CN1388829A - 含有携带剪接受体的基因工程细胞非编码序列的高效逆转录病毒载体 - Google Patents

含有携带剪接受体的基因工程细胞非编码序列的高效逆转录病毒载体 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于基因治疗的安全高效的来源于MLV(鼠白血病病毒)的逆转录病毒载体,它无病毒编码序列,但含有携带剪接受体的基因工程EF 1α非编码序列。

Description

含有携带剪接受体的基因工程细胞非编码序列的 高效逆转录病毒载体
发明领域
本发明涉及一种用于基因治疗的高效安全的逆转录病毒载体，它来源于鼠白血病病毒(MLV)，含有一个突变的异源剪接受体并且无MLV编码序列。
发明背景
来源于鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体已经应用于50％以上被批准的临床基因治疗试验中(Wiley-The Journal of Gene Medicine Website；http：//www.wiley.co.uk/genetherapy)。然而，妨碍这些载体更广泛应用的一个主要限制因素是基因表达水平没有高到足以表现明显的治疗效果。本发明人以前曾构建了不含病毒编码序列但携带一个来自细胞或其它病毒基因的异源剪接受体序列的逆转录病毒载体(KR专利申请公开号(Laid-OpenPublication No.)2000-6334)。这些载体之一含有一个来自人EF1α基因的剪接受体。该载体的基因表达水平明显高于缺乏该剪接受体序列的对照载体。然而该载体存在的一个问题是病毒滴度随着使用的包装株系而改变。例如，当使用基于NIH3T3的PG13株系时，病毒滴度降低约10倍。在来源于HI1080细胞的FLYA13中，病毒滴度降低3倍。RNA分析结果表明，低病毒滴度是由于含有包装信号序列的基因组尺寸转录物的高效剪接。
本发明涉及对这种逆转录病毒的进一步改进，即在剪接受体的周围的区域中导入突变。导入这些突变使逆转录病毒载体产生接近于对照水平的病毒滴度，而同时仍产生很高水平的基因表达。因此，该载体应当比在逆转录病毒基因治疗中应用的其它载体要有效的多。
发明概述
本发明的目的在于提供一种安全和高效的逆转录病毒载体，其避免了RCR产生的风险，而仍然能够有效地表达可用于基因治疗的外源基因。
按照本发明的这一方面，来源于鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体包括：
1)一种插入多克隆位点上游的、作为来源于外源基因的非编码序列的延伸因子EF1α的非编码序列的区域，和
2)一种导入EF1α非编码序列中的剪接受体的下游的突变。
附图简述
从下面结合附图的本发明的说明中，本发明的上述，和其它目的和特征将变得更加清楚；这些附图分别是：
图1：载体MT1，2，3，4和5的序列，分别具有一种导入非编码序列中的突变，该非编码序列含有一个插入载体pMIN-EI中的人EF1α基因的内含子和外显子2的区域，
图2：制备MT1的方法；
图3：制备MT2的方法；
图4：制备MT3的方法；
图5：制备野生型MT4的方法；
图6：制备MT5的方法；
图7：制备含荧光素酶(Luc)基因的载体的方法；
图8：IRES基因克隆的方法；
图9：制备具有作为可筛选的标记的MDR基因的MTM载体的方法；
图10：制备载体MTM4和MTM5的方法，它们各自具有一个MDR基因作为可筛选的标记；和一个修饰的EF1α非编码序列。
发明详述
本发明提供一种基于MLV(鼠白血病病毒)的逆转录病毒载体，其没有任何病毒编码序列，但的确包括一部分插入到多克隆位点的上游的延伸因子EF1α的非编码序列，以便提供一个剪接受体，以及一种导入EF1α的非编码序列中的剪接受体下游的突变。
在本发明中，“非编码序列”指含有一种可以被转录但不能被翻译的内含子和外显子区域的基因组区域。
特别地说，在本发明的逆转录病毒载体中的EF1α的非编码序列来源于人细胞。它含有一部分内含子和外显子2序列，优选地，刚好在外显子2的翻译起始密码子的前面的序列，更具体地说，是SEQ ID NO.1的核苷酸序列，其对应人EF1α基因的3’末端到刚好在外显子2的翻译起始密码子前面的部分(如果EF1α基因的转录起始密码子的位点定为+1，那么它对应于+773到+1006的序列)。
本发明的逆转录病毒载体还具有一个导入来源于外源基因的非编码序列中的突变，以便在基因表达、剪接、和翻译效率之间达到最优化的平衡。
突变发生在剪接受体下游是理想的，具体地说刚好在剪接受体之后是理想的。已经确定了剪接受体周围的序列，尤其是接近剪接受体的外显子区域的序列在剪接中发挥重要作用。例如，一种优选的突变是用CC(胞嘧啶-胞嘧啶)碱基对取代SEQ ID NO.1序列中的第205位和第206位(分别对应于+977和+978)的GT(鸟嘌呤-胸腺嘧啶)碱基对。
本发明的逆转录病毒载体还可以进一步地在多克隆位点的下游包括一种异源启动子或IRES(内部核糖体进入位点，internal ribosomal entrysite)，目的在于表达两个或更多外源基因。
而且，本发明的逆转录病毒载体的基于MLV的5’LTR中的U3，或其部分，可以用异源启动子取代，优选地用HCMV IE(人巨细胞病毒立即早期(immediately-early))启动子。
本发明的逆转录病毒载体可以进一步含有一个可筛选的标记基因，例如NEO(新霉素抗性)基因，和MDR(多药抗性，multidrug resistance)基因。人MDR基因用作可筛选的标记的有利之处在于它容易地制备一种生产细胞系，并防止有害副作用，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。
“野生型”或“野生型载体”用作对照，以便与本发明的具有突变的逆转录病毒载体作比较。该野生型载体由多克隆位点上游的EF1α非编码序列的未修饰的部分组成，其目的在于通过提供剪接能力增加基因表达水平。在本发明中用作对照的是野生型MT4，其具有图1显示的下列序列。
本发明提供的逆转录病毒载体的理想实施例包含：
1)来源于起始的MLV载体的核苷酸序列，其对应于5’LTR，最小包装序列，该最小包装序列包括在起始的gag基因的上游的剪接受体，一种多嘌呤示踪(track)，和一种3’LTR；
2)多克隆位点；
3)EF1α的核苷酸序列的区域，该区域是从内含子3’末端开始到刚好在外显子2的翻译起始密码子之前，被插入到最小包装序列和多克隆位点之间；和
4)仅当需要第二基因表达时，则在多克隆位点下游的一种SV40最小启动子或一种个内部核糖体进入位点(IRES)。
更优选的是，本发明提供了一种包含以下元件的逆转录病毒载体MT5：
1)来源于起始的MLV载体的核苷酸序列，它是5’LTR，最小包装序列，该最小包装序列含有在起始的gag基因的上游的剪接供体，多嘌呤示踪，和3’LTR；
2)一种多克隆位点；
3)一部分的EF1α的核苷酸序列，它从内含子的3’末端开始到刚好在外显子2的翻译起始密码子之前，被插入到最小包装序列和多克隆位点之间；
4)在多克隆位点下游的一种内部核糖体进入位点(IRES)；和
5)在剪接受体下游，在+977～+978位点上有取代GT碱基对的GC碱基对。
下面将详细描述本发明。
1.无病毒编码序列但含有人EF1α的非编码序列的基于MLV的逆转录病毒载体MIN-EI的构建
在韩国专利申请公开号No.2000-6334中详细描述了制备无其MLV-编码gag，env和pol基因序列的基于MLV的逆转录病毒载体MIN，和在载体MIN的多克隆位点上游含有人EF1α的非编码序列的MIN-EI的方法。
载体MIN和MIN-EI的结构特征如下：
载体MIN含有1)刚好就在gag编码区域之前的非编码序列，它含有5’LTR和MLV基因组的剪接受体；2)一种多克隆位点；3)IRES-neo盒；和4)依次的3’非翻译区，多嘌呤示踪和3’LTR。
载体MIN-EI具有SEQ ID NO.1的序列，它对应于刚好就在翻译起始密码子之前的EF1α的内含子和外显子2的序列，它被插入到载体MIN的多克隆位点的上游。
2.具有EF1α的非编码序列的逆转录病毒载体在各种包装细胞中的效率
为了产生最优化的逆转录病毒载体，在目标细胞中有效表达治疗基因需要转录和剪接效率之间的精确的平衡。逆转录病毒载体MIN-EI的基因表达水平在如Phoenix，293T，FlyA13，和PG13的包装细胞系中比载体MIN(KR专利申请公开号2000-6334)的表达水平高3～5倍。然而，载体MIN-EI在FlyA13或PG13细胞系中表现降低的病毒滴度，可能是由于FlyA13或PG13细胞系的高效剪接和一般地低的转录活性。因此，需要研制一种同时具有高水平的基因表达和改进的病毒滴度的逆转录病毒载体。
3.含有修饰的EF1α基因的非编码序列的逆转录病毒载体的构建
为了满足上述需要，通过在MIN-EI的EF1α基因的内含子和剪接受体周围导入突变，来构建修饰的逆转录病毒载体。
本发明构建的5个突变载体如下：
1)MT1，其中在剪接受体上没有导入突变，并且对应于EF1α的外显子2的区域被删除；
2)MT2，其中在剪接受体的下游导入一种突变，并且对应于EF1α的外显子2的区域被删除；
3)MT3，其中在剪接受体的上游导入一种突变，并且对应EF1α的外显子2的区域被去除；
4)MT4是在剪接受体上没有突变的野生型；和
5)MT5，其中在剪接受体的下游导入一种突变。
当应用荧光素酶基因作为报告基因时，修饰的载体MT1，2，和3较之于野生型MT4表现出降低的病毒滴度，但载体MT5比野生型MT4给出的病毒滴度高2～3倍。载体MT5的剪接效率相对较低，是野生型MT4的剪接效率的大约70～80％，然而，由于提高的病毒滴度，使表达的基因总量增加。这种总转导效率的增强还在携带人白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)基因而非荧光素酶基因作为报告基因的载体MT5中观察到。
因此，鉴定载体MT5是一种新的，安全的载体，它能够提供高水平的基因表达以及高病毒滴度。已命名用载体MT5转化的大肠杆菌菌株JM109为MT5(JM)，并且于2000年7月28日保藏于韩国微生物保藏中心(the Korean Culture Center of Microorganisms)(KCCM)(保藏号：KCCM-10205)。
4.含修饰的EF1α非编码序列和MDR可筛选的标记基因的载体MTM5的构建
携带人MDR基因作为可筛选的标记基因的载体也已经被构建出来，并且被命名为MTM5，由于它们增强的病毒滴度而使它们表现卓越的转导效率。
本发明在下面实施例中详细描述。显然，下列实施例的目的在于进一步举例说明本发明而不是限制本发明的范围。
实施例 实施例1：载体MIN-EI在各种包装细胞系中的效率
为了研究含EF1α基因的内含子和非编码序列的载体MIN-EI在各种包装细胞系中的效率，应用常用的包装细胞系例如Phoenix(ATCCSD3443，MD，USA)，FlyA13(Cosset等，J.Virol.69：7430-7436，1995)，和PG13(ATCC CRL10686，MD，USA)细胞系考察基因表达水平和病毒滴度。
MIN-CAT和MFG-CAT(Byun等，Gene Ther.3：780-788，1996)用作对照。将含有CAT(氯霉素酰基转移酶)基因的质粒pCRII-CAT(KR专利申请号1998-24478)的BamHI片段分别插入载体MIN-EI和MIN的BamHI位点，构建MIN-EI-CAT和MIN-CAT。将pCRII-CAT的NcoI-BamHI片段插入载体MFG的NcoI-BamHI位点构建载体MFG-CAT(Byun等，Gene Ther.3：780-788，1996)。
分别用载体MIN-EI-CAT，MIN-CAT或MFG-CAT转染Phoenix和FlyA13细胞，培养48小时，用从细胞提取的蛋白质测定基因表达水平。通过0.45μm滤纸过滤细胞培养上清液制备无细胞病毒。用无细胞病毒上清液转导2组NIH3T3细胞后，温育48小时，一组NIH3T3细胞用于测定CAT活性。另一组NIH3T3细胞通过记数G418抗性菌落的数目用于测定病毒滴度和转导效率(参见表1和表2)。
对于PG13细胞，产生生产者株系以获得病毒。因为用瞬时转染法不可能在PG13细胞中得到高病毒滴度。也就是说，用通过使用Phoenix细胞得到的约0.1m.o.i的无细胞病毒感染PG13细胞，用G418处理2周后，筛选G418抗性细胞系。用无细胞病毒上清液转导2组HT1080细胞。将它们温育48小时，然后分别进行CAT分析和病毒滴度测定(参见表3)。
按照下述程序测定CAT活性：收获转导的细胞，用1ml PBS(磷酸盐-缓冲的盐水)清洗一次，然后重悬浮于0.25M Tris缓冲液(pH7.5)中。对细胞进行3次冷冻(在干冰中)-解冻(37℃水浴)循环，使细胞裂解。60℃加热7分钟，使脱乙酰酶灭活，将得到的细胞提取物在12,000rpm离心旋转10分钟，收集上清液。用Bradford’s法定量测定蛋白质浓度。将固定量的蛋白质与1μl 14C-氯霉素(60mCi/mmol，0.1mCi/ml)、2μl乙酰辅酶A(40mM)、和适量0.25M Tris缓冲液(pH7.5)混合，在37℃温育。反应后，用乙酸乙酯提取氯霉素，减压浓缩。残存物重悬浮于15μl乙酸乙酯，点样到薄层色谱(TLC)板，用溶剂(95％氯仿，5％甲醇)展开。干燥TLC板，然后曝光到X-射线胶片或置于磷酸图像分析仪(phosphoimage analyzer)下，从而能够测定氯霉素的乙酰化水平。计算乙酰化氯霉素对总氯霉素的放射性比值而测定CAT活性。<表1>Phoenix细胞中逆转录病毒载体效率的比较
  载体                    相对CAT活性*     病毒滴度
    瞬时转导                转导
    瞬时     稳定
  MIN     1.0     1.0     1.0     1.0
  MIN-EI     3.5±0.4     3.3±0.4     3.0±0.6     1.1±0.2
  MFG     1.0±0.2     1.1±0.3     0.4±0.2     1.0±0.3
*：基于载体MIN的CAT活性(乙酰化氯霉素的放射性/总氯霉素的放射性)
如表1所示，当使用Phoenix细胞作为包装细胞系时，MIN-EI的CAT活性比MIN或MFG的CAT活性高3～4倍。这表明MIN-EI的基因表达效率优越于其它的基因表达效率。这些载体之间病毒滴度没有明显差异，因此，转导的NIH3T3细胞的测量的CAT活性直接反应该基因表达效率。<表2>FlyA13细胞中逆转录病毒载体效率的比较
  载体                  相对CAT活性    病毒滴度
  瞬时转导              转导
    瞬时     稳定
  MIN     1.0     1.0     1.0     1.0
  MIN-EI     4.5±0.7     0.6±0.1     2.2±0.5     0.3±0.1
  MFG     1.7±0.3     0.8±0.2     0.5±0.1     1.1±0.2
<表3>PG13细胞中逆转录病毒载体效率的比较
    载体          转导     病毒滴度
    瞬时     稳定
    MIN     1.0     1.0     1.0
    MIN-EI     0.8     7.0     0.1
    MFG     2.6     2.9     1.0
然而，当使用FlyA13(参见表2)或PG13(参见表3)作为包装细胞系时，MIN-EI的病毒滴度相当低，仅为MIN或MFG的三分之一到十分之一。实施例2：MIN-EI的病毒生产力
为了考察为什么病毒滴度会随着使用的包装细胞系而改变，进行了northern印迹分析。首先，从分别用MFG和MIN-EI转染的Phoenix细胞，并且也分别从生产MFG和MIN-EI的PG13细胞中用下述的硫氰酸胍-铯法提取细胞质RNA：用PBS清洗培养在100mm平皿中的细胞两次，之后加入3ml胍缓冲液。变透明后，用注射器使混合物均匀，注入含有2ml 5.7M CsCl2的polyaloma管(Beckman)中，在20℃，29,000rpm离心16小时，得到RNA沉淀。将RNA沉淀溶解于150μl含有DEPC的蒸馏水，进行乙醇沉淀，得到50μl RNA溶液。
将20μg RNA与20μl甲酰胺、10μl 37％甲醛和10μl 10×MOPS混合。将混合物在70℃加热10分钟，然后在甲醛-琼脂糖凝胶上在50mA下电泳。将凝胶依次浸泡于50mM NaOH、10mM NaCl 10分钟和20×SSC溶液(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)45分钟。分离处理后的RNA，用毛细法转移到硝酸纤维素膜上，在80℃固定1小时。与ExpressHyb杂交溶液(Clontech，USA)在65℃预杂交30分钟后，用同位素标记的CAT DNA片段对硝酸纤维素膜进行杂交反应。用缓冲液清洗硝酸纤维素膜两次，然后曝光于X-射线胶片，然后用磷酸图像分析仪(phosphoimage analyzer)分别定量测定得到的基因组RNA和次基因组RNA带。<表4>不同包装细胞系中RNA组成的比较
            Phoenix细胞系                 PG13细胞系
  载体               RNA的量  载体               RNA的量
  基因组RNA   次基因组RNA  总RNA   基因组RNA   次基因组RNA  总RNA
  MFG   257(69％)*   118(31％)  375(100％)  MFG   241(63％)   139(37％)  380(100％)
  MIN-EI   187(6％)   2834(94％)  3021(100％)  MIN-EI   22(5％)   388(95％)  410(100％)
*：()代表各基因组RNA和次基因组RNA对总RNA的比值
表4的结果显示，MIN-EI的剪接效率并不随包装细胞系而显著改变。在Phoenix细胞系中，MIN-EI比MFG明显地合成显著地更多量的次基因组RNA，并且表现普遍地高的转录水平。这个结果解释了为什么MIN-EI表现高的基因表达水平。然而，在PG13细胞系中，MIN-EI的转录活性明显降低，而同时剪接效率维持在约与在Phoenix细胞系中的同一水平。因此，基因组RNA的绝对量变低，其导致病毒滴度的减少。
也就是说，在Phoenix细胞系中，通过该EF1α基因的内含子和非编码序列的作用导致有效剪接，得到比基因组RNA更多的次基因组RNA，导致基因表达水平的增加。而且，由于高转录活性有利于基因组RNA的合成，病毒滴度也保持较高。然而，在FlyA13和PG13细胞系中，剪接有效地进展，得到相对大量的次基因组RNA，但基因组RNA的总量明显减少，导致低病毒滴度。实施例3：同时具有在EF1α内含子上的突变和非编码序列的逆转录病毒载 体的构建
为了研制一种驱动高水平基因表达而不损害病毒滴度的改进的载体，导入突变以维持剪接效率和病毒滴度之间的精确平衡。通过在MIN-EI的EF1α基因的内含子和剪接受体上或周围导入突变，构建了5个突变载体(参见图1)：
1)MT1，其中在剪接受体上没有导入突变，并且对应于EF1α的外显子2的区域被删除；
2)MT2，其中在剪接受体的下游导入了突变，并且对应于EF1α的外显子2的区域被删除；
3)MT3，其中在剪接受体的上游导入了突变，并且对应于EF1α的外显子2的区域被删除；
4)MT4是在该剪接受体上没有导入突变的野生型；和
5)MT5，其中在该剪接受体的下游导入了突变。(3-1)MT1的构建
为了构建MT1，用质粒pMIN-EI(韩国专利申请号1999-23398)作为PCR模板、SEQ ID NO.2(EI5’)和3(EI3’-1s)的合成寡核苷酸作为引物进行PCR。
用含200ng模板质粒DNA和1μl各种引物(10pmol/μl)的100μlPCR反应液进行30次PCR扩增反应循环，每次循环为94℃1分钟(变性)、50℃1分钟(退火)和72℃1分30秒(聚合)。
将EF1α内含子的扩增片段克隆到pGEM T easy载体(Promega，WI，USA)后，切下MluI-BamHI片段，插入pMIN的MluI-BamHI位点，产生MT1(参见图2)。(3-2)MT2的构建
用质粒pMIN-EI作为PCR模板和SEQ ID NO.2(EI5’)和4(EI3’-2s)的合成寡核苷酸作为引物对，按照实施例(3-1)的方法通过PCR构建MT2。
将具有在剪接受体的下游导入的突变的EF1α内含子的PCR扩增的片段克隆到pGEM T easy载体(Promega，WI，USA)中，并且切下MluI-BamHI片段，插入pMIN的MluI-BamHI位点，产生MT2(参见图3)。(3-3)MT3的构建
用质粒pMIN-EI作为PCR模板和SEQ ID NO.5(EI5’m)和3(EI3’-1s)的合成寡核苷酸作为引物对，按照实施例(3-1)的方法通过PCR构建MT3。
将具有在剪接受体的上游导入的突变的EF1α内含子的PCR扩增片段克隆到载体pGEM T easy载体(Promega，WI，USA)中，并且切下MluI-BamHI片段，插入到pMIN的MluI-BamHI位点，产生MT3(参见图4)。(3-4)MT4的构建
用质粒pMIN-EI作为PCR模板和SEQ ID NO.2(EI5’)和6(EI3’-1l)的合成寡核苷酸作为引物对，按照实施例(3-1)的方法通过PCR构建野生型载体MT4。
将EF1α内含子的PCR扩增的片段克隆到载体pGEM T easy载体(Promega，WI，USA)中，并且切下MluI-HincII片段，插入到pMIN-EI的MluI-PmeI位点，产生MT4(参见图5)。(3-5)MT5的构建
用质粒pMIN-EI作为PCR模板和SEQ ID NO.2(EI5’)和7(EI3’-2l)的合成寡核苷酸作为引物对，按照实施例(2-1)的方法通过PCR构建MT5。
将EF1α内含子的PCR扩增片段克隆到载体pGEM T easy载体(Promega，WI，USA)中，并且切下MluI-SacI片段，插入到pMIN-EI的MluI-PmeI位点，产生MT5(参见图6)。实施例4：携带Luc基因的本发明的载体的效率(4-1)荧光素酶(Luc)基因的克隆
用pGL2对照载体(Promega，WI，USA)作为模板，以及SEQ IDNO.8(Luc 5’)和9(Luc 3’)的合成寡核苷酸作为引物对，通过PCR扩增Luc基因。将扩增的片段插入到pGEM T easy载体(Promega，WI，USA)中，以便产生pGEM T easy-Luc载体(参见图7)。将通过用BamHI/BglII处理pGEM T easy-Luc载体得到的含有该荧光素酶基因的片段插入实施例2制备的各载体的BamHI位点，产生图7所示的荧光素酶表达载体。(4-2)荧光素酶活性的测定
将含有荧光素酶基因的MT1，2，3，4，和5分别转染到Phoenix细胞中，使细胞温育48小时。用无细胞病毒上清液转导NIH3T3细胞。分别测定转染和转导细胞的荧光素酶活性。还测定了G418抗性稳定的细胞系的荧光素酶活性和病毒滴度(参见表5)。在表5中，各逆转录病毒载体的荧光素酶活性表示为基于野生型MT4载体的荧光素酶活性的相对值。
如下述测定荧光素酶的活性：用1ml PBS清洗收获的细胞。完全去除PBS后，将细胞重悬浮于合适量的1×报告分子裂解缓冲液(Promega，WL，USA)中，并且在室温下反应5分钟。将反应混合物在12,000rpm离心1分钟，收集上清液。提取物中的蛋白质浓度通过Bradford’s法定量测定。将固定量的蛋白质与100μl荧光素酶分析试剂(Promega，WI，USA)混合，并且将反应混合物转移到96孔平板中，以便用发光计测定Luc活性(参见图5)。<表5>突变载体效率的比较
    载体           相对荧光素酶活性   病毒滴度
  瞬时转导          转导
    瞬时    稳定
    MT1     0.4     0.2     -     0.1
    MT2     0.8     1.0     -     0.6
    MT3     0.1     0.2     -     0.1
    MT4     1.0     1.0     1.0     1.0
    MT5     0.5     1.3     0.9     1.6
如表5所示，MT 1，2和3的基因表达水平和病毒滴度均比含野生型EF1α内含子和剪接受体序列的对照MT4的低。MT5在Phoenix细胞中的基因表达水平达到MT4基因表达水平的50～70％，但其病毒滴度增加大约2倍，并且在转导的NIH3T3细胞中的荧光素酶活性也增加了。也就是说，MT5的剪接效率比MT4的稍低，产生减少量的次基因组RNA。因此，MT5的基因表达略微低一些，但由于它相对较高的病毒滴度使它的整体转导效率增强了。该结果表明导入到剪接受体的下游的突变能够保持剪接效率和基因组可包装转录物的量之间的平衡。实施例5：携带IL-1ra基因的本发明的载体的效率以及RNA成分的分析(5-1)用IL-1ra基因的载体的效率的比较
为了考察实施例4中观察到的MT5载体的改进的活性是否是可应用于其它外源基因的普遍现象，用人IL-1ra基因代替Luc基因重复实施例4的方法(参见表6)。
从外周血淋巴细胞收集IL-1ra基因。首先，用Ficoll-hypaque从正常人血提取外周血淋巴细胞，然后提取RNA，并进行逆转录酶PCR(RT-PCR)，从而得到cDNA。用该cDNA作为模板，以及SEQ ID NO.10(IRAP5’)和11(IRAP 3’)的合成寡核苷酸作为引物对扩增该IL-1ra基因片段。将扩增的PCR产物插入到pGEM T easy载体(Promega，WI，USA)中，产生载体pGEM T easy-IL-1ra。通过用BamHI/BglII处理得到的载体而获得含有该IL-1ra基因的片段，然后将该片段分别插入实施例3制备的MT4和MT5的BamHI位点。与载体MFG-IL-1ra一起检测得到的IL-1ra表达载体(Yu等，Gene Ther.7：797-804，2000)。
将含有IL-1ra基因的载体MT4，MT5，和MFG分别转染到Phoenix细胞中，保温48小时。用无细胞的病毒上清液转导NIH3T3细胞。用人IL-1raELISA(R&D system，USA)测量分泌到转染和转导的细胞的上清液中的IL-1ra的量，通过记数G418抗性细胞的数目确定病毒滴度(参见表6)。<表6>应用IL-1ra基因时载体效率的比较
    载体       相对IL-1ra活性    病毒滴度
    转染     转导
    MT4     1.0     1.0     1.0
    MT5     0.5     1.5     1.8
    MFG     0.2     0.3     1.3
表6得到的结果证明，当MT5携带IL-1ra作为报告基因时，它的转导效率和病毒生产力也增强了。(5-2)细胞质RNA
为了考察实施例(5-1)得到的结果是否是由于剪接效率的改变，通过northern印迹分析细胞质RNA。简单地说，从转染的Phoenix细胞提取细胞质RNA，用IL-1ra基因作为探针进行杂交，以评价基因组RNA和次基因组RNA的量。用磷酸图像分析仪定量测定杂交的RNA带的强度(参见表7)。<表7>Phoenix细胞RNA的组成
    载体                   RNA的量
  基因组RNA   次基因组RNA    总RNA
    MT4   266(4.5％)   5635(95.5％)   5901(100％)
    MT5   408(10.3％)   3560(89.7％)   3968(100％)
    MFG   257(69％)   118(31％)   375(100％)
结果表明MT4的次基因组RNA占总RNA的95％，与MT4相比，MT5的次基因组RNA的相对比例约为94％。另一方面，观察到MT5的比次基因组RNA的量明显地更低的基因组RNA的量比MT4观察到的基因组RNA的量高2倍。这些结果解释了为什么与MT4相比，MT5给出更高的病毒滴度。(5-3)本发明载体在PG13细胞中的效率
考察了逆转录病毒载体在可以应用于实际的临床试验的PG13细胞系中的效率。将从Phoenix细胞和MFG(对照)病毒得到的无细胞的培养溶液分别转染到PG13细胞，得到G418抗性病毒生产细胞。将PG13生产细胞系的病毒上清液转导到HT1080细胞中，测定转导的细胞的IL-1ra活性和病毒滴度(参见表8)。<表8>在PG13细胞中载体效率的比较
    载体   相对的IL-1ra活性     病毒滴度
    MT4     1.0     1.0
    MT5     7.0     3.3
    MFG     5.1     4.0
表8结果证明，当使用PG13细胞时，MT5的病毒滴度是MT4的约3～4倍。实施例6：含MDR的载体的构建
构建了一种具有与MT5相同的修饰EF1α内含子和非编码序列但是含有人MDR基因作为可筛选的标记的载体，并且被命名为MTM5。(6-1)IRES基因的克隆
为了产生IRES(内部核糖体进入位点，internal ribosomal entry site)的基因片段，用下述物质进行PCR：含有IRES的质粒pCBIN(韩国专利申请号1997-48095)作为模板；具有BamHI和NotI识别序列的SEQ IDNO.12的寡核苷酸作为5’引物；具有StuI，ClaI和BglII识别序列的SEQID NO.13的寡核苷酸序列作为3’引物。
将PCR产物克隆到载体pCRII(Invitrogen，CA，USA)后，从得到的载体切下BamHI/BglII片段，然后插入MSN(韩国专利申请号1999-23398)的BamHI位点，以便产生质粒MSN-IRES。(6-2)MDR基因的克隆和质粒MTM的构建
为了产生MDR基因片段，PCR如下进行：用含有MDR的质粒作为模板，该质粒得自于Sugimoto博士(癌症化疗中心，日本癌症研究基金会，东京170，日本)；具有BamHI和ClaI识别序列的SEQ ID NO.14的寡核苷酸作为5’引物；具有SalI和BamHI识别序列的SEQ ID NO.15的寡核苷酸作为3’引物。
将PCR产物克隆到载体pCRII(Invitrogen，CA，USA)中，产生pCR-MDR，通过测序分析证明MDR基因正确地插入。从该pCR-MDR载体切下BamHI/BglII片段，除去ClaI/XhoI片段后插入质粒MSN-IRES，以便产生质粒MTM(参见图9)。(6-3)载体MTM4和MTM5的构建
分别从载体MT4和MT5得到含有修饰的非编码序列的MluI/BamHI DNA片段，并且插入到MTM载体的MluI/BamHI位点，以分别构建质粒MTM4和MTM5(参见图10)。因此，来自MTM4和MTM5的MDR基因的表达衍生于剪接的mRNA。实施例7：MTM载体的效率
为了考察实施例6得到的载体MTM，MTM4，和MTM5的效率，将IL-1ra基因插入这些载体的BamHI位点，以分别产生载体MTM-IL-1ra，MTM-IL-1ra，和MTM-IL-1ra。将各得到的载体与gag/pol，env表达载体一起转染到293T细胞中，培养细胞48小时。用无细胞的病毒上清液转导NIH3T3细胞，然后培养48小时。测定该转染细胞和转导的细胞的IL-1ra活性，并且通过记数抗长春新碱的细胞的数目测定病毒滴度。<表9>
    载体     相对的IL-1ra活性     病毒滴度
    转染     转导
    MTM     1.0     1.0     1.0
    MTM4     10.0     3.3     1.8
    MTM5     3.4     5.0     2.5
如表9所示，MTM5的基因表达水平仅为野生型MTM4的大约30％，但比MTM的高3倍。另外，因为MTM5的病毒滴度比MTM和MTM4的高很多，因此就整体转导效率而言MTM5表现最优。
为了进一步比较逆转录病毒载体在PG13细胞中的表现，将各种无细胞的病毒上清液转导PG13细胞，用25ng/ml的长春新碱筛选2周得到生产病毒的细胞系。用从PG13生产细胞系得到的病毒上清液转导HT1080细胞，并且测定IL-1ra活性和病毒生产力。<表10>
    载体   相对的IL-1ra活性     病毒滴度
    MTM     1.0     1.0
    MTM4     2.4     0.2
    MTM5     11.3     5.5
表10结果显示，MTM5的病毒滴度比MTM和MTM4的高很多，并且因此，MTM5具有卓越的转导效率。
如上述所公开和证明的，本发明提供了一种有效并且安全的逆转录病毒载体，它可以被有利地应用于基因治疗。本发明的逆转录病毒载体具有下列特征：
1.因为所有逆转录病毒编码序列(MLV的gag，pol和env基因序列)被完全删除，所以，不可能通过同源重组产生具有复制能力的逆转录病毒。
2.由于存在插入到多克隆位点上游的异源内含子，剪接受体和/或非编码序列，因此，该逆转录病毒载体中的外源基因可以被有效地表达。
3.由于在外源剪接受体的周围导入了合适的突变，因此，能够维持剪接效率和病毒滴度之间的精确平衡。
4.因为5’LTR的U3区域被启动转录，尤其是在人细胞中启动转录的外源启动子所取代，因此，用本发明的载体转染的人细胞来源的包装细胞系表现出显著增加的病毒滴度。
5.为了表达两种或更多种外源基因，可以在本发明载体中导入一种IRES或一种外源启动子。此时，可以插入一个最小启动子，以使外源内部启动子的干扰减至最小，并且还可以克隆大尺寸的外源基因。
序列表<110>金善荣等；百疗医株式会社<120>含有携带剪接受体的基因工程细胞非编码序列的高效逆转录病毒载体<130>PCA10935/VML/PCT<160>15<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>234<212>DNA<213>人<220><221>内含子<222>(1)..(204)<223>人延伸因子1-(基因的内含子(对应于该序列的+773-+976)<220><221>外显子<222>(205)..(234)<223>人延伸因子1-(基因的外显子2，其刚好就在翻译的终止密码子之前终止(对应于该序列的+977-+1008)<400>1tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt       60ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc      120ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt      180caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaaaactac ccctaaaagc caaa            234<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物EI5′<400>2acgcgtgtcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggtt                                38<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物EI3′-1s<400>3ggatccgttt aaacacctga aatggaagaa aaaaactttg aa                          42<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物EI3′-2s<400>4ggatccgttt aaacgcctga aatggaagaa aaaaactttg aa                          42<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物EI5′m<400>5acgcgtgtcg agcttttgga gtactgcgtc tttaggtt                               38<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>EI3′-1l<400>6tttttggctt ttaggggtag ttttcacgac acctgaaatg ga                          42<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物EI3′-2l<400>7tttttggctt ttaggggtag ttttcacgac ggctgaaatg ga                          42<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Luc5′<400>8ggatccatgg aagacgccaa aaacataaag aaaggcccgg cg                          42<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Luc3′<400>9agatctacaa tttggacttt ccgcccttct tggcc                                  35<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物IRAP5′<400>10ggatccatgg aaatctgcag aggcctccgc agtcac                                 36<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物IRAP3′<400>11agatctctac tcgtcctcct ggaagtagaa tttggt                                 36<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>IRES基因PCR的有义引物<400>12ggatccgcgg ccgcgaattc cgcccctctc cct                                    33<210>13<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>IRES基因PCR的反义引物<400>13agatctatcg ataggcctca tggttgtggc catattatca tc                          42<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>MDR基因PCR的有义引物<400>14ggatccatcg atatggatct tgaaggggac cg                                     32<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>MDR基因PCR的反义引物<400>15ggatccgtcg actcactggc gctttgttcc ag                                     32

Claims (11)

1.一种来源于鼠白血病病毒(MLV)载体的逆转录病毒载体，包括
1)插入多克隆位点上游的，作为来源于外源基因的非编码序列的延伸因子EF1α的非编码序列的一部分，和
2)一种导入到EF1α的非编码序列中的剪接受体下游的突变，所述逆转录病毒载体没有病毒编码序列。
2.权利要求1的逆转录病毒载体，其中EF1α的非编码序列是刚好就在翻译起始密码子之前的人EF1α的内含子和外显子2的序列。
3.权利要求2的逆转录病毒载体，其中EF1α的非编码序列具有SEQ IDNO.1的核苷酸序列。
4.权利要求1的逆转录病毒载体，其中的突变导入到该剪接受体下游的SEQ ID NO.1的第205位和第206位的GT(鸟嘌呤-胸腺嘧啶)位点。
5.权利要求4的逆转录病毒载体，其中GT碱基对用CC(胞嘧啶-胞嘧啶)碱基对取代。
6.权利要求1的逆转录病毒载体，它包括：
1)来源于起始的MLV载体的核苷酸序列，其是5’LTR，包含在起始的gag基因的上游的剪接供体的最小包装序列，多嘌呤示踪，和3’LTR；
2)多克隆位点；
3)EF1α的核苷酸序列的一部分，从内含子3’末端开始到刚好就在外显子2的翻译起始密码子之前，其被插入到该最小包装序列和该多克隆位点之间；和
4)在该多克隆位点下游的一种SV40最小启动子或一种内部核糖体进入位点(IRES)。
7.权利要求1至6之一的逆转录病毒载体，其中该起始的MLV载体的5’LTR中的U3或其部分被作为外源启动子的HCMV IE(人巨细胞病毒立即早期)启动子所取代。
8.权利要求6的逆转录病毒载体，它进一步包括NEO或MDR基因作为可筛选的标记基因。
9.权利要求1的逆转录病毒载体，它是载体MT5，包括
1)来源于起始MLV载体的核苷酸序列，其为5’LTR，含有起始的gag基因的上游的剪接供体的最小包装序列，多嘌呤示踪，和3’LTR；
2)多克隆位点；
3)一部分的EF1α核苷酸序列，它从内含子的3’末端开始到刚好就在外显子2的翻译起始密码子之前，被插入到该最小包装序列和该多克隆位点之间；
4)在多克隆位点下游的一种内部核糖体进入位点(IRES)；和
5)在该剪接受体下游，取代在+977～+978位点上的GT碱基对的CC碱基对。
10.用权利要求9的载体MT5转化的大肠杆菌菌株MT5(JM)(保藏号KCCM-10205)。
11.权利要求8的逆转录病毒载体，它是载体MTM5，包括
1)来源于起始的MLV载体的核苷酸序列，其为5’LTR，含有起始的gag基因的上游的剪接供体的最小包装序列，多嘌呤示踪、和3’LTR；
2)多克隆位点；
3)一部分的EF1α核苷酸序列，它从内含子的3’末端开始到刚好就在外显子2的翻译起始密码子之前，被插入到该最小包装序列和该多克隆位点之间；
4)在该多克隆位点下游的一种内部核糖体进入位点(IRES)；和
5)在剪接受体下游，在+977～+978位点上的取代该GT碱基对的CC碱基对；和
6)作为可筛选的标记基因的MDR基因。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2450688A (en) * 2005-05-11 2009-01-07 Viragen Inc Ovalbumin promoter constructs for retroviral vectors
US8105575B2 (en) * 2006-10-10 2012-01-31 Viromed Co., Ltd. Expression vectors with improved safety
KR101390967B1 (ko) * 2006-10-10 2014-05-14 주식회사 바이로메드 안전성이 향상된 레트로바이러스 벡터
US8613936B2 (en) * 2009-03-13 2013-12-24 Bavarian Nordic A/S Replication deficient recombinant viruses expressing antigens regulated by transcriptional control elements comprising multiple elements
WO2012157743A1 (ja) * 2011-05-19 2012-11-22 タカラバイオ株式会社 外来性ｓｄ－ｓａを有するレトロウイルスベクター
WO2012157742A1 (ja) * 2011-05-19 2012-11-22 タカラバイオ株式会社 ｓｉＲＮＡ発現レトロウイルスベクター
WO2014162318A2 (en) * 2013-03-30 2014-10-09 Usha Biotech Limited Methods and constructs for expressing biologically active proteins in mammalian cells
WO2015053398A1 (ja) * 2013-10-11 2015-04-16 タカラバイオ株式会社 高力価レトロウイルスベクター
WO2020080908A1 (ko) 2018-10-19 2020-04-23 주식회사 헬릭스미스 항-l1cam 항체 또는 그의 항원결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
US20220010332A1 (en) * 2020-07-08 2022-01-13 Neuracle Genetics Inc. Intron fragments

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693508A (en) * 1994-11-08 1997-12-02 Chang; Lung-Ji Retroviral expression vectors containing MoMLV/CMV-IE/HIV-TAR chimeric long terminal repeats
KR20000006334A (ko) 1998-06-26 2000-01-25 이선경 바이러스코딩염기서열이전혀없는고효율레트로바이러스벡터

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Publication number Publication date
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CN1206359C (zh) 2005-06-15
JP3921445B2 (ja) 2007-05-30
US7049143B2 (en) 2006-05-23
EP1326988A4 (en) 2005-04-06
EP1326988B1 (en) 2010-06-09
US20030166251A1 (en) 2003-09-04
AU2001286302A1 (en) 2002-03-22
DE60142348D1 (de) 2010-07-22
KR20010069245A (ko) 2001-07-25
ATE470717T1 (de) 2010-06-15
JP2004508047A (ja) 2004-03-18
WO2002020810A1 (en) 2002-03-14
KR100373821B1 (ko) 2003-02-26

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