング（ｉｎｔｒｏｎ ｓｐａｎｎｉｎｇ）ＰＣＲ（以下の組織発現、β−１
０の節を参照のこと）は、β１０が、下垂体を含む多数の組織において発現され
ることを示した。
【０２８５】 β１０の全コード領域（ＡＴＧからＴＧＡ停止コドンまで）および３’ＵＴＲ
（非翻訳領域）の一部を、以下の反応混合物およびＰＣＲ条件を用いたＰＣＲに
よって１つのフラグメントとしてクローニングした： テンプレート：１０マイクロリットルのＨｕｍａｎ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｍａ
ｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；カタログ番号７４２４−１）。
順方向プライマー：５’−ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴ
−３’（配列番号４）。 逆方向プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴ−３’
（配列番号５）。 各プライマーの最終濃度：１．０マイクロモル濃度。 ｄＮＴＰの最終濃度：２００マイクロモル濃度。 ５単位のＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
）。 １０マイクロリットルの１０×Ｐｆｕ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。 １０マイクロリットルのＧＣ ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣ
ｃＤＮＡ ＰＣＲキット；カタログ番号Ｋ１９０７−１）。 最終反応容量：１００マイクロリットル。
【０２８６】 サイクル条件：９４℃で６０秒間、続いて９４℃（１０秒間）、６０℃（２０
秒間）、７２℃（９０秒間）を４５サイクル、次いで４５番目のサイクルの終わ
りに、７２℃で７分間のインキュベーション、次いで９４℃（１０秒間）、６０
℃（２０秒間）、７２℃（９０秒間）をさらに１０サイクル、次いでこのさらな
る１０番目のサイクルの終わりに７２℃で７分間のインキュベーション。
【０２８７】 ＰＣＲ反応物をアガロースゲルに泳動し、そして１本のバンドが見られた。こ
のＤＮＡバンドをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＡＭＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中
にクローニングした。得られたクローンのうちの１つにおける挿入物の配列は、
β１０の全コード領域（ＡＴＧからＴＧＡ停止コドンまで）および３’ＵＴＲ（
非翻訳領域）の一部を含む、配列番号２の配列である。
【０２８８】 以下は、公に利用可能なデータベースからのβ１０配列のリストおよび説明で
ある： ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０４９８７１：１７０キロ塩基対のヒトゲノム配
列。この記録にはエキソンも遺伝子も相同性も同定されておらず、そしてβ１０
の全コード領域の配列は介在配列によって破壊されている。
【０２８９】 ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１１８５５５：１２６キロ塩基対のヒトゲノム配
列。この記録にはエキソンも遺伝子も相同性も同定されておらず、そしてβ１０
の全コード領域の配列は介在配列によって破壊されている。
【０２９０】 （実施例２：組織発現、β−１０） ＰＣＲフラグメントをプローブとして用いて、種々のＨｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉ
ｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉ
ｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）についてハイブリダイゼーションシグナル
を得ることは可能でなかった。イントロンスパニングＰＣＲを用いて、β−１０
の発現パターンを以下の通りに決定した。
【０２９１】 Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｅ−ＲＡＣＥ Ｐａｎｅｌｓ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；カタログ番号ＨＲＡ
Ａ−１０１）について、ｃＤＮＡサンプルは、脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、結
腸、肺、小腸、筋肉、胃、精巣、胎盤、下垂体、甲状腺、副腎、膵臓、卵巣、子
宮、前立腺、末梢血白血球、胎児脳、胎児肝臓、脂肪および乳腺を示した。各ｃ
ＤＮＡサンプルは、ＤＮＡの完全に乾燥したペレットの形態で別々のチューブ内
にあった。この反応混合物は以下の通りに構成されていた： 順方向プライマー：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（
配列番号６）； 逆方向プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴ−３
’（配列番号５）； 各プライマーの量：０．５ピコモル； ｄＮＴＰの最終濃度：２００マイクロモル濃度； ２．５マイクロリットルのＧＣ ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｇ
Ｃ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット；カタログ番号Ｋ１９０７−１）； ２．５単位のＴａｑ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ；カタログ番号１５７８ ５
５３）； ２．５マイクロリットルの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉ
ｔ；カタログ番号１５７８ ５５３）。
【０２９２】 各ｃＤＮＡサンプルについて、上記の反応混合物を、２５マイクロリットルの
容量にし、そして２０マイクロリットルのこの混合物を、完全に乾燥したｃＤＮ
Ａペレットに添加した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃にて６０秒間
、続いて９４℃（１０秒間）および７２℃（４０秒間）を５サイクル、続いて９
４℃（１０秒間）および７０℃（４０秒間）を５サイクル、続いて９４℃（１０
秒間）および６８℃（４０秒間）を３５サイクル、次いで続いて６８℃で７分間
。
【０２９３】 次いで、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。β１０の
発現を示す２９３塩基対の正確なサイズのＰＣＲ産物が、結腸、小腸、精巣、下
垂体および胎児肝臓に見出された。
【０２９４】 Ｈｕｍａｎ Ｒａｐｉｄ−Ｓｃａｎ Ｐｌａｔｅ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ；カタログ番号ＨＳＣ
Ａ−１０１）について、ｃＤＮＡサンプルは、脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、結
腸、肺、小腸、筋肉、胃、精巣、胎盤、唾液腺、甲状腺、副腎、膵臓、卵巣、子
宮、前立腺、皮膚、末梢血白血球、骨髄、胎児脳および胎児肝臓を示した。各ｃ
ＤＮＡサンプルは、ＤＮＡの完全に乾燥したペレットの形態で別々のチューブ内
にあった。
【０２９５】 利用した反応混合物は以下の通りであった： 順方向プライマー：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（
配列番号６）； 逆方向プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴ−３
’（配列番号５）； 各プライマーの量：０．５ピコモル； ｄＮＴＰの最終濃度：２００マイクロモル濃度； ２．５マイクロリットルのＧＣ ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｇ
Ｃ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット；カタログ番号Ｋ１９０７−１）； ２．５単位のＴａｑ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ；カタログ番号１５７８ ５
５３）； ２．５マイクロリットルの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉ
ｔ；カタログ番号１５７８ ５５３）。
【０２９６】 各ｃＤＮＡサンプルについて、上記の反応混合物を２５マイクロリットルの容
量にし、次いで２０マイクロリットルのこの混合物を、完全に乾燥したｃＤＮＡ
ペレットに添加した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で６０秒間、続
いて９４℃（１０秒間）、７２℃（４０秒間）を５サイクル、次いで続いて９４
℃（１０秒間）、７０℃（４０秒間）を５サイクル、次いで続いて９４℃（１０
秒間）、６８℃（４０秒間）を３５サイクル、次いで続いて６８℃で７分間。
【０２９７】 次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。β１０の発
現を示す、２９３塩基対の正確なサイズのＰＣＲ産物は、脳、脾臓、肝臓、結腸
、胃、胎盤、甲状腺、副腎、膵臓、皮膚および末梢血白血球において見出された
。
【０２９８】 Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｅ−ＲＡＣＥ Ｐａｎｅｌｓからの発現の結果とＨｕｍａ
ｎ Ｒａｐｉｄ−Ｓｃａｎ Ｐｌａｔｅからの発現の結果とを組み合わせると、
β１０が脳、肝臓、胎児肝臓、胃、下垂体、結腸、小腸、甲状腺、副腎、膵臓、
皮膚、末梢血白血球、脾臓、精巣および胎盤において発現されることが示された
。
【０２９９】 （実施例３：組織発現、α２） ノーザン分析を行って、α２の発現パターンを決定した。ノーザンのためのプ
ローブは、３９０塩基対のＰＣＲ産物（ＷＯ９９／４１３７７による配列番号１
のヌクレオチド５６〜４４５に対応する）であった。このＰＣＲ産物を、４６６
塩基対のＰＣＲ中間体を介して以下の通りに生成した： ＰＣＲを最初に用い、以下の反応混合物およびＰＣＲ条件を用いて、ヒト精巣
ｃＤＮＡからα２の４６６塩基対のフラグメントをクローニングした： テンプレート：１０マイクロリットルのＨｕｍａｎ Ｔｅｓｔｉｓ Ｍａｒａ
ｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；カタログ番号７４１４−１）； 順方向プライマー：５’−ＧＡＧＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴ−
３’（配列番号７）； 逆方向プライマー：５’−ＧＴＴＴＣＣＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡ−
３’（配列番号８）； 各プライマーの最終濃度：１．０マイクロモル濃度； ｄＮＴＰの最終濃度：２００マイクロモル濃度； ５単位のＰｆｕポリメラーゼ； 最終反応容量：１００マイクロリットル； サイクル条件：９４℃で６０秒間、続いて９４℃（１０秒間）、６０℃（３０
秒間）、７２℃（６０秒間）を３５サイクル、次いで３５回目のサイクルの最後
に７２℃で５分間のインキュベーション。
【０３００】 ＰＣＲ反応物をアガロースゲルで泳動し、そして４本の別々のバンドが見られ
た。複数のバンドが、Ｈｕｍａｎ Ｔｅｓｔｉｓ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄ
ｙ ｃＤＮＡ中に存在する夾雑ヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅から生じた。４６
６塩基対のＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、そしてクローニングした。
４６６塩基対の配列を含むプラスミドクローンを、以下の反応混合物およびＰＣ
Ｒ条件を用い、３９０塩基対のＰＣＲフラグメントを生成するためのテンプレー
トとして用いた： テンプレート：上記の４６６塩基対の配列を含む１０ピコグラムのプラスミド
クローン； 順方向プライマー：５’−ＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＡＣ
−３’（配列番号９）； 逆方向プライマー：５’−ＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡ
ＴＧＴＣＡ−３’（配列番号１０）； 各プライマーの最終濃度：１．０マイクロモル濃度； ｄＮＴＰの最終濃度：２００マイクロモル濃度； １０単位のＴａｑポリメラーゼ； 最終反応容量：１００マイクロリットル； サイクル条件：９４℃で６０秒間、続いて９４℃（１０秒間）、６８℃（６０
秒間）を３５サイクル、次いで３５番目のサイクルの終わりに、６８℃で６分間
のインキュベーション。
【０３０１】 次いで、３９０塩基対のＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製
した。このＰＣＲフラグメントを、３２Ｐを用いて標識化し、そして以下のよう
な高いストリンジェントな条件を使用して、種々のＣｌｏｎｔｅｃｈヒト複数組
織ノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ）示される組織／細胞は、以下であった：膵臓、副腎髄質、
甲状腺、副腎皮質、精巣、胸腺、小腸、胃、脾臓、前立腺、子宮、結腸、末梢血
白血球、脳、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓、胎盤および肺）ならびに下垂体ｍＲＮ
Ａで作製されたノーザンブロットにハイブリダイズさせた。
【０３０２】 ハイブリダイゼージョンは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ハイ
ブリダイゼージョン溶液」を使用して６８℃で１時間であった。このブロットは
、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で室温で２回、各回２０分間洗浄した。次い
で、ブロットを、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で５０℃で１０分間洗浄
し、次いでフィルムに曝露した。
【０３０３】 単一のバンドを示す強いシグナルを、膵臓ｍＲＮＡのレーンおよび下垂体ｍＲ
ＮＡレーンにおいて観察した。有意により弱いシグナルを、胎盤ｍＲＮＡのレー
ンにおいて観察した。
【０３０４】 インサイチュハイブリダイゼージョンによってα２遺伝子発現の位置をさらに
決定した。正常胚性（Ｅ１０．５〜Ｅ１８．５）および成体マウス組織ならびに
成体アカゲザル組織のパネルを、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフ
ィンに包埋し、そして５μｍの切片にする。インサイチュハイブリダイゼージョ
ンの前に、組織を０．２ＭのＨＣｌで透過化処理し、次いでプロテイナーゼＫで
消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化する。切片に
、マウスα２配列かまたはヒトα２配列（アカゲザル組織用）かのいずれかに相
補的な３３Ｐ標識化アンチセンスＲＮＡプローブおよびセンス（コントロール）
プローブを５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。このアンチセンスおよびセンス３３ Ｐ標識化ＲＮＡプローブを、プラスミドＤＮＡのインビトロ転写物によって
得た。このプラスミドｃＤＮＡは、マウスα２ ＤＮＡ（ｐｕｂｌｉｃ Ｗａｓ
ｈＵ−ＨＨＭＩ Ｍｏｕｓｅ ＥＳＴ Ｐｒｏｊｅｃｔからの細菌クローン番号
１２２４９９０）かまたはヒトα２ ｃＤＮＡ（上記のＰＣＲによって生成され
た３９０塩基対のヒトα２コード領域配列を含むプラスミドクローン）かのいず
れかを含む。
【０３０５】 ハイブリダイゼージョン後、切片を、緩衝液で洗浄し、ＲＮａｓｅＡで処理し
てハイブリダイズされなかったプローブを除去し、次いで０．１×ＳＳＣ中で５
５℃での高いストリンジェシーな洗浄に供した。スライドを、Ｋｏｄａｋ ＮＴ
Ｂ２エマルジョンに浸漬し、４℃で２〜３週間曝露し、現像し、次いで対比染色
をした。切片を、組織形態およびハイブリダイゼージョンシグナルを同時に評価
することを可能にするために、暗視野および標準の照明で調べた。次いで以下の
組織を調べた： マウス組織：脳（１矢状切断、２冠状切断）；ＧＩ管（食道、胃、十二指腸、
空腸、回腸、近位結腸および遠位結腸）；下垂体；肝臓；肺；心臓；脾臓；胸腺
；リンパ節；腎臓；副腎；膀胱；膵臓；唾液腺；雄性生殖器官および雌性生殖器
官（雌の卵巣、卵管および子宮；雄の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢および精管
）；ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎周囲）；骨（大腿骨）；皮膚；胸部；ならび
に骨格筋。
【０３０６】 アカゲザル組織：副腎；肝臓；胆嚢；腸；膵臓；および唾液線。
【０３０７】 マウスとヒトの両方のアンチセンスプローブは、センス標準コントロール用い
て見られる非常に低いレベルのバックグランドより高い検出可能な陽性シグナル
を生じた。マウス胚において、シグナルは、Ｅ８．５〜Ｅ１８．５までのいかな
る主要な器官においても観察されなかった。Ｅ１５．５およびＥ１８．５におい
て、シグナルは、発生中の頭部の骨および歯のいくつかに隣接した点在する細胞
に存在した。成体マウスにおいて、中程度のレベルのシグナルが、副腎皮質に存
在した。より低いレベルのシグナルが、下垂体の前葉および中葉ならびに陰窩の
レベルにおける腸上皮において検出可能であった。さらに、粒密度は、精巣の精
細管内の発生中の精子において、および卵巣における発生中の卵胞の周りの顆粒
膜細胞のおいてバックグランドよりわずかに高かった。
【０３０８】 アカゲザル組織において、中程度のシグナルが、副腎皮質、胆嚢上皮および主
に陰窩のレベルにおける腸上皮において見られた。
【０３０９】 α２ノーザンとα２インサイチュ分析の発現結果の組み合わせは、α２が、下
垂体前葉、胎盤、膵臓、副腎皮質、腸の陰窩および胆嚢粘膜に発現されることを
示す。
【０３１０】 （実施例４：α２に対する抗体） ウサギポリクローナル抗体を、キーホールリンペントヘモシアニン（カタログ
番号７７６０５ Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に結合体
化されたペプチドＣＳＰＲＹＳＶＬＶＡＳＧＹＲＨＮ（配列番号２８）を用いて
ウサギを免疫することによってα２に対して産生した。このペプチドは、Ｃ−末
端アミドを用いて合成し、それ故、そのＣ末端は、ＣＯＯＨではなく、ＣＯＮＨ２ であった。ペプチド配列のＲＹＳＶＬＶＡＳＧＹＲＨＮ部分は、ヒトα２とマ
ウスα２との間で全体的に保存されている。これらの抗体が、ヒトα２およびマ
ウスα２に結合し得るので、この領域を選択した。これらの抗体を、ペプチド抗
原（配列番号２８）が結合されているカラム（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｋｉｔ，カ
タログ番号４４８９５，Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上
でウサギ血清からアフィニティー精製した。ヒトα２−ポリＨｉｓ−タグ哺乳動
物発現ベクターまたはヒトα−サブユニット−ポリＨｉｓ−タグ哺乳動物発現ベ
クターのいずれかをトランスフェクトした２９３細胞から回収された馴化培地の
ウエスタンブロット分析は、これらのアフィニティー精製されたポリクローナル
抗体が、α２ポリペプチドに対して高い特異性を有し、そしてαサブユニットと
交差反応しないことを実証した。
【０３１１】 （実施例５：マウスβ−１０をコードするＤＮＡ） 種々のヒトβ−１０ ｃＤＮＡプローブを使用して、高密度フィルターに整列
されたマウスゲノム１２９ＳｖＪ ＢＡＣライブラリー（カタログ番号ＦＢＡＣ
−４４３１、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をプロー
ブした。プレート番号２１８−ウェル番号Ｐ２２におけるマウスＢＡＣクローン
を得た。（カタログ番号ＦＢＡＣ−４４３２．Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）このＢＡＣクローンからの１０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩサ
ブフラグメントは、ヒトβ−１０ ｃＤＮＡプローブに強くハイブリダイズした
。この１０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ
−ＫＳ（−）にサブクローニングし、そして全体的に配列決定をした。この１０
ｋｂのマウスゲノム配列のコンピューター分析を使用して、ヒトβ−１０のマウ
スオルソログをコードする２つのエキソンを同定した。
【０３１２】 プライマーを、この電子配列から設計して以下のようにマウスβ−１０ ｃＤ
ＮＡをクローニングした。
【０３１３】 テンプレート：２０μｌのマウス精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮ
Ａ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ；カタログ番号７４５５−１） 順方向プライマー：５’−ＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴ
ＧＧＴＡＴＡＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１４）； 逆方向プライマー：５’−ＴＴＡＡＴＡＡＴＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴ
ＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧ−３’（配列番号１５）； 各プライマーの最終濃度：１．０μｍｏｌ ＰＣＲキット：Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓ
ｔｅｍ （カタログ番号１７３２６４１， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ） 最終反応容積：５０μｌ； サイクリング条件：９４℃で６０秒間、次いで９４℃（１０秒間）、６５℃（
２０秒間）、７２℃（４０秒間）の５５サイクル、次いで５５サイクル目の終了
時に７２℃で７分間のインキュベーション。
【０３１４】 次いで、０．４ｋｂのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製し
、そしてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，
ＣＡ）にクローニングした。マウスβ−１０の完全コード領域ｃＤＮＡ（配列番
号１２）を含むクローンを、配列決定によって同定した。
【０３１５】 （実施例６：α２単独、β１０単独を過剰発現するおよびα２およびβ１０を
同時発現するトランスジェニックマウスの産生ならびに分析） ヒトａｐｏリポタンパク質Ｅプロモーターからα２単独、β１０単独を過剰発
現するおよびα２およびβ１０を同時発現するトランスジェニックマウスを、本
質的に、以前に記載されるように産生した（Ｓｉｍｏｎｅｔら，１９９７，Ｃｅ
ｌｌ ８９巻 ３０９〜３１９頁）。このヒトａｐｏＥプロモーターベクターは
、トランスジェニックマウスにおいて高レベルの、肝臓特異的な遺伝子発現を指
向し、そして、以前のように使用して、マウスの循環中に高レベルのトランスジ
ーンコード分泌タンパク質をコードするを有するトランスジェニックマウスを産
生した。以下に記載される全ての表現型分析に関して、非トランスジェニックマ
ウスコントロールは、該当のトランスジェニック発現体と同じ一連のマイクロイ
ンジェクションの間に産生されたマウスであった。
【０３１６】 ゲノム（すなわち、α２のエキソンおよびイントロンおよびβ１０のエキソン
およびイントロンを含む）トランスジーンを、発現を最大化するトランスジェニ
ックを産生するために使用した。さらに、全てに場合において、Ｋｏｚａｋ部位
（ＣＣＡＣＣ）を、開始部位ＡＴＧの直ぐ５’側に操作した。
【０３１７】 ヒトａｐｏＥプロモーター発現ベクターは、ＨＣＲ（肝臓特異的エンハンサー
エレメント）、その後にａｐｏＥプロモーターおよび第１のイントロン（ａｐｏ
Ｅ５’ＵＴＲにおいて）、その後にＳＶ４０ ポリＡ−シグナル／ターミネータ
ーを含む。このベクターのａｐｏＥプロモーター−第１のイントロンとＳＶ４０
ポリＡ−シグナル／ターミネーター領域との間に、遺伝子の直接的なクローニ
ングのための固有のＳｐｅＩ部位およびＳｆｉＩ部位（ＰｖｕＩと適合性）が存
在する。
【０３１８】 以下の手順を使用して、「マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現ベクタートラン
スジーン」を産生した： ＢＡＣ Ｍｏｕｓｅ ＥＳ（１２９ＳｖＪ）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｃｒｅｅｎｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＤＴＷ−７４６０，Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のプールを、マウスα２に特異的なプライマーを使
用するＰＣＲによってスクリーニングした。プレート番号４４−ウェル番号１９
におけるマウスＢＡＣクローンを得た（カタログ番号ＦＢＡＣ−４４３２、Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。このＢＡＣクローンから
の１２ｋｂのＸｂａＩサブフラグメントは、マウスα２ ｃＤＮＡプローブに強
くハイブリダイズした。この１２ｋｂのＸｂａＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩ−ＫＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）にサブクローニングし、そして全体的に配列決定した。この１２−ｋ
ｂマウスのゲノム配列のコンピューター分析を使用して、３つのα２コードエキ
ソンを同定した。
【０３１９】 プライマーを設計して、以下のように完全マウスゲノムα２コード配列（開始
ＡＴＧから停止ＴＡＧ；配列番号１８）を増幅した。
【０３２０】 テンプレート：５ｎｇの１２ｋｂのＸｂａＩ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−
ＫＳ（−）クローンＤＮＡ； 順方向プライマー：５’−ＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡ
ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＴ−３’（配列番号１６）； 逆方向プライマー：５’−ＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＧＣＧ
ＧＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣ−３’（配列番号１７）； 各プライマーの最終濃度：１．０μｍｏｌ ＰＣＲキット：Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ） 最終反応容積：５０ｍｌ； サイクリング条件：９４℃で６０秒間、次いで９４℃（１０秒間）、６０℃（
２０秒間）７２℃（１８０秒間）の４０サイクル、次いで４０サイクル目の終了
時に７２℃で４分間のインキュベーション。
【０３２１】 ０．８ｋｂのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｓｐｅ
ＩおよびＰｖｕＩを用いて切断し、そしてＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ切断したヒトａｐ
ｏＥ発現ベクターにクローニングした。正確な全ゲノムコード領域マウスα２を
含むクローンを、配列決定によって同定した。この「マウスゲノムα２ヒトａｐ
ｏＥ発現ベクタートランスジーン」クローンからのＤＮＡを、ＣｌａＩとＡｐａ
ＬＩで消化した；４ｋｂのバンドを、ゲル電気泳動によって精製し、そしてこれ
を使用して、以前に記載のようにトランスジェニックマウスを産生した（Ｓｉｍ
ｏｎｅｔら，１９９７，Ｃｅｌｌ ８９巻、３０９〜３１９頁）。
【０３２２】 トランスジェニックマウスを以下のようにＰＣＲによって同定した： テンプレート：耳パンチＤＮＡ。
【０３２３】 順方向プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣ−３
’（配列番号１９）； 逆方向プライマー：５’−ＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＣ−３
’（配列番号２０）； 各プライマーの最終濃度：１．０μｍｏｌ ＰＣＲキット：Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒａｍａｉｃａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ，ＮＪ） 最終反応容積：２５μｌ； サイクリング条件：９４℃（６０秒）、６２℃（２０秒）、７２℃（３０秒）
の３０サイクル。
【０３２４】 ＰＣＲ産物の電気泳動において、０．３７ｋｂバンドの存在は、特定のマウス
が、トランスジェニックあることを示した。
【０３２５】 α２を過剰発現するトランスジェニックを、種々のＰＣＲで同定されたトラン
スジェニックから得られた血漿のウエスタンブロット（実施例４において上記さ
れる、アフィニティー精製された抗α２ポリクローナル抗体を使用する）によっ
て同定した。６匹のα２過剰発現体（番号７、８、２６、２８、１５６および１
８６）および６匹の非トランスジェニックコントロールマウス（番号１０、１１
、１２、１８、２０、２１）を、表現型的に分析した。全てのマウスを、収集す
る１時間前に５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵを注射し、エックス線写真をとり、そし
て屠殺した。マウスを、１２週齢で屠殺した。有意な知見は、検死の間に見られ
なかった。
【０３２６】 全てのマウスにおいて、体重および選択した器官の重量を測り、血液を、血液
学および血清化学のために採取し、そして器官を、組織学的分析およびＢｒｄＵ
標識化のために収集した。
【０３２７】 肝臓、胆嚢、脾臓、肺、脳、下垂体、心臓、腎臓、副腎、胃、小腸、膵臓、盲
腸、結腸、腸間膜リンパ節、皮膚、乳腺、気管、食道、甲状腺、上皮小体、唾液
線、膀胱、卵巣または精巣、子宮または前立腺および精嚢、骨および骨髄のＨ＆
Ｅ染色切片を調べた。
【０３２８】 α２過剰発現体トランスジェニックマウスと非トランスジェニックコントロー
ルマウスとの間には、平均または個々の動物の器官重量、血液学的値、臨床化学
的値または組織学的知見における生物学的に意義のある差異は存在しなかった。
言い換えれば、α２過剰発現体トランスジェニックマウスは、表現型を有さなか
った。
【０３２９】 以下の手順を使用して、「マウスゲノムβ１０ヒトａｐｏＥ発現ベクタートラ
ンスジーン」を産生した。
【０３３０】 プライマーを設計して、以下のように完全マウスゲノムβ１０コード配列を増
幅した（開始コドンＡＴＧ〜停止コドンＴＧＡ；配列番号２３）： テンプレート：１０ｎｇの実施例５に記載されるマウスゲノムβ１０の１０ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＫＳ（−）クローンＤＮＡ
。
【０３３１】 順方向プライマー：５’−ＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴ
ＧＧＴＡＴＡＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴ−３’（配列番号２１）； 逆方向プライマー：５’−ＴＴＡＡＴＡＡＴＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴ
ＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧ−３’（配列番号２２）； 各プライマーの終濃度：１．０μｍｏｌ ＰＣＲキット：ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ） 最終反応容積：５０μｌ サイクリング条件：９２℃で６０秒間、次いで、９２℃（１０秒間）、６５℃
（２０秒間）、６８℃（４分間）の１５サイクル。
【０３３２】 ３ｋｂのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、ＳｐｅＩお
よびＰｖｕＩで切断して、ＳｐｅＩ−ＳｆｉＩで切断したヒトａｐｏＥ発現ベク
ターにクローニングした。マウスβ１０コード領域のゲノムの正確な全長を含む
「マウスゲノムβ１０ヒトａｐｏＥ発現ベクター導入遺伝子」クローンを、配列
決定によって同定した。
【０３３３】 次いで、以下の手順を使用して、組み合わされた「マウスゲノムβ１０マウス
ゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現ベクター導入遺伝子」を作製した。
【０３３４】 「マウスゲノムβ１０ヒトａｐｏＥ発現ベクター導入遺伝子」クローンＤＮＡ
を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで切断し、そして末端を、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で平滑にした。５．６ｋｂのフラ
グメントをゲル精製して、ＨｉｎｃＩＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ
Ｉ ＫＳ（−）にクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−
）ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接するカセットのＳＶ４０ポリＡシグ
ナル／ターミネーター領域を有する方向での、５．６ｋｂの「マウスゲノムβ１
０ヒトａｐｏＥ発現カセット」を有するクローンを、同定した。このクローン由
来のＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｃａＩＩによって切断し、そして上記の
「マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現ベクター導入遺伝子」クローンから単離さ
れた、３．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩ「マウスゲノムα２ヒトａｐｏ
Ｅ発現カセット」に連結させた。最終の１１．８ｋｂの「マウスゲノムβ１０マ
ウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現ベクター導入遺伝子」構築物は、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）に縦列で（すなわち、両方とも同じ転写方向で）
クローニングされた「マウスゲノムβ１０ヒトａｐｏＥ発現カセット」および「
マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現カセット」からなる。この構築物において、
β１０およびα２の各々は、発現目的のための、それら自身のＨＣＲ／ａｐｏＥ
プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナル／ターミネーターを有する。
【０３３５】 この「マウスゲノムβ１０マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現ベクター導入遺
伝子」クローン由来のＤＮＡを、ＢｓｓＨＩＩで消化した；９ｋｂのバンドを、
ゲル電気泳動で精製し、そして以前に記載された（Ｓｉｍｏｎｅｔら、１９９７
、Ｃｅｌｌ 第８９巻 ３０９−３１９頁）トランスジェニックマウスを作製す
るために使用した。
【０３３６】 「マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現カセット」についてのトランスジェニッ
クマウスを、以下のようなＰＣＲで同定した： テンプレート：耳パンチＤＮＡ 順方向プライマー：
【０３３７】
【化１】 逆方向プライマー：
【０３３８】
【化２】 各プライマーの最終濃度：１．０μＭ ＰＣＲキット：Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
、ＮＪ） 最終反応容量：２５μｌ； サイクル条件：９４℃で６０秒、次いで９４℃（１０秒）、６０℃（２０秒）
、７２℃（４０秒）の３５サイクル、次いで、この３５サイクルの最後での７２
℃で７分間のインキュベーション。
【０３３９】 このＰＣＲのための順方向プライマー
【０３４０】
【化３】 は、３番目のα２コードエキソン（このエキソンは、終止コドンを含む）に位置
する。
【０３４１】 このＰＣＲのための逆方向プライマー
【０３４２】
【化４】 は、ＳＶ４０ポリＡシグナル／ターミネーター領域に位置する。
【０３４３】 ＰＣＲ産物の電気泳動に際して、０．３１ｋｂのバンドの存在は、この特定の
マウスが、「マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現カセット」についてのトランス
ジェニックであることを示した。これらのマウスの番号は、２５、４５、５３、
７６、９４、９５および１１３であった。
【０３４４】 「マウスゲノムβ１０ヒトａｐｏＥ発現カセット」についてのトランスジェニ
ックマウスを、以下のようなＰＣＲで同定した： テンプレート：耳パンチＤＮＡ 順方向プライマー：
【０３４５】
【化５】 逆方向プライマー：
【０３４６】
【化６】 各プライマーの最終濃度：１．０μＭ ＰＣＲキット：Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
、ＮＪ） 最終反応容量：２５μｌ； サイクル条件：９４℃で６０秒、次いで９４℃（１０秒）、６０℃（２０秒）
、７２℃（４０秒）の３５サイクル、次いで、この３５サイクルの最後での７２
℃で７分間のインキュベーション。
【０３４７】 このＰＣＲのための順方向のプライマー
【０３４８】
【化７】 は、２番目のβ１０コードエキソン（このエキソンは、終止コドンを含む）に位
置する。
【０３４９】 このＰＣＲのための逆方向のプライマー
【０３５０】
【化８】 は、ＳＶ４０ポリＡシグナル／ターミネーター領域に位置する。
【０３５１】 このＰＣＲ産物の電気泳動に際して、０．３７ｋｂのバンドの存在は、この特
定のマウスが、「マウスゲノムβ１０ヒトａｐｏＥ発現カセット」についてのト
ランスジェニックであることを示した。これらのマウスの番号は、２５、３１、
４５、５３、７６、９４、９５および１１３であった。「マウスゲノムβ１０ヒ
トａｐｏＥ発現カセット」についてＰＣＲによって陽性であったマウス＃３１が
、「マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現カセット」についてはＰＣＲによって陰
性であったことに注目されたい。
【０３５２】 マウス＃７６および＃１１３は、ＰＣＲ遺伝型特定後直ぐに死亡した。残り６
匹のトランスジェニック［＃２５（雌性）、＃３１（雄性）、＃４５（雌性）、
＃５３（雄性）、＃９４（雄性）および＃９５（雄性）］ならびに５匹の非トラ
ンスジェニックコントロールマウス［＃１７（雄性）、＃１８（雌性）、＃１９
（雌性）、＃２０（雄性）および＃２１（雄性）］を、続く表現型分析のために
７週齢で剖検した。全てのマウスに、５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵを注射し、その
１時間後に収集、ラジオグラフィー、および屠殺した。剖検に際して、異常に大
きい甲状腺が、いくつかのトランスジェニックマウスにおいて見出された。剖検
の一部として、マウスを計量し、血液学および血清化学のために採血し、そして
肝臓、脾臓、腎臓、心臓および胸腺を計量した。肝臓、胆嚢、脾臓、肺、脳、下
垂体、心臓、腎臓、副腎、胸腺、胃、小腸、膵臓、盲腸、結腸、腸間膜リンパ節
、皮膚、乳腺、気管、食道、甲状腺、上皮小体、唾液腺、膀胱、卵巣または精巣
、子宮または前立腺および精嚢、骨ならびに骨髄を、組織学的分析のために収集
した。
【０３５３】 ノーザンブロット分析を使用して、下記のように、全てのトランスジェニック
マウスおよび非トランスジェニックコントロールマウスの肝臓におけるα２ ｍ
ＲＮＡおよびβ１０ ｍＲＮＡのレベルを決定した。
【０３５４】 総ＲＮＡを肝臓サンプルから単離して定量し、各マウスについての総ＲＮＡ１
０μｇをホルムアルデヒド変性アガロースゲルで電気泳動し、そしてナイロン膜
に転写させた。これを、探索のための２つのノーザンブロットを作製するために
、二重で行った。このアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色は、全てのウ
ェルにわたる、そして両方のゲル間での、実質的に等価なＲＮＡのローディング
を明らかにした。α２の発現を評価するために、α２ ｃＤＮＡの全コード領域
（ＡＴＧ〜ＴＡＧ）を含む、ランダムプライムしたＰ３２標識プローブで、１つ
のノーザンブロットを探索した。β１０の発現を評価するために、β１０ ｃＤ
ＮＡの全コード領域（ＡＴＧ〜ＴＡＧ）を含む、ランダムプライムしたＰ３２標
識プローブで、第二のノーザンブロットを探索した。
【０３５５】 ハイブリダイゼーションを、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｉｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）
中で、６５℃で１時間行った。ブロットを、室温で、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ中で、各回２０分間、２回洗浄した。次いで、このブロットを、０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ中で、５０℃で１０分間洗浄し、次いで、フィルムに曝露さ
せた。
【０３５６】 ノーザン分析の結果は、以下の通りであった： 非トランスジェニックコントロールマウスについては、α２またはβ１０のいず
れについてもシグナルを見出さなかった。 トランスジェニックマウス＃９４（雄性）については、α２またはβ１０のいず
れについてもシグナルを見出さなかった。 トランスジェニックマウス＃２５（雌性）および＃４５（雌性）については、α
２およびβ１０の両方について、強力なシグナルを見出した。 トランスジェニックマウス＃９５（雄性）については、α２およびβ１０の両方
について、中程度のシグナルを見出した。 トランスジェニックマウス＃５３（雄性）については、α２について中程度のシ
グナルを、そしてβ１０について弱いシグナルを見出した。 トランスジェニックマウス＃３１（雄性）については、β１０については中程度
のシグナルが見出されたが、α２についてはシグナルが見出されず、これは、マ
ウス＃３１が、β１０のみを過剰発現し、α２を発現しなかったことを示す。マ
ウス＃３１におけるβ１０発現レベルは、マウス＃５３において見出されたレベ
ルよりも有意に大きかった。トランスジェニックマウス＃３１についての発現結
果は、上記のＰＣＲ遺伝子型特定（＃３１について、「マウスゲノムβ１０ヒト
ａｐｏＥ発現カセット」に関しては陽性であったが、「マウスゲノムα２ヒトａ
ｐｏＥ発現カセット」に関しては陰性であった）と一致する。マウス＃３１につ
いてのデータは、「マウスゲノムβ１０マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現ベク
ター導入遺伝子」ＤＮＡの「マウスゲノムα２ヒトａｐｏＥ発現カセット」領域
が、マイクロインジェクションプロセスの間のいくつかの時点で短縮されて、β
１０を過剰発現するがα２は発現しないマウスを生じたことを示す。トランスジ
ェニックマウスを作製するプロセスの間の、導入遺伝子ＤＮＡの剪断／短縮は、
トランスジェニックに関する文献において以前に報告されている。
【０３５７】 ４匹のα２／β１０過剰発現体（＃２５、＃４５、＃５３および＃９５）、５
匹の非トランスジェニックコントロールマウス（＃１７、＃１８、＃１９、＃２
０および＃２１）およびトランスジェニックマウス＃３１（これは、β１０のみ
を過剰発現したがα２を発現しなかった）由来の肝臓、胆嚢、脾臓、肺、脳、下
垂体、心臓、腎臓、副腎、胸腺、胃、小腸、膵臓、盲腸、結腸、腸間膜リンパ節
、皮膚、乳腺、気管、食道、甲状腺、上皮小体、唾液腺、膀胱、卵巣または精巣
、子宮または前立腺および精嚢、骨ならびに骨髄のＨ＆ＥおよびＢｒｄＵ染色切
片を試験した。
【０３５８】 ＢｒｄＵでの免疫組織学的染色を、自動化ＤＰＣ Ｍａｒｋ ５ Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ、Ｒａｎｄｏｌｐｈ、ＮＪ）を使用して、４μｍの
厚さのパラフィン包埋切片上で行った。脱パラフィン化した組織切片を、０．１
％のプロテアーゼで消化し、次いで、２Ｎの塩酸で処理した。切片を、ＣＡＳ
ＢＬＯＣＫ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ、ＣＡ）でブロッキングし、ラット抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Ａｃｃ
ｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｅｓｔｂｕ
ｒｙ、ＮＹ）と共にインキュベートした。この一次抗体を、ビオチン化ウサギ抗
ラット免疫グロブリンポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ
、ＣＡ）で検出した。次いで、切片を、３％の過酸化水素でクエンチしてアビジ
ン−ビオチン三次複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と反応さ
せた。この染色反応を、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｄａｋｏ Ｃａｒｐｉｎ
ｔｅｒｉａ、ＣＡ）で可視化して、切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０３５９】 ４匹全てのα２／β１０過剰発現体は、肝腫（非トランスジェニックコントロ
ールマウスにおける４．９８±０．２９％ＢＷに対して６．７５±０．６８％Ｂ
Ｗ、ｐ＝０．００１１）および腎肥大（非トランスジェニックコントロールマウ
スにおける１．７５±０．１２％ＢＷに対して２．２３±０．２１％ＢＷ、ｐ＝
０．００３３）を示した。α２／β１０過剰発現体マウスはまた、非トランスジ
ェニックコントロールの対応マウスよりも僅かに低い平均体重を有した；この差
異は、統計的に有意ではなかった。α２／β１０過剰発現体マウス＃４５および
＃５３はまた、中程度の巨脾腫を示した。β１０のみを過剰発現したがα２を発
現しなかったトランスジェニックマウス＃３１は、正常な肝臓、腎臓および脾臓
重量を有した。
【０３６０】 ４匹全てのα２／β１０過剰発現体マウスは、上昇した血清Ｔ４レベル（非ト
ランスジェニックコントロールマウスにおける５．０±０．７μｇ／ｄｌに対し
て２３．１±５．４μｇ／ｄｌ、ｐ＝０．０００１）を有し、そしてトランスジ
ェニックマウス＃２５および＃４５は、中程度の循環リンパ球増加症を有した。
β１０のみを過剰発現したがα２を発現しなかったトランスジェニックマウス＃
３１は、正常な血清Ｔ４レベルおよびリンパ球数を有した。各々のマウスについ
ての個々の血清Ｔ４値は、以下の通りであった：＃１７（５．０μｇ／ｄｌ）、
＃１８（４．８μｇ／ｄｌ）、＃１９（６．３μｇ／ｄｌ）、＃２０（４．４μ
ｇ／ｄｌ）、＃２１（４．７μｇ／ｄｌ）、＃２５（２８．５μｇ／ｄｌ）、＃
４５（２６．９μｇ／ｄｌ）、＃５３（１８．２μｇ／ｄｌ）、＃９５（１８．
７μｇ／ｄｌ）、および＃３１（３．２μｇ／ｄｌ）。
【０３６１】 ４匹のα２／β１０過剰発現マウス、５匹の非トランスジェニックコントロー
ルマウス、およびマウス＃３１（β１０のみを過剰発現したがα２を発現しなか
った）由来の肝臓、胆嚢、脾臓、肺、脳、下垂体、心臓、腎臓、副腎、胸腺、胃
、小腸、膵臓、盲腸、結腸、腸間膜リンパ節、皮膚、乳腺、気管、食道、甲状腺
、上皮小体、唾液腺、膀胱、卵巣または精巣、子宮または前立腺および精嚢、骨
ならびに骨髄のＨ＆ＥおよびＢｒｄＵ染色切片を試験した。組織学的には、４匹
全てのα２／β１０過剰発現体マウスは、多発性小胞状乳頭状腺腫を含む二側方
に増大した甲状腺を示した。４匹全てのα２／β１０過剰発現体マウスはまた、
非トランスジェニックマウスに対して、肝細胞ＢｒｄＵ標識の増大と共に、弱〜
中程度の肝細胞過形成を示した。トランスジェニックマウス＃３１は、これらの
特徴のいずれも有さなかった。
【０３６２】 まとめると、４匹のα２／β１０過剰発現体トランスジェニックマウスは、上
昇した血清Ｔ４レベルによって示されるような、多発性小胞状乳頭状腺腫を有す
る二側方の甲状腺の増大、および生じる甲状腺機能亢進症によって特徴付けられ
る表現型を示した。他の表現型の変化は、全身性の甲状腺機能亢進状態に関連す
るように思われ、これは中程度の肝腫、肝細胞過形成、および僅かに減少した血
清コレステロールレベル、二側方の腎肥大、およびリンパ球の優勢を伴う弱〜中
程度の白血球増加症た。
【０３６３】 マウスα２を過剰発現するがβ１０を発現しない上記のトランスジェニックマ
ウス（＃７、＃８、＃２６、＃２８、＃１５６および＃１８６）は、表現型を有
さず、そしてβ１０を過剰発現するがα２を発現しないトランスジェニックマウ
ス＃３１は、表現型を有さなかった。これは、４匹全てのα２／β１０過剰発現
体トランスジェニックマウス（＃２５、＃４５、＃５３および＃９５）において
見出された甲状腺機能亢進の表現型が、本発明において記載されたα２／β１０
ヘテロ二量体ホルモンに起因し得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従うヒトβ１０ポリペプチドの全長コード領域（配列番号１
）を線状アレイにて示す。推定シグナルペプチドに下線を付し、そしてその推定
シグナルペプチド切断部位を含む領域を四角で囲む。古典的ＮｘＴグリコシル化
モチーフ中に位置しそして非常にグリコシル化される可能性が高い、アスパラギ
ン（Ｎ）残基が、より大きなフォントで示される。このポリペプチドをコードす
る対応する核酸配列（配列番号２）は、この図に示される核酸配列のヌクレオチ
ド１〜３９０（両端を含む）を含む。
【図２】 図２Ａ〜２Ｄは、既知のヒト糖タンパク質ホルモンβサブユニットポリペプチ
ド（先行技術）と本発明のβ１０ポリペプチドとの関連を示す。これらの比較の
ために使用されるβ１０の成熟形態（配列番号３）は、おそらく、真正なインビ
ボ形態のβ１０ポリペプチドを示す。図２Ａ〜Ｄは、成熟形態のβ１０と、それ
ぞれ、ＴＳＨ−（甲状腺刺激ホルモン）−βサブユニット、ＦＳＨ−（卵胞刺激
ホルモン）−βサブユニット、ＬＨ−（黄体形成ホルモン）−βサブユニット、
およびＣＧ−（絨毛性性腺刺激ホルモン）−βサブユニットとの、アミノ酸相同
性を示すＧＡＰ出力を含む。
【図３】 図３は、おそらく成熟形態のβ１０（配列番号３）における５つの推定ジスル
フィド結合の可能なジスルフィド結合システイン（Ｃ）対を示す。その１０個の
システイン残基は、より大きなフォントで示され、そしてそのジスルフィド結合
は、実線として描かれる。システイン−ノットを形成する３つのジスルフィド結
合（Ｃ１２−Ｃ６０、Ｃ３６−Ｃ９１、Ｃ４０−Ｃ９３）が、アミノ酸配列の上
に描かれ、そしてその２つのさらなるジスルフィド結合（Ｃ２６−Ｃ７５、Ｃ９
６−Ｃ１０３）が、そのアミノ酸配列の下に描かれる。
【図４】 図４は、成熟形態のヒトβ１０と成熟形態のマウスβ１０との間のアミノ酸相
同性を示す、Ｂｅｓｔｆｉｔ出力である。この比較のために使用される成熟形態
のヒトβ１０（配列番号３）は、おそらく、真性なインビボ形態のヒトβ１０ポ
リペプチドを示す。この比較のために使用される成熟形態のマウスβ１０（配列
番号１３）は、おそらく、真性なインビボ形態のマウスβ１０ポリペプチドを示
す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 3/06 ４Ｃ０８６ 3/04 3/10 ４Ｈ０４５ 3/06 5/14 3/10 9/10 １０１ 5/14 9/12 9/10 １０１ 11/06 9/12 15/00 11/06 15/10 15/00 15/12 15/10 17/02 15/12 17/06 17/02 19/02 17/06 21/00 19/02 25/22 21/00 29/00 25/22 31/00 29/00 31/18 31/00 35/00 31/18 37/02 35/00 37/08 37/02 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/575 43/00 １１１ 16/26 Ｃ０７Ｋ 14/575 19/00 16/26 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／７２３，９７０ (32)優先日 平成12年11月27日(2000．11．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カオ， ジン アメリカ合衆国 カリフォルニア 91356， タルザナ， エティワンダ アベニュー 5731 ナンバー５ (72)発明者 ダニレンコ， ディミトリー マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア 91361， サウザンド オークス， ローリング オークス ドライブ 750 (72)発明者 ゴング， ジャンフア アメリカ合衆国 カリフォルニア 91362， サウザンド オークス， ガーリンガム サークル 2489 (72)発明者 ヒル， デイビッド シー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 91360， サウザンド オークス， カレ カスタ ノ 998 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA01 CA01 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 DA20 HA20 4B063 QA00 QA19 QQ02 QQ79 QQ94 QR48 QS33 QX01 4B064 AG15 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93Y AB01 AB04 AC14 BA02 BA08 CA25 CA26 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA21 BA23 CA53 DB72 NA14 ZA052 ZA072 ZA422 ZA452 ZA592 ZA662 ZA692 ZA702 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZB072 ZB112 ZB132 ZB262 ZB332 ZB352 ZC062 ZC332 ZC352 ZC542 ZC552 4C086 AA01 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA05 ZA07 ZA42 ZA45 ZA59 ZA66 ZA69 ZA70 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZB07 ZB11 ZB13 ZB26 ZB33 ZB35 ZC06 ZC33 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 BA53 CA40 DA30 DA76 EA20 FA74

Claims (99)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体に対して、中程度にストリンジェントな条
    件または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配
    列であって、ここで該コードされたポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対
    してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する
    、ヌクレオチド配列；および （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、 単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１に記載のポリペプチドに対して、少なくとも約７０、７５、
    ８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるポリペプ
    チドをコードする、ヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドは、ヒト
    α２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ
    二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプラ
    イス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされたポリ
    ペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα
    ２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２、（ａ）、または（ｂ）のヌクレオチド配列であって、該ヌ
    クレオチド配列は、少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメント
    をコードし、ここで該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二
    量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレオチ
    ド配列； （ｄ）配列番号２、または（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列であって、少な
    くとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、ヌクレオチド配列； （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体に対して、中程度にストリンジェン
    トな条件または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオ
    チド配列であって、ここで該コードされたポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチ
    ドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を
    有する、ヌクレオチド配列；ならびに （ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、 単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号１に記載のポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドは、
    ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘ
    テロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号１に記載のポリペプ
    チドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドは、ヒトα
    ２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二
    量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号１に記載のポリペプ
    チドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドは、ヒトα
    ２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二
    量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号１に記載のポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドは、ヒト
    α２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ
    二量体の活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｅ）配列番号１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であっ
    て、該ヌクレオチド配列は、以下：アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失
    、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改
    変を有し、ここで該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量
    体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、ヌクレオチド
    配列； （ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）の
    ヌクレオチド配列； （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体に対して、中程度にストリンジェン
    トな条件または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオ
    チド配列であって、ここで該コードされたポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチ
    ドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を
    有する、ヌクレオチド配列；および （ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、 単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項１、２、または３に記載の核酸分子を含む、ベクター
    。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  6. 【請求項６】 真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
  7. 【請求項７】 原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
  8. 【請求項８】 β１０ポリペプチドを生成するプロセスであって、該ポリペ
    プチドを発現するのに適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程
    、および必要に応じて該培養物から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する
    、プロセス。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載のプロセスによって生成される、ポリペプチ
    ド。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載のプロセスであって、前記核酸分子が、前
    記β１０ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブ
    なβ１０ポリペプチドのためのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを
    含む、プロセス。
  11. 【請求項１１】 請求項２に記載の単離された核酸分子であって、前記パー
    セント同一性が、以下：ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、Ｂ
    ＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍ
    ａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて
    決定される、単離された核酸分子。
  12. 【請求項１２】 化合物がβ１０ポリペプチドの活性または産生を調節する
    か否かを決定するためのプロセスであって、請求項４に記載のベクターを含む細
    胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞中のβ１０ポリペプチドの活性また
    は産生を測定する工程、を包含する、プロセス。
  13. 【請求項１３】 配列番号３のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチ
    ド。
  14. 【請求項１４】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号３に記載の成熟アミノ酸配列であって、残基１に成熟アミノ末
    端を含み、必要に応じてさらに、アミノ末端メチオニンを含む、成熟アミノ酸配
    列； （ｂ）配列番号３のオルソログのアミノ酸配列であって、該コードされたポリ
    ペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα
    ２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列； （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０、７５、８０、
    ８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列で
    あって、該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化され
    た場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列； （ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を有する、配列番号３のアミノ酸配列の
    フラグメントであって、ここで該ポリペプチドが、ヒトα２ポリペプチドに対し
    てヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、
    アミノ酸配列のフラグメント； （ｅ）配列番号３のアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの
    いずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列であって、
    該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、
    ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列、 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、 単離されたポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号３に記載のア
    ミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ
    二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸
    配列； （ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号３のアミノ酸配列で
    あって、ここで該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量体
    化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号３のアミノ酸配列で
    あって、ここで該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量体
    化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列； （ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号３のアミノ酸配列
    であって、ここで該ポリペプチドは、ヒトα２ポリペプチドに対してヘテロ二量
    体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ二量体の活性を有する、アミノ酸配列
    ；ならびに （ｅ）配列番号３のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列は、以下：アミノ
    酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる
    群より選択される少なくとも１つの改変を有し、ここで該ポリペプチドは、ヒト
    α２ポリペプチドに対してヘテロ二量体化された場合、ヒトα２／β１０ヘテロ
    二量体の活性を有する、アミノ酸配列； 、からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１、２または３に記載の核酸分子によってコードさ
    れた、単離されたポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、前
    記パーセント同一性が、以下：ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴ
    Ａ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔ
    ｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを
    用いて決定される、単離されたポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを用いて動物を
    免疫することによって生成された、抗体。
  19. 【請求項１９】 請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチドに特
    異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
  20. 【請求項２０】 モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の抗体。
  21. 【請求項２１】 配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドに結合するモノ
    クローナル抗体を生成する、ハイブリドーマ。
  22. 【請求項２２】 請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチドに特
    異的に結合する、抗β１０抗体またはそのフラグメントを用いて、β１０ポリペ
    プチドの量を検出または定量する方法。
  23. 【請求項２３】 少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する選択的
    結合因子またはそのフラグメントであって、該ポリペプチドが、以下 （ａ）配列番号３のアミノ酸配列；および （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列のフラグメント；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）の天然に存在する改変体、 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、 選択的結合因子またはそのフラグメント。
  24. 【請求項２４】 抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の
    選択的結合因子。
  25. 【請求項２５】 ヒト化抗体である、請求項２３に記載の選択的結合因子。
  26. 【請求項２６】 ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記
    載の選択的結合因子。
  27. 【請求項２７】 ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
    項２３に記載の選択的結合因子。
  28. 【請求項２８】 モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
    項２３に記載の選択的結合因子。
  29. 【請求項２９】 キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に
    記載の選択的結合因子。
  30. 【請求項３０】 ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項２
    ３に記載の選択的結合因子。
  31. 【請求項３１】 抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請
    求項２３に記載の選択的結合因子。
  32. 【請求項３２】 可変領域フラグメントである、請求項２３に記載の選択的
    結合因子。
  33. 【請求項３３】 ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、
    請求項２３に記載の可変領域フラグメント。
  34. 【請求項３４】 配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する
    特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子または
    そのフラグメント。
  35. 【請求項３５】 検出可能な標識に結合している、請求項２３に記載の選択
    的結合因子。
  36. 【請求項３６】 β１０ポリペプチドの生物学的活性を拮抗する請求項２３
    に記載の選択的結合因子。
  37. 【請求項３７】 疾患、状態、または障害を、処置、予防、または改善する
    ための方法であって、請求項２３に記載の選択的結合因子の有効量を患者に投与
    する工程を包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 甲状腺関連の疾患、状態、または障害を、処置、予防、ま
    たは改善するための方法であって、請求項２３に記載の選択的結合因子の有効量
    を患者に投与する工程を包含する、方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いて動物
    を免疫することによって生成される、選択的結合因子。
  40. 【請求項４０】 請求項１、２、または３に記載のポリペプチドに結合し得
    る選択的結合因子を生成する、ハイブリドーマ。
  41. 【請求項４１】 請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチドおよ
    び薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
  42. 【請求項４２】 請求項４１に記載の組成物であって、前記薬学的に受容可
    能な処方剤が、キャリア、アジュバント、溶解剤、安定剤、または抗酸化剤であ
    る、請求項４１に記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 前記ポリペプチドが、配列番号３に記載の成熟アミノ酸配
    列を含む、請求項４１に記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチドの誘
    導体を含む、ポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 水溶性ポリマーで共有結合的に改変されている、請求項４
    ４に記載のポリペプチド。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載のポリペプチドであって、前記水溶性ポ
    リマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、
    デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリ
    コール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレ
    ンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアル
    コールからなる群より選択される、ポリペプチド。
  47. 【請求項４７】 請求項１、２または３に記載の核酸分子、および薬学的に
    受容可能な処方剤を含む、組成物。
  48. 【請求項４８】 前記核酸分子が、ウイルスベクターに含まれる、請求項４
    ７に記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 請求項１、２、または３に記載の核酸分子を含む、ウイル
    スベクター。
  50. 【請求項５０】 異種アミノ酸配列に融合した、請求項１３、１４または１
    ５に記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
  51. 【請求項５１】 前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはその
    フラグメントである、請求項５０に記載の融合ポリペプチド。
  52. 【請求項５２】 医学的状態を処置、予防、または改善するための方法であ
    って、請求項１３、１４、もしくは１５に記載のポリペプチド、または請求項１
    、２もしくは３に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを患者に投与す
    る工程を包含する、方法。
  53. 【請求項５３】 被験体において、病的状態、または病的状態に対する感受
    性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項１３、１４、もしくは１５に記載のポリペプチド、または請求項
    １、２、もしくは３に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドの発現
    の、サンプル中における存在または量を決定する工程；および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、病的状態または病的
    状態に対する感受性を診断する、工程、 を包含する、方法。
  54. 【請求項５４】 被験体において、甲状腺に関連した病的状態または甲状腺
    に関連した病的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項１３、１４、もしくは１５に記載のポリペプチド、または請求項
    １、２、もしくは３に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドの発現
    の、サンプル中における存在または量を決定する工程；および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、甲状腺に関連した病
    的状態または甲状腺に関連した病的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  55. 【請求項５５】 デバイスであって、以下： （ａ）移植に適切な膜；および （ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞は、請求項１３、１４
    、または１５に記載のポリペプチドを分泌する、細胞、 を備え、 ここで該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に対して有害
    な物質に対して不透過性である、デバイス。
  56. 【請求項５６】 ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、
    以下： （ａ）請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチドを化合物と接触さ
    せる工程；および （ｂ）該化合物に対するポリペプチドの結合の程度を決定する工程、 を包含する、方法。
  57. 【請求項５７】 動物において、ポリペプチドのレベルを調節する方法であ
    って、請求項１、２、または３に記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含
    する、方法。
  58. 【請求項５８】 請求項１、２、または３に記載の核酸分子を含む、トラン
    スジェニック非ヒト動物。
  59. 【請求項５９】 ヒトβ１０ポリペプチドおよびヒトα２ポリペプチドのヘ
    テロ二量体。
  60. 【請求項６０】 請求項５９に記載のα２／β１０ヘテロ二量体の天然に存
    在する改変体。
  61. 【請求項６１】 ヒトβ１０ポリペプチドおよびヒトα２ポリペプチドをコ
    ードする核酸分子を含む、ベクター。
  62. 【請求項６２】 請求項６１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  63. 【請求項６３】 原核生物細胞である、請求項６２に記載の宿主細胞。
  64. 【請求項６４】 真核生物細胞である、請求項６２に記載の宿主細胞。
  65. 【請求項６５】 α２／β１０ヘテロ二量体を生成するプロセスであって、
    該α２／β１０ヘテロ二量体を発現するのに適切な条件下で、請求項６２に記載
    の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて該培養物から該α２／β１０ヘ
    テロ二量体を単離する工程、を包含する、プロセス。
  66. 【請求項６６】 請求項６５に記載のプロセスによって生成されるヘテロ二
    量体。
  67. 【請求項６７】 化合物がα２／β１０ヘテロ二量体の活性または産生を調
    節するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項６２に記載の細胞を該
    化合物に曝露する工程、および該細胞中の、α２／β１０ヘテロ二量体の活性ま
    たは産生を測定する工程、を包含する、プロセス。
  68. 【請求項６８】 ヒトα２／β１０ヘテロ二量体を用いて動物を免疫するこ
    とによって生成される、抗体。
  69. 【請求項６９】 請求項５９に記載のα２／β１０ヘテロ二量体またはその
    天然に存在する改変体に特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
  70. 【請求項７０】 モノクローナル抗体である、請求項６９に記載の抗体。
  71. 【請求項７１】 α２／β１０ヘテロ二量体に特異的である、請求項７０に
    記載のモノクローナル抗体を生成する、ハイブリドーマ。
  72. 【請求項７２】 請求項６９に記載の抗体を用いて、α２／β１０ヘテロ二
    量体の量を検出または定量する、方法。
  73. 【請求項７３】 選択的結合因子またはそのフラグメントであって、該選択
    的結合因子またはそのフラグメントは、以下： （ａ）請求項５９に記載のα２／β１０ヘテロ二量体； （ｂ）請求項５９に記載のα２／β１０ヘテロ二量体のフラグメント；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）の天然に存在する改変体、 のうち少なくとも１つに特異的に結合する、 選択的結合因子またはそのフラグメント。
  74. 【請求項７４】 抗体またはそのフラグメントである、請求項７３に記載の
    選択的結合因子。
  75. 【請求項７５】 ヒト化抗体である、請求項７３に記載の選択的結合因子。
  76. 【請求項７６】 ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項７３に記
    載の選択的結合因子。
  77. 【請求項７７】 ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
    項７３に記載の選択的結合因子。
  78. 【請求項７８】 モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
    項７３に記載の選択的結合因子。
  79. 【請求項７９】 キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項７３に
    記載の選択的結合因子。
  80. 【請求項８０】 ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項７
    ３に記載の選択的結合因子。
  81. 【請求項８１】 抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請
    求項７３に記載の選択的結合因子。
  82. 【請求項８２】 可変領域フラグメントである、請求項７３に記載の選択的
    結合因子。
  83. 【請求項８３】 ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、
    請求項８２に記載の可変領域フラグメント。
  84. 【請求項８４】 ヒトα２／β１０ヘテロ二量体に対して特異性を有する少
    なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント
    。
  85. 【請求項８５】 検出可能標識に結合している、請求項７３に記載の選択的
    結合因子。
  86. 【請求項８６】 α２／β１０ヘテロ二量体の生物学的活性を拮抗する、請
    求項７３に記載の選択的結合因子。
  87. 【請求項８７】 疾患、状態、または障害を処置、予防、または改善するた
    めの方法であって、請求項５９に記載のα２／β１０ヘテロ二量体、あるいは該
    ヘテロ二量体、またはそのフラグメントもしくは天然に存在する改変体に特異的
    に結合する選択的結合因子の有効量を患者に投与する工程、を包含する、方法。
  88. 【請求項８８】 甲状腺に関連した疾患、状態、または障害を処置、予防、
    または改善するための方法であって、請求項５９に記載のα２／β１０ヘテロ二
    量体、あるいは該ヘテロ二量体、またはそのフラグメントもしくは天然に存在す
    る改変体に特異的に結合する選択的結合因子の有効量を患者に投与する工程、を
    包含する、方法。
  89. 【請求項８９】 組成物であって、請求項５９に記載のヘテロ二量体、また
    は該ヘテロ二量体の天然に存在する改変体、または該ヘテロ二量体のフラグメン
    ト、または前述のいずれかの選択的結合因子、および薬学的に受容可能な処方剤
    を含む、組成物。
  90. 【請求項９０】 前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバン
    ト、溶解剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項８９に記載の組成物。
  91. 【請求項９１】 動物においてα２／β１０ヘテロ二量体のレベルを調節す
    る方法であって、請求項１、２、または３に記載の核酸分子を該動物に投与する
    工程を包含する、方法。
  92. 【請求項９２】 水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変されている、請
    求項５９に記載のヘテロ二量体またはその天然に存在する改変体。
  93. 【請求項９３】 請求項９２に記載のヘテロ二量体であって、前記水溶性ポ
    リマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、
    デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリ
    コール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレ
    ンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアル
    コールからなる群より選択される、ヘテロ二量体。
  94. 【請求項９４】 融合ポリペプチドであって、異種アミノ酸配列に融合され
    た、請求項５９に記載のヘテロ二量体またはその天然に存在する改変体を含む、
    融合ポリペプチド。
  95. 【請求項９５】 請求項９４に記載の融合ポリペプチドであって、前記異種
    アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、融合ポリ
    ペプチド。
  96. 【請求項９６】 被験体において病的状態、または病的状態に対する感受性
    を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項５９に記載のヘテロ二量体またはその天然に存在する改変体の発
    現の存在または量を決定する工程；および （ｂ）該ヘテロ二量体の発現の存在または量に基づいて、病的状態または病的
    状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  97. 【請求項９７】 被験体において、甲状腺に関連した病的状態または甲状腺
    に関連した病的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項５９に記載のヘテロ二量体またはその天然に存在する改変体の発
    現の存在または量を決定する工程；および （ｂ）該ヘテロ二量体の発現の存在または量に基づいて、甲状腺に関連した病
    的状態または甲状腺に関連した病的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  98. 【請求項９８】 デバイスであって、以下： （ａ）移植に適切な膜；および （ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞は、請求項５９に記載
    のα２／β１０ヘテロ二量体またはその天然に存在する改変体を分泌する、細胞
    、を備え、 該膜は、該ヘテロ二量体に対して透過性であり、そして該細胞に対して有害な物
    質に対して不透過性である、デバイス。
  99. 【請求項９９】 ヘテロ二量体に結合する化合物を同定する方法であって、
    以下： （ａ）請求項５９に記載のヘテロ二量体またはその天然に存在する改変体を化
    合物と接触させる工程；および （ｂ）該化合物に対する該ヘテロ二量体の結合の程度を決定する工程、 を包含する、方法。
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