CN1055968C - 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因及含该基因的新实体 - Google Patents

Abstract

克隆出CD基因，经酶活性分析筛选到高表达活性克隆。将CD基因、嵌合CD基因、同时将CD基因和HSV-TK基因组装入逆转录病毒或腺病毒载体，得到重组表达载体。以包有上述不同重组表达载体的感染性“假型”逆转录病毒、腺病毒或能产生“假型”逆转录病毒的“包装细胞”与5-PC用于癌症治疗，达到杀灭癌细胞或抑制其生长目的。

Description

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因及含该基因的新实体

本发明涉及分子生物学的基因治疗领域，具体地说是涉及克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD，cytosine deaminase，E.C.3.5.4.1)基因，通过酶活性分析筛选得高表达活性克隆，含CD基因及含嵌合CD基因真核重组表达载体的构建。此类真核重组表达载体用以产生“假型”病毒及该类“假型”病毒用作恶性肿瘤基因治疗的用途。

目前，肿瘤的传统疗法是手术、放疗和化疗联合使用，对提高肿瘤疗效取得了一定的进展，但对于多数肿瘤如肝癌、脑瘤、肺癌等其治疗效果不尽人意，故临床上对新疗法的出现有迫切需求。肿瘤治疗中的新一代疗法，生物治疗中的基因治疗具有现有疗法不具备的优点，如更好的选择性、多重目的性等。因此，恶性肿瘤基因治疗将会成为现有疗法的一种补充，并成为综合疗法的一员。因此，各国生命科学工作者都竞相展开了有关肿瘤基因治疗的研究工作，其中胞嘧啶脱氨酶基因用于基因治疗就是其中的研究方向之一。

依据一种对人体无毒或极低毒性的药物前体经相关酶代谢后生成对细胞具有代谢毒性的产物事实，为肿瘤基因治疗提出了病毒介导的酶—药物前体治疗方案。胞嘧啶脱氨酶具有催化胞嘧啶脱氨形成脲嘧啶的功能。哺乳类生物细胞一般不产生这种酶，而许多真菌、细菌类细胞能够生成该酶。细胞内表达CD基因的微生物将5-氟胞嘧啶(5-FC，5-fluorocytosine)代谢成为对细胞具有杀灭毒性的产物5-氟脲嘧啶(5-FU，5-fluorouracil)。现已知大肠杆菌编码的CD是以同一单体的多聚体形式行使其功能的。该酶的全酶分子量为210,000道尔顿；单体多肽分子量为58,000道尔顿；在pH7-9范围内，于40℃情况下可保持活性数月。1992年Craig A.Mullen等报道了5-FC对有CD基因导入的真核哺乳类细胞杀伤性研究(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，33～37，1992)。1993年Elizabeth A.Austin和Brian E.Hubcr报道了大肠杆菌CD基因的DNA序列(Molecular Pharmacology 43，380～387，1993)。同年Brian E.Huber等报道了5-FC对活体外和活体内有CD基因导入的人结肠癌细胞杀伤性研究数据，其结果表明CD基因可望于恶性肿瘤基因治疗上取得疗效(Cancer Research，53，4619～4626，1993；Gene Therapy for Neoplastic Disease，716，104～114，1994)。

本发明目的是利用标准的分子生物学方法克隆、筛选出高表达活性的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因，构建含CD基因及含嵌合CD基因的真核重组表达载体。将上述真核重组表达载体转导入包装细胞，以产生可应用于恶性肿瘤基因治疗的“假型”病毒用作基因治疗用途。

本发明主要包括四个方面，它们分别为：提供了一种具有高表达活性的胞嘧啶脱氨酶基因；提供了含CD基因及嵌合CD基因的真核重组表达载体；提供了包有含CD基因，嵌合CD基因真核重组表达载体的感染性“假型”病毒；“假型”病毒与药物前体同时用作恶性肿瘤基因治疗的用途。

本发明第一方面是提供了一种具有高表达活性的胞嘧啶脱氨酶基因，其在原核细胞(大肠杆菌细胞)中的表达活性明显高于已报道的CD基因(Elizabeth A.Austin和Brian E.Huber Molecular Pharmacology，43，380～387，1993)。本发明按相关文献所报道的CD基因DNA序列(Craig A.Mullen等Proc.Natl.Acad.SCi.USA，89，33～37，1992；Elizabeth A.Austin等，Molecular Pharmaclogy，43，380～387，1993)，设计了两对引物。引物设计时，考虑到“GTG”为弱起始密码子，“ATG”为强起始密码子，故将起始密码子“GTG”人为地突变为“ATG”，DNA序列分析证实了这一结果。

第一对引物为P_I和P_III组成，P_I(引物I)：^5′AAAAGAATTCTGGTTACCGGGAATTGTTCCGGTCAACGCGGTATTAGG^3′；P_III(引物III)：^5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTCAACCTTTCTAATCCAT^3′。第二对引物为P_II和P_III组成，P_II(引物II)：^5′TCACCCCAATTCAGGCTAGCAATGTCG^3′；P_III(引物III)：^5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTCAACGTTTGTAATCGAT^3′。

第一对引物用来克隆带启动区域的CD基因，第二对引物用来克隆CD基因的阅读框架且将起始密码子“GTG”突变为“ATG”。基因克隆以标准分子生物学方法进行，以大肠杆菌株H-30的基因组DNA为模板；通过PCR方法克隆出CD基因。为筛选高表达活性CD基因，先构建重组克隆载体pUC18-CD，获得重组克隆载体pUC18-CD后，组建原核重组表达载体pBV220-CD，组建过程见图1。DH5α[pBV220-CD]已于1995年6月5日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M95031。将含有原核重组表达载体pBV220-CD的单克隆菌落接种于LB+Amp(含氨苄青霉素的一种大肠杆菌培养基)培养基中培养，使CD基因在大肠杆菌中表达，测定CD活性，筛选得高表达活性克隆。

对CD进行活性分析之前，进行了CD单体多肽的SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，这样从单体多肽的分子量大小及CD基因在大肠杆菌中表达状态水平上鉴定了CD基因的表达情况。电泳结果见图2，其表明，表达的单体多肽分子量大小为58.0kD左右与预期结果一致，相关阴性对照组未见有单体多肽的蛋白条带，这亦表明出现的表达蛋白条带是CD基因的表达产物，即CD基因获得了表达。

从蛋白水平表明CD基因在大肠杆菌中已获得表达后，进行CD活性分析，以便筛选高表达活性克隆。CD活性分析参照文献(Elizabeth A.Auatin等，MolecularPharmacology 43，380～387.1993)中所采用的酶活性分析方法。通过Bradford法测定11个含原核重组表达载体pBV200-CD克隆，1个含原核表达空载体pBV220克隆，1个宿主菌(大肠杆菌)DH5α克隆的细胞抽提液蛋白量值。紫外分光光度法测定上述克隆的一定量细胞抽提液和胞嘧啶混合物在一定温度下于一定时内，285nm处吸光度变化情况。据实验所得数据，利用朗伯-比耳定律，经公式： $S.A.=\frac{\mathrm{\ΔA}}{P.Q.}\×48.17$

S.A.：胞嘧啶脱氨酶活性，单位为：以nmol为单位的脲嘧啶生成量/毫克细胞抽提蛋白/分钟

△A：吸光度的降低值

P.Q.：以毫克为单位的蛋白量值

计算出每个克隆CD活性，结果见表1。11个克隆中第1，2，6，7，9，10，11号克隆有活性，活性最高的克隆为11号克隆。

表2为已报道的(Elizabeth A.Austin和Brian E.Huber，MolecularPharmacolgy，43，380～387，1993)CD活性数据。比较表1、表2中CD活性，不难发现，我们所克隆到的CD基因的表达活性，尤其是第11号克隆表达活性明显高于已报道的CD基因的表达活性。

本发明的克隆、筛选高表达活性CD基因方法是以达到优化筛选表达活性基因的目的。本方法可描述为以下步骤：用已知的标准PCR法克隆出CD基因→构建原核重组表达载体pBV220-CD，并使CD基因在原核细胞(大肠杆菌)中获得表达→测定不同克隆的酶活性，筛选得到高活性克隆第11号克隆→对第11号克隆进行DNA序列分析，得本发明克隆的CD基因DNA核苷酸序列。

经上述克隆、筛选方法得到高表达活性克隆，如上述的第11号克隆后，对该克隆进行DNA序列分析。DNA序列分析采取标准的分子生物学方法进行，DNA序列分析结果见图3。本发明克隆到的高表达活性CD基因DNA序列与已报道的CD基因相比较，存在16个位点碱基改变，引起肽链中氨基酸改变的位点有5个，结果见表3。这些碱基位点的改变来自不同种源的CD基因多态性及PCR法克隆CD基因过程中引起的碱基变化。这样本发明提供了高表达活性的CD基因及其整个阅读框架的1284个碱基序列。

本发明的克隆、筛选高表达活性CD基因方法适用于全部以大肠杆菌基因组DNA为模板，克隆具有表达活性的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因，而且所克隆出的CD基因DNA序列与本发明所提供的CD基因DNA序列同源率不小于50％。

本发明的第二个方面是提供了含CD基因的真核重组表达载体，具体包括逆转录病毒和腺病毒两类重组表达载体。重组表达载体的构建过程采用已知的标准DNA重组技术。以逆转录病毒载体pLXSN，腺病毒载体pAdE1CMV为例说明组建含CD基因的真核重组表达载体。将CD基因组装入逆转录病毒载体pLXSN的5′LTR中相关转录调控元件下游，得重组体pLCDSN，构建过程见图4；CD基因组装入腺病毒载体pAdE1CMV的CMV启动子下游，得重组体pAdE1CMV-CD，构建过程见图5。XL1-Blue[pAdE1CMV-CD]已于1996年11月25日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 96021。

获得上述真核重组表达载体基础上，构建嵌合CD基因的真核重组表达载体。具体说明，以下列实例加以阐述。

为了使CD基因在用作恶性肿瘤基因治疗用途上起到更好的治疗效果，本发明构建肿瘤组织特异性表达的嵌合CD基因。即利用肿瘤组织特异的转录调控元件(如增强子)和转录启始元件(如启动子)，构建CD基因的嵌合体。增强子包括，肝细胞癌特异表达的AFP(甲胎蛋白)增强子，肺癌特异表达的SLPI(分泌性白细胞蛋白酶抑制物)增强子，结肠癌等特异表达的CEA(癌胚抗原)增强子等；启动子包括，肝细胞癌特异表达的AFP(甲胎蛋白)启动子，肝癌相关癌基因启动子，如IGF-I，IGF-II基因的启动子等。肿瘤细胞特异性表达的嵌合基因真核重组表达载体中，基因的表达调控是受肿瘤组织特异的相关增强子和启动子调控的，而非利用真核表达空载体上原有的转录元件，为达到此目的，采取两种措施。其一为，对腺病毒空载体pAdE1CMV，使CMV启动子从载体上缺失；其二为，对逆转录病毒空载体pLXSN，将嵌合基因“反装”在3′LTR上游处。嵌合CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLNAFP-CD构建过程见图6，采用已知的标准DNA重组技术。XL1-Blue[pLNAFP-CD]已于1996年11月25日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 96022。

在构建嵌合CD基因的同时，我们构建了同时含HSV-TK基因和CD基因的重组逆转录病毒载体pLTK-IRES-CDSN，构建过程见图7，采用已知的标准DNA重组技术。XL1-Blue[pLTK-IRES-CDSN]已于1996年11月25日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 96023。

将上述组建好的含有CD基因，嵌合CD基因或同时含CD基因和TK基因的真核重组表达载体转导入相关的包装细胞中，产生内部含有真核重组表达载体的“假型”病毒。以这些“假型”病毒或相关“包装细胞”用作癌症治疗用途，这是本发明的第三个方面。具体地讲，本发明的第三个方面是提供含CD基因用于癌症治疗的新实体。含CD基因的新实体，在本发明中专指内部包有CD基因、嵌合CD基因或同时含CD基因和TK基因的真核重组表达载体的感染性“假型”逆转录病毒、腺病毒或能产生感染性“假型”逆转录病毒的″包装细胞″。将上述构建好的真核重组表达载体以磷酸钙共沉淀或相关基因转导技术转导入相应的包装细胞中。具体地讲，对逆转录病毒重组表达载体来说，是将其转导入包装细胞PA317中；用相应的抗代谢药物(本发明使用的是G418[新霉素的一种类似物])来筛选转导有逆转录病毒重组表达载体的“包装细胞”PA317(pLCDSN)阳性克隆，包装细胞PA317(pLCDSN)已于1995年6月5日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C95016；对腺病毒重组表达载体来讲，是将其转导入包装细胞293中，用挑选“噬斑”的方法得含有目的基因重组“假型”腺病毒，并用该类腺病毒感染“293”细胞，以产生大量内部含有目的基因的“假型”腺病毒用于恶性肿瘤基因治疗用途。

用于恶性肿瘤基因治疗用途的“假型”逆转录病毒，腺病毒或能产生“假型”逆转录病毒的“包装细胞PA317”应用于医疗时，“假型”逆转录病毒携带前述逆转录病毒重组表达载体以感染的方式将目的基因整合入被感染细胞的染色体上，由于该类重组表达载体不仅缺失了包装成完整病毒的位点(ψ位点)，而且丢失了gag，pol和env基因，这样使得该类“假型”病毒仅具有一次性感染能力，使产生野生型病毒的可能性降低到极低的限度。“假型”腺病毒携带“目的”基因以感染的方式将其转导入被感染细胞中，“目的”基因是以独立于染色体之外的方式进行表达而行使其功能。

对有CD基因表达的细胞(包括原核和真核细胞)，5-氟胞嘧啶对该类细胞能产生“诱导性”杀灭毒性；而对无CD基因表达的细胞，5-氟胞嘧啶对细胞则不能产生“诱导性”杀灭毒性。具体地讲，对有CD基因表达的“包装细胞PA317(pLCDSN)”(Northern分析有CD基因表达，见图8)，大肠肝菌DH5a(CD活性分析显示，该类细胞有CD基因表达)在5-氟胞嘧啶存在下，这些细胞被杀灭。例如5-氟胞嘧啶对有CD基因表达的大肠杆菌DH5α“诱导”杀伤表型情况总结于表5。

用本发明产生的内部含有逆转录病毒重组表达载体的“假型”病毒感染真核细胞，随后给予5-氟胞嘧啶，对被感染的真核细胞亦产生杀灭毒性，具体地讲，用“包装细胞”PA317产生的“假型”病毒(即用培养“包装细胞”PA317的培液上清，其中含有“假型”病毒)感染NIH/3T3，肝癌细胞7721等细胞系，对被感染的细胞给予不同剂量的5-氟胞嘧啶，观察到杀伤性表型。杀伤性数据统计于表4。

由表4的5-FC对不同细胞的“诱导”杀伤作用数据，可以得出如下的结论。对有CD基因导入的真核细胞，5-FC具有显著的“诱导”杀伤作用，克隆分析结果显示无克隆存活。对没有CD基因导入的真核细胞，5-FC对细胞不存在“诱导”杀伤作用。

含CD基因的新实体与药物前体同时用作恶性肿瘤基因治疗的用途是本发明的第四个方面，例如，前述的“假型”逆转录病毒和“假型”腺病毒与药物前体5-氟胞嘧啶同时用于被医治恶性肿瘤患者，给药途径的具体临床实例视具体情况选择静脉注射或实体瘤定位注射中的一种。又例如产生“假型”逆转录病毒的“包装细胞PA317”与药物前体5-氟胞嘧啶联合使用时，采取的给药剂型为：对实体肿瘤定位注射能产生“假型”逆转录病毒的“包装细胞PA317”，数天后再给被医治患者使用药物前体5-氟胞嘧啶，药物前体给药途径视具体情况选择静脉注射或实体瘤定位注射中的一种。药物前体剂量范围为每天每千克患者体重0.2至27毫克。

本发明优点：本发明首次克隆出具有高表达活性的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因。酶活性分析结果显示本发明所克隆的CD基因的表达活性明显高于已报道的CD基因的表达活性。本发明又提供了含CD基因或嵌合CD基因的真核重组表达载体的感染性“假型”逆转录病毒、腺病毒或能产生感染性“假型”逆转录病毒的“包装细胞”的新实体，与药物前体5-氟胞嘧啶同时用作恶性肿瘤基因治疗的用途。含CD基因的“假型”病毒感染真核细胞后，在药物前体5-FC存在情况下，对真核细胞产生显著的杀灭毒性。又构建了对肿瘤组织有特异性表达的嵌合CD基因。又将CD基因与HSV-′TK基因同时构建成重组逆转录病毒载体，这样于肿瘤细胞同时表达两种外源基因，提高了目的基因在医疗上的治疗效果，起到了单一“假型”病毒一次性给药而行使联合治疗的效果。表1.pBV220-CD重组表达载体所表达的CD活性^[a]

含有不同质粒

   的克隆                         CD活性^[b]

缓冲溶液A^[c]                       0

缓冲溶液B^[d]                       0

DH5α

pBV220pBV220-CD[克隆1]                       28,805pBV220-CD[克隆2]                       23,218pBV220-CD[克隆3]                       0pBV220-CD[克隆4]                       0pBV220-CD[克隆6]                       27,492pBV220-CD[克隆7]                        1,345pBV220-CD[克隆8]                       0pBV220-CD[克隆9]                          352pBV220-CD[克隆10]                      33,127pBV220-CD[克隆11]                      36,028pBV220-CD[克隆12]                      0注：[a]利用脲嘧啶对胞嘧啶在285nm处摩尔消光系数差值：1.038×10³M^-1cm^-1计算胞嘧啶脱氨酶活性，所示数字为三次平行实验的平均值。[b]  CD活性单位为：生成的脲嘧啶nmol数/mg细胞抽提蛋白/min。[c]  缓冲溶液A含有细胞抽提液，不含底物。[d]  缓冲溶液B含有底物，不含细胞抽提液。

表2  已报道的CD活性数据

克隆	CD活性[a]
		pEA001	1,890
pEA002	3,919
		pFA003	2,043
pEA004	0
		pEA005	0
pEA006	17,407
		pEA007	0
pEA009	16
		pEA010	0
pEA013	8
		pEA014	0

注：[a].CD活性单位为：生成的脲嘧啶nmol数/mg细胞抽提蛋白/min。表3  H-30-CD-11基因DNA及其氨基酸序列与Brian E.Huber

          所报导的CD基因相异位点比较CD基因             报导的           改变的          改变的位点^[a]            碱基             碱基          氨基酸^[b]49                   G                A            Glu→Lys183                  A                G315                  A                C456                  C                T707                  A                G            His→Arg1074                 C                T1076                 C                G            Ala→Gly1077                 A                C1080                 G                A1083                 G                A1104                 C                T1121                 G                T            Ser→Ile1124                 C                T            Ala→Val1125                 C                A1155                 G                A1221                 C                T[a]  第一号碱基为起始密码子的第一位碱基。[b]  ‘→’意为CD肽链中氨基酸变化。

                           表4  5-FC对不同细胞的“诱导”杀伤作用^[a、c]

给药类型细胞类型	(-)[d]	G418[b]	5-FC(63mg/ml)	5-FC+G418(63mg/ml)	5-FC(126mg/ml)	5-FC+G418(126mg/ml)
							“PA317”[pLCDSN]	30	20	0	0	0	0
“PA317”[pLXSN]	29	20	24	25	28	26
							PA317	37	0	21	0	17	0
“NIH/3T3”[pLCDSN]	79	76	0	0	/	/
							“NIH/3T3”[pLXSD]	134	137	120	128	/	/
NIH/3T3	124	0	117	0	/	/

注：[a]本表提供的是克隆分析数据。进行克隆分析时，含有10个及10个以上的细胞群落计数为1只克隆。

[b]本实验中所用的G418浓度为1毫克/毫升。

[c]所示实验数据为三次平行实验的平均值。

[d]“(-)”，意为细胞培养液中不含有G418或/和5-FC。

表5.pBV220-CD重组表达载体所表达的CD活性及5-FC对相应克隆“诱导”杀伤表型^[a]

含有不同质粒的克隆	CD活性[b]	杀伤表型[c]
			缓冲溶液A[c]	0	△
缓冲溶液B[d]	0	△
			DH5α	0	208
pBV220	0	210
			pBV220-CD[克隆1]	28,805	△
pBV220-CD[克隆2]	23,218	△
			pBV220-CD[克隆3]	0	174
pBV220-CD[克隆4]	0	168
			pBV220-CD[克隆6]	27,492	2
pBV220-CD[克隆7]	1,345	1
			pBV220-CD[克隆8]	0	204
pBV220-CD[克隆9]	352	5
			pBV220-CD[克隆10]	33,127	△
pBV220-CD[克隆11]	36,028	△
			pBV220-CD[克隆12]	0	217

注：[a]利用脲嘧啶对胞嘧啶在285nm处摩尔消光系数差值：1.038×10³M^-1cm^-1计算胞嘧啶脱氨酶活性，所示数字为三次平行实验的平均值。

[b]CD活性单位为：生成的脲嘧啶nmol数/mg细胞抽提蛋白/min。

[c]缓冲溶液A含有细胞抽提液，不含底物。

[d]缓冲溶液B含有底物，不含细胞抽提液。

[e]“△”意为无克隆生成，该栏中所示数据为氨卞青霉素和5-FC阳性的琼脂平板上所长出的克隆数。

附图说明：

图1.重组载体pBV220-CD的构建。

图2.SDS-PAGE分析含有不同质粒的DH5α克隆细胞抽提液

1.蛋白分子量标记，2.不含质粒的克隆，3.含pBV220的克隆，4-14.分别为含重组质粒pBV220-CD的克隆12，11，10，9，8，7，6，4，3，2，1。″→″示意所表达的单体多肽位置。

图3.CD基因DNA及氨基酸序列。每组别的第四行为基因文库中CD基因的碱基序列，第一行为本发明所克隆的CD基因碱基序列，相同的碱基以″·″替代，第三行为基因文库中CD基因的氨基酸序列，第二行为本发明所克隆的CD基因的氨基酸序列，相同的氨基酸以″·″替代。

图4.逆转录病毒重组表达载体pLCDSN的构建。

图5.腺病毒重组表达载体pAdE1CMV-CD的构建。

图6.嵌合CD基因逆转录病毒重组表达载体pLNAFP-CD的构建。

图7.同时含HSV-TK基因和CD基因的重组逆转录病毒载体pLTK-IRES-CDSN的构建。

图8.Northern杂交结果显示CD基因在mRNA水平于PA317细胞中有转录，[A]图为电泳结果，[B]图为杂交结果。1、2、3泳道分别代表“PA317[pLCDSN]”(PA317阳性克隆)，含空载体PA317(PA317[pLXSN])，没有转导pLXSN和/或pLCDSN的PA317细胞。″→″示意杂交信号。

图9.琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果显示两次PCR所扩增出的DNA片段与预期结果相一致。第1泳道为第一次PCR产物，第2泳道为X174/HaeIII DNA大小标记，第3泳道为第二次PCR产物。

图10.琼脂糖凝胶电泳分析EcoRI和BamHI双酶切重组克隆载体pUC18-CD，结果显示有插入DNA片段释放。第1，4泳道各别为DNA大小标记λHindIII和×174/HaeIII；第2，3泳道各别为重组克隆载体pUC18-CD₆，pUC18-CD₁₁经双酶切的产物。

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1 PCR方法克隆CD基因

设计了如下的两对引物：

第一对引物为P_I和P_III组成，P_I(引物I)：^5′AAAA GAATTCTGGTTACCGGGAATTGTTCCGGTCAACGCGGTATTAGG^3′；

P_III(引物III)：^5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTCAACGTTTGTAATCGAT^3′。第二对引物为P_II和P_III组成，P_II(引物II)：^5′TGACGCGAATTCAGGCTAGCAATGTCG^3′；P_III(引物III)：^5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTCAACGTTTGTAATCGAT^3′。

第一次pCR以第一对引物(由P_I和P_III组成)及模板(大肠杆菌株H-30基因组DNA)扩增出带5′UAS的CD基因。

PCR反应混合物中各组份含量为：

双重去离子水                                  29.5微升

1OX缓冲液                                     10微升

四种dNTP混合物(每种                           16微升

浓度为1.25毫摩尔浓度)

引物I(100皮摩尔)                              2.5微升

引物III(100皮摩尔)                            2.5微升

模板DNA(大肠杆菌株H-30基因组DNA)(1微克)       39微升

TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Centus公司产品)     0.5微升

                                             (5单位/微升)

反应按如下程序进行：第1-5个循环条件为93℃(1分钟)，52℃(30秒)，72℃(2分钟)；第6-30个循环条件为93℃(1分钟)，52℃(1分钟)，72℃(2分钟)。

第二次PCR以第二对引物(由P_II和P_III组成)及模板(第一次PCR产物)扩增出CD基因阅读框架。

PCR反应混合物中各组份含量为：

双重去离子水                                   47.5微升

1OX缓冲液                                      10微升

四种dNTP混合物(每种浓度为1.25毫摩尔浓度)       16微升

引物II(100皮摩尔)                              2.5微升

引物III(100皮摩尔)                             2.5微升

模板DNA(第一次PCR产物)[4拉克]                  21微升

TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Centus公司产品)      0.5微升

                                              (5单位/微升)

反应按如下程序进行：第1-5个循环条件为93℃(1分钟)，42℃(1分钟)，72℃(2分钟)；第6-30个循环条件为93℃(1分钟)，56℃(30秒)，72℃(2分钟)。

两次PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，出现了预期的条带(见图9)。

实施例2.构建重组克隆载体pUC18-CD

第二次PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，将1.33Kb左右的DNA条带凝胶块割下，经″电洗脱法″分离、纯化出目的DNA片段。引物设计时，第二对引物的P_II上设计了EcoR I限制性内切酶位点，P_III上设计了BamH I限制性内切酶位点。因此纯化出的前述DNA片段和克隆载体pUC18分别经EcoR I和BamH I消化(EcoRI，BamHI为美国Stratagene公司产品)，内切酶消化的反应条件参照提供该酶的公司使用说明书提示的条件进行。

克隆载体pUC18经EcoRI和BamHI消化后，再经CIAP(小牛肠衣膜碱性磷酸酶)[CIAP购自Promega公司)处理，反应条件按照提供该酶的公司提示的反应条件进行。经上述处理的第二次PCR产物(DNA片段)及克隆载体pUC18分别经酚，氯仿等体积各抽提一次，再经等体积氯仿抽提一次。加入1/10倍体积的3N NaAC(pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇于-20℃情况下过夜沉淀出目的DNA片段及克隆载体pUC18。各以10μlTE溶液(由发明人工作室配制)溶解所得的沉淀，各取1ul经琼脂糖凝胶电泳监定出插入片段(第二次PCR产物，即CD基因)和克隆载体(pUC18)的质量数值。依据插入DNA片段与克隆载体的摩尔数之比为2∶1，插入DNA片段为50ng至100ng左右计算出所需克隆载体及插入DNA片段的体积。依前述沉淀核酸的方法共沉淀克隆载体及插入DNA片段于同一1.5ml离心管中。加入7微升双重去离子水溶解沉淀，再加入2微升5×连接酶缓冲液和1微升(T4连接酶)(1个单位/微升，连接酶由Boehringer-Mannheim公司提供)于16℃保温12小时。

按标准的分子生物方法制备工程菌XL1-Blue(由发明人工作室提供该菌株)的感受态细胞。以2ul上述连接反应混合物加到100ul感受态细胞中，按标准的分子生物学方法转化感受态大肠杆菌XL1-Blue。得到相应抗性的单克隆菌落后，挑选单克隆菌落于相应抗性培养基中于37℃振摇12小时后，以标准分子生物学方法抽提质粒。以连接反应时所用的相同内切酶EcoRI和BamHI消化所得的质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定出目的DNA条带出现，提示得到重组质粒pUC18-CD，即CD基因已组装入pUC18载体中(见图10)。

实施例3构建重组表达载体pBV220-CD

重组表达载体pBV220-CD构建过程基本与构建重组克隆载体pUC18-CD相同。不同之处仅为所使用的感受态大肠杆菌细胞为DH5α(DH5α由发明人工作室提供)，内切酶EcoRI和BamHI消化的对象为重组克隆载体pUC18-CD和原核表达空载体pBV220。连接反应时的插入DNA片段为重组克隆载体pUC18-CD经EcoRI和BamHI消化时所释放的CD基因DNA片段，纯化该DNA片段的方法为重组克隆载体pUC18-CD经EcoRI和BamHI消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离，将含目的DNA片段条带(1.33Kb左右)的凝胶割下。用″电洗脱纯化法″分离纯化出目的CD基因的DNA片段。

构建重组表达载体pBV220-CD时，选用了重组克隆载体pUC18-CD的第1，2，3，4，6，7，8，9，10，11，12号克隆提供插入片段，所得的重组表达载体pBV220-CD亦相应地为第1，2，3，4，6，7，8，9，10，11，12号克隆。我们将得到的11种重组表达载体pBV220-CD的克隆用于表达，筛选高表达活性克隆。

实施例4.CD基因在原核细胞(大肠杆菌DH5α)中表达及CD酶活性测定

将得到的11种含重组表达载体PBV220-CD的DH5α克隆用于表达。具体操作如下：首先从Amp抗性琼脂平板上挑选每种克隆的单包菌落接种于Amp抗性的LB培养基中，于30℃振摇培养12小时后，将培养物以1∶100倍释稀至Amp抗性的LB培养基中。30℃振摇培养5小时后，立即转入42℃水浴中振摇培养4.5小时。

收集细菌沉淀，将沉淀重悬于50mM Tris·HCl(pH7.3)中，超声粉碎细菌，离心去除残渣得上清液用于酶活性测定。

酶活性检测所设置的反应条件依据胞嘧啶经胞嘧啶脱氨酶催化脱氨形成脲嘧啶时，反应混合物吸光度在285nm处有所降低的事实进行的。CD活性分析所采取的反应条件如下：1ml分析混合物中Tris-HCl(pH7.3)为50mM，细胞裂解液2ul，胞嘧啶为0.5mM，37℃保温25分钟后终止反应。

每只克隆的蛋白量值通过Bradford法来测定，平行实验进行三次，取其平均值作为每只克隆的细胞抽提液蛋白量值。利用紫外分光光度计测量不同克隆的反应混合物于反应开始的○点与25分钟时吸光度降低值。平行实验进行三次，取其平均值作为每只克隆的反应混合物吸光度降低值。经公式， $S.A.=\frac{\mathrm{\ΔA}}{P.Q.}\×48.17$ (S.A.胞嘧啶脱氨酶活性，单位为以nmol为单位的胞嘧啶生成量/毫克细胞抽提蛋白/分钟；△A吸光度降低值；P.Q.以毫克为单位的蛋白量值)计算出每只克隆的CD活性，结果见表1。

实施例5.CD基因DNA序列分析

在测定CD活性基础上，选择了表达活性最高的克隆H-30-CD₁₁，组建了pBluescript SK(-)重组克隆及亚克隆。应用Sanger双脱氧末端终止法测定它的全基因DNA序列。CD基因DNA序列分析实施具体步骤如下：

1、CD基因pBluescript SK(-)重组克隆及亚克隆组建

将表达活性最高的克性H-30-CD₁₁的重组表达载体pBV220-CD和测序用载体SK(-)同时进行限制性内切酶EcoRI和BamHI的消化。如前述组建重组表达载体pBV220-CD步序类同，组建了用于测序的重组质粒SK/CD。与组建重组表达载体pBV220-CD步骤不同之处为，组建用于测序的重组质粒SK/CD时，转化反应所用的感受态细胞为工程菌XL1-Blue。

得重组克隆SK/CD基础上，组建亚克隆。亚克隆组建步骤如下：以内切酶EcoRI消化重组克隆SK/CD得线性DNA片段，然后以外切酶Ba131(购自Boehringcr-Mannheim公司)消化上述线性DNA片段。分别以不同时间段终止反应，得到三种不同长度的线性DNA片段，纯化并沉淀所得的DNA片段。使沉淀溶解后以DNA多聚酶I Klenow片段(购自Boehri-nger-Mannheim公司)及dNTP补平头后，再用内切酶BamHI消化上述所得到的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳分离内切酶消化产物，″电泳洗脱法″纯化出自完整的3′端至缺失的5′端的CD基因不同长度的部分DNA片段。它们的大小分别为1.0kb，0.75kb，0.55kb左右，命名为B、C、E片段。以限制性内切酶EcoRV和BamHI消化测序用载体SK，如同组建重组克隆SK/CD方法，组建得三种亚克隆SK/B，SK/C，SK/E。

2.CD基因DNA序列分析

组建好重组克隆SK/CD及亚克隆SK/B，SK/C，SK/E基础上。利用上述克隆的重组质粒双链DNA为测序反应的模板，用美国U.S.B.公司测序试剂盒，放射性同位素采用³⁵S标记的dATP，测序操作过程为先制备好聚丙烯酰胺凝胶电泳用凝胶，然后进行测序反应；最后进行电泳，放射自显影。具体详细步骤参照U.S.B.公司产品使用说明进行。

实施例6.CD基因的逆转录病毒重组表达载体构建

逆转录病毒空载体pLXSN和第11号原核重组表达载体pBV220-CD经内切酶EcoRI和BamHI消化，空载体pLXSN经CIAP处理，″电泳洗脱法″纯化、回收CD基因DNA片段的操作同实施例2。插入的CD基因DNA片段和载体pLXSN在T4 DNA连接酶作用下于16℃保温12小时，连接反应产物转化感受细胞的具体操作同实施例2。组建过程见图4。CD基因借助于5′LTR中相关调控元件进行转录、表达。

实施例7.CD基因的腺病毒重组表达载体构建

用于DNA序列分析的重组克隆SK/CD经内切酶BamHI消化后，再经DNA聚合酶IKlenow片段和dNTP补平头后，经内切酶HindIII消化。″电泳洗脱法″分离出CD基因DNA片段的操作同实施例2，经上述处理的CD基因DNA片段5′端为内切酶HindIII的粘性末端，3′端为补平的内切酶BamHI平端。

腺病毒载体pAdE1CMV经内切酶HindIII和HpaI消化，经CIAP处理的操作同实施例2。插入的CD基因DNA片段和载体pAdE1CMV在T4 DNA连接酶作用下于16℃保温12小时，连接反应产物转化感受态细胞的具体操作同实施例2。将CD基因组装入腺病毒载体pAdE1CMV的CMV启动子下游。构建了CD基因的腺病毒重组表达载体pAdE1CMV-CD。组建过程见图5。

实施例8 嵌合CD基因重组逆转录病毒表达载体pLNAFP-CD构建

不含抗性基因neo的重组逆转录病毒载体pLCD经BamHI消化。含抗性基因neo的重组质粒SK/neo经BamHI，HindIII消化后回收、纯化neo基因DNA片段。neo基因DNA片段和载体pLCD在T4 DNA连接酶作用下于16℃保温12小时的具体操作同实施例2。连接产物加上1个单位DNA多聚酶Klenow片段，dNTP终浓度为1mM，于37℃保温1小时补平头。补平头后再加入T4 DNA连接酶，于16℃保温12小时。经HindIII消化的连接产物及含粘性末端HindIII，XhoI AFP增加子/启动子，在T4 DNA连接酶存在时于16℃保温12小时。连接产物经DNA多聚酶Klenow片段补平头同前述。补平头产物在T4 DNA连接酶存在时，于16℃保温12小时，连接反应产物转化感受态细胞的具体操作同实施例2。组建过程见图6。CD基因借助于AFP的顺式调控元件进行转录、表达。

实施例9同时含CD基因和HSV-TK基因的重组逆转录病毒表达载体pLTK-IRES-CDSN构建

质粒pBluescript SK(-)经Xho I，BamH I消化后，与带粒性末端的Xho I，BamH I的IRES[内部核糖体结合位点]，在T4 DNA连接酶作用于16℃保温12小时。连接反应产物转化感受态细胞的具体操作同实施例2。得重组质粒SK/IRES后，重组质粒SK/IRES经Xho I，Xba I消化，回收、纯化带粒性末端Xho I，Xba I的IRES，IRES与带粒性末端Xba I、EcoR I适配子在T4 DNA连接作用下于16℃保温12小时。重组载体pLCDSN经EcoR I，BamH I双酶切，回收纯化CD基因。重组载体pLTKSN经BamH I消化后与CD基因及IRES和适配子的连接产物在T4 DNA连接酶作用下于16℃保温12小时。连接产物在DNA多聚酶Klenow片段作用下补平头同实施例8。补平头产物在T4 DNA连接酶作用下于16℃保温12小时，连接反应产物转化感受态细胞的具体操作同实施例2。组建过程见图7。CD基因和TK基因同时于同一载体获得表达。

实施例10 5-FC对有CD表达活性的原核细胞产生诱导杀灭毒性试验

将实施例3中测定CD活性时的大肠杆菌培养物以1∶10⁴倍稀释。取40微升稀释液与160微升LB(一种大肠杆菌培养基)混合后，将混合物涂于含5-FC的LB+Ampagar(氨卞抗性LB琼脂)平板上。30℃培养2小时，42℃培养4小时，紧接着37℃培养10小时，对照实验为5-FC阴性氨卞抗性LB琼脂平板，其它条件类同。另外设置有大肠杆菌内不含重组表达载体和仅含有空载体pBV220的对照组。

实验结果为5-FC对有CD活性的克隆产生诱导杀伤毒性，使得5-FC阳性的平板上几乎未见菌落出现，而5-FC阴性的平板与对照组，不含重组质粒的克隆和仅含空载体pBV220的克隆的平板上所出现的细菌克隆数相当。无CD活性的克隆的，其5-FC阳性的平板上所长出的克隆数几乎与5-FC阴性平板上相当。低活性克隆与高活性克隆相比较，其5-FC阳性平板上亦几乎未见有细菌克隆出现。不同克隆的酶活性及杀伤表型总结于表5。

实施例11 5-FC对有CD活性的真核细胞产生“诱导”杀灭毒性试验

本实试中培养细胞用的培养基成分为：在DEMEM(培养细胞用的一种商业化的基本培养基)基础上添加了体积比为10％的经热灭活的胎牛血清，2毫摩尔浓度谷氨酰胺，每毫升50单位浓度的青霉素，每毫升50微克浓度的链霉素。培养细胞条件为5％CO₂培养箱37℃培养，实施例6构建好的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN用标准的磷酸钙共沉淀方法转染包装细胞PA317(包装细胞PA317是一种商业化的用于包装“假型”逆转录病毒的经基因工程改造的NIH/3T3细胞，复制缺限性逆转录病毒基因组已稳定整合入该细胞染色体中。当带有逆转录病毒包装位点的逆转录病毒质粒载体转染入PA317中，其会行使“包装机”功能，包装出内部包含有所转导的逆转录病毒质粒载体的“假型”逆转录病毒)。

包装细胞经标准磷酸钙共沉淀转导入逆转录病毒重组表达载体pLCDSN 72小时后重新换细胞培养基，另外加G418(一种新毒素类似物抗生素，购自GIBCO公司)至浓度为1毫克/毫升，使细胞在该条件下选择性生长7天(其中每两天换一次培养基)，7天后挑选阳性克隆。

用阳性克隆的培养基上清中阳性克隆所产生的“假型”逆转录病毒感染NIH/3T3(一种小鼠成纤维细胞)细胞。实施步骤为在培养NIH/3T3细胞的培养基中加入“包装细胞PA317”阳性克隆的培养基上清，培养24小时，接着在培养基中培养48小时后，重新换G418浓度为1毫克/毫升的培养基，选择性培养7天(其中每两天换一次培养基)，7天后挑选阳性克隆。

得到上述阳性克隆基础上，用Southern杂交来验证重组表达载体pLCDSN是否整合入包装细胞PA317和被感染的细胞NIH/3T3中；以Northern杂交来分析所整合的CD基因，在mRNA水平是否被转录。Southern杂交和Norther杂交分析均采用标准的分子生物学方法进行。分别培养每种阳性克隆细胞，采用标准的分子生物学方法抽提基因组DNA和总RNA。

Southern杂交结果显示重组表达载体已整合入PA317和NIH/3T3细胞中。Northern杂交结果显示，在mRNA水平CD基因被转录，结果见图8。

证实重组表达载体pLCDSN已整入PA317和NIH/3T3细胞中；CD基因在mRNA水平已被转录基础上，进行5-FC对该类阳性克隆细胞“诱导”杀伤性表型研究。

在孔径为4厘米的平底六孔培养板中，每个培养孔中加入5毫升培养基，加入的细胞量为10³个细胞/培养孔。所加入G418量使其在培养基中的终浓度为1毫克/毫升；5-FC(购自美国U.S.B公司)加入量是其在培养基中终浓度为63微克/毫升和126微克/毫升两种。

进行表型研究时设置了相关对照组，它们分别为“空”的PA317细胞，整合有空载体pLXSN的PA317细胞及“空”的NIH/3T3细胞，整合有pLXSN的NIN/3T3细胞。将上述不同组别、不同培养条件的细胞培养5天后(每两天换一次培养基)，进行克隆计数分析。实验结果总结于表4。

Claims (17)

1、一种大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，其特征在于它是具有高表达活性的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因，其DNA的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如下：

1   Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly

1   ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA ATT ATT AAC GCC CGG TTA CCA GGC17   Lys Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala49   AAA GAG GGG CTG TGG CAG ATT CAT CTG CAG GAC GGA AAA ATC AGC GCC33   Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp97   ATT GAT GCG CAA TCC GGC GTG ATG CCC ATA ACT GAA AAC AGC CTG GAT49   Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His145   GCC GAA CAA GGT TTA GTT ATA CCG CCG TTT GTG GAG CCG CAT ATT CAC65   Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly193   CTG GAC ACC ACG CAA ACC GCC GGA CAA CCG AAC TGG AAT CAG TCC GGC81   Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu241   ACG CTG TTT GAA GGC ATT GAA CGC TGG GCC GAG CGC AAA GCG TTA TTA97   Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln289   ACC CAT GAC GAT GTG AAA CAA CGC GCC TGG CAA ACG CTG AAA TGG CAG113   Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp337   ATT GCC AAC GGC ATT CAG CAT GTG CGT ACC CAT GTC GAT GTT TCG GAT129   Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val385   GCA ACG CTA ACT GCG CTG AAA GCA ATG CTG GAA GTG AAG CAG GAA GTC145   Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile433   GCG CCG TGG ATT GAT CTG CAA ATT GTC GCC TTC CCT CAG GAA GGG ATT161   Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu481   TTG TCG TAT CCC AAC GGT GAA GCG TTG CTG GAA GAG GCG TTA CGC TTA177   Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu529   GGG GCA GAT GTA GTG GGG GCG ATT CCG CAT TTT GAA TTT ACC CGT GAA193   Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr577   TAC GGC GTG GAG TCG CTG CAT AAA ACC TTC GCC CTG GCG CAA AAA TAC209   Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser625   GAC CGT CTC ATC GAC GTT CAC TGT GAT GAG ATC GAT GAC GAG CAG TCG225   Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His Arg Glu Gly Met Gly673   CGC TTT GTC GAA ACC GTT GCT GCC CTG GCG CAC CGT GAA GGC ATG GGC

                                 后续   241   Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly721   GCG CGA GTC ACC GCC AGC CAC ACC ACG GCA ATG CAC TCC TAT AAC GGG257   Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn769   GCG TAT ACC TCA CGC CTG TTC CGC TTG CTG AAA ATG TCC GGT ATT AAC273   Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp817   TTT GTC GCC AAC CCG CTG GTC AAT ATT CAT CTG CAA GGA CGT TTC GAT289   Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu865   ACG TAT CCA AAA CGT CGC GGC ATC ACG CGC GTT AAA GAG ATG CTG GAG305   Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp913   TCC GGC ATT AAC GTC TGC TTT GGT CAC GAT GAT GTC TTC GAT CCG TGG321   Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu961   TAT CCG CTG GGA ACG GCG AAT ATG CTG CAA GTG CTG CAT ATG GGG CTG337   His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn1009   CAT GTT TGC CAG TTG ATG GGC TAC GGG CAG ATT AAC GAT GGC CTG AAT353   Leu Ile Thr His His Ser Gly Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly1057   TTA ATC ACC CAC CAC AGT GGC AGA ACA TTG AAT TTG CAG GAT TAC GGT369   Ile Ala Ala Gly Asn Ile Val Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn1105   ATT GCC GCC GGA AAC ATC GTA AAC CTG ATT ATC CTG CCG GCT GAA AAT385   Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg1153   GGA TTT GAT GCG CTG CGC CGT CAG GTT CCG GTA CGT TAT TCG GTA CGT401   Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr1201   GGC GGC AAG GTG ATT GCC AGT ACA CAA CCG GCA CAA ACC ACC GTA TAT417   Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg^***1249   CTG GAG CAG CCA GAA GCC ATC GAT TAC AAA CGT TGA

2、如权利要求1所述的CD基因，其特征在于所述大肠杆菌是为大肠杆菌株H-30。

3、含有权利要求1所述CD基因的重组克隆载体，其特征在于是由所述CD基因与原核克隆载体pUC18构建的原核重组克隆载体pUC18-CD。

4、含有权利要求1所述CD基因的重组表达载体，其特征在于是由含所述CD基因的原核重组克隆载体pUC18-CD与原核表达载体pBV220构建的根据保藏登记号为CCTCC NO.M95031的原核重组表达载体pBV220-CD。

5、含有权利要求1所述CD基因的重组表达载体，其特征在于是由所述CD基因与真核表达载体：逆转录病毒载体pLXSN或腺病毒载体pAdE1CMV，构建的真核重组表达载体。

6、如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述逆转录病毒重组表达载体是pLCDSN，它包含在根据保藏登记号为CCTCC NO.C95016的PA317[pLCDSN]中。

7、如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述腺病毒重组表达载体是根据保藏登记号为CCTCC NO.M96021的pAdE1CMV-CD。

8、含有权利要求1所述的CD基因的嵌合基因，其特征在于是由所述CD基因与肿瘤组织特异增强子和启动子构建的嵌合CD基因。

9、如权利要求8所述的嵌合CD基因，其特征在于所述嵌合CD基因中包含肝细胞癌特异表达的甲胎蛋白增强子和甲胎蛋白启动子。

10、含有权利要求8所述嵌合CD基因的重组表达载体，其特征在于由所述嵌合CD基因与逆转录病毒载体pLXSN构建的根据保藏登记号为CCTCC NO.M96022的含有嵌合CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLNAFP-CD。

11、含有权利要求1所述CD基因的重组表达载体，其特征在于由所述CD基因与HSV-TK基因构建同时含CD基因和HSV-TK基因的根据保藏登记号为CCTCC NO.M96023的逆转录病毒重组表达载体pLTK-IRES-CDSN。

12、含有权利要求5、6、7、10或11之一所述重组表达载体的包装细胞，其特征在于由所述的真核重组表达载体转导入包装细胞PA317或包装细胞293中，以产生内部含有真核重组表达载体的“假型”病毒。

13、如权利要求12所述的包装细胞，其特征在于所述的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN转导入包装细胞PA317中形成根据保藏登记号为CCTCC NO.C95016的包装细胞PA317(pLCDSN)，以产生“假型”逆转录病毒。

14、如权利要求1所述的CD基因的应用，其特征在于它是一种用于制造为恶性肿瘤基因治疗用的含有CD基因、嵌合CD基因、或同时含CD基因和TK基因的真核重组表达载体的感染性“假型”逆转录病毒或含有CD基因的真核重组表达载体的感染性“假型”腺病毒，或能产生感染性“假型”逆转录病毒的“包装细胞”。

15、如权利要求14所述的CD基因的应用，其特征在于它是一种用于制造为恶性肿瘤基因治疗用的含有CD基因的真核重组表达载体的感染性“假型”逆转录病毒或能产生感染性“假型”逆转录病毒的包装细胞PA317(pLCDSN)。

16、如权利要求1所述的CD基因的应用，其特征在于它是一种用于制造为恶性肿瘤基因治疗用的含有CD基因、嵌合CD基因、或同时含CD基因和TK基因的真核重组表达载体的感染性“假型”逆转录病毒或含有CD基因的真核重组表达载体的感染性“假型”腺病毒，或能产生感染性“假型”逆转录病毒的“包装细胞”，与药物前体5-氟胞嘧啶联合使用的药物。

17、如权利要求16所述的CD基因的应用，其特征在于它是一种用于制造为恶性肿瘤基因治疗用的含有CD基因的真核重组表达载体的感染性“假型”逆转录病毒或能产生感染性“假型”逆转录病毒的包装细胞PA317(pLCDSN)，与药物前体5-氟胞嘧啶联合使用的药物。

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