JP3260822B2 - Ｄ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
Ｄ−グルタミン酸の製造法Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｄ−グルタミン酸の製
造方法に関する。Ｄ−グルタミン酸は、医薬、農薬など
の合成原料として有用な物質である。
造方法に関する。Ｄ−グルタミン酸は、医薬、農薬など
の合成原料として有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｄ−グルタミン酸の製造方法とし
ては、ＤＬ−５−カルボキシエチルヒダントインに微生
物由来の加水分解酵素を作用させる方法（特開昭５５−
１１４２９１）、α−ケトグルタル酸にＤ−アミノ酸ト
ランスアミナーゼを作用させ、Ｄ−グルタミン酸を製造
する方法（特開昭６２−２０５７９０）、ＤＬ−グルタ
ミン酸を優先晶出法により光学分割する化学的方法（特
公昭３１−４２２、同３１−４２３、同３１−２９７
２）、ＤＬ−グルタミン酸と他の光学活性化合物との塩
をつくり、ジアステレオマーとして分割する方法（特公
昭３２−５４１９）などが知られている。しかし、これ
らの方法は原料基質が高価なため製造コストが高く、ま
た酵素系が不安定であったり製造工程が複雑で生産性が
低かったりするなど工業的に有利な方法ではない。
ては、ＤＬ−５−カルボキシエチルヒダントインに微生
物由来の加水分解酵素を作用させる方法（特開昭５５−
１１４２９１）、α−ケトグルタル酸にＤ−アミノ酸ト
ランスアミナーゼを作用させ、Ｄ−グルタミン酸を製造
する方法（特開昭６２−２０５７９０）、ＤＬ−グルタ
ミン酸を優先晶出法により光学分割する化学的方法（特
公昭３１−４２２、同３１−４２３、同３１−２９７
２）、ＤＬ−グルタミン酸と他の光学活性化合物との塩
をつくり、ジアステレオマーとして分割する方法（特公
昭３２−５４１９）などが知られている。しかし、これ
らの方法は原料基質が高価なため製造コストが高く、ま
た酵素系が不安定であったり製造工程が複雑で生産性が
低かったりするなど工業的に有利な方法ではない。
【０００３】また、高いグルタミン酸ラセマーゼ活性お
よびグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するラクトバチル
ス属に属する微生物（例えばラクトバチルス・ブレビス
ＡＴＣＣ８２８７）を用いて、Ｌ−グルタミン酸からＤ
−グルタミン酸を製造する方法（特開平２−５３４９
４）が開示されている。しかしながら、この方法は単一
の微生物によるＬ−グルタミン酸からＤ−グルタミン酸
の効率的製造という優れた点を有しているにもかかわら
ず、ラクトバチルス属の微生物を用いることに起因する
問題点がある。すなわち、一般的にラクトバチルス属に
属する微生物はその菌体収量が低く、菌体の大量調製が
困難であるため、生産性向上の阻害要因となっている。
よびグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するラクトバチル
ス属に属する微生物（例えばラクトバチルス・ブレビス
ＡＴＣＣ８２８７）を用いて、Ｌ−グルタミン酸からＤ
−グルタミン酸を製造する方法（特開平２−５３４９
４）が開示されている。しかしながら、この方法は単一
の微生物によるＬ−グルタミン酸からＤ−グルタミン酸
の効率的製造という優れた点を有しているにもかかわら
ず、ラクトバチルス属の微生物を用いることに起因する
問題点がある。すなわち、一般的にラクトバチルス属に
属する微生物はその菌体収量が低く、菌体の大量調製が
困難であるため、生産性向上の阻害要因となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
で効率よくＤ−グルタミン酸を製造する方法を提供する
ことにある。
で効率よくＤ−グルタミン酸を製造する方法を提供する
ことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラクトバ
チルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７のグルタミン酸ラセ
マーゼをコードする遺伝子を大腸菌中でクローニング
し、その結果得られた組換え体ＤＮＡを保有する微生物
の湿菌体当たりのグルタミン酸ラセマーゼ活性が、ラク
トバチルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７と比較して１０
０倍以上に向上しており、該微生物と既存の高いグルタ
ミン酸脱炭酸酵素活性を有する微生物とを組み合わせて
用いることにより、発酵生産により工業的に安価に製造
されているＬ−グルタミン酸からＤ−グルタミン酸を更
に効率よく生成させることができることを見出し、本発
明を完成するに至った。
チルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７のグルタミン酸ラセ
マーゼをコードする遺伝子を大腸菌中でクローニング
し、その結果得られた組換え体ＤＮＡを保有する微生物
の湿菌体当たりのグルタミン酸ラセマーゼ活性が、ラク
トバチルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７と比較して１０
０倍以上に向上しており、該微生物と既存の高いグルタ
ミン酸脱炭酸酵素活性を有する微生物とを組み合わせて
用いることにより、発酵生産により工業的に安価に製造
されているＬ−グルタミン酸からＤ−グルタミン酸を更
に効率よく生成させることができることを見出し、本発
明を完成するに至った。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明
は、エシェリヒア属に属し、グルタミン酸ラセマーゼ活
性を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物
を水性媒体中でＬ−グルタミン酸と接触させてＤＬ−グ
ルタミン酸を生成させ、ついで該水性媒体中に生成した
ＤＬ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素活性
を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物と
を接触させて、該水性媒体中のＬ−グルタミン酸を分解
し、該水性媒体から残存するＤ−グルタミン酸を採取す
ることを特徴とするＤ−グルタミン酸の製造法に関す
る。
は、エシェリヒア属に属し、グルタミン酸ラセマーゼ活
性を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物
を水性媒体中でＬ−グルタミン酸と接触させてＤＬ−グ
ルタミン酸を生成させ、ついで該水性媒体中に生成した
ＤＬ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素活性
を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物と
を接触させて、該水性媒体中のＬ−グルタミン酸を分解
し、該水性媒体から残存するＤ−グルタミン酸を採取す
ることを特徴とするＤ−グルタミン酸の製造法に関す
る。
【０００７】本発明における微生物が生成するグルタミ
ン酸ラセマーゼおよびＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素は機
能するｐＨ領域が異なっており、前者はｐＨ7.5 〜9.5
、後者はｐＨ3.5 〜5.5 である。エシェリヒア属に属
し、グルタミン酸ラセマーゼ活性を有する微生物の菌
体、培養液またはそれらの処理物をｐＨ7.5 〜9.5 、好
適にはｐＨ8.0 〜9.0 に保持しつつ水性媒体中でＬ−グ
ルタミン酸と接触させることにより、Ｌ−グルタミン酸
をＤＬ−グルタミン酸にすることができる。
ン酸ラセマーゼおよびＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素は機
能するｐＨ領域が異なっており、前者はｐＨ7.5 〜9.5
、後者はｐＨ3.5 〜5.5 である。エシェリヒア属に属
し、グルタミン酸ラセマーゼ活性を有する微生物の菌
体、培養液またはそれらの処理物をｐＨ7.5 〜9.5 、好
適にはｐＨ8.0 〜9.0 に保持しつつ水性媒体中でＬ−グ
ルタミン酸と接触させることにより、Ｌ−グルタミン酸
をＤＬ−グルタミン酸にすることができる。
【０００８】接触させる際に用いるＬ−グルタミン酸
は、化学的な純品でも粗精製品でもよく、水性媒体中、
１０〜２００ｇ／ｌ、好適には５０〜２００ｇ／ｌの濃
度範囲で用いる。菌体の濃度は、湿菌体として0.1 〜50
ｇ／ｌ、好適には0.5 〜10ｇ／ｌ、酵素単位として0.1
〜65Ｕ／ml、好適には0.6 〜13Ｕ／mlで用いられる。そ
の際、そのまま菌体を用いてもよいが、トルエンやキシ
レンなどの有機溶剤を添加したり、アセトン処理菌体を
用いたりすることもできる。トルエンやキシレンなどの
有機溶剤を添加する場合には、その添加量は0.1 〜5.0
％（v/v)であればよい。ｐＨの調整は、アンモニア水、
水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液を用い、接触中の
温度は、２５〜４５℃、好適には３０〜４０℃で行う。
接触時間は用いるグルタミン酸量および菌体量により異
なるが、通常１〜７２時間である。
は、化学的な純品でも粗精製品でもよく、水性媒体中、
１０〜２００ｇ／ｌ、好適には５０〜２００ｇ／ｌの濃
度範囲で用いる。菌体の濃度は、湿菌体として0.1 〜50
ｇ／ｌ、好適には0.5 〜10ｇ／ｌ、酵素単位として0.1
〜65Ｕ／ml、好適には0.6 〜13Ｕ／mlで用いられる。そ
の際、そのまま菌体を用いてもよいが、トルエンやキシ
レンなどの有機溶剤を添加したり、アセトン処理菌体を
用いたりすることもできる。トルエンやキシレンなどの
有機溶剤を添加する場合には、その添加量は0.1 〜5.0
％（v/v)であればよい。ｐＨの調整は、アンモニア水、
水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液を用い、接触中の
温度は、２５〜４５℃、好適には３０〜４０℃で行う。
接触時間は用いるグルタミン酸量および菌体量により異
なるが、通常１〜７２時間である。
【０００９】このようにして得られる該水性媒体中に、
ＤＬ−グルタミン酸が存在している。該水性媒体中に
て、さらに生成したＤＬ−グルタミン酸とグルタミン酸
脱炭酸酵素活性を有する微生物の菌体、培養液またはそ
れらの処理物を、ｐＨ3.5 〜5.5 、好適にはｐＨ4.0 〜
5.0 に保持しつつ接触させることにより、該水性媒体中
のＬ−グルタミン酸のみをγ−アミノ酪酸にすることが
できる。
ＤＬ−グルタミン酸が存在している。該水性媒体中に
て、さらに生成したＤＬ−グルタミン酸とグルタミン酸
脱炭酸酵素活性を有する微生物の菌体、培養液またはそ
れらの処理物を、ｐＨ3.5 〜5.5 、好適にはｐＨ4.0 〜
5.0 に保持しつつ接触させることにより、該水性媒体中
のＬ−グルタミン酸のみをγ−アミノ酪酸にすることが
できる。
【００１０】接触させる際に用いる菌体の濃度は、湿菌
体として１〜１００ｇ／ｌ、好適には１〜５０ｇ／ｌ、
酵素単位として0.09〜９Ｕ／ml、好適には0.09〜4.5 Ｕ
／mlである。その際、そのまま菌体を用いてもよいが、
トルエンやキシレンなどの有機溶剤を添加したり、アセ
トン処理菌体を用いたりすることもできる。トルエンや
キシレンなどの有機溶剤を添加する場合にはその添加量
は0.1 〜5.0 ％（v/v)であればよい。ｐＨの調整は、リ
ン酸、塩酸、硫酸などの酸溶液を用い、接触中の温度は
２５〜４０℃で行う。接触時間はラセミ化反応に用いた
Ｌ−グルタミン酸量および菌体量によって異なるが、通
常１〜７２時間である。
体として１〜１００ｇ／ｌ、好適には１〜５０ｇ／ｌ、
酵素単位として0.09〜９Ｕ／ml、好適には0.09〜4.5 Ｕ
／mlである。その際、そのまま菌体を用いてもよいが、
トルエンやキシレンなどの有機溶剤を添加したり、アセ
トン処理菌体を用いたりすることもできる。トルエンや
キシレンなどの有機溶剤を添加する場合にはその添加量
は0.1 〜5.0 ％（v/v)であればよい。ｐＨの調整は、リ
ン酸、塩酸、硫酸などの酸溶液を用い、接触中の温度は
２５〜４０℃で行う。接触時間はラセミ化反応に用いた
Ｌ−グルタミン酸量および菌体量によって異なるが、通
常１〜７２時間である。
【００１１】このようにして得られる該水性媒体中に
は、Ｄ−グルタミン酸およびγ−アミノ酪酸が存在して
いる。該水性媒体より、微生物菌体または菌体処理物を
遠心分離などの手段により除去した後、直接晶出法、イ
オン交換樹脂処理などにより、Ｄ−グルタミン酸を得る
ことができる。なお、Ｄ−グルタミン酸の同定は、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定および
比旋光度の測定によって行う。
は、Ｄ−グルタミン酸およびγ−アミノ酪酸が存在して
いる。該水性媒体より、微生物菌体または菌体処理物を
遠心分離などの手段により除去した後、直接晶出法、イ
オン交換樹脂処理などにより、Ｄ−グルタミン酸を得る
ことができる。なお、Ｄ−グルタミン酸の同定は、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定および
比旋光度の測定によって行う。
【００１２】ラクトバチルス属に属する微生物のグルタ
ミン酸ラセマーゼ遺伝子の大腸菌へのクローン化は、以
下のように行われる。グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子源
としては、ラクトバチルス属に属し、グルタミン酸ラセ
マーゼ活性を有する微生物であればいずれでもよい。好
適な例としては、ラクトバチルス・ブレビスＡＴＣＣ８
２８７があげられる。グルタミン酸ラセマーゼをコード
するＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとしては、大
腸菌Ｋ１２株で複製可能なものであればいずれでもよ
い。好適な例としては、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）が
あげられる。
ミン酸ラセマーゼ遺伝子の大腸菌へのクローン化は、以
下のように行われる。グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子源
としては、ラクトバチルス属に属し、グルタミン酸ラセ
マーゼ活性を有する微生物であればいずれでもよい。好
適な例としては、ラクトバチルス・ブレビスＡＴＣＣ８
２８７があげられる。グルタミン酸ラセマーゼをコード
するＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとしては、大
腸菌Ｋ１２株で複製可能なものであればいずれでもよ
い。好適な例としては、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）が
あげられる。
【００１３】グルタミン酸ラセマーゼをコードするＤＮ
Ａ断片とプラスミドベクターとの組換えは、ラクトバチ
ルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素
で処理してグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子領域を含むＤ
ＮＡ断片を作製し、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端
を生じる制限酵素で処理したプラスミドに組み込んだ
後、該組換え体ＤＮＡで大腸菌を形質転換し、目的のＤ
ＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体を
分離すればよい。この一連の操作は公知のin vitro組換
え技法〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloni
ng), T.Maniatiset al. コールド スプリング ハー
バー ラボラトリー（1982）〕に従って行われる。
Ａ断片とプラスミドベクターとの組換えは、ラクトバチ
ルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素
で処理してグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子領域を含むＤ
ＮＡ断片を作製し、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端
を生じる制限酵素で処理したプラスミドに組み込んだ
後、該組換え体ＤＮＡで大腸菌を形質転換し、目的のＤ
ＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体を
分離すればよい。この一連の操作は公知のin vitro組換
え技法〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloni
ng), T.Maniatiset al. コールド スプリング ハー
バー ラボラトリー（1982）〕に従って行われる。
【００１４】組換え体ＤＮＡの受容菌としてはエシェリ
ヒア属に属する微生物であればいずれでもよいが、一般
的に大腸菌はグルタミン酸ラセマーゼ活性を有しないた
め、Ｌ−グルタミン酸を単一の炭素および窒素源として
良好に生育するが、Ｄ−グルタミン酸では生育できない
か、あるいは生育が微弱である。しかるに、グルタミン
酸ラセマーゼ活性を有するようになった大腸菌は、グル
タミン酸ラセマーゼによりＤ−グルタミン酸がＬ−グル
タミン酸に転換するため、Ｄ−グルタミン酸を単一の炭
素および窒素源として良好に生育できるようになる。従
って、組換え体ＤＮＡの受容菌としては、制限系を欠損
したエシェリヒア属に属する微生物であればいずれでも
よいが、より好適にはＬ−グルタミン酸要求株が用いら
れる。
ヒア属に属する微生物であればいずれでもよいが、一般
的に大腸菌はグルタミン酸ラセマーゼ活性を有しないた
め、Ｌ−グルタミン酸を単一の炭素および窒素源として
良好に生育するが、Ｄ−グルタミン酸では生育できない
か、あるいは生育が微弱である。しかるに、グルタミン
酸ラセマーゼ活性を有するようになった大腸菌は、グル
タミン酸ラセマーゼによりＤ−グルタミン酸がＬ−グル
タミン酸に転換するため、Ｄ−グルタミン酸を単一の炭
素および窒素源として良好に生育できるようになる。従
って、組換え体ＤＮＡの受容菌としては、制限系を欠損
したエシェリヒア属に属する微生物であればいずれでも
よいが、より好適にはＬ−グルタミン酸要求株が用いら
れる。
【００１５】このような微生物は、変異処理によりエシ
ェリヒア・コリＫ１２株の制限系を欠損させた菌株を親
株として、さらに通常の変異処理を行うことにより取得
することができる。変異誘導法としては、紫外線照射、
Ｘ線照射、放射線照射、変異誘起剤処理などの通常用い
られる変異処理のいずれも用いることができる。
ェリヒア・コリＫ１２株の制限系を欠損させた菌株を親
株として、さらに通常の変異処理を行うことにより取得
することができる。変異誘導法としては、紫外線照射、
Ｘ線照射、放射線照射、変異誘起剤処理などの通常用い
られる変異処理のいずれも用いることができる。
【００１６】変異処理菌体からのＬ−グルタミン酸要求
株の分離は、以下のように行われる。すなわち、変異処
理を行った菌体を寒天栄養培地（例えばＬ寒天培地）に
塗布し、３０℃で１〜２日間培養する。出現したコロニ
ーを寒天最少培地（例えばＭ９寒天培地）および微量の
Ｌ−グルタミン酸を含む寒天最少培地に塗布し、それぞ
れ３０℃で１〜３日間培養しその生育を比較する。Ｌ−
グルタミン酸を含む寒天最少培地で生育し、Ｌ−グルタ
ミン酸を含まない寒天最少培地では生育できないコロニ
ーを選択することにより、Ｌ−グルタミン酸要求株を得
ることができる。
株の分離は、以下のように行われる。すなわち、変異処
理を行った菌体を寒天栄養培地（例えばＬ寒天培地）に
塗布し、３０℃で１〜２日間培養する。出現したコロニ
ーを寒天最少培地（例えばＭ９寒天培地）および微量の
Ｌ−グルタミン酸を含む寒天最少培地に塗布し、それぞ
れ３０℃で１〜３日間培養しその生育を比較する。Ｌ−
グルタミン酸を含む寒天最少培地で生育し、Ｌ−グルタ
ミン酸を含まない寒天最少培地では生育できないコロニ
ーを選択することにより、Ｌ−グルタミン酸要求株を得
ることができる。
【００１７】このような微生物は一般的にＬ−グルタミ
ン酸が培地中に存在しないと生育できないのに対し、グ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を有するようになった該微生
物では、Ｄ−グルタミン酸でもグルタミン酸ラセマーゼ
の働きによってＬ−グルタミン酸と同等の効果を微生物
の生育にたいして有する。従って、グルタミン酸ラセマ
ーゼ活性を有するようになった該微生物では、Ｄ−グル
タミン酸を要求物質として生育する。このような微生物
の例として、エシェリヒア・コリＨ−ＴＭ９３（以下、
Ｈ−ＴＭ９３と略記する）があげられる。Ｈ−ＴＭ９３
は本発明者らが、制限系の欠損した大腸菌エシェリヒア
・コリＫ１２株より新たに分離した微生物である。
ン酸が培地中に存在しないと生育できないのに対し、グ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を有するようになった該微生
物では、Ｄ−グルタミン酸でもグルタミン酸ラセマーゼ
の働きによってＬ−グルタミン酸と同等の効果を微生物
の生育にたいして有する。従って、グルタミン酸ラセマ
ーゼ活性を有するようになった該微生物では、Ｄ−グル
タミン酸を要求物質として生育する。このような微生物
の例として、エシェリヒア・コリＨ−ＴＭ９３（以下、
Ｈ−ＴＭ９３と略記する）があげられる。Ｈ−ＴＭ９３
は本発明者らが、制限系の欠損した大腸菌エシェリヒア
・コリＫ１２株より新たに分離した微生物である。
【００１８】ラクトバチルス属に属する微生物のグルタ
ミン酸ラセマーゼをコードするＤＮＡを含有する組換え
体ＤＮＡで宿主大腸菌のＬ−グルタミン酸要求株を形質
転換し、Ｄ−グルタミン酸を単一の炭素および窒素源あ
るいは要求物質として良好に生育できる形質転換体を選
択すれば、該形質転換体は該組換え体ＤＮＡを保有する
菌株である可能性が高い。さらに、選択した菌株のグル
タミン酸ラセマーゼ活性を測定することにより、目的と
する組換え体ＤＮＡを保有する菌株を得ることができ
る。
ミン酸ラセマーゼをコードするＤＮＡを含有する組換え
体ＤＮＡで宿主大腸菌のＬ−グルタミン酸要求株を形質
転換し、Ｄ−グルタミン酸を単一の炭素および窒素源あ
るいは要求物質として良好に生育できる形質転換体を選
択すれば、該形質転換体は該組換え体ＤＮＡを保有する
菌株である可能性が高い。さらに、選択した菌株のグル
タミン酸ラセマーゼ活性を測定することにより、目的と
する組換え体ＤＮＡを保有する菌株を得ることができ
る。
【００１９】このような微生物として、エシェリヒア・
コリＨ−ＴＭＧＲ１およびＨ−ＴＭＧＲ２があげられ
る。これらの微生物は平成４年３月３日付けで工業技術
院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−３７７９お
よびＦＥＲＭ ＢＰ−３７８０として寄託されている。
コリＨ−ＴＭＧＲ１およびＨ−ＴＭＧＲ２があげられ
る。これらの微生物は平成４年３月３日付けで工業技術
院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−３７７９お
よびＦＥＲＭ ＢＰ−３７８０として寄託されている。
【００２０】グルタミン酸ラセマーゼをコードするＤＮ
Ａ断片を各種の制限酵素で処理して小断片を調製し、得
られた各々の小断片を含むプラスミドのグルタミン酸ラ
セマーゼ活性を測定することにより、グルタミン酸ラセ
マーゼ遺伝子の存在位置をさらに限定することができ
る。ＤＮＡ断片の塩基配列は、ダイデオキシ法〔サイエ
ンス(Science), 214, 1205(1981)〕などにより決定でき
る。
Ａ断片を各種の制限酵素で処理して小断片を調製し、得
られた各々の小断片を含むプラスミドのグルタミン酸ラ
セマーゼ活性を測定することにより、グルタミン酸ラセ
マーゼ遺伝子の存在位置をさらに限定することができ
る。ＤＮＡ断片の塩基配列は、ダイデオキシ法〔サイエ
ンス(Science), 214, 1205(1981)〕などにより決定でき
る。
【００２１】グルタミン酸ラセマーゼ活性は、以下のよ
うにして測定する。Ｌ−グルタミン酸１００ｇ／ｌ、ト
ルエン２％（v/v)を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、
ｐＨ8.5 ）に、湿菌体を１ｇ／ｌになるように加え、３
０℃で２時間反応させた後、反応液を沸騰水中で１０分
間保持し反応を停止させる。反応液より菌体を遠心除去
後、上清をＨＰＬＣにて分析し、生成したＤ−グルタミ
ン酸量を測定する。
うにして測定する。Ｌ−グルタミン酸１００ｇ／ｌ、ト
ルエン２％（v/v)を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、
ｐＨ8.5 ）に、湿菌体を１ｇ／ｌになるように加え、３
０℃で２時間反応させた後、反応液を沸騰水中で１０分
間保持し反応を停止させる。反応液より菌体を遠心除去
後、上清をＨＰＬＣにて分析し、生成したＤ−グルタミ
ン酸量を測定する。
【００２２】ＨＰＬＣでの分析条件は以下のとおりであ
る。 ＨＰＬＣ分析条件： １）カラム ：ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＲＳ１０Ｗ（三菱
化成工業社製） ２）移動相 ：２ｍＭ ＣｕＳＯ4 水溶液 ３）カラム温度：３５℃ ４）流速 ：１ml／min ５）サンプル量：２０μｌ ６）検出 ：２５４nm紫外部吸収 なお、１分間に、１μmol のＤ−グルタミン酸を生成す
る酵素活性を１ユニット（Ｕ）として表示する。
る。 ＨＰＬＣ分析条件： １）カラム ：ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＲＳ１０Ｗ（三菱
化成工業社製） ２）移動相 ：２ｍＭ ＣｕＳＯ4 水溶液 ３）カラム温度：３５℃ ４）流速 ：１ml／min ５）サンプル量：２０μｌ ６）検出 ：２５４nm紫外部吸収 なお、１分間に、１μmol のＤ−グルタミン酸を生成す
る酵素活性を１ユニット（Ｕ）として表示する。
【００２３】グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する微生
物としては、該活性を有する微生物であればいずれでも
よい。このような微生物の例としては以下のようなもの
がある。 エシェリヒア・コリ２６：ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.), 235, 1649(1
960) エシェリヒア・コリＷ：バイオケミストリー（Biochemi
stry),９, 226(1970) エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ１１２４６，ＡＴＣＣ１
３６７６，ＡＴＣＣ２１１８６ ラクトバチルス・ブレビス ＡＴＣＣ８２８７ なお、より活性の強い微生物を用いることにより、より
効率よくＤ−グルタミン酸を製造することができる。た
とえばエシェリヒア・コリＡＴＣＣ１１２４６はラクト
バチルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７と比べ、湿菌体当
たり２０倍以上のグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有す
る。
物としては、該活性を有する微生物であればいずれでも
よい。このような微生物の例としては以下のようなもの
がある。 エシェリヒア・コリ２６：ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.), 235, 1649(1
960) エシェリヒア・コリＷ：バイオケミストリー（Biochemi
stry),９, 226(1970) エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ１１２４６，ＡＴＣＣ１
３６７６，ＡＴＣＣ２１１８６ ラクトバチルス・ブレビス ＡＴＣＣ８２８７ なお、より活性の強い微生物を用いることにより、より
効率よくＤ−グルタミン酸を製造することができる。た
とえばエシェリヒア・コリＡＴＣＣ１１２４６はラクト
バチルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７と比べ、湿菌体当
たり２０倍以上のグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有す
る。
【００２４】エシェリヒア属に属し、グルタミン酸ラセ
マーゼ活性を有する微生物もしくはＬ−グルタミン酸脱
炭酸酵素活性を有する微生物を培養する培地としては、
炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類を含有している
ものが使用できる。炭素源としては、グルコース、フラ
クトース、シュクロース、ラクトースなどの各種の炭水
化物およびこれらを含有する糖蜜、デンプン加水分解物
などが用いられる。
マーゼ活性を有する微生物もしくはＬ−グルタミン酸脱
炭酸酵素活性を有する微生物を培養する培地としては、
炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類を含有している
ものが使用できる。炭素源としては、グルコース、フラ
クトース、シュクロース、ラクトースなどの各種の炭水
化物およびこれらを含有する糖蜜、デンプン加水分解物
などが用いられる。
【００２５】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、アミン類、その他含窒素化合物、ならびにペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カ
ゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体お
よびその消化物などが用いられる。無機物としては、リ
ン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネ
シウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用い
られる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、アミン類、その他含窒素化合物、ならびにペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カ
ゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体お
よびその消化物などが用いられる。無機物としては、リ
ン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネ
シウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用い
られる。
【００２６】培養温度は、２０〜４２℃、好適には３０
〜３８℃である。培養中ｐＨは5.0〜9.0 、好適には6.0
〜7.5 に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機
の酸、アルカリ溶液、炭酸カルシウム、アンモニアなど
を用いて行う。培養時間は、通常５〜７２時間である。
このようにして培養して得られる各々の微生物菌体中
に、Ｌ−グルタミン酸をＤＬ−グルタミン酸にするグル
タミン酸ラセマーゼ、もしくはＬ−グルタミン酸を分解
してγ−アミノ酪酸にするＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素
が生成蓄積される。以下に本発明の実施例を示す。
〜３８℃である。培養中ｐＨは5.0〜9.0 、好適には6.0
〜7.5 に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機
の酸、アルカリ溶液、炭酸カルシウム、アンモニアなど
を用いて行う。培養時間は、通常５〜７２時間である。
このようにして培養して得られる各々の微生物菌体中
に、Ｌ−グルタミン酸をＤＬ−グルタミン酸にするグル
タミン酸ラセマーゼ、もしくはＬ−グルタミン酸を分解
してγ−アミノ酪酸にするＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素
が生成蓄積される。以下に本発明の実施例を示す。
【００２７】
実施例１．ラクトバチルス・ブレビス ATCC 8287を酵母
エキス−ペプトン寒天平板培地（酵母エキス ５.５g/
l、ペプトン １２.５g/l、グルコース １１.０g/l、KH2
PO4０.２５g/l、K2HPO4 ０.２５g/l、酢酸ナトリウム
１０g/l、MgSO4・7H2O ０.１g/l、MnSO4・4〜6H2O ５mg/
l、FeSO4・7H2O ５mg/l、寒天２０g/l、pH６.８）に塗布
し、３７℃、２日間培養した。
エキス−ペプトン寒天平板培地（酵母エキス ５.５g/
l、ペプトン １２.５g/l、グルコース １１.０g/l、KH2
PO4０.２５g/l、K2HPO4 ０.２５g/l、酢酸ナトリウム
１０g/l、MgSO4・7H2O ０.１g/l、MnSO4・4〜6H2O ５mg/
l、FeSO4・7H2O ５mg/l、寒天２０g/l、pH６.８）に塗布
し、３７℃、２日間培養した。
【００２８】培養菌１白金耳を、１リットルの醗酵培地
（グルコース ２０g/l、コーンスチープリカー ３０g/
l、酢酸ナトリウム ２０g/l、KH2PO4 １g/l、K2HPO4 ３
g/l、MgSO4・7H2O １g/l、MnSO4・4〜6H2O １mg/l、FeSO4
・7H2O １０mg/l、微量金属液１ml およびビタミン混合
液１ml からなる液をpH７.０に調整後、１２０℃、２０
分間殺菌したもの）に植菌し、３７℃で２４時間静置培
養した。なお、微量金属液とは、(NH4)6Mo7O24・4H2O ３
７mg/l、FeSO4・7H2O ９９０mg/l、ZnSO4・7H2O８８０mg/
l、CuSO4・5H2O ３９３mg/l、MnCl2・4H2O ７２mg/l、お
よびNa2B4O7・10H2O ８８mg/lの組成からなる液のことを
いい、ビタミン混合液とは、リボフラビン ２g/l、チア
ミン−HCl １g/l、ｐ−アミノ安息香酸 １g/l、ニコチ
ン酸 １g/l、パントテン酸カルシウム １g/l、ピリドキ
シン １g/l、ビオチン １０mg/lおよび葉酸 １mg/lの組
成からなる液のことをいう。
（グルコース ２０g/l、コーンスチープリカー ３０g/
l、酢酸ナトリウム ２０g/l、KH2PO4 １g/l、K2HPO4 ３
g/l、MgSO4・7H2O １g/l、MnSO4・4〜6H2O １mg/l、FeSO4
・7H2O １０mg/l、微量金属液１ml およびビタミン混合
液１ml からなる液をpH７.０に調整後、１２０℃、２０
分間殺菌したもの）に植菌し、３７℃で２４時間静置培
養した。なお、微量金属液とは、(NH4)6Mo7O24・4H2O ３
７mg/l、FeSO4・7H2O ９９０mg/l、ZnSO4・7H2O８８０mg/
l、CuSO4・5H2O ３９３mg/l、MnCl2・4H2O ７２mg/l、お
よびNa2B4O7・10H2O ８８mg/lの組成からなる液のことを
いい、ビタミン混合液とは、リボフラビン ２g/l、チア
ミン−HCl １g/l、ｐ−アミノ安息香酸 １g/l、ニコチ
ン酸 １g/l、パントテン酸カルシウム １g/l、ピリドキ
シン １g/l、ビオチン １０mg/lおよび葉酸 １mg/lの組
成からなる液のことをいう。
【００２９】得られた培養液を４℃、５,０００rpm、１
０分間遠心分離し、集菌後、菌体をＴＥ緩衝液〔１０mM
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリス
と略す）、１mM EDTA-Na2 、（pH７.５）〕にて洗浄集
菌し、菌体から、斉藤−三浦の方法〔バイオキミカ・エ
・バイオフィジカ・アクタ(Biochim.Biophys.Acta)，7
2，619 (1963)〕に従って、高分子染色体ＤＮＡを単離
した。この染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化
した。即ち、染色体ＤＮＡ２μgを含む制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII用反応液〔トリス ５０mM、MgCl2 １０mM、NaCl
５０mM、（pH７.５）〕９０μlに、２単位のＨｉｎｄII
I（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０分間反応さ
せ、６５℃、１０分間の加温で反応を停止させた。
０分間遠心分離し、集菌後、菌体をＴＥ緩衝液〔１０mM
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリス
と略す）、１mM EDTA-Na2 、（pH７.５）〕にて洗浄集
菌し、菌体から、斉藤−三浦の方法〔バイオキミカ・エ
・バイオフィジカ・アクタ(Biochim.Biophys.Acta)，7
2，619 (1963)〕に従って、高分子染色体ＤＮＡを単離
した。この染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化
した。即ち、染色体ＤＮＡ２μgを含む制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII用反応液〔トリス ５０mM、MgCl2 １０mM、NaCl
５０mM、（pH７.５）〕９０μlに、２単位のＨｉｎｄII
I（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０分間反応さ
せ、６５℃、１０分間の加温で反応を停止させた。
【００３０】一方、クローニングのベクターとしては、
ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）〔ジーン（Gene）,2 ,95
（1975）〕を用いた。このｐＢＲ３２２ １μgを含むＨ
ｉｎｄIII用反応液９０μlに、２単位のＨｉｎｄIIIを
添加し、３７℃、６０分間反応後、６５℃で１０分間加
温して反応を停止させた。上記で得られた両反応液を混
合し、１０倍濃度のＴ４ＤＮＡリガーゼ用緩衝液〔トリ
ス ６６０mM、MgCl2 ６６mM、ジチオスレイトール １０
０mM、（pH７.６）〕２０μl、１００mM ＡＴＰ２μl、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３５０単位を加え、
１２℃で１６時間連結反応させた。この反応液を、エシ
ェリヒア・コリＨ−ＴＭ９３の形質転換に供した。
ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）〔ジーン（Gene）,2 ,95
（1975）〕を用いた。このｐＢＲ３２２ １μgを含むＨ
ｉｎｄIII用反応液９０μlに、２単位のＨｉｎｄIIIを
添加し、３７℃、６０分間反応後、６５℃で１０分間加
温して反応を停止させた。上記で得られた両反応液を混
合し、１０倍濃度のＴ４ＤＮＡリガーゼ用緩衝液〔トリ
ス ６６０mM、MgCl2 ６６mM、ジチオスレイトール １０
０mM、（pH７.６）〕２０μl、１００mM ＡＴＰ２μl、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３５０単位を加え、
１２℃で１６時間連結反応させた。この反応液を、エシ
ェリヒア・コリＨ−ＴＭ９３の形質転換に供した。
【００３１】形質転換は、モレキュラー・クローニング
〔Molecular Cloning，T. Maniatiset al. コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1982）〕記載の
方法に従って行った。即ち、Ｌ培地（バクトトリプトン
１０ｇ、酵母エキス ５ｇ、グルコース １ｇおよび塩
化ナトリウム ５ｇを水１リットルに含み、pH７.２に調
整した培地）１００mlにＨ−ＴＭ９３を１白金耳植菌
し、ＯＤ66０が０.２になるまで３７℃で培養した。培
養液を氷中で１０分間冷やした後、遠心して菌体を得
た。冷却した５０mM塩化カルシウム−２０mMトリス（pH
８.０）２５mlに菌体を再懸濁し氷水中に１５分間お
き、再遠心した。さらに、菌体を２mlの５０mM塩化カル
シウム−２０mMトリス（pH８.０）に懸濁し氷中で１８
時間置いた。得られた菌液１５０μlに上記リガーゼ反
応混合液５０μlを添加混合し、氷中で１０分間置いて
から４２℃で２分間加温した。次いでＬ培地２mlを添加
し、３７℃で２時間培養した。
〔Molecular Cloning，T. Maniatiset al. コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1982）〕記載の
方法に従って行った。即ち、Ｌ培地（バクトトリプトン
１０ｇ、酵母エキス ５ｇ、グルコース １ｇおよび塩
化ナトリウム ５ｇを水１リットルに含み、pH７.２に調
整した培地）１００mlにＨ−ＴＭ９３を１白金耳植菌
し、ＯＤ66０が０.２になるまで３７℃で培養した。培
養液を氷中で１０分間冷やした後、遠心して菌体を得
た。冷却した５０mM塩化カルシウム−２０mMトリス（pH
８.０）２５mlに菌体を再懸濁し氷水中に１５分間お
き、再遠心した。さらに、菌体を２mlの５０mM塩化カル
シウム−２０mMトリス（pH８.０）に懸濁し氷中で１８
時間置いた。得られた菌液１５０μlに上記リガーゼ反
応混合液５０μlを添加混合し、氷中で１０分間置いて
から４２℃で２分間加温した。次いでＬ培地２mlを添加
し、３７℃で２時間培養した。
【００３２】この菌液を遠心し、得られた菌体を生理食
塩水で２回洗浄後、アンピシリン１００μg/ml、Ｄ−グ
ルタミン酸 ２５０μg/mlを含むＭ９寒天培地〔Na2HPO4
６ｇ，KH2PO4 ３ｇ，NaCl ０.５ｇ，NH4Cl １ｇ，MgSO4
・7H2O ０.５ｇ，グルコース ２ｇ，塩化カルシウム ０.
０１ｇ，サイアミン塩酸塩 ０.１mgを水１リットルに含
みpH７.２に調整した培地（Ｍ９培地）１リットルに寒
天２０ｇを加えた培地〕に塗布し、３０℃で５日間培養
した。Ｄ−グルタミン酸を含有したＭ９寒天培地上で生
育したコロニーを釣菌しＬ培地で培養後集菌してそのグ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を調べたところ、該菌株はラ
クトバチルス・ブレビス ATCC 8287の１００倍以上のグ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を有していることが判明し
た。結果を第１表に示す。
塩水で２回洗浄後、アンピシリン１００μg/ml、Ｄ−グ
ルタミン酸 ２５０μg/mlを含むＭ９寒天培地〔Na2HPO4
６ｇ，KH2PO4 ３ｇ，NaCl ０.５ｇ，NH4Cl １ｇ，MgSO4
・7H2O ０.５ｇ，グルコース ２ｇ，塩化カルシウム ０.
０１ｇ，サイアミン塩酸塩 ０.１mgを水１リットルに含
みpH７.２に調整した培地（Ｍ９培地）１リットルに寒
天２０ｇを加えた培地〕に塗布し、３０℃で５日間培養
した。Ｄ−グルタミン酸を含有したＭ９寒天培地上で生
育したコロニーを釣菌しＬ培地で培養後集菌してそのグ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を調べたところ、該菌株はラ
クトバチルス・ブレビス ATCC 8287の１００倍以上のグ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を有していることが判明し
た。結果を第１表に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単
離し、制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し
たところ、得られたプラスミドは、７.１キロベース（k
b）の大きさであり、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII切断点
に、ラクトバチルス・ブレビス ATCC 8287の染色体ＤＮ
Ａ由来の約２.７kbのＨｉｎｄIII断片を有していた。こ
のプラスミドをｐＧＡＲ１と命名した。同様にして、他
の形質転換株を調べたところ、ｐＧＡＲ１に挿入されて
いる約２.７kbのＨｉｎｄIII断片がｐＧＡＲ１とは逆向
きであるプラスミドが存在することが判明した。このプ
ラスミドをｐＧＡＲ２と命名した。プラスミドｐＧＡＲ
１およびｐＧＡＲ２の制限酵素地図を図１および図２に
示す。
離し、制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し
たところ、得られたプラスミドは、７.１キロベース（k
b）の大きさであり、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII切断点
に、ラクトバチルス・ブレビス ATCC 8287の染色体ＤＮ
Ａ由来の約２.７kbのＨｉｎｄIII断片を有していた。こ
のプラスミドをｐＧＡＲ１と命名した。同様にして、他
の形質転換株を調べたところ、ｐＧＡＲ１に挿入されて
いる約２.７kbのＨｉｎｄIII断片がｐＧＡＲ１とは逆向
きであるプラスミドが存在することが判明した。このプ
ラスミドをｐＧＡＲ２と命名した。プラスミドｐＧＡＲ
１およびｐＧＡＲ２の制限酵素地図を図１および図２に
示す。
【００３５】プラスミドｐＧＡＲ１をエシェリヒア・コ
リＨ−ＴＭ９３に導入した組換え株をＨ−ＴＭＧＲ１、
プラスミドｐＧＡＲ２をエシェリヒア・コリＨ−ＴＭ９
３に導入した組換え株をＨ−ＴＭＧＲ２と各々命名し
た。プラスミドｐＧＡＲ１を保有する組換え株Ｈ−ＴＭ
ＧＲ１を１白金耳、１００μg/mlのアンピシリンを含む
３００mlのＬ培地に植菌し、３０℃、１８時間振盪培養
した。培養後集菌し、１リットル三角フラスコ中のＬ−
グルタミン酸 １００g/l、トルエン ２％（v/v）を含む
水溶液（水酸化ナトリウムによりpH８.５に調整したも
の）５００mlに、Ｈ−ＴＭＧＲ１を湿菌体として３g/l
となるように加え、３０℃、５時間緩やかに振盪した。
その結果、水性媒体中にはＤ−グルタミン酸４９.７g/l
が生成し、残存するＬ−グルタミン酸は４９.８g/lであ
った。
リＨ−ＴＭ９３に導入した組換え株をＨ−ＴＭＧＲ１、
プラスミドｐＧＡＲ２をエシェリヒア・コリＨ−ＴＭ９
３に導入した組換え株をＨ−ＴＭＧＲ２と各々命名し
た。プラスミドｐＧＡＲ１を保有する組換え株Ｈ−ＴＭ
ＧＲ１を１白金耳、１００μg/mlのアンピシリンを含む
３００mlのＬ培地に植菌し、３０℃、１８時間振盪培養
した。培養後集菌し、１リットル三角フラスコ中のＬ−
グルタミン酸 １００g/l、トルエン ２％（v/v）を含む
水溶液（水酸化ナトリウムによりpH８.５に調整したも
の）５００mlに、Ｈ−ＴＭＧＲ１を湿菌体として３g/l
となるように加え、３０℃、５時間緩やかに振盪した。
その結果、水性媒体中にはＤ−グルタミン酸４９.７g/l
が生成し、残存するＬ−グルタミン酸は４９.８g/lであ
った。
【００３６】得られたＤＬ−グルタミン酸を含む水性媒
体のpHを６Ｎ塩酸にて４.２とし、１リットル三角フラ
スコ中の水性媒体５００mlに、Ｌ−グルタミン酸脱炭酸
酵素活性を有するエシェリヒア・コリ ATCC 11246 の培
養菌体を湿菌体として、５g/lになるように加え、３０
℃、１０時間、緩やかに振盪した。エシェリヒア・コリ
ATCC 11246 の培養は、アンピシリンを含まないＬ培地
を用いたほかは、Ｈ−ＴＭＧＲ１の培養方法に準じて行
った。その結果、水性媒体中のＬ−グルタミン酸が定量
的にγ−アミノ酪酸に転換し、水性媒体中にはＤ−グル
タミン酸４８.１g/lが残存した。またＬ−グルタミン酸
は検出されなかった。
体のpHを６Ｎ塩酸にて４.２とし、１リットル三角フラ
スコ中の水性媒体５００mlに、Ｌ−グルタミン酸脱炭酸
酵素活性を有するエシェリヒア・コリ ATCC 11246 の培
養菌体を湿菌体として、５g/lになるように加え、３０
℃、１０時間、緩やかに振盪した。エシェリヒア・コリ
ATCC 11246 の培養は、アンピシリンを含まないＬ培地
を用いたほかは、Ｈ−ＴＭＧＲ１の培養方法に準じて行
った。その結果、水性媒体中のＬ−グルタミン酸が定量
的にγ−アミノ酪酸に転換し、水性媒体中にはＤ−グル
タミン酸４８.１g/lが残存した。またＬ−グルタミン酸
は検出されなかった。
【００３７】得られた水性媒体１００mlをとり、菌体を
遠心除去したのち、上清液のpHを６Ｎ塩酸にて３.２に
調整後濃縮し、Ｄ−グルタミン酸の結晶４.２gを得た。
得られたＤ−グルタミン酸の比旋光度は、〔α〕20 D＝
−31.8°(c=10,2N HCl) であった。
遠心除去したのち、上清液のpHを６Ｎ塩酸にて３.２に
調整後濃縮し、Ｄ−グルタミン酸の結晶４.２gを得た。
得られたＤ−グルタミン酸の比旋光度は、〔α〕20 D＝
−31.8°(c=10,2N HCl) であった。
【００３８】実施例２．ｐＧＡＲ１およびｐＧＡＲ２に
挿入されている約2.7kbのＨｉｎｄIII断片におけるグル
タミン酸ラセマーゼ遺伝子の位置を特定するために、こ
の挿入断片上に存在する制限酵素切断部位を利用して、
種々の小断片を調製した。これらの断片と、それぞれ粘
着末端を生じるように制限酵素処理をしたプラスミド・
ベクターｐＵＣ１８あるいはｐＵＣ１９とを連結し、エ
シェリヒア・コリＴＭ９３に導入し、組換え体のグルタ
ミン酸ラセマーゼ活性を測定した。
挿入されている約2.7kbのＨｉｎｄIII断片におけるグル
タミン酸ラセマーゼ遺伝子の位置を特定するために、こ
の挿入断片上に存在する制限酵素切断部位を利用して、
種々の小断片を調製した。これらの断片と、それぞれ粘
着末端を生じるように制限酵素処理をしたプラスミド・
ベクターｐＵＣ１８あるいはｐＵＣ１９とを連結し、エ
シェリヒア・コリＴＭ９３に導入し、組換え体のグルタ
ミン酸ラセマーゼ活性を測定した。
【００３９】これらの組換え体の中で、ＨｉｎｄIII〜
ＥｃｏＲＩ断片の約1.4kbを有する組換え体に、ｐＧＡ
Ｒ１あるいはｐＧＡＲ２を有する組換え体Ｈ−ＴＭＧＲ
１あるいはＨ−ＴＭＧＲ２と同等のグルタミン酸ラセマ
ーゼ活性を認めたことから、グルタミン酸ラセマーゼ遺
伝子がＨｉｎｄIII〜ＥｃｏＲＩ断片上にあることが証
明された。このＨｉｎｄIII〜ＥｃｏＲＩ断片の約1.4kb
について、ダイデオキシ法により、塩基配列を決定した
結果、150b以上のオープン・リーディング・フレームと
しては唯一、配列番号１に示す配列が存在した。このオ
ープン・リーディング・フレームは、ＨｉｎｄIII〜Ｅ
ｃｏＲＩの約1.4kb断片上にＨｉｎｄIIIからＥｃｏＲＩ
方向に存在する。
ＥｃｏＲＩ断片の約1.4kbを有する組換え体に、ｐＧＡ
Ｒ１あるいはｐＧＡＲ２を有する組換え体Ｈ−ＴＭＧＲ
１あるいはＨ−ＴＭＧＲ２と同等のグルタミン酸ラセマ
ーゼ活性を認めたことから、グルタミン酸ラセマーゼ遺
伝子がＨｉｎｄIII〜ＥｃｏＲＩ断片上にあることが証
明された。このＨｉｎｄIII〜ＥｃｏＲＩ断片の約1.4kb
について、ダイデオキシ法により、塩基配列を決定した
結果、150b以上のオープン・リーディング・フレームと
しては唯一、配列番号１に示す配列が存在した。このオ
ープン・リーディング・フレームは、ＨｉｎｄIII〜Ｅ
ｃｏＲＩの約1.4kb断片上にＨｉｎｄIIIからＥｃｏＲＩ
方向に存在する。
【００４０】また、このＨｉｎｄIII〜ＥｃｏＲＩの約
1.4kb断片からＨｉｎｄIII〜ＰｓｔＩの約0.7kb部分
（配列番号１のオープン・リーディング・フレーム上23
2bより上流部分）を欠失した組換え体は、グルタミン酸
ラセマーゼ活性を全く示さなかったことから、配列番号
１に示すオープン・リーディング・フレームがグルタミ
ン酸ラセマーゼ構造遺伝子であることが証明された。
1.4kb断片からＨｉｎｄIII〜ＰｓｔＩの約0.7kb部分
（配列番号１のオープン・リーディング・フレーム上23
2bより上流部分）を欠失した組換え体は、グルタミン酸
ラセマーゼ活性を全く示さなかったことから、配列番号
１に示すオープン・リーディング・フレームがグルタミ
ン酸ラセマーゼ構造遺伝子であることが証明された。
【００４１】
【発明の効果】本発明により、工業的に安価で大量に生
産されているＬ−グルタミン酸から、医薬・農薬などの
合成原料として重要なＤ−グルタミン酸を効率よく生産
できる。
産されているＬ−グルタミン酸から、医薬・農薬などの
合成原料として重要なＤ−グルタミン酸を効率よく生産
できる。
【００４２】
配列番号：1 配列の長さ：831 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Lactobacillus brevis 株名：ATCC 8287 配列 ATG CAA AAT GAT CCG ATT GGT CTA ATG GAT TCA GGG GTC GGT GGT TTG 48 Met Gln Asn Asp Pro Ile Gly Leu Met Asp Ser Gly Val Gly Gly Leu 1 5 10 15 ACC GTC TTA AAG GAA GTT CAA CGG TTG TTG CCC ACT GAA AAT ACA GTA 96 Thr Val Leu Lys Glu Val Gln Arg Leu Leu Pro Thr Glu Asn Thr Val 20 25 30 TTT CTG GGC GAT CAG GCG CGT TTG CCA TAT GGA CCG CGC TCG GTG GCT 144 Phe Leu Gly Asp Gln Ala Arg Leu Pro Tyr Gly Pro Arg Ser Val Ala 35 40 45 GAG GTC ACA ATG TTT ACC AAA CAA ATT GCG CAA TTT TTA CGC CAA CAA 192 Glu Val Thr Met Phe Thr Lys Gln Ile Ala Gln Phe Leu Arg Gln Gln 50 55 60 GCA AGA ATC AAA GCG TTA GTG ATT GCG TGT AAC ACG GCA ACT GCA GCG 240 Ala Arg Ile Lys Ala Leu Val Ile Ala Cys Asn Thr Ala Thr Ala Ala 65 70 75 80 GCT CTA ACA ACG ATG CAG CAA ACA TTG CCC ATT CCG GTA ATC GGC GTT 288 Ala Leu Thr Thr Met Gln Gln Thr Leu Pro Ile Pro Val Ile Gly Val 85 90 95 ATT GCA CCG GGT GCG CAG GCC GCG GTG CAG ACA ACC CGT AAT CAC CGA 336 Ile Ala Pro Gly Ala Gln Ala Ala Val Gln Thr Thr Arg Asn His Arg 100 105 110 ATT GGG GTG ATT GCA ACG GCC GGA ACG GTT AAG AGT GAC CAG TAT CGG 384 Ile Gly Val Ile Ala Thr Ala Gly Thr Val Lys Ser Asp Gln Tyr Arg 115 120 125 CGA GAT ATT TTA GCA GCA GCA CCT AAT AGT CAA ATT TTT AGT GTG GCT 432 Arg Asp Ile Leu Ala Ala Ala Pro Asn Ser Gln Ile Phe Ser Val Ala 130 135 140 TGT CCG GAA ATG GTG ACG CTG GCA GAG CAA AAT GAC TTA ACG ACC ACG 480 Cys Pro Glu Met Val Thr Leu Ala Glu Gln Asn Asp Leu Thr Thr Thr 145 150 155 160 CAT GCC CAG TCC GTA GTA GCG GCA AAC TTG GCG TCA CTT ATG GAT AAG 528 Ser Gln Val Thr Leu Val Asp Pro Gly Leu Ala Thr Ala Glu Gln Thr 165 170 175 AAA ATT GAT ACG TTG GTG ATG GGC TGT ACG CAT TTT CCA TTA TTG CGA 576 Val Ala Ile Leu His Ala Gln Ser Val Val Ala Ala Asn Leu Ala Ser 180 185 190 AGC GCT ATT CAG CAC GCT GTG GGT TCA CAG GTG ACC TTG GTG GAT CCC 624 Leu Met Asp Lys Lys Ile Asp Thr Leu Val Met Gly Cys Thr His Phe 195 200 205 GGC TTA GCA ACT GCG GAA CAA ACA GTG GCT ATC CTA AAG ACG CGG GGG 672 Pro Leu Leu Arg Ser Ala Ile Gln His Ala Val Gly Lys Thr Arg Gly 210 215 220 TTA CTC AAT TCT GCC ACG ACA CGT GGG ACG GCT CAA TTC TTT ACC ACG 720 Leu Leu Asn Ser Ala Thr Thr Arg Gly Thr Ala Gln Phe Phe Thr Thr 225 230 235 240 GGT GAG ACA GAC CAG TTT GAT ACG TTG GCT AGT CAG TGG TTG GAT CAG 768 Gly Glu Thr Asp Gln Phe Asp Thr Leu Ala Ser Gln Trp Leu Asp Gln 245 250 255 CAA CCA ACG CCA GCG AAG CAC GTG GCG ATT GCG CAG CTG ACA ACT CCG 816 Gln Pro Thr Pro Ala Lys His Val Ala Ile Ala Gln Leu Thr Thr Pro 260 265 270 ATG GAG GTT AAC TAA 831 Met Glu Val Asn 275 配列番号：２ 配列の長さ：276 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Lactobacillus brevis 株名：ATCC 8287 配列 Met Gln Asn Asp Pro Ile Gly Leu Met Asp Ser Gly Val Gly Gly Leu 1 5 10 15 Thr Val Leu Lys Glu Val Gln Arg Leu Leu Pro Thr Glu Asn Thr Val 20 25 30 Phe Leu Gly Asp Gln Ala Arg Leu Pro Tyr Gly Pro Arg Ser Val Ala 35 40 45 Glu Val Thr Met Phe Thr Lys Gln Ile Ala Gln Phe Leu Arg Gln Gln 50 55 60 Ala Arg Ile Lys Ala Leu Val Ile Ala Cys Asn Thr Ala Thr Ala Ala 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Met Gln Gln Thr Leu Pro Ile Pro Val Ile Gly Val 85 90 95 Ile Ala Pro Gly Ala Gln Ala Ala Val Gln Thr Thr Arg Asn His Arg 100 105 110 Ile Gly Val Ile Ala Thr Ala Gly Thr Val Lys Ser Asp Gln Tyr Arg 115 120 125 Arg Asp Ile Leu Ala Ala Ala Pro Asn Ser Gln Ile Phe Ser Val Ala 130 135 140 Cys Pro Glu Met Val Thr Leu Ala Glu Gln Asn Asp Leu Thr Thr Thr 145 150 155 160 Ser Gln Val Thr Leu Val Asp Pro Gly Leu Ala Thr Ala Glu Gln Thr 165 170 175 Val Ala Ile Leu His Ala Gln Ser Val Val Ala Ala Asn Leu Ala Ser 180 185 190 Leu Met Asp Lys Lys Ile Asp Thr Leu Val Met Gly Cys Thr His Phe 195 200 205 Pro Leu Leu Arg Ser Ala Ile Gln His Ala Val Gly Lys Thr Arg Gly 210 215 220 Leu Leu Asn Ser Ala Thr Thr Arg Gly Thr Ala Gln Phe Phe Thr Thr 225 230 235 240 Gly Glu Thr Asp Gln Phe Asp Thr Leu Ala Ser Gln Trp Leu Asp Gln 245 250 255 Gln Pro Thr Pro Ala Lys His Val Ala Ile Ala Gln Leu Thr Thr Pro 260 265 270 Met Glu Val Asn 275
【００４３】
【図１】図１は、ラクトバチルス・ブレビス ATCC 8287
由来のグルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＧＡＲ１の制限酵素地図を示す。
由来のグルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＧＡＲ１の制限酵素地図を示す。
【図２】図２は、ラクトバチルス・ブレビス ATCC 8287
由来のグルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＧＡＲ２の制限酵素地図を示す。
由来のグルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドｐＧＡＲ２の制限酵素地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 1:24） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:24） Ｃ１２Ｒ 1:24） (56)参考文献 特開 平２−53494（ＪＰ，Ａ) ＡＢＳＴＲ ＡＮＮＵ ＭＥＥＴ Ａ Ｍ ＳＯＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ （1986），Ｖｏｌ．86，ｐ．203，Ｋ− 61 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 13/14 C12N 9/90 C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ
Claims (8)
- 【請求項１】 エシェリヒア属に属し、グルタミン酸ラ
セマーゼ活性を有する微生物の菌体、培養液またはそれ
らの処理物を水性媒体中でＬ−グルタミン酸と接触させ
てＤＬ−グルタミン酸を生成させ、ついで該水性媒体中
に生成したＤＬ−グルタミン酸と、エシェリヒア属に属
し、Ｌ−グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する微生物の
菌体、培養液またはそれらの処理物とを接触させて、該
水性媒体中のＬ−グルタミン酸を分解し、該水性媒体か
ら残存するＤ−グルタミン酸を採取することを特徴とす
るＤ−グルタミン酸の製造法。 - 【請求項２】 Ｌ−グルタミン酸からＤ−グルタミン酸
を生成させる際、水性媒体をｐＨ7.5 〜9.5 に保持して
Ｌ−グルタミン酸をＤＬ−グルタミン酸にラセミ化し、
つづいてｐＨ3.5 〜5.5 に保持してＬ−グルタミン酸を
分解することからなる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有
するグルタミン酸ラセマーゼ。 - 【請求項４】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有
するグルタミン酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号１に示される塩基配列を有し、
かつグルタミン酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項６】 ラクトバチルス属に属する微生物のグル
タミン酸ラセマーゼをコードするＤＮＡを含有し、かつ
下記制限酵素地図を有する組換え体ＤＮＡ。 【式１】 - 【請求項７】 請求項４または５に記載のＤＮＡを含有
する組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項６または７に記載の組換え体ＤＮ
Ａを組み込んでなるエシェリヒア属に属する微生物。
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|---|---|---|---|
| JP15820692A JP3260822B2 (ja) | 1992-04-27 | 1992-06-17 | Ｄ−グルタミン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-107520 | 1992-04-27 | ||
| JP10752092 | 1992-04-27 | ||
| JP15820692A JP3260822B2 (ja) | 1992-04-27 | 1992-06-17 | Ｄ−グルタミン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067183A JPH067183A (ja) | 1994-01-18 |
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Family
ID=26447543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15820692A Expired - Fee Related JP3260822B2 (ja) | 1992-04-27 | 1992-06-17 | Ｄ−グルタミン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3260822B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006254795A (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimane Univ | アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、ｄ−リンゴ酸製造方法 |
| KR101825667B1 (ko) * | 2014-09-30 | 2018-02-06 | 주식회사 알엔에이 | 비배당체가 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 미생물 제제 |
| JP6372428B2 (ja) | 2015-06-22 | 2018-08-15 | 株式会社オートネットワーク技術研究所 | ジョイントコネクタ |
| CN109576200A (zh) * | 2019-01-10 | 2019-04-05 | 鲁东大学 | 一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用 |
-
1992
- 1992-06-17 JP JP15820692A patent/JP3260822B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＡＢＳＴＲ ＡＮＮＵ ＭＥＥＴ ＡＭ ＳＯＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ（１９８６），Ｖｏｌ．８６，ｐ．２０３，Ｋ−６１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH067183A (ja) | 1994-01-18 |
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