CN101050470A - 携带c57bl/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体，选C57BL/6鼠作为研究对象，从与其同源的肝癌细胞Hepa1－6中提取总RNA，采用聚合酶链反应技术扩增C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的基因编码区序列并进行测序，测序结果与GenBank中已知的标准序列完全一致。将此序列插入穿梭质粒pAC中，与腺病毒重组质粒pJM17共同转染人胚肾293细胞，经过大量扩增，纯化，测定病毒滴度，最终在人胚肾293细胞中成功包装出具有C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶基因的重组腺病毒Ad－C57BL。

Description

携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体

技术领域

本发明涉及腺病毒载体，尤其涉及一种携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体。

背景技术

细胞获得永生化，具有了无限增殖的能力，主要依赖于细胞内端粒酶的激活。自1994年kim等创立了端粒酶活性检测的端粒重复聚合酶链反应方法及在肿瘤组织中发现端粒酶活性以来，端粒酶已成为生命科学领域里研究热点。大量研究表明，各种类型的恶性肿瘤中都有不同程度地表达端粒酶的活性。由于肿瘤诊断和治疗最理想的靶点就是找到一种肿瘤细胞所具有、在正常细胞中不存在的物质基础，而端粒酶在肿瘤细胞中的激活并维持细胞的无限增殖能力，是恶性肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一，具备了作为肿瘤诊断和治疗物质基础的条件，因此，端粒酶已成为肿瘤研究的新热点，有望为肿瘤的诊断和治疗提供一种全新的途径。目前国内外提出的以端粒酶为靶点的肿瘤治疗策略，主要是以抑制端粒酶活性的方法为主。近来，国外提出更优越的新策略，即以肿瘤组织端粒酶激活为目标，以端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)启动子调控其它抗肿瘤基因，从而达到靶向肿瘤细胞并破坏肿瘤细胞的目的。

以端粒酶为基础的肿瘤免疫治疗与其他治疗方法相比有以下优势：第一，不需要为每一位患者确定具有其自身HLA类型的来源于肿瘤抗原的免疫原性抗原决定簇；第二，在所有肿瘤的治疗方案中，没有一项是可以针对所有肿瘤的，以端粒酶为靶点的治疗可以靶向90％以上的各种肿瘤，是目前最为广谱的肿瘤基因治疗方案。因此，以端粒酶为基础的肿瘤免疫治疗在肿瘤新发/复发的治疗上将有广泛的应用价值。

为研究端粒酶逆转录酶的生物学性能和其在肿瘤基因治疗中的作用，我们选用C57BL/6鼠为研究对象，C57BL/6鼠在生命科学领域是常用的试验动物，广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等。同时利用腺病毒载体感染效率高、宿主范围广及安全性较好等特点，构建表达C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体，为端粒酶逆转录酶基因的研究提供有效的生物表达体系。

本文所涉及的C57BL/6鼠，肝癌细胞Hepa1-6，穿梭质粒pAC，腺病毒重组质粒pJM17，人胚肾293细胞以及其它载体，试剂均为公开的商品化产品，在国内外均可购买到，在下文不作特殊说明。

发明内容

针对现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶重组腺病毒载体，克服目前抗肿瘤免疫研究转染效率低，抗肿瘤谱窄缺点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：应用逆转录聚合酶链反应对C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶基因编码区cDNA成功地进行了克隆和序列测定，获得了其编码区序列，在明确端粒酶逆转录酶基因表达与肿瘤发病密切相关的基础上，将C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶克隆到复制缺陷型腺病毒中。

具体来讲：从与其同源的肝癌细胞Hepa1-6中提取总RNA，采用聚合酶链反应技术扩增C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体，将此表达载体与腺病毒重组质粒共同转染人胚肾人胚肾293细胞，经同源重组产生重组腺病毒载体Ad-C57BL，纯化后的重组腺病毒载体Ad-C57BL在人胚肾293细胞大量扩增，纯化，测定病毒滴度。聚合酶链反应及酶切证实：C57BL/6鼠的端粒酶逆转录酶基因编码区正确克隆到穿梭质粒中，成功重组到腺病毒载体基因组，并在人胚肾293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒Ad-C57BL。成功构建了C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶基因重组腺病毒载体，为研究其用于肿瘤的基因治疗奠定基础。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

图1是pAC(+)载体图谱；

图2是pJM17质粒Hind III酶图谱；

图3是pAC(+)mTERT载体产生过程图；

图4是Adv-C57BL产生过程图；

图5是C57BL/6鼠肝癌细胞总RNA的提取结果图；

图6和图7是C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶cDNA的RT-PCR扩增图；

图8和图9是PCRI和PCRII的双酶切鉴定图；

图10和图11是重组质粒plA、plB的酶切鉴定图；

图12是pAC/mTERT载体EcoR I和Hind III双酶切鉴定图；

图13是C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶cDNA序列的部分测序结果图；

图14是pAC-mTERT载体EcoR I和Hind III双酶切鉴定图；

图15是重组病毒PCR鉴定图；

图16是重组病毒的Hind III酶切鉴定图。

具体实施方式

一、首先对腺病毒系统的有关原理和概念作出说明。

请参阅图1，穿梭质粒pAC：

是一个腺病毒相关质粒载体，其中含有人5型腺病毒(Ad5)基因组的部分序列，即0-1.3个图距单位(碱基数为：1-453)和9.3-17.0个图距单位(碱基数为：3334-6103)，这部分序列为以后通过同源重组得到重组腺病毒表达系统提供了同源重组序列。另外，在这两部分腺病毒序列之间还插入有真核细胞表达调控序列：CMV启动子和SV40多聚腺苷酸化信号(SV40 polyA)，以及可供插入外源基因的多克隆位点区。

请参阅图2，腺病毒基因组质粒pJM17：

主要用于与E1区插入了外源基因的其他腺病毒相关质粒载体同源重组，从而得到含有该外源基因但缺失E1区的重组腺病毒表达系统。pJM17含有Ad5全部基因，并且在3.7mu处插入了部分来自质粒pBR322的片段，导致pJM17的大小超过腺病毒基因组的包装容量(39Kb)，因此单独的pJM17无感染活性，只有与含有腺病毒基因组左端序列的其他腺病毒相关质粒载体(如前述的质粒pAC)共同转染，发生重组后才能产生有感染活性的缺失了E1区的重组腺病毒。

二、下面说明携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶重组腺病毒载体的构建以及实验结果。

1、C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶重组腺病毒载体的构建过程：

1.1细胞培养和细胞总RNA的提取

将C57BL/6鼠肝癌细胞株Hepal-6置于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基培养，取对数生长期的细胞，用Trizol试剂从小鼠肝癌细胞中提取总RNA。取1×10⁷肝癌细胞，在1mlTrizol试剂中匀浆1min，室温放置5min，加入0.2ml氯仿，室温放置2min，10000×g 4℃离心15min，于上层水相中加入0.5ml异丙醇，室温放置10min，10000×g 4℃离心10min，用75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500×g 4℃离心5min，干燥后用50μl无RNase的水溶解。

1.2引物设计

根据GenBank中已报道的C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶cDNA的基因序列设计合成下列引物：

F1：5′-CCG GAA TTC ATG ACC CGC GCT CCT CGT TGC CCC GC-3′  (35 bases)

R1：5′-ACG CGT CGA TTT AGT CCA AAA TGG TCT GAA AGT C-3′   (34 bases)

F2：5′-CAT TCC TAC TCA GCA ACC TCC AGC CTA AC-3′          (29 bases)

R2：5′-ACG CAG CAC AAA GGC CCG CCA GGT CCT G-3′           (28 bases)

F3：5′-TGG CGG GCC TTT GTG CTG CGT GTG CGT G-3′           (28 bases)

R3：5′-AGG TTG CTG AGT AGG AAT GAG GGG TTT AG-3′          (29 bases)

P1：5′-TTA TCT TCT GGT GCC CCC-3′                 (18 bases)

P2：5′-TGG GGA AAT ACG GCA AGC-3′                 (18 bases)

P3：5′-AGG TGC AGC GGG ATG GGT-3′                 (18 bases)

扩增片段大小为3369bp。

1.3RT-PCR扩增C57BL/6鼠TERT cDNA

用BamH I将全长基因分为两段，分别用EcoR I/BamH I和BamH I/Sal I酶切后克隆至pUC19载体中，挑到含有正确基因的质粒后，再进行全长基因的克隆。以C57BL/6鼠肝癌组织总RNA为模板，以Random 9mers为反转录引物，使用TaKaRaRNA LA PCRTM Kit(AMV)Ver.1.1反转录合成cDNA。20μl RT-PCR反应体系为：25mmol MgCl₂ 4μl，总RNA 1μg，10倍AMV缓冲液2μl，各10mmol/L dNTP混合液2μl，40U/μl RNase抑制剂0.5μl，5U/μl AMV Reverse TranscriptaseXL 1μl，Random 9mers 1μl，DEPC H2O 8.5μl；RT-PCR反应条件为：30℃10min，42℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。再以合成的cDNA为模板，采用合成的特异性F1/R1、F2/R2引物，PCR扩增目的基因，所得的PCR产物命名为PCRI、PCRII，将纯化后的PCRI用EcoR I/BamH I进行酶切，PCRII用BamH I/Sal I进行酶切；分别获得1.6kb和1.8kb的DNA片段。PCR反应体系为：cDNA 2μl，10倍ExTaq Buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP混合液4μl，20pmol/μl上游引物1μl，20pmol/μl下游引物1μl，5U/μl Ex Taq0.5μl，dH2O 36.5μl；PCR反应条件为94℃变性1min后，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min条件下进行35个循环，最后在72℃保温2min。将PCR产物5μl在含溴化乙锭的1.0％琼脂糖凝胶电泳，用ImageMa ster 9.VDS电泳成像装置观察结果并拍照。

1.4目的基因克隆至测序载体

PCR产物回收后，将1.6kbDNA和1.8kbDNA片段分别与pUC19载体进行16℃连接，热转化至JM109感受态菌中，挑选阳性克隆测序，得到序列完全正确的两个质粒plA(插入基因为全长基因从EcoR I到BamH I位点，长为1.6kb)，plB(插入基因为全长基因从BamH I到Sal I位点，长为1.8kb)。将质粒plA和plB分别用EcoR I/BamH I和BamH I进行酶切，切胶回收上述酶切产物中长度约为1.6Kb和4.5kb的DNA片段，分别命名为Insert DNA和Vector DNA。使用TaKaRa DNALigation Kit中的Solution I，将Insert DNA与Vector DNA进行16℃连接后，获得重组阳性克隆pUC19-C57BL，热转化至JM109感受态菌中，涂布平板，37℃过夜培养菌体。

1.5酶切鉴定和DNA序列测定

取重组阳性克隆pUC19-C57BL，提取质粒DNA，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段的大小。挑选酶切鉴定正确的重组菌，以重组质粒DNA为测序模板，由TaKaRa公司测序。并用Sequence3.0分析软件对测序结果与GenBank中的数据进行分析。

1.6目的片断C57BL插入pAC载体

(1)过量EcoR I和Hind III双酶切5ug pAC载体，用琼脂糖凝胶电泳检查酶切效果，完全酶切后按碱性磷酸酶CIAP使用说明对载体进行去磷酸化

(2)用过量EcoR I和Hind III双酶切5ug pUC19-C57BL载体，0.7％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收小量试剂盒回收C57BL片断

(3)将去磷酸化的pAC载体(0.03pmol)和C57BL片断(0.3pmol)用DNALigation Kit Ver.2试剂盒连接过夜。

(4)将连接物转化感受态DH5α，涂布含Amp的SOB平板，挑取转化菌落，扩增，提取DNA，Hind III酶切，0.7％琼脂糖凝胶电泳，比较转化子的DNA大小，选出大小在12kb的转化子进一步鉴定

(5)将大小在12kb的转化子进行EcoR I和Hind III双酶切，应产生两个大小为8.8kb和3.4kb的片断，该转化子即为pAC/C57BL载体，作酶切及测序鉴定正确后命名为pAC-C57BL。

1.7pAC-C57BL和pJM17质粒的扩增和提取

(1)转化：将质粒DNA转化感受态DH5α，冰上30分钟，42℃90秒，培养1小时，涂布于含Amp的SOB平板，37℃培养16-24小时。

(2)扩增：从转化平板上挑取单菌落，接种5毫升含Amp的LB试管，37℃，220rpm振荡培养6-8小时，按1∶100的比例接种50毫升含Amp的LB培养液，37℃，220rpm振荡培养12-16小时。

(3)DNA提取：参见E.Z.N.APlasmid Midiprep Kit试剂盒的使用说明。采用此试剂盒可获得50-100μg DNA，其纯度能满足转染动物细胞的要求。

1.8pAC-C57BL和pJM17共转染293细胞

用磷酸钙介导法共转染后每3～5天换液1次，每次留原培养液的1/3～1/4。10-14天，将出现明显病变的细胞孔转入6孔板扩大培养，取其培养上清进行鉴定。从转染第11天开始，陆续出现发生细胞病变的孔，挑取6个孔进行鉴定试验。

试剂：

pAC DNA：5μg

pJM17 DNA：5μg

2.5M CaCl₂溶液：27.7g无水CaCl₂，溶于100毫升水中，除菌

2 x HBS：280mM NaCl，50mM HEPES，1.5mM Na₂HPO₄，pH7.05

步骤：

(1)转染前一天接种人胚肾293细胞7.5×10⁵到60毫米的培养皿中。

(2)将5μg pAC/mTERT和pJM17 DNA悬于纯水中，使其终体积为250ul

(3)加入250μl 2.5M的CaCl₂溶液。用枪头上下混合两次。另取一支加入250μl2.5M CaCl₂+250μl水作为对照组。

(4)将以上混合物滴加入500μl 2×HBS缓冲液中。

(5)室温放置20分钟，取出细胞培养皿，将磷酸钙-DNA沉淀物逐滴铺在细胞上

(6)将培养皿放入培养箱培养过夜

(7)第二天，移去含有磷酸钙-DNA沉淀物的培养液，用PBS洗细胞两次。

(8)用新细胞将转染细胞作一倍稀释后，接种96孔板，37℃，5％CO₂培养

(9)10-14天，将出现明显病变的细胞孔转入6孔板扩大培养，取其培养上清进行鉴定。从转染第11天开始，陆续出现发生细胞病变的孔，挑取6个孔进行鉴定试验。

1.9重组腺病毒的鉴定

将上述重组腺病毒液2ml感染80％融合的人胚肾293细胞，待单层细胞大部分变圆但尚未脱落时收集细胞，反复冻融3次，取少许提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定，并以一个目的基因不同的重组病毒为阳性对照，采用纯水作为阴性对照。C57BL正、反义引物序列分别为：5’-ATTACCGAAGAAATGGCCGC-3’和5’-CCCATTTAACACGCCATGCA-3’。50μL反应体系中含有正、反义引物各1μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，25mmol/L 3μL，Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃变性4min，94℃30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，经鉴定正确的重组腺病毒命名为Ad-C57BL。

1.10重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定

将鉴定正确的病毒液感染60％～80％融合的293细胞，5～7d后收集细胞，反复冻融3次，收集上清反复扩增至需要病毒量，用氯化铯密度梯度超速离心法纯化，用TICD50法测定病毒滴度。以同样方法包装对照病毒Ad-LacZ。

(1)细胞传代

细胞汇合度达到80％，吸去原培养液，用PBS洗一次，加入0.25％胰蛋白酶0.5ml/瓶，消化至细胞开始从瓶壁脱落，加入细胞生长用培养液中止消化，以1∶3的比例平均分瓶，每瓶加10ml生长用培养液，5％CO₂，37℃培养。

(2)病毒扩增

细胞汇合度达到90-100％时感染病毒。首先用无血清培养液稀释毒种，将培养瓶中原培养液弃去，加入病毒液1ml/瓶，然后每瓶加入9ml病毒感染用培养液，37℃，5％CO₂培养。同时，用不加病毒，只加培养液的细胞设置空白对照2瓶，共感染细胞40瓶

(3)病毒收获：

待细胞出现完全CPE后，收获细胞。将细胞和培养液混合物1000rpm，5分钟离心，收集细胞沉淀，以0.5ml/瓶细胞的比例悬浮分装于15ml离心管中，共3支。

(4)细胞破碎

取细胞管用超声波仪(100W)破碎1分钟。细胞破碎后立即用冷冻高速离心机离心去除细胞碎片，10000g，15分钟，得到裂解上清20ml。

(5)两步CsCl超速离心

溶液配制：

100mMTris-Cl(pH8.0)贮液：称取Tris(Gibco，cat#15504-012)6.059克，溶于450ml纯水中，用HCl调节pH8.0，定容到500ml。

10mMTris-Cl溶液：量取100mMTris-Cl(pH8.0)贮液300毫升，加入2700毫升纯水中，并用HCl调节pH值为8.0

1.20g/ml氯化铯溶液：称取氯化铯(Gibco，cat#15507-023)27.33克，用90毫升10mMTris-Cl溶液(pH8.O)溶解，定容至100毫升

1.45g/ml氯化铯溶液：称取氯化铯60.9克，用90毫升10mMTris-Cl溶液(pH8.0)溶解，定容至100毫升

透析液：量取10mMTris-Cl溶液2300毫升，1.0165克MgCl₂、100克蔗糖溶解。用HCl调节pH8.0，定容到2500ml。

两步CsCl超速离心：

第一次超速离心：依次在超离心管中加入密度为1.20g/ml氯化铯溶液和1.45g/ml的氯化铯溶液，将裂解上清液置于氯化铯之上，三者的体积比为1∶1∶1，用L8-M型超离心机，SW41转子，26000rpm，2小时离心，取界面处病毒带。

第二次超速离心：用透析液1∶1稀释第一次离心样品，作为第二次离心样品液。按前述方法装入样品和CsCl溶液，26000rpm，13小时离心，取界面处条带，共4ml。

(6)透析

第二次离心样品以2ml/支分装透析管，加100ml透析液4℃透析，每隔2小时换一次液，共换液3次。透析结束后，收集各透析管中病毒。

(7)病毒滴度测定

将达到汇合度80％的人胚肾293细胞从方瓶中吹下，制成细胞悬液并计数，将其稀释为2.5×10⁵/ml，接种96孔板，100μl/孔(即2.5×10⁴/孔)。之后将培养板放入37℃，5％CO₂孵箱中培养至少2小时。用完全培养基将病毒原液预稀释10倍，再进行倍比系列稀释。2小时后，将96孔板取出。吸去培养上清，接种病毒稀释液，100μl/孔，每稀释度两个复孔。设96孔板中两孔作为阴性对照加入100μl培养基。用封口膜封板，放于37℃，5％CO₂孵箱继续培养。逐日观察，48h观察结果。

(8)纯度测定

试剂：

50mmol/L Tris(pH7.5)

25％甘油

1mol/L NaCl

0.5mol/L NaOH

仪器：

Waters 600E HPLC

Resource Q阴离子交换层析柱(1ml)

步骤：

使用200μl定量环上样，从50mmol/L Tris(pH7.5)到50mmol/L Tris，1mol/L NaCl(pH7.5)洗脱梯度30分钟，流速1ml/min，使用260nm和280nm两个紫外波长进行检测。

纯度的计算公式：

总峰面积＝腺病毒峰面积+(杂质峰面积-基线杂质峰面积)

结果：95.23％

二、实验结果

2.1总RNA的定性定量分析

请参阅图5，提取总RNA后，用紫外分光光度仪检测显示RNA A260/A280为2.0，浓度为320μg/ml。1％琼脂糖凝胶电泳可见总RNA为明显的18S和28S条带，说明总RNA完整。

2.2 PCR产物的克隆及酶切鉴定

2.2.1请参阅图6和图7，以F1/R1、F2/R2为引物，PCR扩增目的基因，所得的PCR产物为PCRI、PCRII，取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如下：

Lane M1：DNA marker DL2000；

Lane 1：RT-PCRI product 1.6kb；

Lane 2：RT-PCRII product 1.8kb。

2.2.2请参阅图8和图9，将纯化后的PCR I用EcoR I/BamH I进行酶切，PCR II用BamH I/Sal I进行酶切，分别获得1.6kb和1.8kb的DNA片段，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，两DNA片段之和与目的基因大小一致，结果如下：

Lane M：DNA marker DL2000；

Lane 1：RT-PCRI product digested by EcoR I/BamH I product 1.6kb；

Lane 2：RT-PCRII product digested by BamH I/Sal I product 1.8kb。

2.2.3请参阅图10和图11，将质粒plA和plB分别用EcoR I/BamH I和BamH I进行酶切，获得长度约为1.6Kb和4.5kb的DNA片段，酶切结果如下：

Lane 1：Recombinant plA digested by EcoR I/BamH I；

Lane 2.Recombinant plB digested by BamH I；

Lane M1：λ-Hind III DNA Marker；

Lane M2：DNA marker DL2000。

2.2.4请参阅图12，将大小在12kb的C57BL/6鼠TERT真核表达载体pAC(+)/C57BL进行EcoR I和Hind III双酶切，产生两个大小为8.8kb和3.3kb的片断，与相应的目的片段及载体片段大小一致，证明PCR扩增产物已经插入克隆载体中。酶切结果如下：

LaneM：λ-EcoT14 DNA Marker；

Lanel：Recombinant pAC/C57BL digested by EcoR I/Hind III。

2.3阳性重组质粒的提取及质粒测序

请参阅图13，将初筛的4个阳性重组菌通过摇菌、质粒提取并纯化，进行DNA测序，将测序结果与GenBank的标准序列完全一致。

2.4pAC-C57BL的构建及酶切鉴定

请参阅图14，将从pUC19-C57BL质粒扩增酶切回收的C57BL基因片段与酶切后的pAC载体连接，将大小在12kb的产物进行EcoR I和Hind III双酶切及特异引物的PCR鉴定，产生两个大小为8.8kb和3.3kb的片断，说明pAC-C57BL构建成功，C57BL插入正确。

Lane M：λ-EcoT14 DNA marker；Lane 1：Recombinant pAC-C57BL digested byEcoR I/Hind III

2.5重组病毒Ad-C57BL的PCR鉴定

请参阅图15，选取6个重组病毒，采用特异性引物进行PCR鉴定，在选出的6个重组病毒中有5个含有目的基因的扩增产物。

Lane 1：λ-Hind IIIDNA marker；Lane 2，3，4，5，6，7：recombinant adenovirusvector 1，2，3，4，5，6；Lane  8：negative control；Lane 9：positive control

2.6重组病毒Ad-C57BL的Hind III酶切鉴定

请参阅图16，将重组腺病毒用Hind III酶切，结果与预计酶切图谱相同。

Lane 1：λ-EcoT14 DNA marker；Lane 2：Ad-C57BL digested by Hind III；Lane3：λ-Hind III DNA marker

2.7病毒滴度的测定

Ad-C57BL小量扩增后测定病毒滴度为8×10⁹pfu/mL，按需要扩增一定量后，进行超离心纯化浓缩，病毒滴度达到1.5×10¹⁰pfu/mL。

综上，腺病毒是目前用于基因转移最广泛的载体之一，与其他病毒载体不同，腺病毒载体的诸多优点决定了腺病毒载体在基因治疗领域中具有广阔的应用前景：宿主细胞范围广泛，不依赖于宿主细胞增殖而表达外源基因，既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；容易制备高滴度病毒粒子，可达10¹¹pfu/mL；而且在受染细胞内不发生整合，因此没有致癌和致突变的危险，并可插入大片段的外源基因。本研究成功构建了C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶基因重组腺病毒载体，并在人胚肾293细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-C57BL，为进一步研究端粒酶逆转录酶的生物学性能和激发特异性抗肿瘤免疫的肿瘤生物治疗奠定了基础。

Claims (1)

1、一种携带C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶的重组腺病毒载体，其特征在于：选用C57BL/6鼠为研究对象，从与其同源的肝癌细胞Hepa1-6中提取总RNA，采用聚合酶链反应技术将C57BL/6鼠端粒酶逆转录酶基因编码区cDNA成功地进行了克隆和序列测定，获得的编码区序列与GenBank中已知的标准序列完全一致，将此序列插入穿梭质粒pAC中，与腺病毒重组质粒pJM17共同转染人胚肾293细胞，经同源重组在人胚肾293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒Ad-C57BL。

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