KR20080032562A - 안전성이 향상된 레트로바이러스 벡터 - Google Patents

안전성이 향상된 레트로바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안전성 및 바이러스의 역가를 고려하여 최적의 U3 부위만을 결실시킨 뮤린 류케미아 바이러스 (murine leukemia virus; MLV)-유래 재조합 레트로바이러스 벡터에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 MLV의 LTR (long terminal repeat)의 U3 부분의 뉴클레오티드 번호 x에서 y까지가 결실된 (상기에서, x는 7800 내지 7900이고, y는 8100 내지 8260 임) MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 바이러스 벡터는 표적 세포의 주변 유전자를 활성화시킬 가능성이 낮아 안전하면서도 바이러스 역가 및 목적 유전자의 발현율은 높게 유지하므로 유전자 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

안전성이 향상된 레트로바이러스 벡터 {RETROVIRAL VECTORS WITH IMPROVED SAFETY}
도 1은 실시예 1에서 제조한 플라스미드의 구조를 나타낸 것이고,
도 2는 실시예 1에서 제조한 플라스미드를 K562 세포에 형질감염시킨 후 노던 블롯팅으로 CAT mRNA의 발현량을 확인한 결과이고,
도 3은 실시예 2에서 LTR 제거 과정을 나타낸 것이고,
도 4는 실시예 2에서 제조한 플라스미드 형태의 레트로바이러스 벡터 pI-D1 내지 pI-D5의 결실 부위를 나타낸 것이고,
도 5는 실시예 3의 pI-LND-n의 구조를 나타낸 것이고,
도 6a 및 6b는 실시예 3의 pC-LND-GFP-n의 구조 및 이를 이용한 293T 세포에서의 레트로바이러스의 생산과 형질도입 과정을 각각 나타낸 것이고,
도 7은 실시예 3에서 293T 세포로부터 얻은 C-LND-GFP-n 레트로바이러스의 HT1080 세포에서의 유전자 발현을 확인한 FACS 분석 결과로서, 도면 중의 MFI는 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity)를 의미하며,
도 8a 및 8b는 선형화된 실시예 3의 pC-LND-GFP-n의 구조 및 이를 이용한 생산세포주 PG13에서의 레트로바이러스의 생산과 형질도입 과정을 각각 나타낸 것이 고,
도 9는 실시예 3에서 생산세포주로부터 얻은 C-LND-GFP-n 레트로바이러스의 HT1080 세포에서의 유전자 발현을 확인한 FACS 분석 결과이며,
도 10은 실시예 3에서 생산세포주로부터 얻은 C-LND-GFP-n 레트로바이러스의 K562 세포에서의 유전자 발현을 확인한 FACS 분석 결과이다.
본 발명은 바이러스의 역가 및 목적 유전자의 발현 효율을 유지하면서 안전성을 향상시킨 뮤린 류케미아 바이러스 (murine leukemia virus; 이하 MLV)-유래 재조합 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.
레트로바이러스 벡터는 표적 세포의 염색체 내로 삽입되어 세포가 분열하여도 유전자가 사라지지 않고 계속 자손 세포로 전달될 수 있으므로, 지속적인 유전자 발현을 필요로 하는 질환, 특히 유전병의 치료에 널리 사용되어 왔다. 유전자 치료에 사용되는 대부분의 레트로바이러스 벡터는 MLV 게놈을 기본 게놈으로 사용하고 있는데, 이러한 레트로바이러스 벡터는 안전성과 유전자 발현량, 바이러스 역가 등에서 많은 개선을 필요로 한다.
특히, 상기 벡터가 표적 세포의 염색체로 삽입되는 과정은 비특이적으로 일어나기 때문에 중요 유전자 주변에 삽입되었을 경우 치명적인 부작용을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 LTR (long terminal repeat)에는 주변 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 전사 조절 서열이 존재하는데, 레트로바이러스 벡터가 종양 유전자 주변에 삽입되면, LTR에 의해 종양 유전자 발현이 증가되어 암을 유발할 수 있다. 그 실례로서 2003년 초반, 선천성 면역결핍증인 X-SCID (X-linked severe combined immunodeficiency)의 치료를 위하여 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 치료를 받은 환자 중 일부에서 백혈병 증세가 나타났다. 후에, 유전자치료에 사용된 레트로바이러스 벡터가 백혈병 발생과 관련이 있다는 보고가 나오면서 (Hacein-Bey-Abina 등, Science 302:415-9, 2003) 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 치료에서 삽입 돌연변이의 가능성이 중요한 문제로 대두되게 되었다.
상기와 같은 삽입 돌연변이에 의한 부작용을 낮추는 방법으로서 주로 제시되는 방법은 레트로바이러스 벡터의 LTR에 존재하는 전사 조절 서열을 제거하는 것이다. LTR은 U3, R 및 U5의 세 부분으로 구성되어 있는데, 그 중 U3 (NCBI 등록번호 J02255를 기준으로 7816 내지 8264의 핵산에 해당)에는 상류 조절 구역 (upstream control region) 및 반복 부위 (direct repeat)를 포함하는 인핸서; 및 CAAT 박스 및 TATA 박스를 포함하는 프로모터가 존재한다 (Sun 등, J Virol 69:4941-9, 1995; 및 Wahlers 등, Mol Ther 6:313-20, 2002). 따라서, 레트로바이러스 벡터로부터 U3 부분을 제거하면 주변 유전자를 활성화시키는 것을 방지할 수 있으며, 다양한 방식으로 U3을 제거한 사례들이 보고되고 있다. 예를 들어, Yu 등 (Yu 등, Proc Natl Acad Sci USA 83:3194, 1986)은 MLV 벡터의 3'LTR의 PvuII 부위부터 SacI 부 위까지 (NCBI 등록번호 J02255 기준, 핵산 7938 내지 8233에 해당)를 제거하였다. 이 경우, 인핸서 부분의 반복 부위 (direct repeat)와 프로모터 부분의 CAAT 박스가 제거된다. 또한, Yee 등 (Yee 등, Proc Natl Acad Sci USA 84:5197, 1987)은 MLV 벡터의 LTR에서 인핸서, CAAT 박스, 및 TATA 박스 부위 (NCBI 등록번호 J02255 기준, 핵산 7909 내지 8240에 해당)를 제거한 벡터를 만들었다.
이렇게 U3를 제거한 벡터의 경우 주변 유전자를 활성화시키는 능력이 감소하기는 하지만, 목적 유전자의 발현을 위해 넣어주는 내부 프로모터에 의해 주변 유전자가 활성화될 가능성이 여전히 존재한다. 따라서, 내부 프로모터에 의한 영향을 차단하기 위한 인슐레이터 (insulator) 서열을 삽입하기도 하고 (Ramezani 등, Mol Ther 14:245-54, 2006), 내부 프로모터에 의해 발현되는 유전자가 전사 종결 위치에서 멈추지 않고 계속 전사되어 주변 유전자를 발현시키는 것을 막기 위해 폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 서열을 추가로 삽입하기도 한다 (Ramezani 등, Mol Ther 14:245-54, 2006).
하지만, 이렇게 벡터의 안전성을 높이기 위해 U3 부위를 제거하거나 인슐레이터 서열, 폴리아데닐레이션 서열을 추가로 넣을 경우 바이러스의 역가가 낮아지는 문제가 발생한다.
이에 본 발명자들은 레트로바이러스 벡터의 안전성을 확보하면서도 바이러스의 역가 및 목적 유전자의 발현율을 저하시키지 않는 벡터의 개발에 예의 연구 노력한 결과, 표적 세포의 주변 유전자에 대한 영향은 최소화하면서 바이러스 역가도 유지할 수 있는 LTR의 최적 결실 부위를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 바이러스의 역가 및 목적 유전자의 발현 효율을 유지하면서 안전성을 향상시킨 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뮤린 류케미아 바이러스 (murine leukemia virus, MLV)의 LTR (long terminal repeat)의 U3 부분의 뉴클레오티드 번호 x에서 y까지가 결실된 (상기에서, x는 7800 내지 7900이고, y는 8100 내지 8260 임) MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터; 및 (2) 선별 표지 유전자, 이에 작동가능하게 연결된 이종 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 재조합 플라스미드를 제공한다.
아울러, 상기 MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 상기 재조합 플라스미드를 포함하는 재조합 레트로바이러스 생산세포주; 상기 생산세포주를 배양하여 재조합 레트로바이러스를 생산하는 방법; 및 상기 생산세포주로부터 생산된 재조합 레트로바이러스로 형질감염된 세포를 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 이종 유전자 및 이와 작동가능하게 연결된 이종 프로모터; 및 MLV의 LTR의 U3 부분의 뉴클레오티드 번호 x에서 y까지가 결실된 MLV-유래 재조합 레트로바이러스의 게놈을 포함하는 재조합 레트로바이러스 (상기에서, x 는 7800 내지 7900이고, y는 8100 내지 8260 임)를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터는 LTR의 U3 중 일부가 결실되어 안전성이 향상되었으면서도, 바이러스 역가를 유지할 수 있는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터에서 상기 U3의 결실 부위는 NCBI 등록번호 J02255를 기준으로 하여 뉴클레오타이드 번호 x에서 y까지가 결실되는데, 이때, x는 7800 내지 7900이고, y는 8100 내지 8260이며, 더욱 바람직하게는 x가 7840 내지 7860이고, y가 8100 내지 8244이다. 가장 바람직한 결실 부위는 상기에서 x가 약 7847이고, y가 8113 내지 8208이다.
본 출원에서 "레트로바이러스"는 생활사 중 역전사 과정이 있는 RNA 바이러스를 일컫는다. 레트로바이러스의 게노믹 RNA는 역전사 효소에 의해 이중가닥 DNA로 바뀌고, 이중가닥 DNA 형태의 바이러스는 감염세포의 염색체 내로 삽입될 수 있다. 일단 세포의 염색체 내로 삽입된 후에는 "프로바이러스"라고 불리우며, 이러한 프로바이러스는 RNA 중합효소의 주형으로 사용되어 RNA로 발현될 수 있다.
본 발명에서 "벡터"는 목적 유전자를 세포로 전달할 수 있는 일체의 유전 물질을 말하는데, 이 때 유전물질에는 플라스미드, 파지, 바이러스, 코스미드 등이 포함된다.
또한, "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스에서 유래된 유전 물질을 뜻하며, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 입자 생산을 위해 필요한 시스 서열을 포함한다. 시스 서열은 바이러스의 게노믹 RNA가 바이러스 입자 내로 포장되기 위해 필요한 포장 염기서열 (packaging sequence) 및 프라이머 결합 염기서열 (primer binding site)은 포함하지만, 바이러스 구조 단백질 유전자, 즉, gog, pol, 및 env는 포함하지 않는다. 바이러스 입자 생산을 위한 바이러스 구조 단백질은 포장 구조 (packaging constructs)로부터 제공된다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터에 삽입되어 그 발현을 목적으로 하는 이종 유전자로는 생물학적으로 활성이 있는 단백질이나 폴리펩타이드, 항원성이 있는 단백질이나 폴리펩타이드, 치료 단백질이나 폴리펩타이드를 코드하는 염기서열일 수 있다. 또한, 이종 유전자는 안티-센스 RNA, siRNA (small interfering RNA), 리보자임 등을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 바람직하게는 강화 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescence protein, eGFP), 루시퍼라아제, gp91-phox, IDS (iduronate-2-sulfatase), 아데노신 디아미네이즈 (adenosine deaminase), IL-2 수용체 감마, 각종 사이토카인 (IL-2, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15 등), 호르몬, 항원, 항체, 효소, 면역 활성 물질, 안티-센스 RNA, si RNA, 리보자임이, 더욱 바람직하게는 강화 녹색 형광 단백질 또는 gp91-phox가 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서와 같이 U3 부분이 결실될 경우, 상기 목적의 이종 유전자를 발현시키기 위해서는 별도로 이종 내부 프로모터를 넣어주어야 한다. 이종 내부 프로모터는 본 발명의 레트로바이러스 벡터를 유전자 전달 및 발현을 위해 사용 할 때 목적 유전자의 발현을 촉진시키기 위한 것이며, 5'LTR과 3'LTR 사이의 임의의 위치에 삽입시킬 수 있다.
상기 이종 프로모터로는 인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus, HCMV)의 IE (immediate-early) 프로모터, 인간 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, 인간 EF1-α (elongation factor 1-alpha) 프로모터, 및 인간 베타-액틴 (β-actin) 프로모터가 사용가능하다.
본 발명의 재조합 레트로바이러스 벡터는 공지의 재조합 바이러스 벡터의 제조 방법에 따라 제조가능하며, 5'LTR과 3'LTR 사이에 외래 유전자의 도입을 용이하게 하기 위한 다클로닝 부위 (multicloning site)를 포함하거나, 선형화 (linearization)를 위한 제한효소 자리를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터; 및 (2) 선별 표지 유전자, 이에 작동가능하게 연결된 이종 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 재조합 플라스미드를 제공한다.
이 때 선별 표지 유전자로서 네오마이신 (neomycin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (puromycin) 저항유전자, 하이그로마이신 (hygromycin) 저항유전자, O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제 (MGMT) 유전자, 신호전달 도메인이 제거된 Δ-LNGFR (p75 low affinity nerve growth factor receptor) 유전자 등이 사용될 수 있다.
보다 바람직하게는 본 발명의 재조합 레트로바이러스 벡터는 도 5의 유전자 지도를 갖는 재조합 플라스미드 pI-LND-n이다.
본 발명의 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 플라스미드는 제조 후 이를 적절한 숙주 세포에 공지된 방법에 의하여 형질감염할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 표적 세포 염색체로 삽입시킨 본 발명의 재조합 레트로바이러스 벡터의 주변 유전자에 대한 활성화 능력을 기존의 벡터와 비교하였다.
그 결과, 레트로바이러스 벡터의 LTR 내의 U3의 인핸서 부분만을 제거함으로써, 레트로바이러스 벡터의 숙주염색체로의 삽입 이후에 우려되는 위험성인 주위 유전자 발현의 활성화 가능성을 낮출 수 있다는 사실을 확인하였다 (표 1 및 도 2).
한편, 상기와 같은 사실을 바탕으로 하여 본 발명의 다른 일 실시예에서는, 3'LTR의 U3의 결실 부위를 달리한 다양한 벡터들을 제조한 후, 이들을 MLV의 gag-pol, 긴팔원숭이-유인원 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus)의 env 유전자를 각각 발현하는 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질감염 (transfection)시키고 이로부터 얻은 바이러스액을 인간 섬유육종 (fibrosarcoma) 세포주에 형질도입하여 바이러스 역가를 확인한 결과, NCBI 등록번호 J02255 기준으로 하여, 뉴클레오타이드 번호 7847에서 8113까지가 결실된 벡터 (pI-D1-SV-Neo), 7847에서 8161까지가 결실된 벡터 (pI-D2-SV-Neo) 및 7847에서 8208까지가 결실된 벡터 (pI-D3-SV-Neo)의 바이러스 역가가 야생형 U3을 갖는 대조군과 유사한 수치임을 확인하였다 (표 2 및 표 3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 pI-D2-SV-Neo 벡터를 유전자치료에 적합한 형태로 개조하여 이를 293T 세포 및 포장세포주 PG13 세포에 형질감염시켜 바이러스 역가를 확인하였으며, 그 결과 생산세포주에서도 만족할 만한 바이러스 역가를 얻을 수 있음을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명은 상기 MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 상기 재조합 플라스미드를 포함하는 재조합 레트로바이러스 생산세포주; 상기 생산세포주를 배양하여 재조합 레트로바이러스를 생산하는 방법; 및 상기 생산세포주로부터 생산된 재조합 레트로바이러스로 형질감염된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 이종 유전자 및 이와 작동가능하게 연결된 이종 프로모터; 및 MLV의 LTR의 U3 부분의 뉴클레오티드 번호 x에서 y까지가 결실된 MLV-유래 재조합 레트로바이러스의 게놈을 포함하는 재조합 레트로바이러스 (상기에서, x는 7800 내지 7900이고, y는 8100 내지 8260 임)를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체로서 부형제 또는 희석제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 이용한 통상의 유전자 치료에서와 같이, 본 발명의 재조합 레트로바이러스 벡터로 형질감염된 세포를 이용하여 생체외 (ex vivo) 유전자 치료를 수행할 수 있다. 정확한 투여량은 환자의 상태, 질병의 종류, 병용되는 약물에 따라 달리 적용하는 것이 바람직하고, 이러한 투여량은 전임상 및 임상 1상을 통하여 결정된다.
이와 같이, 본 발명의 재조합 MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터는 표적 세포의 주변 유전자를 불필요하게 활성화시킬 가능성이 낮아 안전하면서도, 바이러스 역가가 높고 목적 유전자의 전달효율이 우수하여 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> U3 결실 벡터의 제조
숙주 염색체로의 삽입 이후에 주위 유전자에 대한 활성화 가능성을 최대한 낮춘 구조의 레트로바이러스 벡터를 개발하기 위하여 U3의 인핸서 부분을 제거한 벡터를 제조하고, 이 벡터의 주위 유전자에 대한 활성화 능력을 기존의 벡터와 비교하였다.
레트로바이러스 벡터는 숙주 세포의 염색체에 무작위로 삽입하는 특징이 있다. 따라서, 일반 레트로바이러스 벡터를 사용할 경우 주위 유전자에 대한 활성화 영향을 동일한 조건에서 비교하는 것이 불가능하다. 동일한 조건에서의 비교를 위해 한 플라스미드에 레트로바이러스 벡터와 그에 영향을 받을 수 있는 유전자의 프로모터, 유전자 발현 수준을 정량화할 수 있는 마커 유전자를 넣고 세포에 전달한 후 마커 유전자의 활성을 비교하였다. 이와 같은 방법을 사용하면 다양한 구조의 레트로바이러스 벡터가 특정 프로모터 및 유전자에 대해 같은 위치에 삽입되어 있는 상황을 만들 수 있다. 따라서, 레트로바이러스 벡터 구조가 특정 프로모터에 미치는 영향을 특정 유전자의 발현양을 통하여 정량적으로 비교할 수 있게 된다.
(단계 1) pNRT-CAT 플라스미드의 제조
레트로바이러스 벡터 및 그 주변 염기서열의 구성은 2003년 보고된 X-SCID 유전자치료에서 발생한 백혈병 환자의 경우와 비슷하게 제조하였다 (Kohn 등, Nat Rev Cancer 3:477-88, 2003). 즉, 레트로바이러스 벡터 부분의 하류 5.0 kb에 인간 LMO2 유전자의 프로모터 상류 염기서열 및 프로모터 부분, 5'UTR (untranslated region)을 차례로 위치시켰다. 0.43 kb 크기의 5'UTR은 LMO2 전사에 중요한 염기서열을 포함하는 것으로 알려져 있다 (Crable 등, Blood 101:4757-64, 2003). 레트로바이러스 서열 내부에는 GFP-IRES-Neo 발현 카세트를 삽입하여 플라스미드가 전달된 세포의 선별이 가능하도록 하였다. LMO2의 5'UTR 하류에는 CAT 유전자를 삽입하여 CAT 유전자의 발현량을 통해 각 구조의 레트로바이러스 벡터의 활성화 가능성을 정량적으로 분석할 수 있도록 하였다.
(단계 2) pUC-LMO2P의 제조
먼저, K562 세포 (ATCC CCL-243)의 게놈 DNA로부터 LMO2 유전자의 프로모터 상류 부분, 프로모터 및 5'UTR 부분을 클로닝하기 위하여, 서열번호 1 및 2의 프라 이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 주형 DNA 1㎕ (K562 세포의 게놈 DNA 100 ng), 10 pmol/㎕ 프라이머 각 1㎕, 10mM dNTP 5㎕, 확장 고성능 효소 (Expand High Fidelity enzyme; Gibco BRL, USA) 3.5 유닛과 효소용 완충용액 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕의 반응액을 만든 후, 이를 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 반응으로 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 마지막으로 증폭시켰다.
증폭된 PCR 산물을 pGemT easy 플라스미드 (Promega, WI, USA)에 서브클로닝하여 pGemT-LMO2P 플라스미드를 제조하였으며, 염기서열 분석을 통해 제조된 플라스미드를 확인하였다. 상기에서 제조된 pGemT-LMO2P 플라스미드를 SalI/SmaI으로 처리하여 얻은 유전자 절편을 pUC18 (Invitrogen, USA)의 SalI/SmaI 위치에 삽입하여 pUC-LMO2P 플라스미드를 제조하였다.
(단계 3) pNRT-CAT 플라스미드의 제조
CAT 유전자와 poly A 신호 부분을 pCN 플라스미드 (Lee 등, Biochem Biophys Res Commun 272:230-35, 2000)로부터 클로닝하기 위하여, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR은 주형 DNA 1㎕ (pCN 플라스미드 100ng), 10 pmol/㎕ 프라이머 각 1㎕, 10mM dNTP 5㎕, 확장 고성능 효소 (Expand High Fidelity enzyme; Gibco BRL, USA) 3.5 유닛과 효소용 완충용액 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕의 반응액을 만든 후, 이를 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 반응으로 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 간 마지막으로 증폭시켰다.
증폭된 PCR 산물을 pGemT easy 플라스미드에 삽입하여 pGemT-CATpA 플라스미드를 제조하였으며, 염기서열 분석을 통해 제조된 플라스미드를 확인하였다. 상기에서 제조된 pGemT-CATpA 플라스미드를 SmaI으로 처리하여 얻은 유전자 절편을, 상기에서 제조한 pUC-LMO2P 플라스미드의 LMO2 5'UTR 하류에 위치한 SmaI 위치에 삽입하여 pNRT-CAT 플라스미드를 제조하였다.
(단계 4) 결실 부위가 상이한 플라스미드들의 제조
상기 단계 3에서 제조된 pNRT-CAT 플라스미드의 가장 상류에 위치한 HindIII/SalI 제한효소 부위에 레트로바이러스 서열을 삽입하여 다양하게 결실된 LTR을 갖는 레트로바이러스 서열을 포함하는 플라스미드들을 제조하였다 (도 1).
우선, pMIN-CAT 레트로바이러스 벡터 (Yu 등, Gene Ther 7:797-804, 2000)의 CAT 유전자를 MluI/BglII으로 처리하여 제거한 후, pMT-GFP 레트로바이러스 벡터 (Hong 등, J Gene Med 6:724-33, 2004)를 MluI/BglII로 처리하여 얻은 GFP 유전자 절편을 삽입하여 pMIN-GFP 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. pMIN-GFP 레트로바이러스 벡터를 HindIII/SalI으로 처리하여 얻은 전체 레트로바이러스 벡터 염기서열을 포함하는 유전자 절편을 pNRT-CAT의 HindIII/SalI 위치에 삽입하여 pMT-CAT 플라스미드를 제조하였다.
pNRT-CAT과 pMT-CAT 이외의 플라스미드들에는 MLV의 LTR 중 U3 일부가 제거된 LTR을 대체하여 제조하였다. U3 결실 LTR은 LTR의 U3 부분 중 32번째 염기서열 부터 298번째 염기서열까지를 제거한 형태이다 (NCBI 등록번호 J02255 기준, 뉴클레오타이드 번호 7847-8113의 총 267 bp의 염기서열이 제거됨). 제거된 부위에는 조절 시스-액팅 조절 서열 (cis-acting regulatory sequence)인 YY1, NFAT, ELP 및 DR (direct repeats)이 존재하며, 이들은 LTR로부터의 전사에 영향을 준다 (Wahlers 등, Mol Ther 6:313-20, 2002).
U3 결실 LTR을 가진 플라스미드를 제조하기 위해서, MLV 유래의 야생형 LTR을 가지는 pMT 레트로바이러스 벡터 (Yu 등, Gene Ther 7:797-804, 2000; 미국특허 제6,451,595호)를 XhoI/SalI으로 처리하여 얻은 3'LTR 유전자 절편을 pUC 플라스미드의 XhoI/SalI 부위에 삽입하여 pUC-3LTR 플라스미드를 제조하였다. pUC-3LTR을 NheI/XbaI으로 처리하여 LTR의 U3 부분을 분리해낸 후, 남은 플라스미드 부분을 자가-라이게이션 (self-ligation)하여 pUC-d3LTR을 제조하였다.
한편, pMT-CAT 플라스미드 제조시에 사용한 pMIN-GFP 벡터를 XhoI/SalI으로 처리하여 3'LTR 부분을 제거한 후, 상기에서 제조한 pUC-d3LTR을 XhoI/SalI으로 처리하여 얻은 U3 결실 3'LTR 유전자 절편을 대신 삽입하여 pMIN-GFP-d3LTR 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 다시 NheI/XbaI으로 처리하여 5'LTR 부분의 U3 부분을 제거한 후, 벡터 부분만을 자가 라이게이션하여 결국 5'과 3'LTR이 모두 결실된 형태의 pMIN-GFP-dLTR 플라스미드를 제조하였다. 그 후, pMIN-GFP-dLTR 플라스미드를 HindIII/SalI으로 처리하여 레트로바이러스 벡터 부분만을 분리해 낸 후, 이를 pNRT-CAT의 HindIII/SalI 위치에 삽입하여 pI-D-CAT을 제조하였다.
pI-D-CAT 제조 과정 중 제작한 상기 pMIN-GFP-dLTR 플라스미드에 다시 XhoI/SalI을 처리한 후, 여기에 pMIN-GFP 벡터를 XhoI/SalI으로 처리하여 얻은 3'LTR 유전자 절편을 삽입하여 pMIN-GFP-d5LTR 벡터를 제조하였다. 그 후, pMIN-GFP-d5LTR 벡터를 HindIII/SalI을 처리하여 레트로바이러스 벡터 부분만을 분리해 낸 후, 이를 pNRT-CAT의 HindIII/SalI 위치에 삽입하여 p5'-I-D-CAT을 제조하였다.
p3'-I-D-CAT 플라스미드는 상기 pMIN-GFP-d3LTR 벡터를 HindIII/SalI으로 처리하여 레트로바이러스 벡터 부분만을 분리해 낸 후, 이를 pNRT-CAT의 HindIII/SalI 위치에 삽입하여 제조하였다.
pC-D-CAT 플라스미드는 pMIN-GFP-dLTR 벡터의 MluI/BamHI 위치에 HCMV IE 프로모터가 삽입된 형태이다. pCN 플라스미드 (Lee 등, Biochem Biophys Res Commun 272:230-35, 2000)를 MluI/BamHI 제한효소 처리하여 얻은 HCMV의 IE 프로모터 유전자 절편을 pMIN-GFP-dLTR 벡터에 삽입하여 pMIN-C-GFP-dLTR 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 HindIII/SalI으로 처리하여 레트로바이러스 벡터 부분만을 분리해 낸 후, pNRT-CAT의 HindIII/SalI위치에 삽입하여 pC-D-CAT을 제조하였다.
<시험예 1> 주변 유전자 CAT의 발현율 측정-CAT 분석법
제조된 상기 플라스미드 각 10 ㎍씩을 NdeI 제한효소를 이용하여 선형화한 후, K562 세포 (ATCC CCL-243)에 전기천공법 (electroporation)으로 도입 (BIORAD, USA)하고, 1일 후부터 G418 sulphate (Gibco-BRL, NY, USA)가 함유된 배지에서 키워, NEO를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 세포만을 선별하였다. 약 2주 후, 각 플라스미드별로 선별된 세포군을 수확하여 CAT 유전자의 발현을 하기와 같이 비 교하였다 (Gorman 등, Mol Cell Biol 2:1044-51, 1982).
각각의 플라스미드를 가진 선별된 세포군을 회수하여 PBS 완충액으로 세척한 후, 0.25M Tris-HCl (pH 7.5)로 현탁시켰다. 이 세포군을 총 5회의 연속된 동결-해동 과정을 통하여 용해시킨 후, 65℃에서 7분간 유지시켜 CAT 단백질 이외의 효소를 불활성화하는 과정을 거친 다음, CAT 유전자 발현량 비교 시험 (CAT 분석법)에 사용하였다. 각각 25 ㎍의 세포 단백질을 2 ㎕의 아세틸-CoA (40 mM)와 1 ㎕의 C14-클로람페니콜과 반응시킨 후 (30분 내지 1시간), 400 ㎕의 에틸-아세테이트를 이용하여 반응에 사용한 클로람페니콜을 회수하였다. 회수된 물질은 진공상태의 원심분리를 통하여 농축한 후, 최종 15 ㎕의 에틸-아세테이트에 녹인 후, 박층 크로마토그래피 (thin-layer chromatography; TLC) 플레이트에 점적하여 전개액 (95% 클로로폼, 5% 메탄올) 에서 30분간 전개하였다. 전개 후, 전체 클로람페니콜의 양에 대한 아세틸화된 클로람페니콜의 비율을 방사형광분석기 (phosphoimager; FUJIX BAS 1000)를 이용하여 정량화하였다. 이때, 각 시험군의 결과를 pNRT-CAT의 결과를 1로 환산하여 상대적으로 계산하여 표시하였으며, 모든 경우에 3회 이상의 시험을 실시한 후, 평균과 표준 편차를 구하였다.
Figure 112006073236382-PAT00001
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 양쪽 LTR 모두 야생형의 LTR을 가진 pMT-CAT의 경우, CAT 유전자의 활성은 레트로바이러스 벡터를 갖지 않는 pNRT-CAT과 비교하여 약 7배 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 실제로 LTR이 염색체 상에서 5.0 kb 정도 상류에 존재하는 상황에서도, 하류에 있는 세포의 프로모터의 유전자 발현을 유도할 수 있음을 의미한다.
pI-D-CAT의 경우 매우 낮은 CAT 발현율을 보이는데, 이는 5'과 3'의 양 LTR의 U3이 결실된 형태의 레트로바이러스 벡터는 하류 유전자에 미치는 영향이 극도로 적다는 사실을 의미한다.
결실된 LTR을 사용한 레트로바이러스 벡터를 실제로 유전자 전달 및 발현을 위하여 사용하기 위해서는 목적 유전자의 발현을 촉진시킬 내부 프로모터를 별도로 사용해야 한다. 표 1에서 보는 바와 같이, HCMV 프로모터가 삽입된 pC-D-CAT은 HCMV 프로모터가 삽입되지 않은 pI-D-CAT과 유사한 수준의 낮은 CAT 유전자 발현이 확인되었으며, 이 결과는 레트로바이러스 벡터에서의 내부 프로모터의 사용이 주변 유전자의 활성화에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
또한, U3이 결실된 LTR의 위치에 따라, LMO2 프로모터를 활성화시키는 영향력에 큰 차이를 보였다. 5'LTR의 U3가 결실된 경우 (p5'-I-D-CAT)의 CAT 발현은 pNRT-CAT과 비교하여 약 11배 증가하지만, 3'LTR의 U3가 결실된 경우 (p3'-I-D-CAT)의 CAT 발현은 약 1.6배에 그쳤다. 이 사실은 하류 프로모터에 인접한 LTR (본 실험의 경우에는 3'LTR)의 프로모터 활성화에 미치는 영향이 프로모터로부터 멀리 떨어진 LTR (5'LTR)에 비해 더 크다는 사실을 의미한다.
<시험예 2> 주변 유전자 CAT의 발현율 측정- 노던 블롯팅 분석법
상기 실시예에서 제조한 레트로바이러스 벡터에 의한 CAT 발현 정도를 노던 블롯팅을 이용하여 비교해 보았다. 각 플라스미드로 형질전환된 K562 세포주들로부터 구아니딘 티오시아네이트-세슘 클로라이드 (guanidine thiocyanate-cesium chloride)법을 이용하여 RNA를 분리한 후, 10 ㎍의 RNA를 1%의 포름 알데하이드-아가로즈 겔 (formaldehyde-agarose gel)에서 전기영동하였으며, 이 아가로즈 겔을 니트로셀룰로오스 (NC) 막으로 옮긴 후, 32P로 표지된 CAT 유전자의 전체 염기서열을 프로브로 사용하여 융합반응을 유도하였다. 이 때, 아가로즈 겔에 전개된 RNA량의 차이 유무를, 세포의 베타-액틴 (beta-actin) RNA의 양을 동일한 니트로셀룰로오스 막에서 함께 전개시킴으로써 확인하였다. CAT 유전자의 프로브는 pCN-CAT 플라스미드를 BamHI으로 처리한 후의 유전자 절편을 사용하였고, 베타-액틴 유전자의 프로브는 액틴 cDNA의 EcoRI 처리 후의 유전자 절편을 사용하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 화살표는 세포의 28S, 18S rRNA의 상대적인 위치를 각각 나타내는 것이며, 이 크기는 1%의 아가로즈 겔 상에서 5.02 kb 와 1.86 kb 정도의 위치를 나타내는 표지자로 사용할 수 있다.
실험 결과, 앞서 실시했던 CAT 분석 결과와 유사하게, 야생형 LTR을 레트로바이러스 벡터의 양쪽에 모두 가지고 있는 경우 (2 열: pMT-CAT)와 3'쪽에만 가진 경우 (4 열: p5'-I-D-CAT)에 다른 것과 비교하여 비교적 강한 신호의 CAT mRNA가 감지되었다. 28S와 18S rRNA의 위치를 고려하여 판단할 때에, 결과에서 보이는 두 종류의 RNA 중 아래의 mRNA는 LMO2 프로모터로부터 발현한 것이며, 위의 mRNA는 3'LTR로부터 발현한 것이라고 판단할 수 있다. 이 결과를 통하여 기존의 LTR을 가진 레트로바이러스 벡터에 의해 LMO2 유전자의 활성화가 이루어지고 있음을 mRNA 수준에서 확인할 수 있었다.
<실시예 2> U3 제거 부위가 상이한 레트로바이러스 벡터의 제조
안전성과 높은 바이러스 역가를 획득할 수 있는 LTR의 최적 제거 부위를 알아보기 위하여, LTR 제거 부위가 다른 일련의 레트로바이러스 벡터들을 다음과 같이 제조하였다 (도 3).
pMT (미국특허등록번호 제6,451,595호)를 주형으로 하고 서열번호 5 (SCV3LB)와 6 (SCV3LRI)으로 기재되는 프라이머쌍을 이용해 PCR 방법으로 MLV의 야생형 3'LTR 부분을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM T easy 벡터의 NheI/SalI 부위에 삽입하여, pGEM T easy-3'LTR 플라스미드를 제조하였다. 그리고, 상기 pGEM T easy-3'LTR의 NheI-XbaI 조각을 제거한 뒤 자가-라이게이션을 하여 pGEM T easy-3'dLTR을 만들었다.
pMT를 주형으로 하고, 서열번호 5 (SCV3LB)와 서열번호 7 (3LTR-1)로 기재되는 프라이머쌍으로 증폭된 PCR 산물을 pGEM T easy 벡터의 NheI/SalI 부위에 삽입하여 pGEM T easy-3'dLTR1 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드의 NheI-SalI 조각을 pGEM T easy-3'LTR의 NheI-SalI 위치에 삽입하여 pPreSIN2를 제조하였다.
서열번호 5 (SCV3LB)와 서열번호 8 (3LTR-2)로 기재되는 프라이머쌍으로 증폭된 PCR 산물을 pGEM T easy 벡터의 NheI/SalI 부위에 삽입하여 pGEM T easy-3'dLTR2 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드의 NheI-SalI 조각을 pGEM T easy-3'LTR의 NheI-SalI 위치에 삽입하여 pPreSIN3을 제조하였다.
서열번호 5 (SCV3LB)와 서열번호 9 (3LTR-3)로 기재되는 프라이머쌍으로 증폭된 PCR 산물을 pGEM T easy 벡터의 NheI/SalI 부위에 삽입하여 pGEM T easy-3'dLTR3 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드의 NheI-SalI 조각을 pGEM T easy-3'LTR의 NheI-SalI 위치에 삽입하여 pPreSIN4를 제조하였다.
서열번호 5 (SCV3LB)와 서열번호 10 (3LTR-4)으로 기재되는 프라이머쌍으로 증폭된 PCR 산물을 pGEM T easy 벡터의 NheI/SalI 부위에 삽입하여 pGEM T easy-3'dLTR4 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드의 NheI-SalI 조각을 pGEM T easy-3'LTR의 NheI-SalI 위치에 삽입하여 pPreSIN5를 제조하였다 (도 3).
이후, 상기에서 제조한 pGEM T easy-3'dLTR 플라스미드에서 BamHI-SalI 조각을 얻은 후 BamHI-SalI으로 처리한 레트로바이러스 벡터 pMT에 삽입하여 레트로바이러스 벡터 pI-D1을 제조하였으며, pPreSIN2, pPreSIN3, pPreSIN4 및 pPreSIN5의 BamHI-SalI 조각을 각각 레트로바이러스 벡터 pMT의 BamHI-SalI 위치에 삽입하여 레트로바이러스 벡터 pI-D2, pI-D3, pI-D4 및 pI-D5를 제조하였다 (도 4).
<시험예 3> pSV-Neo 카세트 삽입 후 바이러스 역가 비교
상기 실시예 2에서 제조된 일련의 레트로바이러스 벡터들의 바이러스 역가를 비교하기 위하여, 하기와 같이 각각의 벡터에 pSV-Neo 카세트를 삽입한 뒤 네오마이신 (neomycin)에 저항성을 가지는 콜로니의 개수를 측정하였다.
pDON-AI 벡터 (Takara Bio, Otsu, Japan)를 BamHI-XhoI으로 처리하여 pSV-Neo 카세트를 얻고, 이를 MT 벡터 및 상기 실시예 2에서 제조된 pI-D1, pI-D2, pI-D3, pI-D4, 및 pI-D5 각 벡터의 BamHI-XhoI 위치에 삽입하여 pI-D1-SV-Neo (NCBI 등록번호 J02255 기준으로 하여, 뉴클레오타이드 번호 7847에서 8113까지가 결실된 벡터), pI-D2-SV-Neo (NCBI 등록번호 J02255 기준으로 하여, 뉴클레오타이드 번호 7847에서 8161까지가 결실된 벡터), pI-D3-SV-Neo (NCBI 등록번호 J02255 기준으로 하여, 뉴클레오타이드 번호 7847에서 8208까지가 결실된 벡터), pI-D4-SV-Neo (NCBI 등록번호 J02255 기준으로 하여, 뉴클레오타이드 번호 7847에서 8244까지가 결실된 벡터), 및 pI-D5-SV-Neo 벡터 (NCBI 등록번호 J02255 기준으로 하여, 뉴클레오타이드 번호 7847에서 8264까지가 결실된 벡터)를 제조하였다.
제조한 레트로바이러스 벡터 DNA를 MLV의 gag-pol, 긴팔원숭이-유인원 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus)의 env 유전자를 각각 발현하는 pVM-gp 및 pVM-GeR 플라스미드 DNA (Yu 등, Gene Ther 10:706-11, 2003)와 함께 293T 세포에 형질감염 (transfection) 시키고, 37℃, CO2 배양기 (이산화탄소 분압 5%)에서 10%의 FBS (Fetal bovine serum; Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA, Cat. 26140)가 첨가된 DMEM (CAMBREX, 12-604F) 배양액에서 48시간 배양한 후, 세포 배양액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 세포가 제거된 바이러스 액을 얻었다. 1×105개의 HT1080 세포 (인간 섬유 육종 세포주; ATCC CCL-121)를 60mm 접시에 준비하고 다음날 연속 희석한 바이러스액을 넣어 형질도입 (transduction)한 후 1일 동안 배양하였다. 다음날 형질도입된 HT1080 세포를 100mm 접시로 옮긴 후 1 ㎎/㎖이 되도록 G-418 설페이트 (Gibco, NY, USA)를 첨가하고, 약 2주 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 콜로니 개수를 측정하고, 바이러스 상대 역가를 구하여 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112006073236382-PAT00002
그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이 I-D1과 I-D2가 야생형 LTR을 가진 MT 벡터와 비슷한 수준으로 바이러스를 생산하였다.
<시험예 4> GFP 유전자 삽입 후 바이러스 역가 비교
상기 시험예 3에서 제조된 일련의 레트로바이러스 벡터들에 외래 유전자가 더 삽입되었을 때 바이러스 역가에 어떤 영향을 미치는지 비교하기 위하여, 각각의 벡터에 리포터 유전자 GFP를 삽입한 뒤 바이러스 역가를 하기와 같이 비교하였다.
하기 실시예 3의 단계 2에서 제조된 pGem T easy-eGFP의 BamHI-BglII 조각을 얻은 후, 상기 실시예 2에서 제조된 pI-D1-SV-Neo, pI-D2-SV-Neo, pI-D3-SV-Neo 및 pI-D4-SV-Neo 각각의 BamHI 위치에 삽입하여 pI-D1-GFP-SV-Neo, pI-D2-GFP-SV-Neo, pI-D3-GFP-SV-Neo 및pI-D4-GFP-SV-Neo 벡터를 제조하였다.
제조한 벡터 DNA를 MLV의 gag-pol 및 env 유전자를 각각 발현하는 pVM-gp 및 pVM-AE 플라스미드 DNA (Yu 등, Gene Ther 10:706-11, 2003)와 함께 293T 세포에 형질감염시키고 37℃, CO2 배양기 (이산화탄소 분압 5%)에서 48시간 배양한 후 세포 배양액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 세포가 제거된 바이러스 액을 얻었다. 1×105개의 HT1080 세포를 60mm 접시에 준비하고 다음날 바이러스액 1 ㎕를 넣어 형질도입한 후 1일 동안 배양하였다. 다음날 형질도입된 HT1080 세포를 100mm 접시로 옮긴 후 1 ㎎/㎖이 되도록 G-418 설페이트 를 첨가하고, 약 10일 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 콜로니 개수를 측정하고, 바이러스 상대 역가를 구하여 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112006073236382-PAT00003
상기 시험예 3에서는 I-D1과 I-D2가 야생형 LTR을 가진 MT 벡터와 비슷한 수준으로 바이러스를 생산하였으며, I-D3과 I-D4의 경우에는 바이러스의 역가가 절반 이하로 감소하였다. 하지만 리포터 유전자 GFP를 삽입한 벡터에서는 상기 표 3에 나타난 바와 같이 I-D1-, I-D2-, 및 I-D3-GFP-SV-Neo은 비슷한 수준으로 바이러스를 생산하였으며, I-D4-GFP-SV-Neo의 경우에만 바이러스 역가가 절반이하로 감소하였다.
시험예 3 및 4의 결과를 종합해볼 때, I-D1, I-D2 및 I-D3은 비슷한 수준으로 바이러스를 생산함을 알 수 있다. 하지만, I-D2 및 I-D3이 I-D1에 비해 U3 부위를 더 적게 포함하고 있기 때문에, 레트로바이러스 벡터 삽입에 의한 주변 유전자 활성화의 가능성이 상대적으로 낮다고 유추되므로, I-D2 또는 I-D3 형태의 레트로바이러스를 사용하는 것이 바람직하다고 판단할 수 있다.
<실시예 3> 유전자치료에 적합한 형태의 레트로바이러스 벡터 개발
(단계 1) 레트로바이러스 벡터 pI-LND-n의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 레트로바이러스 벡터 pI-D2를 기반으로 하여 편의성을 극대화한 레트로바이러스 벡터를 개발하였다.
우선, 목적하는 치료 유전자를 레트로바이러스 벡터 pI-D2에 쉽게 클로닝 할 수 있도록 새로운 다-클로닝 부위 (MCS)를 도입하였다. 52 bp 길이의 MCS는 서열번호 11 (NEWMCSF) 및 12 (NEWMCSR)의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용해 주형 없이 중합효소 반응을 하여 제조하였다.
상기 PCR 반응조건으로는 10 p㏖/㎕ 프라이머 각 1 ㎕, 10 mM dNTP 10 ㎕, 확장 고성능 효소 (Expand High Fidelity enzyme; Gibco BRL, USA) 3.5 유닛과 효소용 완충용액 10 ㎕를 혼합하여 총 100 ㎕의 반응액을 만든 후, 이를 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 반응으로 1회 수행하였다. 이로부터 증폭된 조각은 MluI, PmeI, SacII, EcoRI, BamHI, DraIII, StuI, BglII, 및XhoI의 제한효소 자리를 가지고 있으며 이 조각을 pGEM T easy 벡터에 삽입하여 pGEM T easy-nMCS 플라스미드를 제조하였다. 염기 서열이 맞는지 시퀀싱을 통해 확인한 후에 MluI-XhoI 조각을 pI-D2의 MluI-XhoI 자리에 삽입하여 pI-ND를 제조하였다.
한편, 야생형 LTR을 가진 레트로바이러스 벡터 생산세포주는 형질도입 (transduction) 또는 형질감염 (transfection)의 두 가지 방법을 모두 사용하여 제조할 수 있는데, U3 부위가 결실된 레트로바이러스 벡터의 생산세포주를 만들기 위해서는 플라스미드 DNA 형태의 레트로바이러스 벡터를 형질감염 방법에 의해 포장세포주의 게놈에 도입하여야한다. 왜냐하면, U3 부위가 결실된 레트로바이러스 벡터의 경우에는 한 번 형질도입을 하고 나면 양 LTR의 U3이 모두 결실되어 더 이상 바이러스의 게노믹 RNA를 만들 수 없기 때문이다. 또한, 형질감염 방법으로 생산세포주를 만들고자 하는 경우, DNA 구조를 온전히 유지하면서 게놈에 삽입하기 위하여, 플라스미드 DNA 형태의 레트로바이러스 벡터를 선형화 (Linearization) 하는 과정이 반드시 필요하다. 이에 본 실시예에서는 선형화를 위한 제한효소 부위를 다음과 같이 도입하였다.
선형화를 위한 제한효소 부위를 포함한 두 개의 조각 L1 및 L2를 각각 5'LTR의 앞쪽과 3'LTR 뒤쪽의 약 200bp 떨어진 곳에 각각 삽입하였다. L1 조각은 주형 없이 서열번호 13 (L1F) 및 14 (L1R)의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용해 상기와 동일한 조건에서 중합효소 반응을 수행하여 제조하였다.
이로부터 증폭된 조각은 SapI, PmlI, BclI, SwaI, BstBI, 및 SapI의 제한효소 자리를 가지고 있으며 이 조각을 pGEM T easy 벡터에 삽입하여 pGEM T easy-L1 플라스미드를 제조하였다.
L2 조각은 pUC18 (Promega, WI, USA)을 주형으로 하여 서열번호 15 (L2F) 및 16 (L2R)의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용해 PCR 반응으로 증폭하여 제조하였다.
상기 PCR 반응조건으로는 주형 DNA 1 ㎕, 10 p㏖/㎕ 프라이머 각 1 ㎕, 10 mM dNTP 10 ㎕, 확장 고성능 효소 (Expand High Fidelity enzyme; Gibco BRL, USA) 3.5 유닛과 효소용 완충용액 10 ㎕를 혼합하여 총 100 ㎕의 반응액을 만든 후, 이를 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 반응으로 30회 반복하였다. 이로부터 증폭된 조각은 StuI, BstEII, SfiI, PmlI, BclI, SwaI, 및 SspI의 제한효소 자리를 가지고 있으며, 이 조각을 pGEM T easy 벡터에 삽입하여 pGEM T easy-L2 플라스미드를 제조하였다. L1과 L2의 염기 서열이 맞는지 시퀀싱을 통해 확인한 후 pGEM T easy-L1의 SapI 조각을 pI-ND의 SapI 위치에, pGEM T easy-L2의 StuI-SspI 조각을 pI-ND의 SspI 위치에 각각 삽입하여 pI-LND를 제조하였다.
또한, 역가가 높은 바이러스 생산세포주를 제조하기 위해서는 레트로바이러스 벡터 DNA를 포함하는 세포만을 골라낼 필요가 있다. 이러한 목적으로 선별 표지 유전자가 종종 사용되는데, 레트로바이러스 벡터 내에 선별 표지 유전자가 포함될 경우, 이후 생체 내에 벡터 또는 벡터를 포함하는 세포가 주입되었을 때에 선별 표지 유전자에 대한 면역 반응 때문에 벡터 또는 벡터를 포함하는 세포가 오래 유지되지 못하고 사라질 가능성이 있다. 따라서, 벡터를 유전자 치료에 사용하기 위해서는 벡터 내부에는 선별 표지 유전자가 포함되지 않는 것이 바람직하다.
본 실시예에서는 레트로바이러스 벡터의 생산세포주 선별 과정을 용이하게 하기 위하여 선별 유전자를 레트로바이러스 벡터 게놈의 외부에 도입하였다. 선별 유전자로는 네오마이신 (neomycin) 저항 유전자를 사용하였다. 네오마이신 저항성 유전자를 발현시키기 위해 다음과 같은 방법으로 발현 카세트 (expression cassette)를 제조하였다.
우선, K562 세포주에서 얻은 게놈 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 17 (BApF) 및 18 (BApR)의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용해 PCR 증폭하여 인간 베타 액틴 프로모터를 클로닝하였다.
상기 PCR 반응조건은 상기에서 L2 조각의 제조시 사용된 것과 동일하다. 이로부터 증폭된 조각을 pGEM T easy 벡터에 삽입하여 pGEM T easy-pBA 플라스미드를 제조하였다. 시퀀싱을 통해 염기 서열이 맞는지 확인하였다.
네오마이신 저항성 유전자와 폴리아데닐레이션 시그널 (polyadenylation signal; pA)이 연결되어 있는 조각은 다음과 같이 제조하였다.
네오마이신 저항성 유전자는 pcDNA 3.1 (Invitrogen, CA, USA)을 주형으로 하여 서열번호 19 (Neo 5) 및 20 (Neo 3)의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용해 PCR 반응으로 증폭하여 만들었다.
상기 PCR 반응조건은 실시예 3에서 L2 조각의 제조시 사용된 것과 동일하다. 이로부터 증폭된 조각을 pGEM T easy 벡터에 삽입하여 pGEM T easy-Neo 플라스미드를 제조하였다. 시퀀싱을 통해 염기 서열이 맞는지 확인하였다.
폴리아데닐레이션 시그널 (polyadenylation signal; pA)은 pTet-On (Clontech, TAKARA bio, Japan)을 주형으로 하여 서열번호 21 (SVpA 5) 및 22 (SVpA 3)의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용해 PCR 반응으로 증폭하여 만들었다.
상기 PCR 반응조건은 위와 동일하다. 이로부터 증폭된 조각을 pGEM T easy 벡터에 삽입하여 pGEM T easy-pA 플라스미드를 제조하였다. 시퀀싱을 통해 염기 서열이 맞는지 확인하였다.
pGEM T easy-pA의 XhoI-NdeI 조각을 pGEM T easy-Neo의 XhoI-NdeI 위치에 삽입하여 pGEM T easy-Neo-pA를 제조하였다.
pGEM T easy-Neo-pA의 BglII-NdeI 조각을 pGEM T easy-pBA의 BamHI-NdeI 위치에 삽입하여 pGEM T easy-pBA-Neo-pA를 제조하였다. 그리고, pGEM T easy-pBA-Neo-pA에서 얻은 MluI-EcoRI 조각의 말단을 클레노우 (Klenow) 효소로 평활화시킨 뒤, 레트로바이러스 벡터 pI-LND의 SspI 위치에 삽입하여 pI-LND-n 벡터를 제조하였다 (도 5).
(단계 2) 레트로바이러스 벡터 pC-LND-GFP-n의 제조
상기 (단계 1)에서 제조된 pI-LND-n 벡터는 목표 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 가지고 있지 않으므로, 목표 유전자를 발현시킬 수 있도록 내부 프로모터를 별도로 도입하였다. pCN (Lee 등, Biochem Biophys Res Commun 272:230-35, 2000) 로부터 인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus; HCMV)의 IE (immediate-early) 프로모터를 포함하는 MluI-BamHI 조각을 얻고, 이 조각을 pI-LND-n의 MluI-BamHI 위치에 삽입하여 pC-LND-n을 제조하였다.
상기와 같은 과정으로 제조된 pC-LND-n 벡터의 유전자 발현 능력을 확인하기 쉽도록 리포터 유전자로 강화 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescence protein; eGFP)을 삽입하였다. eGFP 유전자는 pIRES2-EGFP (CLONTECH Laboratory, Palo Alto, CA, USA, Cat. #6029-1)로부터 서열번호 23 (eGFP5)및 24 (eGFP3)의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용해 PCR 반응으로 증폭하여 만들었다. 상기 PCR 반응조건은 상기에서 L2 조각의 제조시 사용된 것과 동일하다.
이로부터 증폭된 PCR 산물을 pGEM T easy 벡터에 삽입하여 pGEM T easy-eGFP 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드의 BamHI-BglII 조각을 레트로바이러스 벡터들의 BamHI 위치에 삽입하였다. pGEM T easy-eGFP의 BamHI-BglII 조각을 pC-LND-n의 BamHI 위치에 삽입하여 pC-LND-GFP-n을 제조하였다 (도 6a).
<시험예 5> 293T 세포에서의 C-LND-GFP-n의 성능 확인
상기 실시예 3의 (단계 2)에서 제조한 레트로바이러스 벡터 pC-LND-GFP-n의 성능을 알아보기 위해서 이 벡터 DNA를 MLV의 gag-pol 및 env 유전자를 각각 발현하는 pVM-gp 및 pVM-AE 플라스미드 DNA (Yu 등, Gene Ther 10:706-11, 2003)와 함께 293T 세포에 형질감염시켜 바이러스를 생산하였다. 형질감염 후 8시간 뒤에 배지 (10% FBS가 첨가된 DMEM 배지)를 교환하고, 37℃, CO2 배양기 (이산화탄소 분압 5%)에서 다시 48시간 동안 배양한 후, 세포 배양액을 얻어 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 세포가 제거된 바이러스 액을 얻었고, 이 액의 C-LND-GFP-n 레트로바이러스를 HT1080 세포주에 다음과 같이 형질도입하였다.
1×105 개의 HT1080 세포들을 형질도입하기 하루 전에 60 mm 접시에 깔아주었다. 상기에서 획득한 바이러스액 500 ㎕를 폴리브렌 (polybrene; 최종 8 ㎍/㎖)과 함께 넣어주고 48시간 배양한 후 세포들을 수확하여 FACS 분석을 통해 분석하였다 (도 6b).
FACS 분석은 다음과 같은 방법으로 실시하였다: 세포를 수확한 후 0.1% 소디움 아자이드 (sodium azide)를 포함하는 PBS (phasphate-buffered saline)로 세포를 세척하였다. 그 후 FACSort 기기 (Becton Dickinson)를 이용하여 형광을 내는 세포의 비율 및 형광의 세기를 분석하였다. 이 때 데이타 획득 및 분석용 소프트웨어로는 CellQuest (Becton Dickinson)를 사용하였다. 대조군으로는 바이러스를 전달하지 않은, 즉 형질 도입하지 않은 HT1080세포를 사용하였다.
분석 결과 레트로바이러스 벡터 pC-LND-GFP-n는 높은 수준으로 유전자 발현을 유도하고 (평균 형광 강도: 1265), 높은 역가로 바이러스를 생산할 수 있음을 알 수 있었다 (83% 세포가 GFP 발현) (도 7).
<시험예 6> PG13 생산세포주에서의 pC-LND-GFP-n의 성능 확인
실제 유전자치료에서는 293T 세포에서 만든 바이러스가 아니라, 생산세포주에서 얻은 레트로바이러스 벡터를 사용한다. 따라서, 제조한 레트로바이러스 벡터가 유전자 치료에 사용가능한지 알기 위해서는 생산세포주를 제조한 후 유전자 발현과 바이러스 역가를 확인할 필요가 있다. 이를 위해 레트로바이러스 벡터 pC-LND-GFP-n를 포장 세포주 PG13 (ATCC CRL-10686)에 전달하여 생산세포주 PG13-C-LND-GFP-n을 제조하고 실험에 사용하였다. 전반적인 실험 과정은 도 8b에 나타내었다.
우선 레트로바이러스 DNA pC-LND-GFP-n은 제한효소 SwaI를 처리해 선형으로 만들었는데 (도 8a), 이는 선형화된 DNA를 사용하지 않을 경우, 형질감염 및 플라스미드가 포장 세포주 염색체에 삽입되는 과정에서 전달하는 플라스미드 구조가 제대로 유지되지 않을 가능성이 있기 때문이다. 상기 선형화된 레트로바이러스 벡터 DNA를 다음과 같은 조건으로 전기천공법을 사용하여 형질감염시켰다.
7.5×105 개의 PG13 세포를 0.5 ㎖의 무혈청 DMEM 배지에 잘 섞은 뒤 0.4-cm 큐벳 (cuvette) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)에 넣었다. 한편 레트로바이러스 DNA pC-LND-GFP-n은 제한효소 SwaI를 처리해 선형으로 만들고 이 중 10 ㎕ (0.1 ㎍/㎕)를 세포가 들어있는 큐벳에 첨가한 뒤 5분간 실온에 두었다. 그 후 진 펄서 (Gene Pulser XcellTM, Bio-Rad)을 이용하여 200 V, 20 ms의 조건으로 전기천공법을 수행하였고, 바로 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지 10 ㎖과 섞어 100 mm 세포배양 접시에 넣어주었다. 24시간 뒤에 농도가 1 ㎎/㎖이 되도록 G-418 설페이트 (Gibco, NY, USA)를 처리하고 2주간 배양하여 레트로바이러스 벡터 DNA가 도입된 생산세포주 PG13-C-LND-GFP를 얻었다.
상기 과정을 통해 얻은 생산세포주 세포 5×106개를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지, 37℃, CO2 배양기(이산화탄소 분압 5%)에서 다시 48시간 동안 배양한 후, 세포 배양액을 얻어 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 세포가 제거된 바이러스 액을 얻었다.
상기에서 획득한 C-LND-GFP-n 레트로바이러스를 HT1080 세포주에 형질도입하고 48시간 동안 배양한 후, 표적 세포들을 FACS 분석을 통해 분석하였다. 실험 과정은 다음과 같다: 1×105 개의 HT1080 세포를 형질도입하기 하루 전에 60mm 접시에 깔아주었다. 500 ㎕의 바이러스를 폴리브렌 (최종 8 ㎍/㎖)과 함께 넣어주고 48시간 동안 배양한 후 세포들을 수확하여 FACS 분석을 통해 분석하였다 (대조군으로는 바이러스를 전달하지 않은, 즉 형질 도입하지 않은 HT1080세포를 사용).
분석 결과, 293T 세포주를 사용했을 때보다 바이러스 역가는 떨어지지만 PG13 세포주에서도 약 6.5% 세포가 GFP을 발현하는 것으로 보아 레트로바이러스 벡터가 제대로 만들어지고 있음을 알 수 있었다 (도 9).
다른 세포주에서 유전자 발현과 역가를 분석하기 위해서 생산세포주에서 얻은 C-LND-GFP-n 레트로바이러스를 K562 세포주 (ATCC CCL-243)에 형질도입하였다. K562에 형질 도입한 방법은 다음과 같다: 1×105 개 세포를 6 웰 플레이트의 각 웰에 넣은 뒤 500 ㎕의 바이러스와 폴리브렌 (최종 8㎍/㎖)을 넣어 주었다. 2800 rpm으로 2시간 동안 원심분리한 뒤 37℃에서 2시간 동안 배양하고 배양이 끝난 뒤 바이러스가 들어있지 않은 새 배지로 배양액을 바꿔 주었다. 48시간 더 배양한 후 세포들을 FACS 분석을 통해 분석하였다 (대조군으로는 바이러스를 전달하지 않은, 즉 형질 도입하지 않은 K562 세포를 사용).
분석 결과 효과적인 GFP 발현을 관찰할 수 있었으며 (12% 세포가 GFP 발현), 따라서, PG13 생산세포주에서 레트로바이러스 벡터가 제대로 만들어지고 있음을 다시 한 번 확인할 수 있었다 (도 10).
실시간 정량 PCR 방법 (한국특허 제440852호)을 통해 생산세포주에서 생산되는 바이러스 역가를 정량적으로 확인한 결과, 5×104 바이러스 입자/㎖ 정도의 바이러스를 생산하고 있음을 알 수 있었다.
본 실험에 사용한 파퓰레이션 상태의 생산세포주가 클론 선별 과정을 거치면 파퓰레이션 상태에 비해 10배 정도 생산 효율이 높은 고생산 클론 (high-producer clone)을 얻을 수 있으므로, 추후 클론 선별 과정을 거치면 대략 5×105 바이러스 입자/㎖ 수준 이상으로 바이러스를 생산하는 세포주를 확보할 수 있을 것이다.
본 발명의 바이러스 벡터는 표적 세포의 주변 유전자를 활성화시킬 가능성이 낮아 안전하면서도 바이러스 역가 및 목적 유전자의 발현율은 높게 유지하므로 유전자 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> VIROMED LIMITED <120> Retroviral vectors with improved safety <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for LMO2 <400> 1 gtcgacatgc tgctttcaaa atgtctagtt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for LMO2 <400> 2 cccgggaagc ttgaagactt gtaccccttt 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CAT <400> 3 cccgggatgg agaaaaaaat cactgg 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CAT <400> 4 cccgggtccc cagcatgcct gcta 24 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCV3LB <400> 5 ggatccctcg agcgataaaa taaaagattt tatttagtct cc 42 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCV3LRI <400> 6 gaatccgtcg actgaaagac ccccgctgac gg 32 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LTR-1 <400> 7 gctagcccct gtgccttatt tgaa 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LTR-2 <400> 8 gctagcttcg cgcgcttctg ctcc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LTR-3 <400> 9 gctagcccca caacccctca ctcg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3LTR-4 <400> 10 gctagcgcgc cagtcctccg attg 24 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEWMCSF <400> 11 acgcgtttaa accgcggaat tcggatccac atcgtg 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEWMCSR <400> 12 ctcgagatct aggcctcacg atgtggatcc gaattc 36 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L1F <400> 13 gctcttccgc tcacgtgtga tcaatttaaa tttcgaa 37 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L1R <400> 14 agcggaagag cttcgaaatt taaattgatc acacgtg 37 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L2F <400> 15 aggcctggtc accggccatt atggccacgt gatcatttaa atttg 45 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L2R <400> 16 tattcgcgcg tttcggtgat gaatatt 27 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BApF <400> 17 gtcgacatta atgccggtga gtgagcggcg cggggccaa 39 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BApR <400> 18 ggatccggtg gcgcgtcgcg ccgctgggtt tt 32 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neo5 <400> 19 agatctatgg gatcggccat tgaacaa 27 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neo3 <400> 20 ctcgagtcag aagaactcgt caagaaggc 29 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVpA 5 <400> 21 ctcgagatgg gatcggccat tgaacaa 27 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SVpA 3 <400> 22 catatgagta atcagccata ccacattt 28 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eGFP5 <400> 23 acgcgtggat ccatggtgag caagggcgag 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eGFP3 <400> 24 ctcgagagat ctttacttgt acagctcgtc 30

Claims (15)

  1. 뮤린 류케미아 바이러스 (murine leukemia virus, MLV)의 LTR (long terminal repeat)의 U3 부분의 뉴클레오티드 번호 x에서 y까지가 결실된 (상기에서, x는 7800 내지 7900이고, y는 8100 내지 8260 임), MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    x가 7840 내지 7860이고, y가 8100 내지 8244인 것을 특징으로 하는 재조합 레트로바이러스 벡터.
  3. 제 1 항에 있어서,
    x가 약 7847이고, y가 8113 내지 8208인 것을 특징으로 하는 재조합 레트로바이러스 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    MLV의 구조 유전자인 gag, pol 및 env의 염기 서열이 완전히 제거된 것을 특징으로 하는 재조합 레트로바이러스 벡터.
  5. 제 1 항에 있어서,
    이종 유전자 및 이와 작동가능하게 연결된 이종 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 레트로바이러스 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서,
    이종 프로모터가 인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus)의 IE (immediate-early) 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 레트로바이러스 벡터.
  7. 제 5 항에 있어서,
    이종 유전자가 강화 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescence protein) 또는 gp91-phox을 발현하는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 레트로바이러스 벡터.
  8. 제 1 항에 있어서,
    MLV의 양 LTR 사이에 다클로닝 부위 (multicloning site) 또는 제한효소 부위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 레트로바이러스 벡터.
  9. (1) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 재조합 레트로바이러스 벡터; 및 (2) 선별 표지 유전자, 이에 작동가능하게 연결된 이종 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 재조합 플라스미드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    선별 표지 유전자가 네오마이신 (neomycin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (puromycin) 저항유전자, 하이그로마이신 (hygromycin) 저항유전자, O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제 (MGMT) 유전자, 및 신호전달 도메인이 제거된 Δ-LNGFR (p75 low affinity nerve growth factor receptor) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
  11. 제 9 항에 있어서,
    도 5의 유전자 지도를 갖는 플라스미드 pI-LND-n인 재조합 플라스미드.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 MLV-유래 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 제 9 항 내지 제 12 항의 재조합 플라스미드를 포함하는 재조합 레트로바이러스 생산세포주.
  13. 제12항의 생산세포주를 배양하여 재조합 레트로바이러스를 생산하는 방법.
  14. 제12항의 생산세포주로부터 생산된 재조합 레트로바이러스로 형질감염된 세포.
  15. 이종 유전자 및 이와 작동가능하게 연결된 이종 프로모터; 및 MLV의 LTR의 U3 부분의 뉴클레오티드 번호 x에서 y까지가 결실된 MLV-유래 재조합 레트로바이러스의 게 놈을 포함하는 재조합 레트로바이러스 (상기에서, x는 7800 내지 7900이고, y는 8100 내지 8260 임)를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학 조성물.
KR1020060098633A 2006-10-10 2006-10-10 안전성이 향상된 레트로바이러스 벡터 KR101390967B1 (ko)

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