CN100335137C - 人同源盒基因lhx4在制备嗜铬细胞瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人同源盒基因LHX4在制备嗜铬细胞瘤治疗药物中的应用。本发明通过逆转录病毒载体将人LHX4基因转导入嗜铬细胞瘤细胞PC12，LHX4基因具有抑制PC12细胞体外增殖，以及促进PC12细胞向神经元分化和轴突生长的作用，可用于制备嗜铬细胞瘤治疗药物。

Description

人同源盒基因LHX4在制备嗜铬细胞瘤治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种基因的用途，具体的说涉及人同源盒基因LHX4在制备嗜铬细胞瘤治疗药物中的用途。

背景技术

同源盒基因(homeobox gene)是1983年在瑞士Gehring实验室发现的一类基因，它们因在其基因外显子3′端共同具有一段长180个碱基对、高度保守的同源盒序列而得名，同源盒基因的表达产物是一类重要的转录因子，是发育的主控基因，在胚胎的发育调控中发挥重要作用。由这段序列所翻译出的蛋白质更具保守性，并富含碱性氨基酸，因此称为同源盒区(homeodomain)。LIM同源盒基因(LIM homeobox gene)属于同源盒基因家族，它不仅具有同源盒结构，而且含有两个富含半胱氨酸和组氨酸的LIM结构域。LIM结构域的名称是由LIM家族中三个基因Lin-11(线虫)、Isl-1(鼠)和Mec-3(线虫)名称的首字母缩写而成。LIM同源盒转录因子(LIMhomeodomain transcription factor，LIM-HD)是指LIM同源盒基因的蛋白质表达产物，大多表达在神经系统，具有早期特征的的形成及后期调控组织特异性基因的表达等功能，因而这些基因决定脊柱和非脊柱动物发育中组织和细胞特异性分化。

LHX4基因(LIM homeobox gene 4)属于LIM同源盒基因家族，主要是在胚胎发育期的神经组织中表达，是机体胚胎发育过程中运动神经元分化和分类的一个重要调控基因。1994年，美国Hung Li等人依据同源盒区最保守的氨基酸序列“KIWFQNRR”设计了一个含有编码同源盒序列羧基端14个氨基酸序列的基因克隆，然后用这段基因序列去筛选小鼠胚胎cDNA文库后得到一个1196bp的cDNA阳性克隆。这个克隆含有一段编码170个氨基酸的翻译区，它的位置从3′poly-A一直延伸到homeobox的5′端，因而它与LHX3有较高的同源性而命名为LHX4(Li Hung，Witte DP，Branford WW et al.Gsh-4encodes a LIM-type homeodomain is expressed in the developing central nervoussystem and is required for early postnatal survival.The EMBO J，1994，13：2876-2885)。

由于LHX4基因在小鼠出生后表达水平极度降低或消失，且LHX4基因敲除后的小鼠死亡，无法进一步研究该基因在神经发育调控之外的功能作用(1.Li，H.，Witte，D.P.，Banford，W. W.，et al.Gsh-4 encodes a LIM-typehomeodomain，is expressed in the developing central nervous system and isrequired for early postnatal survival.The EMBO J，1994，13：2876-2885；2.SinghG，Kaur S，Stock JL et al.Identification of 10 murine homeobox genes.Proc.NatlAcad.Sci.USA，1991，88：10706-10710)。

发明内容

本发明公开了人同源盒基因LHX4在制备嗜铬细胞瘤药物中的应用。

本发明根据已经报道的人同源盒基因LHX4基因序列，如序列表中序列1所示(参见专利申请00133460.3)，和含有人同源盒基因LHX4全长CDS的质粒(NIH Genbank登录号为AF179849)，利用人LHX4基因cDNA序列为探针，在成人多组织表达Array膜(multiple tissue expression array，MTE array)上通过放射性杂交的方法，研究了LHX4基因在成人不同组织中的表达情况，结果显示全脑、大脑皮层、脊髓和胎脑有杂交信号出现。其中以胎脑信号最强。其余由强到弱依次为脊髓、全脑和大脑皮层，而人体其他组织中则没有杂交信号出现。

他人和本发明的发明人都用实验证明，LHX4是躯体运动神经元发育和分化过程中发挥重要作用，是调节运动神经元发育分化和轴突投射模式形成的一类重要转录因子(Sharma K，Sheng HZ，Lettier K et al.LIM homeoboxfactors Lhx3and LHX4 assign subtype identities for motor neurons.Cell，1998，95：817-828；Thor S and Thomas JB.The Drosophila islet gene governs axonpathfinding and neurotransmitter identity.Neuron，1997，18：397-407)。

尽管基因敲除是目前非常有效的基因功能研究手段，但由于LHX4基因敲除后的胎鼠因肺不扩张而死亡，无法进一步研究成年动物LHX4基因的功能。本发明采用基因转染技术，将人LHX4基因CDS导入可诱导为神经元的PC12(嗜铬细胞瘤)细胞中，在细胞、分子水平从形态及功能等方面研究LHX4基因在靶细胞中所起的作用，与此同时，又将LHX4基因CDS反向克隆入具有筛选标志的表达载体启动子下游，以构建反义LHX4 RNA表达载体，再将重组质粒导入靶细胞，可在靶细胞内转录出大量的反义LHX4 RNA片段，与靶细胞中内源性LHX4基因转录出的正义LHX4 RNA互补结合，从而起到封闭LHX4基因翻译表达的作用，用于分析LHX4基因产物的功能以及缺乏LHX4基因所致的病理性改变。

PC12细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆细胞株，在体外经NGF定向诱导可向神经细胞分化(Suzuki A，Tsutomi Y.Bcl-2 accelerates theneuronal differentiation：new evidence approaching to the biofunction of bcl-2 inthe neuronal system.Brain Res 1998，801(1-2)：59-66)。我们将正、反义LHX4基因通过逆转录病毒分别导入靶细胞PC12后，以细胞基因组DNA为模板，PCR扩增证明转导的正、反义LHX4基因已分别整合在靶细胞基因组DNA上。进而分别以正、反义LHX4基因转染后靶细胞RNA为模板，采用RT-PCR方法检测细胞内LHX4 mRNA的表达水平，证实上述靶细胞中已转录出正、反义LHX4 RNA序列。正义LHX4基因转染组细胞中的LHX4基因表达较空载体转染组中有明显增强，而反义LHX4基因转染组细胞中的LHX4基因表达明显被抑制。

导入正义LHX4基因的PC12嗜铬细胞瘤靶细胞，细胞形态与空载体转染组没有明显区别，但体外细胞增殖能力较其它转染组明显降低，细胞经NGF诱导后，长出突起的细胞数量也明显多于其它转染组，而且细胞突起生长快、突起长度长，从而提示我们，高表达的LHX4基因可能具有促进PC12嗜铬细胞瘤细胞向神经分化的作用，且LHX4基因高表达后可能导致LHX4基因调控的某些下游基因的表达发生变化，从而有助于PC12靶细胞在神经诱导分化中的突起生成；而转染反义LHX4基因的PC12靶细胞，其细胞中的LHX4基因表达被有效封闭，体外培养时，可明显观察到该实验组细胞的返祖现象——细胞增殖旺盛，贴壁性降低，多形成细胞团生长，具有类似肿瘤细胞的培养特性，经NGF诱导后，该实验组的细胞中能形成突起的细胞数较少，生长突起所需的时间长，细胞增殖速度仍明显大于正义LHX4基因和空载体转染组，细胞贴壁性也明显降低，从而提示，LHX4基因表达部分封闭后的细胞中LHX4基因及其所调控的某些下游基因表达降低可能抑制PC12细胞向神经诱导分化，并可能使PC12进一步去分化，从而增强PC12细胞的体外增殖能力。

上述研究结果表明，同源盒LHX4基因具有抑制PC12嗜铬细胞瘤细胞体外增殖，以及促进PC12嗜铬细胞瘤细胞向神经分化和轴突生长的作用。可以用于制备嗜铬细胞瘤基因治疗药物或肽类药物。

附图说明

图1为Promega柱纯化法回收纯化探针(L：200bp Ladder，A：纯化的LHX4探针)。

图2为MTE Array膜与人LHX4 cDNA探针杂交结果。

图3为pLXIN-正义LHX4重组质粒酶切及PCR鉴定电泳图谱，其中

1.pLXIN质粒/BamH I；

2.pLXIN-正义LHX4重组质粒/BamH I；

3.DNA Marker；

4.PCR鉴定扩增出重组质粒中的LHX4片段；

5.pLXIN-正义LHX4重组质粒/BamH I+Hpa I

图4为pLXIN-反义LHX4重组质粒酶切及PCR鉴定电泳图谱

1.DNA Marker；

2.pLXIN质粒/BamH I；

3.pLXIN-反义LHX4重组质粒/BamH I；

4.pLXIN-反义LHX4重组质粒/BamH I+Hpa I；

5.PCR鉴定扩增出重组质粒中的LHX4片段；

图5为阳性克隆细胞中neo基因的PCR扩增结果，其中

1.空载体感染后的PC12嗜铬细胞瘤细胞；

2.pLXIN-正义LHX4感染后的PC12细胞；

3.pLXIN-反义LHX4感染后的PC12细胞；

4.无病毒感染的PC12细胞；

5.DNA Marker；

图6为阳性克隆细胞中LHX4基因表达的PCR鉴定结果，其中

1.DNA Marker；

2.空载体感染后的PC12嗜铬细胞瘤细胞；

3.pLXIN-正义LHX4感染后的PC12细胞；

4.pLXIN-反义LHX4感染后的PC12细胞；

图7为转染空载体和正、反义LHX4基因的PC12细胞生长曲线图

^**：与空载体比较，p＜0.01；++：与反义LHX4比较，p＜0.01

图8为LHX4基因对诱导PC12嗜铬细胞瘤细胞神经元突起生长的影响(NGF诱导9天)其中1为空载体-PC12细胞的神经元诱导后细胞形态；

2为正义LHX4-PC12细胞的神经元诱导后细胞形态；

3为反义LHX4-PC12细胞的神经元诱导后细胞形态。

具体实施方式

实施例一  人同源盒基因LHX4在成人不同组织中的表达

一.材料

主要仪器：HEAR hybrid 杂交炉(Heraeus公司)，扫描仪(Kodak公司)。

主要试剂：Huamn Ubiquitin Control cDNA Probes(Clontech公司，5ng/μl)，ExpressHyb杂交液(Clontech公司)，鲑精DNA(10mg/ml，ssDNA，GIBCO-BRL公司)，C₀t-1 DNA(1mg/ml，Gibrco公司)，20×SSC(pH 7.0)，20％SDS(Sigma公司)，洗膜液1：2×SSC，1％SDS，洗膜液2：0.1×SSC，0.5％SDS，玻璃奶纯化试剂盒(原平公司)，PCR产物纯化试剂盒(Promega公司)，EX Taq PCR系统(TaKaRa公司)。

杂交膜：MTE Arrary膜(Multiple Tissue Expression Arrary，Clontech公司)

放射自显影：α-³²P dCTP(北京亚辉公司)，X光片(Kodak公司)，X光片压片盒(汕头医学实验仪器厂)，D-72显影液，定影液(浙江嘉兴市南湖摄影仪器厂)。

二.方法

1.探针的制备和纯化

1.1.PCR法扩增探针

(1).设计引物：上游引物Primer1：见序列表中序列4，下游引物Primer2：见序列表中序列5。

(2).PCR扩增：体系为TaKaRa公司Ex Taq PCR系统：PCR buffer 2μl，DNTP 2μl，primer 1 1μl，primer 2 1μl，Ex Taq 0.5μl，模板0.5μl，ddH₂O 13μl，共20μl。扩增条件为94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，30个循环，72℃10min，4℃保存。

1.2.探针的纯化：

对PCR扩增后的产物用Promega柱纯化的方法进行纯化

(1).50μl PCR扩增产物中加入100μl纯化缓冲液(direct purificationbuffer)，充分混匀。

(2).再加入1ml PCR纯化树脂(wizard PCR preps DNA purificationresin)，混匀。

(3).将上述液体全部加入5ml注射器中，并装好小柱子(Wizard PCRpurification Spin Column)。将注射器缓慢推下使所有液体通过小柱子。

(4).卸下注射器，加入2ml 80％的异丙醇，装好小柱子并将注射器缓慢推下使所有液体通过小柱子。

(5).将小柱子装入1.5ml Eppendorf管中，8000rpm离心1分钟，使异丙醇彻底从小柱子上去除。

(6).将小柱子换入到干净的Eppendorf管中，并从顶部加入30μl的ddH₂O，静置1分钟，然后12000rpm离心20秒，回收液体。

(7).将所回收的液体取2μl进行琼脂糖电泳，以检测回收的效果。

1.3.探针的标记

采用随机引物标记试剂盒标记(Prime-a-Gene Labeling System，Promega)，操作步骤同Promega公司操作手册。用于标记的DNA来源于PCR扩增的片段。

(1).25ng的DNA，用水补足30μl，98℃变性4分钟，快速放到冰上。

(2).依次向管中加入以下试剂：5×标记缓冲液10μl，dNTP混合物(无dCTP)2μl(终浓度为每种20μM)，10mg/ml BSA 2μl(终浓度为400μg/ml)。

(3).将1，2两管混匀，然后加入〔α-³²P〕dCTP 5μl(终浓度为50μCi，3,000/mmol)，Klenow酶(5U/μl)1μl(终浓度为100U/ml)。

室温标记1小时，取1μl按下述方法测定标记效率，剩余的探针98℃变性5分钟后加入杂交液中。将1μl标记产物稀释500倍，取5μl按三氯乙酸沉淀法测定标记效率。探针的比活度一般约为1×10⁸～1×10⁹cpm/μg.。

1.4.MTE Array膜与特异性探针的杂交

(1).准备ExpressHyb杂交液和鲑精DNA：50-60℃预热15ml ExpressHyb杂交液；98℃变性1.5mg鲑精DNA 5分钟，并迅速置于冰浴中；将上述预热好的ExpressHyb杂交液与变性后的鲑精DNA混匀。

(2).将MTE Array膜放入杂交管中并加入10ml步骤(1)中准备好的杂交液。

(3).保持65℃，连续震荡中持续预杂60分钟。

(4).将标记好的探针中加入30μg C0t-1 DNA，150μg鲑精DNA和50μl 20×SSC，使总体积达到200μl。

(5).将上述步骤(4)中准备好的探针98℃变性5分钟，然后68℃30分钟

(6).将步骤(5)中准备好的探针混合液加入剩下的5ml杂交液中，并确保两种溶液能够充分混合。

(7).从进行MTE Array预杂的杂交管中弃去预杂液，加入步骤(6)中准备好的杂交液，并尽量去除气泡并使杂交液全面覆盖膜。

(8).65℃持续震荡杂交过夜(6-12小时)。

(9).杂交完毕后，到掉杂交液。

(10).加入200ml洗膜液1，65℃持续震荡洗膜20分钟。重复这一过程4次。

(11).然后加入200ml 55℃预热的洗膜液2，55℃持续震荡洗膜20分钟。重复这一过程2-3次，洗膜的程度可用mintor来检测。

(12).洗膜完毕后，将膜置于3M的滤纸上，去掉多余的水分，但不要使膜干。并将膜包入塑料薄膜中。

(13).将步骤1中处理好的膜与X光片一同置入压片盒中，-70℃压片7天。

(14).x光片显影，分析结果。

三、结果

1.探针的制备和纯化：以人LHX4基因的质粒为模板，经过PCR扩增和纯化后，得到人LHX4 cDNA表达序列全长，以其做为MTE Array膜杂交的探针(结果见图1)。

2.杂交及结果分析：经过多次反复杂交后，我们得到较为稳定的杂交结果，并将杂交信号的位置与MTE Array膜上不同组织RNA的位置相比较，发现有杂交信号出现的位置依次是：全脑，大脑皮层，脊髓，胎脑。其中尤以胎脑信号最强，其次信号由强到弱依次为：脊髓，全脑，大脑皮层(结果见图2)。

上述结果表明，我们所克隆到的人LHX4 cDNA全长序列在神经组织具有特异性表达，而且这种表达主要局限在成人的神经系统，但在成人神经系统各组织的表达程度均明显低于胎脑中的表达。由此我们可以推测：人LHX4基因的表达并不止局限在胚胎组织中，在成人的神经组织中也有特异性的表达。

实施例三 人同源盒LHX4基因转染对PC12嗜铬细胞瘤细胞

                体外增殖和分化的影响

一、材料和方法

1、质粒、细胞株：pLXIN逆转录病毒表达载体，6.1Kb，具有氨苄青霉素和新霉素抗性，购自生物试剂公司。SC712质粒，本室首次克隆的含人同源盒基因LHX4全长CDS的质粒，NIH Genbank登录号AF179849。PC12细胞株，雄性大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的细胞株。膜上有NGF受体，在50ng/ml的NGF诱导9日后可分化为成熟的多巴胺能交感神经元。

2、正、反义LHX4逆转录病毒质粒(pLXIN-正义LHX4和pLXIN-反义LHX4)的构建：采用限制性内切酶位点分析软件，分析LHX4全长基因的限制性内切酶位点，并根据pLXIN表达载体的多克隆位点，选择适当的限制性内切酶——Hpa I和BamH I；设计含有所需酶切位点的LHX4基因CDS的正、反义PCR扩增引物，以PCR扩增方法，获取LHX4基因的CDS片段(pLXIN-正义LHX4引物：P1见序列表中序列6，P2见序列表中序列7；pLXIN-反义LHX4引物：P1见序列表中序列8，P2见序列表中序列9)。酶切表达载体pLXIN和正、反义LHX4基因CDS，回收定量后，用T4DNA连接酶将线性化pLXIN分别与已酶切的正、反义LHX4基因CDS片段连接，连接产物转化DH5α菌株感受态细胞，氨苄青霉素抗性LB平板长出的菌落扩增后，提取质粒DNA并酶切及PCR扩增鉴定，获得pLXIN-正义LHX4和pLXIN-反义LHX4重组逆转录病霉表达质粒。

3、重组逆转录病毒载体的包装：经15％胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM常规培养的PA317细胞，转染前24hrs接种于35mm培养皿，转染时，分别取待转染质粒(pLXIN、pLXIN-正义LHX4和pLXIN-反义LHX4)各2μg，依据DOTAP基因转染试剂操作步骤，转染PA317细胞24hrs后，弃去含转染试剂的培养液，每皿各加入2ml完全培养液继续培养48hrs，细胞1∶5传代，在含有G418(1mg/ml)的DMEM培养液中选择培养，直到出现抗性克隆。

4、细胞基因组DNA提取和外源基因整合鉴定：病毒包装细胞经500g离心后，使用细胞基因组DNA提取试剂盒，分别提取转有pLXIN空载体、正义和反义LHX4基因的PA317-pLXIN空载体、PA317-正义LHX4和PA317-反义LHX4的基因组DNA，适当TE溶解后，紫外分光光度计A260定量。取适量细胞基因组DNA作为模板，分别使用neo基因引物(P1见序列表中序列10，P2见序列表中序列11，扩增片段为433bp)和正义、反义LHX4基因引物进行PCR扩增(98℃预变性5min，94℃ 60s，56℃ 50s，72℃ 60s，30个循环后72℃延伸10min)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，以鉴定病毒包装细胞中是否有外源基因的整合。

5、PC12嗜铬细胞瘤细胞体外培养(Greene LA and Tischler AS.Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytomacells which respond to nerve growth factor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1976，73：2424-2428)：PC12细胞培养于5％胎牛血清、10％马血清、85％RPMI 1640培养液中(2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，4.5g/L葡萄糖，10mMHEPES，1.0mM丙酮酸钠)，37℃5％CO₂。

6、包装细胞病毒上清感染PC12嗜铬细胞瘤靶细胞：分别将含有pLXIN空载体、正义和反义LHX4基因的包装细胞混合克隆病毒上清，在无菌条件下，经0.45μm滤膜过滤后分装1ml/管，-80℃保存备用。将PC12靶细胞培养至对数期，按3×10⁵接种于35mm培养皿，培养24hrs后，用无血清、无双抗DMEM培养液洗细胞两次后，分别加入已过滤的混合克隆包装细胞上清1ml，37℃培养3hrs，其间每隔30min轻摇1次，之后补加1ml含双倍血清的DMEM培养液，常规培养，上述感染重复3次后，细胞按1∶5传代至含有G418(1mg/ml)的DMEM培养液中选择培养，直到出现抗性克隆。

7、细胞总RNA提取和外源基因表达的RT-PCR检测：取对数生长期的细胞(1×10⁶)，使用TRIZOL试剂分别提取导入pLXIN空载体、正义和反义LHX4基因的PC12靶细胞总RNA，使用AMV逆转录系统，分别将2μg细胞总RNA进行逆转录，合成的cDNA。取2μl合成的cDNA作为模板，PCR上、下游引物0.5μl(50pmol)、4×dNTP(400μmol)、TaKaRa Ex Taq^TM酶0.5U，扩增条件为94℃预变性3min后，按94℃ 40s，60℃ 30s，72℃ 30s进行33个循环，72℃延伸10min。LHX4基因PCR引物，P1：见序列表中序列2；P2：见序列表中序列3；LHX4基因扩增片段长度为：512bp。三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)作为内参照，PCR引物，P1见序列表中序列12，P2见序列表中序列13；扩增片段长度为：309bp。

8、细胞生长曲线测定：对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，吹打至单细胞悬液，计数后，细胞接种于96孔板中，(1.0×10⁴细胞/孔)，共种植五块板，采用MTT法，分别于0，48，96，120，144h时间点检测细胞增殖，每个时间点样本和空白各设8孔。检测前于待测标本中每孔加MTT 20μl，放入培养箱继续培养2小时后取出，小心吸去培养液，每孔加入DMSO 100μl，微量摇匀器摇匀5min，采用EL311SX型酶联免疫检测仪于595nm处检测光吸收值，绘制细胞生长曲线。

9、PC12嗜铬细胞瘤细胞诱导为神经元的方法：正常培养的PC12细胞，接种到35mm培养皿中，PC12细胞常规培养体系中加入NGF(25ng/ml)，37℃5％CO₂培养诱导，倒置显微镜下观察、计数，图象分析仪检测突起长度，所有数据以X±s表示，采用SAS软件进行单因素多水平设计方差分析。

二、结果

1、正、反义LHX4基因逆转录病毒载体构建

根据LHX4基因CDS限制性内切酶位点分析结果和逆转录病毒载体pLXIN的多克隆位点，设计含有BamH I和Hpa I酶切位点的LHX4基因CDS的正义、反义PCR扩增引物，以含有LHX4全长基因CDS的SC712质粒为模板，PCR扩增获取LHX4基因的CDS片段约1200bp。使用BamH I和HpaI分别双酶切上述获得的正义、反义LHX4基因CDS PCR扩增产物后，分别将其插入pLXIN逆转录病毒载体中，转化受体菌后，挑取阳性克隆，快速提取质粒DNA，经单、双酶切和PCR扩增鉴定，构建pLXIN-正义LHX4和pLXIN-反义LHX4逆转录病毒载体(图3，4)。

2、正、反义LHX4基因重组逆转录病毒的包装、受体细胞的感染和筛选

在DOTAP转染试剂介导下，将重组质粒pLXIN-正义LHX4、pLXIN-反义LHX4和pLXIN空载体分别导入PA317细胞中，经G418筛选两周后，出现G418抗性克隆。待各皿克隆长大后，分别收集PA317细胞包装的正、反义LHX4和pLXIN空载体混合克隆的病毒上清，经0.45μm微孔滤膜过滤后，感染靶细胞PC12，用G418筛选出阳性克隆。

3、外源基因片段在靶细胞中整合的PCR鉴定

使用针对载体上的neo基因和插入的正、反义LHX4基因CDS而设计的PCR引物，从阳性克隆细胞的基因组DNA中，分别扩增出neo基因的433bp和正、反义LHX4CDS片段约1200bp(图5)。电泳结果证实，外源基因片段已经整合到经G418选择的抗性克隆PC12靶细胞的基因组DNA中，而无外源基因病毒感染的对照组PC12细胞的PCR鉴定为阴性。

4、RT-PCR方法检测感染后PC12阳性细胞mRNA中LHX4基因表达

分别从转染pLXIN-正义LHX4、pLXIN-反义LHX4和pLXIN空载体后挑选出的阳性克隆细胞中提取细胞总RNA，再以此RNA为模板，反转录出相应的cDNA，又以转录出的cDNA为模板，用鉴定组织中LHX4基因表达的LHX4PCR引物进行PCR扩增，扩增出512bp的LHX4基因片段(图6)。结果显示，转染pLXIN-正义LHX4的PC12细胞中已转录表达出高水平的LHX4基因，较空载体转染组表达增强32.7％，而转染pLXIN-反义LHX4的PC12细胞中LHX4基因的转录较空载体转染组被封闭约28.3％。

5、正义、反义LHX4基因转染对PC12嗜铬细胞瘤细胞体外增殖的影响

采用MTT法，测定转基因后各组细胞增殖状态的变化。如图7所示，与转导空载体pLXIN的对照组PC12细胞相比，转染pLXIN-正义LHX4的PC12阳性克隆细胞的增殖受到一定程度的抑制，相反，转染pLXIN-反义LHX4的PC12细胞的增殖状况却有明显的增强。

6、正、反义LHX4基因转染对PC12细胞神经诱导后轴突生长的影响

采用经典方法(Biocca S et al.A macromolecular structure favouringmicrotubule assembly in NGF-differentiated pheochromocytoma cells(PC12).EMBO J.1983，2：643-648)，分别对正、反义LHX4基因转染的PC12嗜铬细胞瘤细胞和空载体转染的PC12细胞进行神经诱导，在相同的诱导时间和条件下，比较上述不同转染组细胞经NGF诱导后的细胞形态和轴突生长状态。结果显示，NGF诱导9天时，转染空载体的PC12细胞，有少数细胞有轴突生长；而转染正义LHX4的PC12细胞中长出突起的细胞数量明显增多，而转染反义LHX4的PC12细胞经NGF诱导后，长出突起的细胞数较少，且细胞大多聚集在一起形成细胞团，贴壁性明显减弱，细胞团中心的细胞脱落形成环状(图8)。统计学分析各组NGF诱导后长出突起的细胞计数表明，三个转染组之间存在明显差异(表1)。同时观察NGF诱导后的细胞突起生长状态时发现，转染正义LHX4的PC12细胞经诱导后细胞长出的突起长度最长，与空载体转染组及反义LHX4转染组之间均存在明显差异，而诱导后细胞突起长度在空载体转染组和反义LHX4转染组之间并无显著性差异(表2)。

表1：不同转染组细胞NGF诱导后有突起细胞计数

不同转染组	随机视野(N)	有突起细胞数(x±s)
			空载体正义LHX4反义LHX4	555	13.4+1.1423.0±3.54**/++8.4±1.95**

^**：与空载体比较，p＜0.01；⁺⁺：与反义LHX4比较，p＜0.01

表2：不同转染组细胞NGF诱导后的神经元突起生长

不同转染组	突起测量个数(N)	突起平均长度μm(x±s)
			空载体正义LHX4反义LHX4	161616	86.8±53.8150.9±36.5**/++70.7±19.2

                         序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120>人同源盒基因LHX4在制备嗜铬细胞瘤治疗药物中的应用

<130>

<160>13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2021

<212>DNA

<213>

<400>1

gacgtcgcat gctcccggcc gccatggcgg ccgcgggaat tcgattggtg gcgacgactc    60

ctggagcccg tcagtatcgg cggaattcgc ggccgcgtcg accggagagc gagatcaaag    120

ggattggaaa cagactgggg actggcgggg ggagggggcc ggccagcctg tggagtcctc    180

cctgagaagc ggagggcccg gcttccaccg tgactccagc ggcctgcttg gggttttaat    240

tattattttg aaatttctga atcgagctag agcgagagag cgagagatct ccgtagactg    300

cgactcgctg gctttcgctc cgagatgatg cagagtgcga ctgtccccgc ggaaggggct    360

gtcaaggggc tcccggagat gctaggtgtg ccgatgcaac agattcccca gtgcgctggc    420

tgcaaccagc acatcctgga caagttcatc ctgaaggtcc tggacagaca ctggcacagc    480

tcctgcctca agtgtgcaga ctgccagatg cagctggcgg acaggtgctt ctccagggct    540

gggagcgtct actgcaagga ggacttcttc aagcgcttcg gcacaaaatg cacggcctgc    600

cagcagggta tccccccaac ccaggtggtc cgcaaggccc aggactttgt ctaccacctg    660

cactgctttg cttgcatcat ctgcaaccgg cagctggcca cgggggacga attctacctc    720

atggaggacg ggcggctggt gtgcaaggaa gactacgaga cagccaagca gaacgatgac    780

tcagaggctg gagctaagcg gccccggacc accatcacag ccaagcagct ggagacatta    840

aagaatgcat acaagaactc ccccaagcct gcccggcacg tgagggagca gctgtcctca    900

gagacaggcc tggacatgag ggtcgtacag gtttggtttc agaacagaag ggccaaagag    960

aaacgcctga agaaggatgc agggcggcac cgctgggggc agttctataa gagcgtcaag    1020

aggagccggg gcagcagcaa gcaggagaag gagagctctg cagaggactg tggggttagt    1080

gacagtgagc tgagcttccg agaggatcaa attctctcag aacttggcca caccaatagg    1140

atttatggca acgtggggga cgttacaggc ggacagttaa tgaatgggag cttctccatg    1200

gacgggacag gacaatccta tcaggacttg agggatggga gcccctatgg aatcccccag    1260

tctccatcct ccatatcgtc cctgccatcc cacgctcctt tgctcaatgg gctggattac    1320

acggtggaca gtaatttggg catcattgcg catgcagggc agggagtaag ccagacgctg    1380

agagccatgg ctgggggacc cacctctgac atctccacag gaagcagtgt aggctatccc    1440

gactttccaa ctagcccagg ctcttggctc gatgaaatgg atcatcctcc tttttaaact    1500

tctctcctcc ccaccctacc tgcccccctg gcttgagaga atatcttcaa ggatcaaaag    1560

agacttgcct tttaaggatc gaaagtacgc caatgtgaat ttccattatt ttcaatggaa    1620

gtcctccgct gattcctaga aggctgtgag accacactag ggcattgttt ccctggggaa    1680

gcagtgggag agcagactca tctcagaaca cagcacaggg ggtaatggcc tagagctcta    1740

gggacactgg cttgttgggt ctctcccctg ctgttctgct taggggcttg gctgctcagt    1800

gctttggtag cacaaggtga ctgtgatagg cccccttggc ctttgggaac tttgctccaa    1860

ctggtgtgtc tcacacaatg cctcgtcgac gcggccgcga attccagctg agcgccggtc    1920

gctaccatta ccagttggtc tggtgtcaaa atcactagtg aattcgcggc cgcctgcagg    1980

tcgaccatat gggagagctc ccaacgcgtt ggatgcatag c                        2021

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>2

gccatcgctg gggccagttc                                                20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>

<400>3

ctaaaaagga ggatggtcc                                                 19

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>

<400>4

atgatgcaga gtgcgactgt c                                              21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>5

gtttaaaaag gaggatgatc                                                20

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>

<400>6

aattcgttaa catgaacatg atgcagagtg cgact                               35

<210>7

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<212>DNA

<213>

<400>7

cgcggatcca aaaggaggat gatccat                                        27

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>

<400>8

cgcggatcca tgatgcagag tgcgact                                        27

<210>9

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<212>DNA

<213>

<400>9

ttcgttaact taaaaaggag gatgatccat                                     30

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>

<400>10

tccatcatgg ctgatgcaat gcggc                                          25

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>

<400>11

gatagaaggc gatgcgctgc gaatcg                                         26

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>12

tccctcaaga ttgtcagcaa                                                20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>13

agatccacaa cggatacatt                                                20

Claims (3)

1.人同源盒基因LHX4在制备嗜铬细胞瘤治疗药物中的应用，其特征在于所述人同源盒基因LHX4的核苷酸序列是序列1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于LHX4基因能抑制嗜铬细胞瘤细胞体外增殖，促进嗜铬细胞瘤细胞向神经元分化和轴突生长。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所说的药物为基因治疗药物。

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