CN1702171A

CN1702171A - 可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒及其在治疗肺癌中的应用

Info

Publication number: CN1702171A
Application number: CN 200510053471
Authority: CN
Inventors: 瞿伯荣; 贾韦国; 强东; 杨振达
Original assignee: WUXI BOSHENG MEDICAL BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Royal (Wuxi) Bio-Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2005-03-11
Publication date: 2005-11-30
Anticipated expiration: 2025-03-11
Also published as: CN100489091C

Abstract

本发明涉及一种重组单疱疹病毒和采用该重组病毒进行人类肿瘤的基因治疗方法。特别是涉及带有血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒，及其在治疗或预防肺癌中的应用。还涉及含有该重组病毒的药物组合物。本发明的重组单疱疹病毒能在肿瘤细胞中表达具有抑制血管生成作用的血管抑素和内皮抑素融合蛋白，并且该病毒在肿瘤内裂解性增殖，从而实现了从抑制血管生成和裂解肿瘤细胞这两个途径来治疗肺癌的目的。

Description

可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒及其在治疗肺癌中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组单疱疹病毒和采用该重组病毒进行人类肿瘤的基因治疗方法。特别是涉及带有血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒，及其在治疗或预防肺癌中的应用。还涉及含有该重组病毒的药物组合物。

背景技术

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展和转移是一个极其复杂的多基因调控异常的过程。该病确诊时大多为非早期，所以往往治疗效果较差。最新统计表明，肺癌死亡率上升幅度居各类肿瘤之首，到20世纪90年代已达17.54/10万人，这表明它对人类健康的危害日益严重。近年来，随着医学分子生物学技术和理论的发展，尤其是DNA重组技术和基因转移技术逐步成熟，利用基因转移技术向体内导入目的基因，用以对肺癌发病的分子环节进行干预，为肺癌的治疗开辟了新途径。

研究表明，肺癌的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活和凋亡相关基因的改变导致细胞增殖和死亡异常的结果(Mistudomi T et al.，Cancer and Chemotherapy，1996，23：990-996)。其发生是多阶段、多步骤、多基因参与的过程，在不同阶段相继或同时有不同基因的改变。肺癌的基因治疗就是针对肺癌在发生、发展和演变过程中，细胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活这些节点，采用已知的基因片段导入、转移和重组等技术来消除激活的癌基因和增殖肿瘤中抑癌基因的功能。概括地说，基因治疗包括两部分：一是恢复异常表达或缺失的体细胞基因功能；二是引入有治疗价值的其他来源的基因。在肺癌基因治疗中，除了考虑打破肿瘤的生长规律，纠正其恶性表现外，还需要考虑肿瘤局部微环境及其全身抗肿瘤系统的功能恢复和加强。

目前，研究较多的肺癌的基因治疗方法有：(1)抑癌基因治疗：抑癌基因治疗是一种基因替代疗法，即用野生型的抑癌基因替代失活的抑癌基因，从而达到治疗肿瘤的目的。目前研究较多的是用外源性野生型p53基因治疗肺癌；(2)反义基因治疗：即人工合成的与癌基因序列相反的一段核苷酸或将癌基因反向连接于质粒上，经载体将它们传递到肿瘤细胞，以便在转录或翻译水平上阻断癌基因的过度表达；(3)自杀基因疗法：自杀基因疗法又称病毒介导活化前体药物基因治疗。其机制是一些基因被导入肿瘤细胞后，通过表达特殊的酶而使前体药物活化。这些药物可阻断肿瘤细胞的核酸代谢，导致肿瘤细胞的死亡。Douglas等将数种酶和前体药物联合应用，如胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶，细胞色素P4502B1和环磷酰胺以及黄嘌呤-鸟嘌呤核糖转移酶和6-硫代黄嘌呤联合应用，取得了很好的效果；(4)免疫基因治疗：免疫基因治疗是采用一定的方法或载体将目的基因导入肿瘤细胞或效应细胞——肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，然后将表达目的基因的受体细胞输入患者体内，通过提高人体免疫系统对肿瘤细胞的识别、抑制与杀伤，从而对肿瘤进行治疗的一种方法；(5)核酶基因治疗；以及(6)多向耐药基因治疗等(Albelda S M，Chest，1997，III Suppl：145-149)。

但总的来说，虽然已进行了利用各种方式进行的癌症基因治疗的抗肿瘤率和安全性方面的临床前的动物实验，但迄今为止，其临床结果都不令人满意。一般说来，不是抗肿瘤效率低下，就是根本不存在(BuenoR.，Chest 1999，116(3Suppl)：444S-45S；Arriola EL et al.Oncogene 1999，18(4)：1081-91)。出现这种状况的原因毫无疑问是多种多样的，但是癌症治疗的遗传修饰主要受到无法在足够大数量的靶细胞中获得足够高水平的基因表达从而获得临床效果的限制。

目前基因治疗中转基因最有效和应用最多的方法是以病毒作为载体进行基因治疗的方法，其中研究最多的为逆转录病毒载体。美国1995年批准进入临床的基因治疗106项，病毒介导的有92项，占85％，逆转录病毒76项，占总数50％以上。以逆转录病毒为载体可将外源基因整合到细胞核，随细胞分裂而复制，可持续表达外源基因。但在安全性上存在问题，由于逆转录病毒随机插入到宿主DNA，可能造成病毒整合部位异常，从而病人成为癌携带的危险者。此外，病毒经包装导入细胞后，有重新恢复野生型逆转录病毒的可能，对宿主可能造成潜在的病毒感染。

虽然，研究较为充分的用于肺癌治疗的病毒载体为逆转录病毒(retrovius)和腺病毒(AV)。但其缺点也十分明显：1)如上文所述，逆转病毒经包装导入细胞后，有重新恢复野生型逆转录病毒的可能，从而产生具有复制能力的病毒，宿主存在病毒感染的风险；2)由于逆转录病毒是随机整合至宿主基因组，因而可能会引起“插入诱变”——可引发一些插入位点附近的原癌基因的激活，诱发癌症；3)逆转录病毒包装外源DNA能力十分有限，其一般只能包装小于8kb的外源DNA；4)逆转录病毒还要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应受体。对于腺病毒来说，其缺点也是十分明显的：1)腺病毒几乎可以感染所有的细胞，因此缺乏特异性；2)腺病毒因为不能整合到宿主染色体上，所以不能持续表达所需产物，表达时间短暂，需重复给予载体制剂治疗；3)腺病毒的病毒颗粒可引起强的免疫应答，可能刺激免疫反应，使反复治疗的效果会逐渐降低。

此外，常用于肿瘤治疗的病毒载体，如逆转录病毒和腺病毒，均为非复制性的病毒载体，由于不能实现肿瘤特异性的复制而限制了病毒在肿瘤中的扩散，只能完全依赖其携带的基因对肿瘤的作用，从而其临床效果十分有限。

发明内容

肺癌和其他肿瘤一样，其生长、转移以及预后均有赖血管生成。基于该原理，申请人试图利用在基因分子水平阻断肺癌营养血管的生成这一原理，来有效的治疗肺癌。

目前最有希望的利用抗血管生成方式来治疗肺癌的技术方案是：用一种或多种抗血管生成药物/蛋白长时间作用，从而达到一个稳定的、持续的效果。但目前技术上实施这一设想存在诸多问题：如何选择对肺癌治疗特别有效的抗血管生成药物/蛋白或基因，如何提高基因的导入机体的效率，如何提高基因治疗的安全性减少载体对机体的免疫原性和毒性作用，如何提高基因在体内和体外的转化能力等等。本发明的技术方案克服了现有技术中存在的一系列问题，实现了有效治疗肺癌的目标。

为了克服现有技术中采用常用的逆转录病毒和腺病毒载体作为基因治疗的载体所存在的多方面的缺陷，本发明选用了缺失了部分基因的I型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为载体。

HSV-1是一种常见的能感染神经元和非神经元细胞的人类病毒，其具有表面覆盖有糖蛋白外膜的由162个衣壳蛋白亚基组成的二十面体衣壳。其为双链线形DNA病毒，约153kb，编码约84个蛋白。自从1980年起，HSV-1就在基因治疗中作为载体用于治疗癌症和其他疾病。

与其他常用的载体相比，HSV-1具有许多优点：1)具有最大的容积，可插入至少30kb的外源基因而不影响病毒的组装；2)其具有良好的遗传稳定性，大多数的重组HSV-1病毒在多次感染动物，再在体外大量繁殖后，仍然保持其原来的遗传即表象特征，从而其安全性高；3)感染能力强，能感染多种类型的宿主细胞，除了在神经元中潜伏外，其还可感染多种组织，包括肌肉、肿瘤、肺、肝、胰岛。HSV-1的感染能力可与腺病毒相当，比逆转录病毒的感染能力几乎强1000倍左右；4)此外，对HSV-1感染后的人类病理学、分子生物学和临床方面已有深入的研究，并已建立了相应的动物模型，这与其他的新建议用来进行基因治疗的病毒相比，对HSV-1的了解要彻底的多，从而临床使用非常安全；5)HSV-1以非整合宿主细胞染色体的方式来进行感染，从而不存在造成宿主细胞遗传突变的可能，从而与逆转录病毒相比，安全性要高的多；6)临床上，已开发出多种抗HSV-1感染的药物，如Acyclovir(ACV)或Ganciclovir(GCV)等在临床上已实践多年用于治疗疱疹病毒感染，从而一旦临床基因治疗失控，上述药物可有效的抑制病毒生长，从而中断感染，为进行基因治疗的个体提供了进一步的安全防护；7)HSV-1免疫刺激作用较弱，与腺病毒不同，HSV-1病毒具有掩蔽被感染的宿主细胞，使之不受机体免疫系统攻击的能力；8)HSV-1可进行遗传工程改造从而有条件的在靶向的肿瘤细胞中特异性的复制。

其最后一条特性使得HSV-1成为首个用于癌症治疗的肿瘤裂解性病毒载体(Martuza RLet al.Science 1991；252(5007)：854-6)。已知，当病毒的早期基因，例如胸腺激酶(tk)或核苷酸还原酶基因(也就是，HSV中的ICP6基因)被缺失后，HSV-1具有能在激增的细胞中复制并导致细胞溶解，但不能在有丝分裂后期或增殖缓慢的细胞中复制的特性。G207是目前临床上用于癌症治疗的HSV-1突变子：该病毒衍生于野生型的HSV-1F株，其中导致脑炎的病毒双拷贝ICP34.5基因双双进行了1kb的缺失突变，并且在编码核苷酸还原酶的ICP6基因中插入lacZ基因使其失活，并保留了TK基因，使HSV能在肿瘤中大量复制，但不能在正常细胞中复制。这种遗传改造减弱了HSV-1的神经毒性，并使G207优选的在快速增殖的肿瘤细胞中复制。实验证实，在体内和体外，G207能有效的杀灭各种细胞类型的人类肿瘤，其已经通过来I期临床实验，证实在人体和动物体中均无细胞毒性；同时，由于保留了TK基因，可使用抗无环鸟苷等的一些常规抗病毒药物如Acyclovir(ACV)或Ganciclovir(GCV)，来防止病毒过量复制造成的毒性反应。

本发明人在G207载体的基础上，通过选择抗血管生成的血管抑素和内皮抑素的融合基因来代替G207中的lacZ基因，从而构建得到了除了具有能有效的裂解肿瘤的效果外，还具有抗血管生成的功能的重组病毒AE618。

由于原发性瘤及其转移瘤需要新的血管生成来支持其生长和存在，并且已知非小细胞肺癌需要较高的血管生成。基于上述原因，申请人选择了血管抑素和内皮抑素融合基因作为治疗基因用于针对性的治疗肺癌。

血管抑素(angiostatin)是O’Reilly等于1994年发现的血管生成抑制因子，其来源于肿瘤细胞，为纤维蛋白溶酶原1-4 kringles的裂解片段，能强烈特异性抑制血管内皮细胞增殖，阻止新生血管生成。Ambs等研究表明，将血管抑素的cDNA构建于质粒PMB75.6后转染黑色素瘤细胞B16F10，体外培养肿瘤增殖被抑制，而将筛选获得不同表达量(低中高表达)的细胞系分别接种于C57BL/6小鼠，结果显示肿瘤生长抑制程度与血管抑素表达量成正比，但作用较短暂。用高表达的细胞系静脉注射接种，26天后，肺肿瘤转移癌结节数明显减少(＜3个/侧)，而对照组有一半小鼠多于150个/侧，提示血管抑素高表达能有效抑制原发性或转移性肿瘤，呈剂量依赖性，并需反复使用。

内皮抑素(endostatin)是O’Reilly等1997年发现的又一种血管生成抑制因子，是胶原VIII因子的C末端片段，其抑制血管内皮细胞增殖作用与血管抑素相当，两者抗血管生成作用强于其他血管生成抑制因子。Yoon等将转染了内皮抑素基因的肿瘤细胞静脉注射到小鼠体内，4周后很少出现或不出现肺转移肿瘤。而皮下注射未能抑制肺转移肿瘤的形成，可能与不同组织内皮抑素表达量不同有关；他们还用25％转染了内皮抑素基因的肿瘤细胞和75％未转染的肿瘤细胞混合接种于小鼠皮下，发现其抑制原发肿瘤形成的效果与100％转染内皮抑制基因的肿瘤细胞相当。提示只要少量内皮抑制基因转染肿瘤细胞就能抑制肿瘤细胞生长。研究还表明，内皮抑素主要抑制不同脏器内原发或转移癌的形成，对于已形成的肿瘤效果较差。

在本发明中，我们采用了类似G207分子架构的病毒，作为原始的病毒载体，构建了表达抗血管生成蛋白的重组病毒载体。携带的融合基因受到人延长因子基因(hEF-1)启动子的调控，并在其5’末端具有IL12的信号肽。我们采用在ICP6的编码区插入血管抑素和内皮抑素融合基因来使ICP6失活，从而获得新的重组病毒AE618。

由于实际上在人体作用的药物受到各种因素的影响，例如肿瘤局部的渗透性、药物在不同类型肿瘤内的降解速度、肿瘤对血管供应的敏感性等等，基于理论构建的重组病毒是否能有效的实现其预期的治疗目的，必须通过实验，特别是动物模型的验证才能成立。尤其是，由于不同的肿瘤组织起源不同，往往差别更大。此外，肿瘤的产生是基于基因突变，这标志着肿瘤细胞的基因具有不稳定性，这使得基因治疗药物的效果往往与预先理论设想的相去甚远，使得药物的有效性无法预测。因此，我们通过下文中的实施例中的具体实验，进一步验证了我们构建获得的可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒的治疗效果。我们的实验数据证实，AE618重组病毒不仅能通过病毒复制的方式裂解杀死肺癌细胞，还能通过其分泌的抗血管生成蛋白来抑制肿瘤的生长。

一方面，本发明涉及一种可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒，其特征在于所述的单疱疹病毒HSV-1的两个ICP34.5基因均被部分缺失，并在其非复制所必须的基因内部插入血管抑素和内皮抑素融合基因使该基因失活。

如上文所述的重组单疱疹病毒，其中所述的非复制所必须的基因为ICP6基因。

如上文所述的重组单疱疹病毒，其能选择性的在肺癌肿瘤细胞内复制。

如上文所述的重组单疱疹病毒，其能通过病毒复制的方式选择性的在肺癌肿瘤内扩散，能感染至靶细胞以外的肿瘤细胞。

如上文所述的重组单疱疹病毒，其能通过病毒复制的方式裂解性的杀死分裂旺盛的肺癌肿瘤细胞。

如上文所述的重组单疱疹病毒，其分泌的血管抑素和内皮抑素融合蛋白能有效的抑制血管生成，从而抑制肺癌肿瘤的生长。

如上文所述的重组单疱疹病毒，其为温度敏感突变株，在高于39.5℃的条件下所述的重组病毒增殖失活。

如上文所述的重组单疱疹病毒，其对常规抗病毒药物AVC、GVC敏感，常规抗病毒药物AVC、GVC可抑制所述重组单疱疹病毒的生长。

一方面，本发明涉及一种构建可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒的方法，其步骤是：

1)部分缺失单疱疹病毒HSV-1的两个ICP34.5基因；

2)在HSV-1的ICP6基因的内部插入血管抑素和内皮抑素融合基因使ICP6基因失活。

另一方面，本发明涉及一种含有上述重组单疱疹病毒的药物组合物。

如上文所述的药物组合物，其中所述的药物组合物可以是注射剂、喷射剂及其他常规的药物剂型形式。

包括本发明的药物的药物组合物可以通过已知的方法配制，例如通过与药学上可接受的载体混合。这种载体和配制的方法的例子可从Remington’s药物科学上查到。为了形成一适于有效给药的药学上可接受的组合物，该组合物将含有有效量的所述药物。药物的有效量将根据各种因子如个体的条件，重量，性别和年龄而变化。其他的因子包括给药模式。药物组合物可通过各种途径对个体给药，例如局部的(包括肿瘤内的)，和全身的。

本发明的药物可以以传统用于给药的赋形剂的广泛的治疗药剂形式来给药。例如，所述药物可以以各种剂量的形式，如片剂，胶囊(每一片包括定时释放和持续释放的制剂)，丸剂，粉剂，粒剂，溶液，悬浮液，脂质体和其他可能的药物剂型方式，或通过注射方式，经静脉或肿瘤内直接给药。

另一方面，本发明涉及一种可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于所述的单疱疹病毒HSV-1的两个ICP34.5基因均被部分缺失，并在其ICP6基因的内部插入血管抑素和内皮抑素融合基因使ICP6基因失活。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗和预防肺癌复发的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒能选择性的在肺癌肿瘤细胞内复制。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒能通过病毒复制的方式选择性的在肺癌肿瘤内扩散，能感染至靶细胞以外的肿瘤细胞。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒能通过病毒复制的方式裂解性的杀死分裂旺盛的肺癌肿瘤细胞。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒分泌的血管抑素和内皮抑素融合蛋白能有效的抑制血管生成，从而抑制肺癌肿瘤的生长。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒为温度敏感突变株，在高于39.5℃的条件下所述的重组病毒增殖失活，从而提高基因治疗的安全性。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒对常规抗病毒药物AVC、GVC敏感，可通过常规抗病毒药物AVC、GVC来抑制所述重组单疱疹病毒的生长，从而提高基因治疗的安全性。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒可与各种常规的其他抗癌药物或手术、放疗、化疗药物联合应用。

如上文所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒通过局部或全身注射的方式给药。

对于本领域的熟练技术人员来说，本发明所采用的各种基因工程操作方法、实验条件、常规试剂均采用本领域常用的各种方法、条件和常规试剂，在现有的教科书(如，分子克隆实验指南，第二版)中均有详细的记载，因此本说明书不对其作进一步的说明。本发明所采用的各类试剂、载体均为商业化可购得的试剂、载体。本领域的技术人员结合现有技术中的有关教导，按照本说明书的记载能毫无困难的实施本发明。

本发明所述技术方案的各种改进，对于本领域的熟练技术人员来说是显而易见的，其并未背离本发明的范围和主旨。虽然下文将结合特定实施例来进一步阐明本发明，但应当这样理解，权利要求所要求保护的发明不应当过分的局限于该特定实施例的技术方案中。事实上，本发明试图包括那些对于化学或生物学或相关领域的熟练技术人员来说，对为了实现本发明的目的而记载的技术方案的显而易见的各种改进。上述说明书中提到的所有出版物在此并入参考。

附图说明

图1采用对照感染，或采用G207和AE618感染处理的肺癌细胞A549中的血管抑素和内皮抑素的表达。结果显示，采用AE618感染显著增加了A549细胞中的内皮抑素和血管抑素的表达。而作为对照的未感染组和不带血管抑制因子和内皮抑制因子的病毒G207组均不表达融合蛋白。第二行采用微管蛋白作为蛋白加样量的内对照。

图2AE618和G207对肺癌细胞H460的细胞裂解效果比较。(A)在0.1的M.O.I下，在处理后的1至5天，对分别采用表达血管抑素和内皮抑素融合蛋白的病毒AE618处理和对照病毒G207处理的肺癌细胞H460进行活细胞计数，计数结果没有显著差异；(B)分别采用AE618和G207处理H460肺癌细胞，在处理后第3天进行活细胞技术。在滴度为0.001至10之间，两种处理获得的技术结果之间没有显著差异。该结果表明，重组病毒AE618保留了对肺癌细胞的裂解性杀伤的能力，对肿瘤细胞有完全的抑制作用。

图3人血管内皮细胞(HUVEC)与以0.1的M.O.I的AE618或G207感染的H460肺癌细胞共培养。在处理后的第3天和第4天，与G207处理的对照组相比，采用AE618处理的对照组中的人血管内皮细胞(HUVEC)数量显著下降，出现明显的生长抑制。这说明被AE618感染的肺癌细胞能释放血管抑素和内皮抑素融合蛋白，从而对血管细胞的生长产生了抑制。

图4在SCID鼠模型中，AE618对人肿瘤细胞的抗肿瘤效果。从感染后第6天开始，重组病毒AE618的体内抗肿瘤效果显著高于G207。本图以感染后的每一天的原始肿瘤的尺寸倍数变化来表示。病毒感染的肺癌肿瘤模型表明，注射AE618病毒的肿瘤其生长速率远低于不注射病毒的PBS对照组，也显著地低于不表达血管抑素和内皮抑素融合蛋白的对照病毒G207组。

图5质粒pICP34.5-BLU的质粒图谱。

图6HSV-1ICP 34.5基因位置结构。

图7质粒pICP34.5-BLU28的质粒图谱。

图8重组病毒v345281的构建过程。

图9质粒pGT65质粒结构图谱。

图10质粒pBLUESCRIPT-KS的质粒结构图谱。

图11质粒pICP6-SU6/KS的结构图谱。

图12质粒pAE的结构图谱。

图13AE618的温度敏感性检测结果。

图14AE618对GCV的敏感性结果。

具体实施方式

本发明的技术方案将采用如下非限制性实施例进一步的说明。

实施例1：重组病毒AE618的构建

(a)HSV-1病毒的F株病毒DNA的制备方法：

用于重组的HSV-1病毒的F株由美国ATCC公司购得。用该病毒在MOI＝1的条件下感染培养的Vero细胞(美国ATCC公司)。24-36小时后待大部细胞呈现细胞病变(CPE)时，收集细胞并转入15ml离心管离心去除细胞培养液。加入0.3ml细胞裂解液(含：100Mm NaCl，10Mm Tris.HClpH 8，25Mm EDTA pH8和0.5％SDS)裂解感染细胞并用RNaseA(10mg/ml)65度处理1小时，上述裂解液先用等体积的酚再用等体积的酚/氯仿(1∶1)混合液抽提，含DNA的水相溶液转移到新的离心管后加入1/2体积的7.5M醋酸胺和2倍体积的无水酒精，静置10分钟后离心得到病毒DNA沉淀，用20-100ul Tris/EDTA缓冲液溶解后于4℃保存，制备得到原始HSV-1病毒DNA。

(b)缺失基因ICP34.5的具体实验步骤：

构建质粒pICP34.5BLU28：

取5μg纯化的HSV-1F株病毒DNA用限制性内切酶PstI消化并分离纯化得到包含有ICP34.5基因的一个14509bp的片段。该片段进而用XhoI和SapI(NEWENGLAND)消化分离得到一个5853bp的较小片段，该XhoI/SapI片段在将SapI端用T4DNA合成酶补平后克隆入质粒pBLUESCRIPT的XhoI和EcoRV端得到质粒pICP34.5-BLU(图5)，质粒pICP34.5-BLU用Bsu36I(NEW ENGLAND，BIOLABS)和BstEII消化得到1699bp(BstEII/Bsu36I)和7089bp(Bsu36I/BstEII)两个片段，前者包含有ICP34.5基因3’端的大部，电泳分离后，将7089bp片段保存而1699bp片段进一步用AseI消化，电泳分离后得到一个705bp(AseI/Bsu36I)和一个994bp(BstEII/AseI)的片段，如图6所示，后者包含ICP34.5基因从第84个脱氧核糖核酸(相当于第28个氨基酸)以后的所有碱基编码序列，与此同时合成一条双链寡核苷酸(正链：5’GTTACCGTTTAAACAT 3’，反链：5’TAATGTTTAAACG 3’)，其一端为BstEII，另一端为AseI，最后，将上述7089bp(Bsu36I/BstEII)，705bp(AseI/Bsu36I)和寡核苷酸链混合，加入T4连接酶和相应的缓冲液在室温下反应30分钟后转入大肠杆菌，得到质粒pICP34.5-BLU28(图7)，其中包含的ICP34.5基因编码区的第84到991个碱基被上述合成的寡核苷酸所取代，从而ICP34.5基因编码区第28个氨基酸3’端以后被全部去除。

(c)重组病毒v345281的构建过程(见图8)。

重组质粒pICP34.5BLU28(图7)与纯化的HSV-1F株病毒DNA共转染Vero细胞获得具有缺失ICP34.5基因的重组病毒(v345281)(共转染的具体过程见图8)。

质粒pICP34.5-BLU28与5μg纯化的HSV-1病毒DNA用LIPOFECTAMINE(GIBCOBRL)按公司的产品说明书所推荐的方法共同转入培养的Vero细胞内，基于同源重组机制，病毒基因组中原有的ICP34.5基因被质粒中的DNA序列所替代，而产生重组的HSV-1病毒，从上述过程中共得到92个病毒斑，分别感染在96孔细胞培养板上生长的Vero细胞，待全部细胞出现病变后，收集病毒并取部分病毒按上述的方法提取病毒DNA，重组病毒的挑选采用Southem Blotting，首先，以0.3μg被去除ICP34.5基因序列的片段(991bp，BstEII/AseI)作为模版制备标记有³²P的探针(random primer labelingkit，GIBCO BRL)，然后，每株病毒各取0.1μg点在cellulous膜上，上述探针在60度下杂交15小时以鉴定病毒ICP34.5基因区的存在与否，在上述92株病毒中有5株表现有ICP34.5缺失，用BamHI和NcoI对该5株病毒的DNA消化后作凝胶电泳，并进一步从质粒pICP34.5-BLU28上切下的BamHI/AseI(1315bp)片断为模版得到³²P标记的探针作Southern鉴定。发现其中一株为两个ICP34.5基因拷贝均缺失，命名为v34528。经DNA测序鉴定，证实其两个ICP34.5基因均已被去除。

(d)在基因ICP6的位置插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因的具体实验步骤：

构建具有含Endostatin和Angiostatin的融合基因表达盒及ICP6旁侧序列的重组质粒pAE，重组质粒pAE与重组病毒V34528的病毒DNA共转染VERO细胞，获得在ICP6基因位置中插入表达Endostatin和Angiostatin的融合基因的重组病毒AE618。

构建重组质粒pAE的具体实验步骤：

1.首先将ICP6基因克隆到克隆载体pBlueScriptKS中获得质粒pICP6-SU6/KS。含Endostatin：Angiostatin的融合基因表达盒的质粒pGT65(图9)购自InvivoGen Co.。质粒pICP6-SU6/KS的制备：

取2μg质粒pBLUESCRIPT-KS(图10)用限制性内切酶BamHI和SacI各10单位在50ul相应的缓冲液中于37度下消化2小时后，用1％琼脂凝胶电泳分离并经小提DNA纯化柱(QIAGIN)纯化后得到质粒片段，同时取5μg的通过前述方法纯化得到的HSV-1 F株病毒DNA，采用限制性内切酶BglII和SacI在同样的消化条件下消化，并分离纯化得到包含有ICP6基因的一个3573bp的片段，该BglII/SacI片段与上述pBLUESCRIPT-KS质粒的BamHI/SacI片段混合后，加入5单位的T4 DNA连接酶和相应的反应缓冲液达到总体积20ul，室温下反应30分钟后，取5ul转入敏化的DH5 Ecoli细胞。在含有100μg/ml ampiciline的培养基上培养18小时后长出的菌落，用QIAGEN的质粒小量提纯套液，提取并酶切鉴定得到质粒pICP6-SU6/KS(图11)。

2.将Endostatin，Angiostatin的融合基因表达盒插入质粒pICP6-SU6/KS获得重组质粒pAE。

质粒pAE的构建：

上述质粒pICP6-SU6/KS在插入的HSV-1的ICP6基因中有两个BamHI切点(如图11所述)，该质粒用BamHI在上述条件下消化后，加入5ul含10单位T4DNA合成酶和四种脱氧核糖核酸(各自浓度为10uM)的混合溶液继续在37度反应30分钟以补平，电泳纯化后去除两BamHI点之间的片段(764bp)并得到质粒片段(5736pb)，同时，将含Endostatin，Angiostatin的融合基因表达盒的质粒pGT65(图9)用与上述类似的反应条件用XhoI和SwaI消化并用T4 DNA合成酶在同样条件下补平两端，电泳纯化后得到含Endo：Angio基因表达单位的片段(2854pb)，该片段和上述5736pb的pICP6-SU6/KS质粒片段用T4DNA连接酶连接后转入大肠杆菌中得到质粒pAE。质粒pAE的内切酶谱见图12。

3.将重组质粒pAE与重组病毒V34528的病毒DNA共转染VERO细胞，

获得在ICP6基因位置中插入表达Endostatin和Angiostatin的融合基因的重组病毒AE618。

用与上述构建v34528病毒同样的方法，将质粒pAE与纯化的v34528病毒DNA共同转入培养的Vero细胞内，基于上述相同的同源重组机制，ICP6基因编码区段的序列被pAE中的Endo:Angio融合基因表达单位的DNA序列代替，在得到的53株病毒中，用PCR方法鉴定是否包含有Endo:Angio融合基因表达单位。PCR上游和下游引物的序列选自Endo:Angio融合基因表达单位内部，其理论PCR产物的长度应为330bp。上游和下游引物的序列如下：

上游：5’ACGCATCTTCTCC TTTGACGG 3’

下游：5’GTCCCTCTGTAGTTCTTTCCATT 3’

PCR条件为：0.05μg病毒DNA模版，0.5单位TaqDNA合成酶，5％DMSO和10mMMgCl₂，首先在94℃下失活5’之后按94℃ 45”-52℃ 45”-72℃ 45”作25次循环。PCR产物凝胶电泳结果显示其中有9株为重组病毒，经测序鉴定，证实这些病毒基因组中的ICP6基因中第536到第1300的碱基对按设计要求被上述Endo:Angio基因表达单位的片段所替代，同时两个ICP34.5基因拷贝均缺失其编码区的第84到991个碱基，该病毒命名为AE618，筛选分离后的AE618病毒在Vero细胞上生长繁殖后置于摄氏零下80度保存。

培养所采用的细胞系

非小细胞肺癌细胞系NCI-H460(ATCC HTB-177)和A549(ATCCCCL-185)来源于美国典型培养物保藏中心。将该细胞培养于添加有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中(Dulbecco’s modified Eagle medium)。

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养于添加有2％ FCS和猪脑提取物部分富含的成纤维细胞生长因子(1μg/m))的MCDB 107(JRH Biosciences，Lenexa，KS)培养基中。

实施例2：在感染AE618的癌细胞中检测融合蛋白的表达

感染前，在37℃下，在10cm平皿中平板培养肺癌A549细胞(1×10⁶)4小时。然后将其分别采用G207、AE618、或空白对照来进行感染(每一感染滴度M.O.I.＝1.0)，并将感染后的细胞继续培养24小时。采用PBS冲洗培养细胞样品两次，随后从平皿中将细胞轻轻刮下，并采用细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，1％ NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS)来裂解细胞。将全部细胞裂解产物煮沸，并经Bradford法(Bio-Rad，Hercules，CA)来检测蛋白质浓度。取等量的蛋白(100μg)样品在还原条件下在15％的丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。将电泳后的蛋白转膜至Immobilon-P转移膜(Millipore，Bedford，MA)，接着将膜置于5％的脱脂奶粉中封闭，并在4℃下，将其置于含有0.2％的Tween-20的TBS(TBS-T)中过夜，随后在室温下与一抗温育1小时。采用TBS-T洗膜3次，每次5分钟。针对内皮抑素和血管抑素的一抗购于R & D Systems Inc.(Minneapolis，MN)，针对γ-微管蛋白(sc-7396同上)的一抗购于Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz，CA)。采用与辣根过氧化物酶结合的兔抗羊抗体(Pierce，Rockford，IL)作为二抗。通过鲁米诺化学发光试剂(Santa Cruz)来显色蛋白质。

通过上述的免疫印迹实验，结果显示在以1.0 M.O.I.的AE618感染24小时后的A549肺癌细胞中，内皮抑素和血管抑素的表达均显著增加。与空白对照相比，采用G207感染的A549细胞中上述蛋白的表达没有任何的增加(图1)。该结果有力的证明了本发明构建得到的AE618重组病毒中整合的endostatin-angiostatin融合蛋白基因得到了表达并具有完整的功能。

实施例3：重组病毒AE618的细胞裂解效应的检测

将A549和H460肺癌细胞系(1×10⁵)均置于12孔组织培养板中，在37℃下培养4小时，随后以各种浓度的G207和AE618重组病毒以及空白对照来感染细胞，并将细胞继续培养几天。在经胰蛋白酶处理后，收集细胞并重悬于PBS溶液中。向细胞悬液中加入等体积的含0.1％台酚蓝的PBS。随后利用血细胞计数器来进行活细胞计数。所有的细胞计数均取3份样本计数的平均值。

对于感染后1至5天的H460肺癌细胞的细胞计数结果表明，与空白对照相比，从感染后的第二天开始采用病毒处理的组中的活细胞数目显著下降(p＜0.001)。在采用AE618处理的组和G207处理的组之间的活细胞计数比较不存在显著差异(p＞0.05，图2A)。

此外，同样的采用滴度为0.001至10的AE618和G207分别感染H460细胞系。处理后第3天开始进行活细胞计数。如图2B所示，在所有的滴度下两种病毒处理后的细胞计数没有显著不同。

上述的实验结果表明，我们构建得到的重组病毒AE618仍然完整的保持了其亲本病毒对肺癌细胞的裂解作用。

实施例4：由采用AE618感染的癌症细胞分泌的蛋白对HUVEC生长的抑制作用

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(3×10⁶)培养于35mm的6孔双层培养皿中。培养24小时后，将分别被滴度为0.1的空白对照、G207和AE618重组病毒感染的H460肺癌细胞(5×10⁴)接种于底部具有0.4-μm大小的微孔的细胞培养池中(Cat.#353090，BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)，并将其置于生长有HUVEC的培养孔中。上述微孔允许培养孔和细胞培养池的培养基中的蛋白相互流通。该培养基中加入了0.2％的人γ-球蛋白(ICNBiomedicals，Inc.)来防止HUVEC受到感染的H460细胞释放的病毒的二次感染。从而上述操作使得HUVEC与被病毒感染的H460细胞实现了共培养。在处理后的1至4天，分别收集人脐静脉内皮细胞和H460肺癌细胞，并随后采用血细胞计数器来进行活细胞计数。所有的细胞计数均取3份样本计数的平均值。

结果显示，虽然由于培养基中的病毒蛋白的一般毒性的作用，与感染了任何一种病毒的H460细胞共培养的HUVEC细胞的生长速率均发生下降，但是从结果中可观察到，在处理后第3至4天，采用AE618处理的组的HUVEC细胞的活细胞计数要显著低于采用G207处理的组(p＝0.004和p＜0.001；图3)。该结果表明重组病毒AE618中克隆的内皮抑素和血管抑素融合基因的确得到了表达，且其表达的融合蛋白的确具有抑制血管生成的作用。

实施例5：动物实验

将0.05mL的含有百万H460细胞(1×10⁶)的无菌Hanks缓冲盐溶液经皮下分别注射至SCID鼠(Charles River)的背部两侧。在植入肿瘤16至18天后开始采用重组病毒来治疗肿瘤。将重组病毒AE618、G207和等体积的PBS溶液(每只小鼠分别注射50ul的含有10⁷pfu病毒的溶液)注入右侧的肿瘤中。每个治疗组中包括6只小鼠。在治疗前(第0天)和治疗后(第1至13天)，通过公式V＝L*W*W/2000分别计算肿瘤的大小。数据表示的为相对于原始肿瘤大小的倍数变化，例如治疗后的某天的V/第0天的V。

与PBS处理的对照组相比，从治疗后的第2天(其P值分别为：p＝0.013和p＝0.009)至第13天(其P值分别为：p＝0.008和p＝0.006)，G207和重组病毒AE618均显著的抑制了异种皮移植的H460肿瘤的生长(图4)。从治疗后的第6天开始，采用AE618治疗的组中的肿瘤大小持续的显著小于采用G207治疗的组(p＜0.03)。该结果表明，重组病毒AE618比其亲本病毒G207具有显著的意料不到的良好的治疗效果。

统计方法

在无特别说明的情况下，所有的实验均重复3次。采用平均值±标准误来表示实验结果。采用单尾t-测验来进行统计比较。P值小于0.05表示存在显著差异。

实施例6：重组病毒AE618的温度敏感性

由于AE618的母本HSV-1F株的极早基因ICP4中存在点突变(Preston 1981；DeLuca andSchaffer 1985)，同时其ICP6基因的缺失可进一步增加其温度敏感性(Goldstein and Weller1988)，从而可以预测重组病毒AE618也应保留该特征，为一温度敏感突变型。如下将通过实验来证实重组病毒AE618的温度敏感性。

如上文所述采用重组的AE618病毒感染Vero细胞后，分别在37℃和39.5℃下培养细胞48小时。在感染后不同时间收获细胞并继而进行毒斑滴定。

结果如图13所示，在37℃条件下，在48小时内，AE618的病毒滴度增加了三个Log(即三个数量级，一千倍)；而在39.5℃条件下，AE618在细胞内停止繁殖，48小时后，其滴度反而降低了1.5个数量级(150倍)。该项结果说明，AE618保留了其野生母株F病毒在ICP4基因上的点突变。这一特性对于AE618的安全性非常重要。这表明，在治疗时一旦病人产生由炎症引起的发烧症状时，由于AE618的该项温度敏感性特定，其在体内生长繁殖可以自动的受到抑制，从而减低了产生并发症的危险性，大大提高了重组病毒AE618作为应用于人体的基因治疗重组病毒的安全性。

实施例7：AE618对常规抗病毒药物GCV(Ganciclovir)的敏感性

由于AE618保留有了HSV-1自身的TK基因，因而与其他携带有HSV-1 TK基因的病毒一样，重组病毒AE618对抗疱疹病毒药物GCV或ACV有一定的敏感性。先前的研究表明，ICP6的缺失可进一步增加病毒对这类药物的敏感性(Yamada，Yamamoto et al.1991；Mineta，Rabkin et al.1994)。如下将通过具体实验来验证重组病毒AE618的对常规抗病毒药物GCV的敏感性。

如上文所述，将重组病毒AE618和G207以及F株病毒感染Vero细胞后，分别在不加或添加有不同浓度的GCV的培养液中生长。在感染后48小时收获细胞并继而进行毒斑滴定。

图14的结果表明，AE618与G207对GCV的敏感性完全一样(曲线几乎完全重合)，其对抗病毒药物GCV的敏感性均比野生型的HSV-1(F)病毒株高大约10倍。图中数据以与同样条件、但不含GCV时的病毒的生成滴度为比较来表示(即不含GCV时生成的病毒滴度为100％)。由图可见，GCV浓度在每毫升100微克时可完全抑制VAE在体外的生长。该结果进一步表明，当采用重组病毒AE618进行基因治疗时，一旦病毒增殖失控，可采用常规的抗疱疹病毒治疗剂GCV来抑制AE618的增殖，从而进一步增加重组病毒AE618的基因治疗安全性。

结果讨论

抗血管生成是一条治疗人类肿瘤有希望的途径。血管抑素和内皮抑素显示出能有效的抑制原发性肿瘤和转移瘤中的新血管形成。在临床应用中，这种治疗途径的主要局限在于如何在肿瘤部位获得达到治疗水平的蛋白：根据血管抑素和内皮抑素在动物实验中的剂量推算，血管抑素的有效剂量应为没人每天0.1至1.0g以上，内皮抑素的剂量应约为20mg/kg.d；因此如何获得大量、高纯度、高活性的血管抑素和内皮抑素是目前急需解决的问题。在本发明中，我们将血管抑素和内皮抑素融合蛋白基因整合至一有效复制的肿瘤裂解性HSV-1载体G207，从而构建得到了一种新的重组病毒，将其命名为AE618。当重组病毒AE618在感染的肿瘤细胞内复制时，宿主肿瘤细胞同样能分泌抗血管生产蛋白来防止给实体瘤提供养分的血管的生长。同时，由于AE618是一种裂解性病毒，一旦其感染的肿瘤细胞由于病毒复制而发生裂解时，释放的病毒粒子将可能感染更多的邻近的细胞从而能产生更多的抗血管生成蛋白。我们的实验数据证实，由AE618感染的肿瘤细胞可分泌足够的抗血管生成蛋白。由感染了AE618的细胞分泌的蛋白可显著抑制人内皮细胞的生长。同时，AE618仍然保持了其亲本病毒G207的裂解肿瘤的特性。这两种治疗途径的组合将有利于其临床上应用于癌症基因治疗。由于重组病毒AE618的高肿瘤特异性选择复制和较低的组织毒性，AE618可成为一种用于肺癌治疗的潜在的安全性药物。

在本发明的双层培养系统中，与感染了G207的H460肺癌细胞共培养的存活的HUVEC细胞的数目显著低于空白对照，这表面人γIgG不能完全的保护HUVEC使其免受G207或AE618引起的细胞毒性。但是计数结果同样表明，尽管采用相同的滴度来处理，重组病毒AE618仍然显示出显著高于G207的对HUVEC生长的抑制，这表明由H460细胞分泌的endo:angio融合蛋白的确具有抑制血管生成的作用。然而，由于病毒对HUVEC造成的的至细胞病变可能，分泌的融合蛋白的效果可能被低估了。我们的体内实验结果证实，与G207相比，AE618对于SCID鼠中的人类肿瘤生长具有显著的抑制作用。

综上所述，本发明中的AE618能有效的在临床上用于肺癌的治疗。

附表1：

Endo:Angio融合基因DNA序列：

斜体：氨基端信号肽

带下划线部分：抗内皮细胞因子基因

连接肽

正常字体部分：抗血管生成因子基因

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGGCC CACAGCCACCGCGACTT

CCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGT

GCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGC

ATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCT

GTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCA

CCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGG

ACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCA

TCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAG

GTGT

ATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAA

AAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTG

CAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTC

TTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAA

TGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAA

TTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGTGACA

TCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGG

AATGTGGCTGTTACCGTGTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGA

AAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCA

ACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACA

GCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCAC

CACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATG

CTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGG

TGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTATGA

Claims

1.一种可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒，其特征在于所述的单疱疹病毒HSV-1的两个ICP34.5基因均被部分缺失，并在其非复制所必须的基因内部插入血管抑素和内皮抑素融合基因使该基因失活。

2.如权利要求1所述的重组单疱疹病毒，其中所述的非复制所必须的基因为ICP6基因。

3.如权利要求2所述的重组单疱疹病毒，其能选择性的在肺癌肿瘤细胞内复制。

4.如权利要求2所述的重组单疱疹病毒，其能通过病毒复制的方式选择性的在肺癌肿瘤内扩散，能感染至靶细胞以外的肿瘤细胞。

5.如权利要求2所述的重组单疱疹病毒，其能通过病毒复制的方式裂解性的杀死分裂旺盛的肺癌肿瘤细胞。

6.如权利要求2所述的重组单疱疹病毒，其合成的血管抑素和内皮抑素融合蛋白能有效的分泌并抑制血管生成，从而抑制肺癌肿瘤的生长。

7.如权利要求2所述的重组单疱疹病毒，其为温度敏感突变株，在高于39.5℃的条件下所述的重组病毒增殖失活。

8.如权利要求2所述的重组单疱疹病毒，其对常规抗病毒药物AVC、GVC敏感，常规抗病毒药物AVC、GVC可抑制所述重组单疱疹病毒的生长。

9.一种构建可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒的方法，其步骤是：

1)部分缺失单疱疹病毒HSV-1的两个ICP34.5基因；

10.一种药物组合物，其含有如权利要求1-8中任意一项所述的重组单疱疹病毒作为活性成分。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述的药物组合物可以是注射剂、喷射剂及其他常规的药物剂型形式。

12.一种可分泌血管抑素和内皮抑素蛋白的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于所述的单疱疹病毒HSV-1的两个ICP34.5基因均被部分缺失，并在其ICP6基因的内部插入血管抑素和内皮抑素融合基因使ICP6基因失活。

13.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗和预防肺癌复发的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒能选择性的在肺癌肿瘤细胞内复制。

14.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒能通过病毒复制的方式选择性的在肺癌肿瘤内扩散，能感染至靶细胞以外的肿瘤细胞。

15.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒能通过病毒复制的方式裂解性的杀死分裂旺盛的肺癌肿瘤细胞。

16.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒分泌的血管抑素和内皮抑素融合蛋白能有效的抑制血管生成，从而抑制肺癌肿瘤的生长。

17.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒为温度敏感突变株，在高于39.5℃的条件下所述的重组病毒增殖失活，从而提高基因治疗的安全性。

18.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒对常规抗病毒药物AVC、GVC敏感，可通过常规抗病毒药物AVC、GVC来抑制所述重组单疱疹病毒的生长，从而提高基因治疗的安全性。

19.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒可与各种常规的其他抗癌药物或手术、放疗、化疗药物联合应用。

20.如权利要求12所述的重组单疱疹病毒在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述的重组单疱疹病毒通过局部或全身注射的方式给药。