WO2021136347A1 - 一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体 - Google Patents
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Definitions
- the carrier includes:
- the hCMV enhancer sequence includes:
- this article provides a method for preparing a high expression vector from a basic expression vector, the method comprising:
- Figure 1 is a flow chart of the traditional model for screening the optimal regulatory elements and combinations of expression vectors.
- the expression vector may also include antibiotic resistance genes or selectable marker genes for screening (for example, ampicillin resistance gene (AmpR), thymidine kinase gene (TK), kanamycin resistance gene (KanR), new Resistance gene (NeoR), etc.) and a multiple cloning site (MCS) for the insertion of the coding sequence of the target protein.
- antibiotic resistance genes or selectable marker genes for screening (for example, ampicillin resistance gene (AmpR), thymidine kinase gene (TK), kanamycin resistance gene (KanR), new Resistance gene (NeoR), etc.) and a multiple cloning site (MCS) for the insertion of the coding sequence of the target protein.
- MCS multiple cloning site
- the expression vector is a circular plasmid.
- the expression vector provided herein includes the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19, 20, 21 or 7. In other embodiments, the expression vector provided herein may include at least 80% identity with SEQ ID NO: 19, 20, 21, or 7 (e.g., at least 85%, at least 87%, at least 89%, at least 91%, At least 93%, at least 95%, at least 97%, at least 99% identity) and has a nucleotide sequence that functions as an expression vector.
- pCD5 vector does not contain CMV enhancer, CMV promoter, and bGHploy(A) signal.
- the shown pcDNA3.1 3'UTR nucleotide and SEQ ID NO: 6 the SV40 poly(A) signal nucleotide.
- the complete pCD5 vector map is shown in Figure 4, and the pcDNA3.1 vector map is shown in Figure 8. For the complete sequence of the pCD5 expression vector, see SEQ ID NO: 19.
- Plasmid-transfected cells are placed in an incubator for continuous culture, and the cell culture supernatant is collected for detection or purification on the 6th day after transfection.
- Coating Dilute the coated antibody with 1 ⁇ PBS to 2 ⁇ g/mL, 20 ⁇ L coated antibody+10mL 1 ⁇ PBS, the specific dilution can be scaled up or down. After shaking and mixing, add 100 ⁇ L of diluted antibody to each well without air bubbles when loading. After plating, place the 96-well plate in a plate shaker to shake and mix, then wrap it with plastic wrap or place it in a ziplock bag, incubate overnight at 4°C or incubate at 37°C for 2 hours;
- both the traditional mode and the high-throughput mode can screen the best combination of regulatory elements of the pCD5 vector, namely, hCMV enhancer, hFerl promoter, chEF1a 5'untranslated region and SV40 polyadenylation signal.
- Example 2 The constructed plasmid was subjected to cell culture and transient transfection according to Example 1, and ELISA was performed according to Example 2. The results of calculating protein expression are shown in Table 9 and Table 10.
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Abstract
提供了一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体，其包括1)hCMV增强子序列；2)hFerl启动子序列；3)chEF1a 5'非翻译区序列；以及4)SV40多聚腺苷酸化信号序列。还提供了筛选最佳表达调控元件组合的方法。
Description
本发明涉及生物工程领域，具体涉及哺乳动物表达系统使用的高表达载体。
克隆基因在哺乳动物细胞系中表达是一种常见生物学实验方法，用于帮助研究人员理解基因表达、蛋白质的功能和结构以及生物调控机制，对于解决一系列生物学问题十分重要。部分具有特定生物学活性的蛋白质在医学和工业上也很有应用价值，比如生物药、抗体以及工业酶。外源蛋白在哺乳动物细胞系中的表达水平取决于多种因素，包括DNA拷贝数量、转录的效率、mRNA加工、mRNA的转运、mRNA的稳定性、蛋白质翻译效率以及蛋白质本身的折叠修饰、转运和稳定性。不同基因表达的限速步骤各不相同。提高蛋白表达量的方法由宏观到微观包括：发酵培养工艺优化、细胞系改造、表达载体优化以及密码子优化。
哺乳动物细胞表达系统是应用表达载体将目标基因转染到哺乳动物宿主细胞并整合到宿主细胞染色体上，随着宿主细胞的转录翻译，目标基因得到有效表达。因此，哺乳动物细胞表达系统的关键要素包括表达载体、宿主细胞、转染和筛选方法，其中表达载体是目标蛋白得以稳定高效表达的最重要因素。因此高效哺乳动物细胞表达系统是目前蛋白药物产业化急需解决的技术问题。
发明内容
在一方面，本文提供了真核表达载体，所述载体包括至少一个、至少两个、至少三个或全部的下述元件序列：
1)hCMV增强子序列；
2)hFerl启动子序列；
3)chEF1a 5’非翻译区序列；以及
4)SV40多聚腺苷酸化信号序列。
在一些实施方案中，所述载体包括：
1)hCMV增强子序列；
2)hFerl启动子序列；
3)chEF1a 5’非翻译区序列；以及
4)SV40多聚腺苷酸化信号序列。
在一些实施方案中，所述hCMV增强子序列包括：
1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或
2)与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性并具有增强子活性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述hFerl启动子序列包括：
1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或
2)与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性并具有启动子活性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述chEF1a 5’非翻译区序列包括：
1)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或
2)与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性并具有5’非翻译区序列功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述SV40多腺苷酸化信号序列包括：
1)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；或
2)与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性并具有多腺苷酸化信号功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述真核表达载体还包括pcDNA3.1的3’非翻译区序列。
在一些实施方案中，所述pcDNA3.1的3’非翻译区序列包括：
1)SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或
2)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性并具有3’非翻译区功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述真核表达载体其在所述5’UTR序列下游还包括人胰岛素信号肽(hInsulin SP)的编码序列。
在一些实施方案中，所述人胰岛素信号肽的编码序列包括：
1)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；或
2)与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性并编码具有信号肽功能的多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述真核表达载体包括与SEQ ID NO：19、20、21或7所示的核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述真核表达载体包括SEQ ID NO：19、20、21或7所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体。在一些实施方案中，所述真核表达载体包含pTT5载体或pcDNA3.1载体的基础骨架。pTT5载体或pcDNA3.1载体的基础骨架包含抗性基因和复制子元件。在一些具体实施方案中，所述真核表达载体包含pcDNA3.1载体的基础骨架。在一个具体实施方案中，所述pcDNA3.1载体的基础骨架包含NeoR/KanR、SV40 poly(A)信号、lac启动子、复制子、AmpR和AmpR启动子等元件。在另一些具体实施方案中，所述真核表达载体包含pTT5载体的基础骨架。在一个具体实施方案中，所述pTT5载体的基础骨架包含hCMV增强子、AmpR、AmpR启动子和复制子等元件。
本发明提供了一种真核表达载体，在pcDNA3.1载体的基础上，将CMV增强子替换为hCMV增强子、CMV启动子替换为hFerL启动子、pcDNA3.1-5’UTR替换为chEF1a 5′UTR，增加了pcDNA3.1 3′UTR核苷酸序列。优选地，所述真核表达载体还包括人胰岛素信号肽的核苷酸序列。
本发明提供了另一种真核表达载体，在pTT5表达载体基础上，将CMV启动子替换为hFerL启动子、TPL-MLPen元件替换为chEF1a 5′UTR、β-globin ploy(A)信号替换为SV40 poly(A)信号，在poly(A)信号前增加了pcDNA3.1 3′UTR。优选地，所述真核表达载体还包括人胰岛素信号肽的核苷酸序列。
另一方面，本文提供了从基础表达载体制备高表达载体的方法，所述方法包括：
1)以不同的增强子序列、启动子序列、5’非翻译区序列和多腺苷酸化信号序列逐一替换所述基础表达载体中的对应序列，获得多个第一轮备选表达载体；
2)使所述多个第一轮备选表达载体在细胞中表达目的蛋白，检测所述目的蛋白的表达量，并选择与较高表达量对应的优选增强子序列、启动子序列、5’非翻译区序列和多腺苷酸化信号序列；
3)将所述优选增强子序列、启动子序列、5’非翻译区序列和多腺苷酸化信号序列以所有可能的组合替换所述基础表达载体中的对应序列，获得多个第二轮备选表达载体；以及
4)使所述多个第二轮备选表达载体在细胞中表达所述目的蛋白，检测所述目的蛋白的表达量，并选择与最高表达量对应的所述第二轮备选表达载体作为所述高表达载体。
在一些实施方案中，所述基础表达载体选自pTT5载体或pcDNA3.1载体。
本发明的表达载体相比于基础载体如pcDNA3.1载体和pTT5载体可显著增加目的蛋白的表达量。
图1为筛选表达载体最佳调控元件和组合的传统模式流程图。
图2为筛选表达载体最佳调控元件和组合的高通量模式流程图。
图3为传统模式筛选改造出的中间载体pCTS0图谱。
图4为改造出的pCD5载体图谱。
图5为改造出的pCT8载体图谱。
图6为改造出的pCDS5载体图谱。
图7为改造出的pCTS8载体图谱。
图8为改造前的原始pcDNA3.1载体图谱。
图9为改造前的原始pTT5载体图谱。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
术语“表达载体(expression vector)”指包含各种表达元件以用于在宿主细胞中表达目的蛋白的核酸分子。对于用于在真核细胞中表达目的蛋白的表达载体，这些表达元件通常包括启动子、增强子、多腺苷酸化信号序列等。为了方便在大肠杆菌中扩增，该表达载体通常还包括大肠杆菌复制子序列。此外，表达载体还可包括用于筛选的抗生素抗性基因或选择标记基因(例如氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，胸苷激酶基因(TK)，卡那霉素抗性基因(KanR)，新霉素抗性基因(NeoR)等)和用于目的蛋白编码序列插入的多克隆位点(MCS)。在本发明的一些实施方案中，表达载体为环状质粒。
术语“启动子(promoter)”或“启动子序列”指表达载体上能够被RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列。其通常位于转录起始位点的上游(即5’端)，并包括一些保守序列，例如TATA盒等。在本文的一些实施例中，该启动子用于在哺乳动物细胞中启动RNA聚合酶II转录mRNA。
术语“增强子(enhancer)”或“增强子序列”指表达载体上可增强启动子转录活性的DNA序列。增强子增强转录的活性通常无方向性(即可位于目的蛋白编码基因的上游、下游，甚至内部)，并且在一些情况下可以远距离起作用(例如距转录起始位点数个Kb)。
术语“非翻译区(Untranslated Region，UTR)”指指位于mRNA上编码区两端不翻译为蛋白质的片段。其中位于编码区上游的mRNA片段被称为5’非翻译区(5′-UTR)，位 于编码区下游的片段则被称为3’非翻译区(3’-UTR)。非翻译区可以在基因转录和转录后翻译水平上调控基因表达，例如，5′非翻译区能够影响基因的mRNA的转录效率、稳定性以及出核转运，从而导致蛋白表达水平的改变：3′非翻译区则主要影响mRNA的稳定性和翻译效率。为方便阐述，将表达载体或基因序列中分别与上述非翻译区对应的DNA片段也称为5’非翻译区(5′-UTR)或3’非翻译区(3’-UTR)。
术语“多聚腺苷酸化(Polyadenylation)”指终止转录过程并把一段多聚A尾巴加到转录生成的mRNA 3’末端的机制。该加尾过程由多聚腺苷酸聚合酶催化进行，进而形成成熟的mRNA。相应地，表达载体上与该多聚腺苷酸化相关的序列称为“多聚腺苷酸化信号序列”或“PolyA信号区(PolyA signal)”。
提及核苷酸序列时，术语“序列一致性(Sequence identity)”(也称为”序列同一性”)指两核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两核苷酸序列之间的序列一致性。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包括SEQ ID NO：1所示的hCMV增强子序列。在另一些实施方案中，本文提供的表达载体可包括与SEQ ID NO：1至少有80％序列一致性(例如至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％一致性)并且也具有增强子功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包括SEQ ID NO：2所示的hFerl启动子序列。在另一些实施方案中，本文提供的表达载体可包括与SEQ ID NO：2至少有80％序列一致性(例如至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％一致性)并且也具有启动子功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包括SEQ ID NO：3所示chEF1a 5’非翻译区序列。在另一些实施方案中，本文提供的表达载体可包括与SEQ ID NO：3至少有80％一致性(例如至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％一致性)并具有5’非翻译区序列功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包括SEQ ID NO：6所示的SV40多腺苷酸化信号序列。在另一些实施方案中，本文提供的表达载体可包括与SEQ ID NO：6至少有80％一致性(例如至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％一致性)并具有多腺苷酸化信号功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包括SEQ ID NO：5所示pcDNA3.1的3’非翻译区序列。在另一些实施方案中，本文提供的表达载体可包括与SEQ ID NO：5至少有80％一致性(例如至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％一致性)并具有3’非翻译区功能功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包括SEQ ID NO：4所示的人胰岛素信号肽的编码序列。在另一些实施方案中，本文提供的表达载体可包括与SEQ ID NO：4至少有80％一致性(例如至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％一致性)并编码具有信号肽功能的多肽的核苷酸编码序列。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包括SEQ ID NO：19、20、21或7所示的核苷酸序列。在另一些实施方案中，本文提供的表达载体可包括与SEQ ID NO：19、20、21或7至少有80％一致性(例如至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、至少99％一致性)并具有表达载体功能的核苷酸序列。
本领域技术人员可通过简单核苷酸替换来发现具有类似功能的功能元件(例如增强子、启动子、非翻译区、多聚腺苷酸信号序列等)的序列变体，因此它们也应包括在本发明的范围内。
在提及表达载体优化方法时，术语“基础表达载体”指作为表达载体优化基础的起始载体。其可为可购得的商品化表达载体(例如pcDNA3.1表达载体或pTT5表达载体)，或者，在一些情况下，可为经过初步优化的表达载体。
在提及表达载体优化方法时，目的蛋白的“较高表达量”指表达量排名位于前1/2或前1/3。在一些具体实施方案中，“较高表达量”指表达量位于前三名或前二名。与“较高表达量”对应的增强子、启动子等则作为下一轮筛选过程的备选元件，相应地称为“优选增强子”、“优选启动子”等。在本文的一些实施方案中，将导致表达量位于前三的各功能元件用于下一轮的全因子筛选。
在本发明表达载体的一些实施方案中，该表达载体包括2种优选功能元件的组合，例如优选的增强子(如hCMV增强子)与优选的启动子(例如hFerl启动子)的组合，优选的启动子(如hCMV增强子)与非翻译区(例如chEF1a 5′UTR)的组合等。在本发明表达载体的另一些实施方案中，该表达载体包括3种优选功能元件的组合，例如优选的增强子(如hCMV增强子)、优选的启动子(例如hFerl启动子)与优选的非翻译区(例如chEF1a 5′UTR)的组合，优选的增强子(如hCMV增强子)、优选的启动子(例如hFerl启动子)与优选的多腺苷酸化信号序列(SV40多腺苷酸化信号序列)的组合等。在本发明表达载体的一些实施方案中，该表达载体包括4种优选功能元件的组合，即优选的增强子(如hCMV增强子)、优选的启动子(例如hFerl启动子)、优选的非翻译区(例如chEF1a 5′UTR)与优选的多腺苷酸化信号序列(SV40多腺苷酸化信号序列)的组合。
本发明的表达载体适合于在真核细胞中表达目的蛋白，尤其适合于在哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、羊、猴、猩猩、或人细胞)中表达目的蛋白。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞可选自CHO细胞、HEK293细胞或CV-1细胞。
本发明通过采用传统的表达调控元件替换和迭代优化的方法以及大规模组合文库构建的方法，从两条路径出发，共同筛选出基因表达所需的各种最佳调控元件及其组合，构建出了新的用于哺乳动物表达系统的高表达载体。
本发明开发了用于哺乳动物表达系统的高表达载体pCD5和pCT8。其中，各蛋白表达调控元件的筛选策略有两条，包括传统模式(参见图1)和高通量模式(参见图2)。在传统模式中，我们(1)根据调控元件的功能和位置的不同划分为4类，包括增强子(Enhancer)、启动子(Promoter)、5’非翻译区(5’UTR)、PolyA信号区(PloyA signal)；(2)针对不同类型的元件做逐个的单一替换；(3)针对每个类型的调控元件，筛选出可使eGFP蛋白表达量名列前三的元件；(4)将这些排名靠前的元件做全因子组合设计，并筛选出最优组合。在高通量模式中，我们(1)通过高通量组合文库的构建方法生产出理论值直接覆盖全部元件的全因子组合设计，eGFP同样作为表征蛋白；(2)通过流式细胞术筛选出表达量较高的细胞文库，并作NGS测序；(3)根据NGS测序结果，筛选出频率较高的元件和组合并与传统模式筛选出的元件作比较，并对FACS和NGS筛选出的组合做二次表达实验验证。两种模式均能筛选到pCD5和pCT8载体的最佳调控元件组合。
相较于pcDNA3.1表达载体，pCD5载体不含CMV增强子、CMV启动子及bGH ploy(A)信号。含有SEQ ID NO：1所示的hCMV增强子、SEQ ID NO：2所示的hFerL启动子核苷酸、SEQ ID NO：3所示的chEF1a 5′UTR核苷酸、SEQ ID NO：5所示的pcDNA3.1 3′UTR核苷酸及SEQ ID NO：6所示的SV40 poly(A)信号核苷酸。完整的pCD5载体图谱如图4所示，pcDNA3.1载体图谱如图8所示。pCD5表达载体的完整序列见SEQ ID NO：19。
采用上述元件组合，本文还提供了pCT8高表达载体。相较于pTT5表达载体，pCT8载体不含CMV启动子、TPL-MLPen增强子和β-globin ploy(A)信号。含有SEQ ID NO：2所示的hFerL启动子核苷酸、SEQ ID NO：3所示的chEF1a 5′UTR核苷酸、SEQ ID NO：5所示的pcDNA3.1 3′UTR核苷酸、SEQ ID NO：6所示的SV40 poly(A)信号核苷酸。完整的pCT8载体图谱如图5所示，pTT5载体图谱如图9所示。pCT8表达载体的完整序列见SEQ ID NO：20。
另外，本文还提供了pCDS5高表达载体和pCTS8高表达载体。相较于pCD5载体和pCT8载体，pCDS5载体和pCTS8载体增加了SEQ ID NO：4所示的人胰岛素信号肽(hInsulin SP)的核苷酸。完整的pCDS5载体图谱如图6所示，完整的pCTS8载体图谱如图7所示。pCDS5表达载体的完整序列见SEQ ID NO：21，pCTS8表达载体的完整序列见SEQ ID NO：7。
本发明根据筛选到的调控元件组合，分别以pcDNA3.1和pTT5为基础载体骨架，得到改造后的载体pCD5、pCDS5、pCT8和pCTS8，相较于基础载体，对于同样的外源蛋白，表达载体pCD5的表达量平均提高至1.40倍，表达载体pCDS5的表达量平均提高至1.42倍，表达载体pCT8的表达量平均提高至1.46倍，表达载体pCTS8的表达量平均提高至1.64倍。
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。
实施例1.细胞培养与瞬时转染
实验过程简述如下：
(1)将HEK293-6E细胞(购买于NRC)用无血清培养基FreeStyleTM 293进行传代扩大培养(Thermo Fisher Scientific)；
(2)细胞加入三角瓶(Corning Inc.，Acton，MA)，置于37℃、5％CO
2培养箱中的摇床(VWR Scientific，Chester，PA)上培养；
(3)转染前一天，将细胞按5 x 10
5个细胞/mL，接种到三角瓶内进行培养；
(4)当细胞密度达到1-1.2 x 10
6个细胞/mL时，通过PEI转染试剂将克隆有目的基因的质粒载体按照1μg/mL的用量分别转染293-6E细胞，每个样品做一个平行，分别命名为t1和t2；
(5)转染了质粒的细胞放在培养箱中继续培养，在转染后第6天收集细胞培养上清液用于检测或纯化。
实施例2.ELISA检测(双抗体夹心法)
实验过程简述如下：
(1)包被：用1×PBS稀释包被抗体至2μg/mL，20μL包被抗体+10mL 1×PBS，具体稀释可进行等比例放大或者缩小。振荡混匀后，每孔加入稀释后抗体100μL，加样时不能有气泡。铺板后将96孔板置于震板器中振荡混匀，后用保鲜膜包裹或置于自封袋中，在4℃孵育过夜或37℃孵育2小时；
(2)封闭：次日取出板条恢复室温，用PBST洗涤包被后的96孔板1次，每孔加入300μL预先配制的1％BSA-PBS。室温封闭2小时以上或37℃1小时以上；
(3)标准品的稀释：用0.1％BSA-PBS稀释标准抗原至0-150ng/mL，标准品各浓度点最终体积不能少于300μL；
(4)对照品的准备：用0.1％BSA-PBS稀释对应对照品至0-150ng/mL，对照品浓度应在标准曲线范围内；
(5)加样：用0.1％BSA-PBS稀释待测样品至合适的浓度，使得稀释后样品的浓度落在标准品检测的区间内，从-20℃冰箱中拿出储存的板条，在室温放置4～5min后， 用洗涤缓冲液浸泡，将稀释好的样品和标准品振荡混匀，弃去浸泡板条的洗涤缓冲液，拍干板条，按100μL/孔加入样品和标准品；
(6)检测：加完样的96孔板于Mini Shaker震板器振荡均匀，恒温孵育箱孵育1h，按100μl/孔加入稀释的酶标抗体，酶标抗体孵育结束后用PBST洗板5次，按100μL/孔TMB显色底物加入已拍干的板条中，显色结束后，按加TMB的顺序依次加入50μL2M H
3PO
4，使用酶标仪在450nm和650nm两个波长下进行读数，求出样品的浓度。
实施例3.筛选高表达载体
1、根据hIL-6 SP(NCBI ID：P46650.1)、IG GAMMA-1 CHAIN C(NCBI ID：4CDH_A)、和_Clorf162(NCBI ID：EAW56498.1)氨基酸序列，构建表征蛋白hIL-6 SP-Fc-h_Clorf162，在基础载体pcDNA3.1中插入表征蛋白hIL-6 SP-Fc-h_Clorf162和eGFP，构建中间载体pCTS0(见图3)，完整序列见SEQ ID NO：18。委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成(
https：//www.genscript.com.cn/express gene synthesis.html？src＝baidu，下同)，通过资料搜集，整理筛选元件列表(表1)，针对每个类型待筛选的调控元件，筛选出可使eGFP蛋白表达量名列前三的元件。
表1.筛选元件列表
2、按照表1中的增强子，替换中间载体pCTS0中的增强子，进行质粒构建，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，检测结果如表2。
表2.增强子筛选ELISA检测结果
3、按照表1中的启动子，替换中间载体pCTS0中的启动子，进行质粒构建。委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，计算蛋白表达量的结果及表达量排名如表3。
表3.启动子筛选ELISA检测结果
4、按照表1中的5′UTR，替换中间载体pCTS0中的5′UTR，进行质粒构建，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，计算蛋白表达量的结果及表达量排名如表4。
表4. 5′UTR筛选ELISA检测结果
5、按照表1中的PolyA信号区，替换中间载体pCTS0中的PolyA信号区，进行质粒构建，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，计算蛋白表达量的结果及表达量排名如表5。
表5.PolyA信号区筛选ELISA检测结果
| # | PolyA信号区 | t1(mg/L) | t2(mg/L) | 均值 | 排名 |
| 1 | bGH poly(A)signal | 6.8 | 9.13 | 7.97 | 2 |
| 2 | hEF-1α poly(A)signal | 3.61 | 5.15 | 4.38 | 7 |
| 3 | hGH poly(A)signal | 6.88 | 9.36 | 8.12 | 1 |
| 4 | HSV TK poly(A)signal | 3.74 | 5.57 | 4.66 | 6 |
| 5 | poly(A)signal | 4.04 | 5.39 | 4.72 | 5 |
| 6 | rβ-globin poly(A) | 3.86 | 5.93 | 4.9 | 4 |
| 7 | SV40 poly(A)signal | 5.9 | 8.11 | 7.01 | 3 |
6、如图1所示的传统模式，针对每个类型的调控元件，筛选出可使eGFP蛋白表达量名列前三的元件，将这些排名靠前的元件做全因子组合设计，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，筛选到最好组合，即为pCD5表达载体。
7、如图2所示的高通量模式，对表1中元件，设计覆盖全部元件的全因子组合文库，eGFP同样作为表征蛋白，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。文库合成之后，通过流式细胞术筛选出表达量较高的细胞文库，并作NGS测序。下机原始数据经过bcl2fastq并根据样品Index获得样品数据，使用Trimmomatic对样品数据进行去接头和去除低质量序列，使用bwa将样品数据比对到参考序列上生成比对结果。对NGS数据进行分析，发现pCD5组合同样在表达量较高的细胞。即传统模式和高通量模式均能筛选到pCD5载体的最佳调控元件组合，即hCMV增强子、hFerl启动子、chEF1a 5’非翻译区和SV40多聚腺苷酸化信号。
实施例4.高表达载体pCD5实验验证
为了进一步了解本发明构建的表达载体对蛋白表达量的提升效果。我们比较了5个外源蛋白在pcDNA3.1和pCD5表达效果，并使用ELISA实验检测蛋白表达量。
1、本实施例根据表6所示蛋白来源，构建了h_CTF1蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：8)、h_IL-4蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：9)、h_CX3CL1蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：10)、h_IL-6R蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：11)和m_VISG4蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，经密码子优化的DNA编码序列分别为SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并分别转到表达载体pcDNA3.1和pCD5，提供转染级别质粒h_CTF1_pcDNA3.1、h_IL-4_pcDNA3.1、h_CX3CL1_pcDNA3.1、h_IL-6R_pcDNA3.1、m_VISG4_pcDNA3.1、h_CTF1_pCD5、h_IL-4_pCD5、h_CX3CL1_pCD5、h_IL-6R_pCD5、和m_VISG4_pCD5。
表6.蛋白来源
| 蛋白 | NCBI ID | 标签(Tag) | 标签位置 |
| h_CTF1 | NP_001321.1 | hIgG1 Fc | N-terminal |
| h_IL-4 | 1ITL_A | hIgG1 Fc | C-terminal |
| h_CX3CL1 | DQ890704.2 | hIgG1 Fc | N-terminal |
| h_IL-6R | S56892.1 | hIgG1 Fc | C-terminal |
| m_VISG4 | BC025105.1 | mIgG2a Fc | C-terminal |
2、将构建的质粒按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，检测结果如表7。
表7.pCD5载体转染细胞的蛋白表达的ELISA检测结果
本实施例通过比较5个外源蛋白分别在pcDNA3.1和pCD5表达载体上表达效果，发现新的表达载体pCD5相较基础载体pcDNA3.1，表达量平均提高至1.40倍，说明筛选的新的元件组合对提升蛋白表达有效。
实施例5.表达调控元件组合在其他载体骨架上的可行性验证
为了进一步验证本发明筛选的元件组合对提升蛋白表达有效，我们以pTT5的载体为基础，删除CMV启动子、TPL-MLPen增强子和β-globin ploy(A)信号序列，增加SEQ ID NO：2所示的hFerL启动子核苷酸、SEQ ID NO：3所示的chEF1a 5′UTR核苷酸、SEQ ID NO：5所示的pcDNA3.1 3′UTR核苷酸、SEQ ID NO：6所示的SV40 poly(A)信号核苷酸，构建新的表达载体pCT8(SEQ ID NO：20)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成。
1、将表6所示蛋白的经密码子优化DNA序列，并分别转到载体pTT5和pCT8，质粒构建委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，并提供转染级别质粒 h_CTF1_pTT5、h_IL-4_pTT5、h_CX3CL1_pTT5、h_IL-6R_pTT5、m_VISG4_pTT5、h_CTF1_pCT8、h_IL-4_pCT8、h_CX3CL1_pCT8、h_IL-6R_pCT8、和m_VISG4_pCT8。
2、构建的质粒按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，计算蛋白表达量的结果如表8。
表8.pCT8载体转染细胞的蛋白表达的ELISA检测结果
本实施例通过比较5个外源蛋白分别在pTT5和pCT8表达载体上的表达效果，新的表达载体pCT8相较基础载体pTT5，表达量平均提高至1.46倍，具体地，h_CTF1表达量提高至1.4倍，h_IL-4表达量提高至1.7倍，说明筛选的新的元件组合在不同的载体骨架对提升蛋白表达有效。
实施例6.信号肽元件对表达调控元件组合的影响
为了验证添加信号肽元件后本发明筛选的元件组合对提升蛋白表达有效，在载体pCD5和载体pCT8的元件5’UTR后添加人胰岛素信号肽的编码序列(SEQ ID NO：4)，构建新的载体pCDS5(SEQ ID NO：21)和pCTS8(SEQ ID NO：7)，载体构建委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。
1、表6所示蛋白经密码子优化DNA序列，并分别转到载体pCDS5和pCTS8，质粒构建委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，并提供转染级别质粒h_CTF1_pCDS5、h_IL-4_pCDS5、h_CX3CL1_pCDS5、h_IL-6R_pCDS5、m_VISG4_pCDS5、h_CTF1_pCTS8、h_IL-4_pCTS8、h_CX3CL1_pCTS8、h_IL-6R_pCTS8、和m_VISG4_pCTS8。
2、构建的质粒按照实施例1进行细胞培养与瞬时转染，按照实施例2进行ELISA检测，计算蛋白表达量的结果如表9和表10。
表9.pCDS5载体转染细胞的蛋白表达的ELISA检测结果
表10.pCTS8载体转染细胞的蛋白表达的ELISA检测结果
本实施例通过比较5个外源蛋白分别在pcDNA3.1、pCD5和pCDS5表达载体上表达效果，以及在pTT5、pCT8和pCTS8表达载体上表达效果，添加信号肽元件的表达载体pCDS5相较基础载体pcDNA3.1表达量平均提高至1.42倍，相较新的载体pCD5表达量平均提高至1.02倍，添加信号肽元件的表达载体pCTS8相较基础载体pTT5表达量平均提高至1.64倍，相较新的载体pCT8表达量平均提高至1.12倍，具体地，表达载体pCTS8相较pTT5，h_CTF1表达量提高至1.7倍，h_IL-4表达量提高至2.0倍，说明筛选的新的元件组合添加信号肽元件后，对蛋白表达的提升有一定作用。
本文提及的一些核苷酸和氨基酸序列：
序列说明
SEQ ID NO：1 hCMV增强子
SEQ ID NO：2 hFerL启动子
SEQ ID NO：3 chEF1a 5′UTR
SEQ ID NO：4 hInsulin SP
SEQ ID NO：5 pcDNA3.1 3′UTR
SEQ ID NO：6 SV40 poly(A)signal
SEQ ID NO：7 pCTS8载体全序
SEQ ID NO：8 h_CTF1蛋白序列
SEQ ID NO：9 h_IL-4蛋白序列
SEQ ID NO：10 h_CX3CL1蛋白序列
SEQ ID NO：11 h_IL-6R蛋白序列
SEQ ID NO：12 m_VISG4蛋白序列
SEQ ID NO：13 h_CTF1 DNA序列
SEQ ID NO：14 h_IL-4 DNA序列
SEQ ID NO：15 h_CX3CL1 DNA序列
SEQ ID NO：16 h_IL-6R DNA序列
SEQ ID NO：17 m_VISG4 DNA序列
SEQ ID NO：18 pCTS0载体全序
SEQ ID NO：19 pCD5载体全序
SEQ ID NO：20 pCT8载体全序
SEQ ID NO：21 pCDS5载体全序
Claims (14)
- 真核表达载体，所述载体包括至少一个、至少两个、至少三个或全部的下述元件序列：1)hCMV增强子序列；2)hFer1启动子序列；3)chEF1a 5’非翻译区序列；以及4)SV40多聚腺苷酸化信号序列。
- 如权利要求1所述的真核表达载体，其中所述hCMV增强子序列包括：1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或2)与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有至少80％一致性并具有增强子活性的核苷酸序列。
- 如权利要求1或2所述的真核表达载体，其中所述hFer1启动子序列包括：1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或2)与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列有至少80％一致性并具有启动子活性的核苷酸序列。
- 如权利要求1-3中任一项所述的真核表达载体，其中所述chEF1a 5’非翻译区序列包括：1)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列：或2)与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列有至少80％一致性并具有5’非翻译区序列功能的核苷酸序列。
- 如权利要求1-4中任一项所述的真核表达载体，其中所述SV40多腺苷酸化信号序列包括：1)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；或2)与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列有至少80％一致性并具有多腺苷酸化信号功能的核苷酸序列。
- 如权利要求1-5中任一项所述的真核表达载体，所述载体还包括：1)表达载体pcDNA3.1的3’非翻译区序列；或2)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列有至少80％一致性并具有3’非翻译区功能的核苷酸序列。
- 如权利要求1-6中任一项所述的真核表达载体，所述载体在所述5’UTR序列下游还包括人胰岛素信号肽的编码序列。
- 如权利要求7所述的真核表达载体，其中所述人胰岛素信号肽的编码序列包括：1)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；或2)与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列有至少80％一致性并编码具有信号肽功能的多肽的核苷酸序列。
- 如权利要求1-8中任一项所述的真核表达载体，所述载体包括与SEQ ID NO：19、20、21或7所示的核苷酸序列有至少80％一致性的核苷酸序列。
- 如权利要求9所述的真核表达载体，所述载体包括SEQ ID NO：19、20、21或7所示的核苷酸序列。
- 如权利要求1-10中任一项所述的真核表达载体，其中所述真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体。
- 如权利要求1-11中任一项所述的真核表达载体，其中所述真核表达载体包含pTT5载体或pcDNA3.1载体的基础骨架。
- 从基础表达载体制备高表达载体的方法，包括：1)以不同的增强子序列、启动子序列、5’非翻译区序列和多腺苷酸化信号序列逐一替换所述基础表达载体中的对应序列，获得多个第一轮备选表达载体；2)使所述多个第一轮备选表达载体在细胞中表达目的蛋白，检测所述目的蛋白的表达量，并选择与较高表达量对应的优选增强子序列、启动子序列、5’非翻译区序列和多腺苷酸化信号序列；3)将所述优选增强子序列、启动子序列、5’非翻译区序列和多腺苷酸化信号序列以所有可能的组合替换所述基础表达载体中的对应序列，获得多个第二轮备选表达载体；以及4)使所述多个第二轮备选表达载体在细胞中表达所述目的蛋白，检测所述目的蛋白的表达量，并选择与最高表达量对应的所述第二轮备选表达载体作为所述高表达载体。
- 如权利要求13所述的方法，其中所述基础表达载体选自pTT5载体或pcDNA3.1载体。
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