KR101825667B1 - 비배당체가 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 미생물 제제 - Google Patents

비배당체가 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 미생물 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배당체로부터 전환된 비배당체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물을 이용하여 배당체를 비배당체 형태로 전환한 다음, 미생물의 세포 내에 축적된 비배당체를 회수하여 배당체로부터 비배당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

비배당체가 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 미생물 제제 {Method of Producing Microbial Agent Comprising Intracellular Accumulated Aglycon Therein and Microbial Agent Produced Therefrom}
본 발명은 비배당체를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물을 이용하여 배당체를 비배당체 형태로 전환한 다음, 비배당체가 세포 내에 축적된 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
유산균은 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물의 한 종류로써 발효과정 중에 포도당 또는 유당과 같은 탄수화물을 분해하여 젖산을 생성하는 세균을 의미한다. 1858년 프랑스의 미생물학자인 루이 파스퇴르에 의하여 유산균의 실체가 밝혀졌고 러시아의 면역학자인 일리야 메치니코프가 1908년 노벨 생리의학상 수상 이후 말년에 "발효유에 의한 불로장생설"을 제창하고 불가리아 민족의 장수 원인이 유산균 발효유에 있음을 주장하면서부터 본격적인 연구가 시작되어, 지금까지 300여종의 유산균이 발견되었다. 유산균은 인간을 포함한 대부분의 포유류의 장내에 서식하는데 특히 인체의 장에는 건강에 유익한 균과 해로운 균을 합하여 100여 종에 달하는 세균이 100조 마리 이상 존재한다. 대사산물로 젖산을 만들어 장을 산성화 시켜주기 때문에 유해 세균의 증식을 억제하고 이상발효에 의한 암모니아나 발암물질의 생성을 줄여주는 역할, 즉 정장 작용을 하는 세균으로 알려져 있다.
유산균의 생리 활성은 주로 유기산을 생산하여 장내의 pH를 저하시킴으로써 장내 유해세균의 증식을 억제하며 정상적인 장내 균총을 유지시켜 주는 기능을 하고 β-글루코시다아제를 생산하여 배당체 이소플라본을 체내에서 흡수가 용이한 비배당체로 전환하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
특히, 이소플라본의 경우 당이 붙어 있는 배당체 (glycoside), 당이 제거된 비배당체 (aglycone), 아세틸글루코사이드 (acetylglucoside), 말로닐글루코사이드 (malonylglucoside)의 4가지 형태로 존재하며, 이 중 비배당체 이소플라본은 장내의 β-글루코시다아제에 의해 가수분해되어 활성형 비배당체인 아글리콘 (aglycone)으로 전환되어 흡수된다. 그러나 일반적인 식품에 함유된 이소플라본은 당이 결합된 배당체 형태로 존재하며, 식이로부터 섭취된 이소플라본이 흡수가 되기 위해서는 장내 미생물에 의해 비배당체 형태로 전환되어야 한다. 따라서, β-글루코시다아제의 활성을 가지는 미생물은 이소플라본의 생체이용성에 매우 중요한 역할을 할 수 있다.
기존의 이소플라본 추출방법은 이소플라본을 함유한 식물체의 분말을 물로 추출하고, 추출액을 산성화한 다음, 슬러지와 분리하여 흡착성 수지가 충전된 칼럼에 통과시켜, 추출액 중의 이소플라본을 상기 수지에 흡착, 칼럼에 알콜성 용매를 통과시켜 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하는 방법이 있다. 또 다른 방법으로는 이소플라본이 함유된 식물체 또는 식물 가공품을 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체의 용액에 첨가하여 이소플라본을 상기 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체에 결합시켜 추출하는 제1단계 및 상기 추출로 형성된 추출액에 응집제를 투여하여 상기 추출액으로부터 이소플라본과 사이클로 덱스트린의 결합체를 분리하는 제2단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법이 있다. 특히 토종 콩으로부터 비배당체 이소플라본을 추출하기 위해 다양한 기계적 및 화학적 방법을 사용하는데 이에는 초음파를 이용하여 이소플라본을 추출 후, 액체크로마토그래피로 정제하는 방법이 있다. 그러나 이러한 추출방법은 많은 단계의 공정을 포함하고 있어, 생산율의 저하, 생산비의 증가, 정제과정에서의 오염 가능성 등의 문제를 포함한다.
미생물에 의한 배당체 이소플라본의 비배당체 이소플라본으로의 생물전환이 연구되었으며 (Kuo et al., Appl Microbiol Biotechnol 2006. 73:314-320; Lee et al., J Agric Food Chem 2013. 61:12101-12110), 그 중에서도 유산균에 의한 배당체 이소플라본의 비배당체 이소플라본으로의 생물전환이 가능하며 이에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다 (Cavallini et al., Alim. Nutr. 2010. 21:175-182). 일례로 Ali와 그의 동료들은 유산균에 의한 이소플라본 글리코시드의 물질대사의 활성형태인 아글리콘으로의 전환 및 지방과 콜레스테롤 대사에 미치는 영향을 조사하였다. 결과에 따르면 유산균은 이소플라본의 효능증진을 유도하지 못하는 것으로 나타났다. 이러한 이유는 유산균에 의한 생물전환 효율이 낮기 때문인 것으로 보인다 (Ali, et al., J Nutr Biochem. 2004. 15:583-90). 또 다른 보고에 의하면 유산균 비피도 박테리움에 의한 비배당체로의 전환은 콩우유를 첨가하지 않을 경우 73-74%이하로 나타났다. 그러나 콩우유를 첨가할 경우 84-85%로 전환율이 증가 되었다 (2007 11. Newhope 360.com).
한편, 사포닌 (saponin)은 스테로이드 (steroid), 스테로이드 알카로이드 (steroid alkaroid) 혹은 트리터핀 (triterpene)의 배당체로, 물에 녹아 비누처럼 발포작용을 나타내는 물질의 총칭이다. 인체 면역력을 증강시키는 성분이며 특히 인삼에 함유된 사포닌이 유명하다. 인삼에는 32종류에 이르는 다양한 사포닌이 다량 함유되어 있다. 특히 인삼을 가공한 홍삼에만 들어있는 사포닌은 장기 복용할 경우 성인병 치료에 상당한 효과를 볼 수 있는 것으로 알려져 있다. 인삼 사포닌은 모든 암세포를 억제할 수 있다. 백내장과 관련된 실험에서도 인삼 사포닌은 우수한 효과를 보여 주었다. 진세노사이드 (인삼의 배당체 사포닌)는 동일 분자 내에 탄수화물 (당체; glycone)과 비탄수화물 잔기 (무당체; aglycone)을 가지고 있는 화합물이다. 탄수화물 잔기가 비 탄수화물 잔기와 1번 탄소 위치에서 acetal linkage로 결합된다. 비당류 성분을 아글리콘 (aglycone)이라고 하며 당류 성분을 글리콘 (glycone)이라고 한다. 탄수화물 부위가 포도당일때는 글루코사이드 (glucoside)라고 한다. 따라서, 인삼의 배당체인 진세노사이드를 가수분해하면 당체와 비배당체인 사포제닌 (sapogenin)으로 분해된다.
이소플라본 배당체를 가수분해하는 미생물은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 아스퍼질러스 니거 (Aspergilus niger) 및 사카로폴리스포라 에리트라에아 (Sachcaroplyspora erythraea)등이 있으며, 이들은 모두 공통적으로 β-글루코시다아제를 생산하는 균들이다. 이외에도 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본을 효율적으로 전환할 수 있는 높은 역가의 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물을 개발하기 위한 연구가 계속되고 있다.
그러나 종래의 기술들은 복잡하고 많은 단계의 공정을 포함하고 있어, 생산율의 저하, 생산비의 증가, 정제과정에서의 오염 가능성 등의 문제가 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물을 이용하여 배당체를 비배당체로 전환시킨 후 미생물 내에 전환된 비배당체를 세포 내에 축적시키고, 이를 함유하는 미생물 또는 이의 파쇄물을 원료로 사용함으로써 기존의 문제점을 개선할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물을 이용하여 배당체로부터 전환된 비배당체를 고농도로 제조할 수 있는 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 비배당체를 세포 내에 축적한, 비배당체 함유 미생물 또는 이의 파쇄물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 β-글루코시다아제를 발현하는 미생물을 배당체 함유 배지에서 배양하거나, 배당체 함유 반응물과 반응시켜, 상기 미생물 내에 배당체로부터 전환된 비배당체를 축적시키는 단계를 포함하는, 비배당체가 세포 내에 축적된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 비배당체가 세포 내에 축적되어 있는 미생물 또는 이의 파쇄물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 미생물 또는 이의 파쇄물을 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 미생물 또는 이의 파쇄물을 함유하는 식품을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 미생물 또는 이의 파쇄물을 함유하는 피부 기능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 배당체를 비배당체로 전환하는 능력과 함께 전환된 비배당체를 세포 내에 축적하는 능력을 보유한 미생물을 통해, 비배당체를 고농도로 제조할 수 있는 미생물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 비배당체를 포함하는 미생물 생균 또는 이의 파쇄물 형태로 제작함으로써, 항산화용 조성물, 정장제, 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품 첨가제, 화장품 원료 및 기타 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 락토바실러스 플란타럼 K8를 이용하여 대두 비배당체로 전환시킨 결과를 나타낸 것이다. 락토바실러스 플란타럼 K8에 의한 배당체 이소플라본의 비배당체 이소플라본으로의 전환. 도 1의 원료는 대두 추출물을 함유하는 배양 배지; STD는 이소플라본 스텐다드; L. plantarum K8-LTA 추출물은 대두 추출물을 함유하는 배양 배지에 락토바실러스 플란타럼 K8을 배양한 후 microfluidizer를 이용하여 파쇄한 파쇄물을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 락토바실러스 플란타럼 K8, 락토바실러스 델브루키, 락토바실러스 람노서스 GG, 락토바실러스 사케를 이용하여 대두 비배당체로 전환시킨 결과를 나타낸 것이다. 락토바실러스 플란타럼 K8을 포함하는 유산균의 비배당체 생산 비교. 도 2의 STD는 이소플라본 스탠다드를; delbrueckii는 락토바실러스 델브루키를; GG는 락토바실러스 람노서스 GG를; K8은 락토바실러스 플란타럼 K8을; sakei는 락토바실러스 사케를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 락토바실러스 플란타럼 K8 파쇄물의 제작 과정 중 검출되는 대두 비배당체 측정량을 나타낸 것이다. 도 3의 gg는 락토바실러스 람노서스 GG를, del은 락토바실러스 델브루키를 k8은 락토바실러스 플란타럼 K8을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 락토바실러스 플란타럼 K8를 이용하여 인삼 사포닌으로부터 전환된 사포제닌을 나타내는 그래프이다. rg1, rg3(s), rh2, rb1, rc, rd, rb2, f2는 ginsenoside 화합물이다. 사포닌의 일종으로서 분자구조에 따라 위 이름으로 분류된다. 도 4의 washing은 유산균 배양 후 세척액을; Ginseng ext는 인삼 추출물을; k8은 락토바실러스 플랜타륨 K8을 의미한다.
도 5는 락토바실러스 플란타럼 K8에 의한 비배당체 사포닌 흡수 예상 기작을 나타낸 그림이다.
도 6은 저분자 인삼 사포닌 검출량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 섭취량은 쥐에게 먹인 인삼추출물 양을 나타내고, 흡수량은 쥐의 혈액 중에서 검출된 인삼 사포닌 양을 나타낸다.
도 7은 저분자 인삼 사포닌 흡수율을 나타낸 결과이다. 섭취량 중 흡수된 양을 비율로 환산한 결과이다.
종래 미생물을 이용한 배당체의 비배당체로의 전환 시도는 있었으나, 미생물이 전환된 비배당체를 세포 내에 함유하고 있다는 보고는 아직까지 없으며, 따라서 본 발명에 따른 미생물에 의한 비배당체로의 생물 전환 및 미생물의 세포내 축적에 관한 결과는 신규한 것이다. 본 출원의 발명자들은 미생물 세포 내 축적된 비배당체의 농도는 미생물 배양 배지 중 비배당체의 농도 보다 2배 이상 높아, 고농도의 비배당체를 생산할 수 있음을 확인하였다.
프로바이오틱스의 작용 기전으로는 장내 환경의 리모델링, 병원체의 억제, proinflammatory factor 억제, 상피세포분화에 대한 영향, 장내 장벽 효과의 강화 등이 알려져 있다. 대장암 억제에 대한 프로바이오틱스의 작용은 다양한 생화학적 경로가 있는데, 세포주기, 활성산소, 세포고사, 특정한 세균성 효소의 생산 그리고 숙주 대사를 통하여 대장암 발생을 억제한다. 또한 유산균은 면역계통을 활발하게 하는 면역활성화 작용을 통해서 질병으로부터 몸을 보호한다. 장 표면의 융모에서 유산균은 백혈구나 림프구와 같은 면역세포와 interaction을 하며 면역력의 활성을 촉진시킨다. 유산균은 human colon cancer cells에서 hBD2(human beta defensin)의 발현을 유도함으로써 장 내 면역을 조절한다. 또한 장 세포인 CaCO2에서의 lactobacillus의 노출에 의해 inflammatory cytokine 인 IL-8의 생성과 Hsp70의 발현의 억제가 이루어진다고 한다. 이를 통해 유산균이 cytokine을 조절함으로써 염증반응을 조절하는데 직접적으로 관여하고 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 장내세포에서 Lactobacillus는 자가 면역반응과 TLR(Toll-like receptor)의 발현을 조절한다. 이는 유산균에 의한 장 내 건강 조절 작용이 TLR signaling과 연관이 있다는 것을 의미하는 것이다.
락토바실러스 플란타럼 K8은 인삼사포닌을 배당체 형태로 흡수한 후 β-glucosidase를 이용하여 당과 비배당체로 분해 한다. 당은 유산균의 대사과정에서 사용되는 반면 비배당체의 경우 유산균의 신진대사에 불필요한 물질이므로 체내에 축척 시킨 후 시간이 지남에 따라 세포 밖으로 배출시킬 것으로 여겨진다. 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8을 동물을 이용한 실험에서 변형시키지 않은 인삼사포닌 (사포닌 추출물)을 섭취한 경우에 비해 1,300배 이상 높은 체내 흡수율을 보였다 (실시예 7). 이러한 높은 흡수율은 유산균이 캡슐 역할을 함으로써 위에서 사포닌의 파괴를 방지하고 안전하게 장내로 전달할 수 있는 것이 하나의 이유이다. 또한 비배당체 사포닌 함유 유산균은 장세포내에 존재하는 대식세포 (Tissue Resident Macrophage)에 의해 선택적으로 up take 된 후 lamina propria 또는 lymph node로 이동되어 비배당체 사포닌을 혈관으로 배출할 것으로 예상된다 (도 5).
이를 바탕으로, 일 관점에서 본 발명은 β-글루코시다아제를 발현하는 미생물을 배당체 함유 배지에서 배양하거나, 배당체 함유 반응물과 반응시켜, 상기 미생물 내에 배당체로부터 전환된 비배당체를 축적시키는 단계를 포함하는, 비배당체가 세포 내에 축적된 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 미생물은 비배당체 생산 활성을 나타낸다. 구체적으로 β-글루코시다아제 활성을 통해 배당체를 비배당체 형태로 전환하는 능력을 가지고 있다. 혐기적인 조건하에서 배당체 형태 (genistin, diadzin)을 비배당체 형태 (genistein, diadzein)의 이소플라본을 생산하는 능력이 있다. 이러한 미생물을 파쇄할 경우 세포 내에 축적되어 있는 비배당체를 검출할 수 있다 (도 1).
상기 미생물은 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 유산균, 락토코커스, 코리네박테리움, GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 비피더스, 효모, 바실러스, 아스페르길루스 및 클로스트리디움으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타럼 (L. plantarum), 락토바실러스 사케 (L. sakei), 락토바실러스 람노서스 GG (L. rhamnosus GG), 락토바실러스 델브루키 (L. delbrueckii), 락토바실러스 엑시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스 존스니 (L. johnsonii), 락토바실러스 카제이 (L. casei), 락토바실러스 가세리 (L. gasseri) 및 루코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroid)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 발명자들은 한국의 전통발효 식품인 김치로부터 β-글루코시다아제를 생산하는 락토바실러스 플란타럼 K8을 분리ㅇ동정하였다. 먼저, 김치와 김치국물을 멸균 생리식염수를 사용하여 10배씩 단계적으로 희석한 다음, 원액과 희석액을 락토바실러스 선택배지 (Lactobacillus selective agar, LBS agar, Difco)에 도말하였다. 37℃에서 2-3일간 배양하여 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔별로 구별하여 다시 순수 분리하였다. 분리된 콜로니에 대해 그람염색 및 현미경 관찰을 실시하여 그람양성이면서 막대형을 갖는 콜로니만을 선별하였으며, 이들을 pH 6.8의 Lactobacilli MRS 액체배지 (Difco)에서 37℃, 24 시간 배양하면서 배양액의 pH가 4.5 이하로 감소하는 콜로니를 재 선별하였다. 이후 pH 2.0의 MRS 배지에서 2시간 배양한 후 다시 0.3%의 oxgall이 첨가된 MRS 배지 내에서 9시간 배양한 경우에 생존이 가능한 내산성, 내담즙성 Lactobacillus 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 API CHL 50 kit를 이용한 생화학 테스트와 16S rRNA sequencing을 통하여 동정하였다. 동정결과 Lactobacillus plantarum 종에 속하는 균주임을 확인하였으며, 이를 "Lactobacillus plantarum K8"으로 명명하였다 (기탁번호: KCTC 10887BP).
또 다른 실시예에서, 상기 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물은 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 비피더스, 효모, Bacillus licheniformis, S. thermophilus, L. casei, Streptomyces sp. Bifidobacteria, Lactobacillus delbrueckii Rh2, Sporosarcina sp., Saccharomyces cerevisiae, Pyrococcus furiosus, Lactobacillus plantarum, Aspergillus ochraceus, Lactobacillus delbrueckii Rh2, Pseudomonas sp., Aspergillus niger, Pseudomonas fluorescens, Bifidobacterium adolescentis, Aspergillus sojae, Cunninghamella blakesleeana, Bifidobacteria and Lactobacillus, lactic acid bacteria, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Penicillium melinii, Eubacterium ramulus, Clostridium orbiscindens, Aspergillus awamori, Lactobacillus brevis, Aspergillus parasiticus Speare BGB, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
비배당체 이소플라본 또는 사포제닌 함유 유산균을 제작하기 위하여 Lactobacillus plantarum K8을 대두 추출물 또는 배당체 사포닌을 첨가한 배지에 배양하고, microfluidizer를 이용하여 파쇄한 다음, 파쇄된 유산균을 용매계통분획을 통하여 분획 하였다. 이소플라본 또는 사포제닌이 존재하는 EtOAc 분획에 대하여 2,000 ppm농도로 조제한 다음 LC-MS/MS를 사용하여 분석을 수행하였다. 파쇄 후 비배당체 이소플라본인 daidzein과 genistein의 함량과 아글리콘 사포제닌인 Rg3의 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
Lactobacillus plantarum K8을 sonicator 또는 microfluidizer를 이용하여 파쇄한 후 동결 건조시킴으로써 'Lactobacillus plantarum K8-LTA' 세포 파쇄물을 제조하였다. 구체적으로, 상기 단계 (a)는 미생물 활성화를 위해 정치 배양하는 단계, 진탕 배양하는 단계 및 피딩 배양하는 단계를 순서대로 포함할 수 있다. 이 때, 37℃ 12시간 동안 미생물을 정치 배양하고, 37℃에서 12시간 동안 6rpm의 조건에서 진탕 배양할 수 있다. 미생물을 배양하기 위하여 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지 (예컨대 MRS 배지)를 사용할 수 있다.
경우에 따라서, 단계 (a) 전 배당체 함유 식물체를 단백질 분해효소로 전처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 예를 들어, 프로모드 (promod), 알카라제 (alkalase), 뉴드라제 (neutrase) 및 파파인 (papain)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
구체적으로, 자세한 제조 공정은 아래 '제조공정표' 와 표 1에 기술하였다.
[제조공정표] 균체순환생물반응기 (Membrane Cell-recycling Reactor: MCR) 제조공정
1) 발효라인 살균 : 스팀을 이용하여 발효관으로 유입되는 라인을 살균한다.
2) 발효조, 피딩탱크 공살균 : Sparger, sampling 및 하부 steam을 이용하여 탱크내부로 steam을 주입 시켜서 121±1℃ 1.2~1.5 kgf/cm2의 조건에서 15~20분간 살균한다.
3) 원료칭량 및 배지살균 : 제품의 규격에 따라 배양 배지의 원료를 각 각 정확히 칭량한 후 이를 모두 발효조 및 피딩탱크내로 삽입하여 용량에 맞게 물량을 조절 후 2)의 조건대로 멸균한다.
4) 냉각 : 멸균 후 37℃까지 냉각시킨다.
5) 종균활성화: 동결된 유산균체를 37℃ 항온조에서 급속하게 해동시킨 후 멸균된 배양배지1.5L 에 접종하여 12시간동안 정치 배양한다.
6) 본배양 : 멸균된 본배양배지 30L에 1/100로 희석시킨 종균을 배양 한다.
6) 피딩배양 : 배양조건이 항상 유지되도록 수시로 점검을 실시한다. Optical Density (OD) 값이 설정 값에 다다르면 멤브레인을 순환시켜 사용배지를 제거해주고, 배출된 양만큼의 새 배지를 피딩 탱크에 투입한다. 약 200L의 배지를 연속적으로 제거 및 투입하여 균체를 배양한다.
8) 농도조절 : drain 라인을 스팀으로 30분간 살균한 다음 drain 라인으로 액을 흘려 원심분리하고 적정량의 역삼투압증류수로 희석하여 농도 조절한다.
9) 생균회수 및 제품 포장 또는 균체 파쇄 : 농도 조절된 균체를 균체파쇄기에서 파쇄한다.
10) 사균화 : 파쇄균체를 80℃에서 30분간 유지시켜 배양액을 사균화 시키고 다시 냉각시킨다. 목적에 따라 사균화는 제외시킬 수 있다.
11) 균체회수 및 포장 : 냉각된 액을 탱크 드레인라인을 이용하여 폴리에틸렌 (PE)병에 담아 포장한다.
[표 1] 제조공정
Figure 112015094864135-pat00001
또 다른 실시예에서, 배지에 미생물 접종 후 배양한 다음, 배당체가 함유된 최소배지로 옮겨 1-36시간, 예를 들어 4~24 시간 동안 추가 배양할 수 있다. 본 발명의 실시예 6에 따르면, 미생물을 배당체가 함유된 최소배지를 이용하여 배양하는 경우, 동일양의 세포를 배당체 사포닌이 포함된 MRS 배지에서 배양한 대조군에 비해 비배당체의 세포 내 축척이 증가할 수 있음을 확인하였다.
하나의 실시예에서, 상기 배당체는 인삼, 산삼, 콩, 더덕, 메밀, 도라지, 미나리, 녹두, 마늘, 양파, 은행, 칡으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합물 유래일 수 있다.
상기 배당체는 이소플라본 배당체, 사포닌 배당체, 페놀배당체 (페놀), 청산배당체 (니트릴배당체), 안트라키논배당체, 강심배당체, 쓴맛배당체 (고미질), 쿠마린배당체 (쿠마린), 유황배당체 (리오글리코시드, 유황) 또는 플라보노이드배당체 (블라보노이드) 일 수 있으며, 예를 들어 본 발명에 따른 방법은 다이드진 (daidzin), 제니스틴 (genistin), 글리시틴 (glycitin), 사포닌 (saponin), procyanidin, naringenin, quercetin, rutinose, hesparidin, baicalin, wogonoside, Mogroside V, amygdalin 및 3-Phenyl coumarin으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 배당체를 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 사포제닌 (sapogenin), 3,4-Hydroxyphenylactic acid, 4-HPA, m-coumaric acid, p-coumaric acid, O-beta-D-glucuroniodes, stilbenoids, rutin, quercetin, hesparetin, baicalein, wogonin, Mogroside IIIE, mendelonitrile, benzaldehyde, 및 coumarin-derivated compounds 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비배당체로 전환하는 것일 수 있다.
이러한 제조방법에 의해 생산된 비배당체는 세포 내에 축적될 수 있다. 이를 바탕으로 본 발명은 다른 관점에서, 상기 제조방법에 의해 생산된 비배당체를 세포 내 축적한 미생물 또는 이의 파쇄물에 관한 것이다. 상기 세포 내 축적된 비배당체의 농도는 미생물 배양 배지 중 비배당체의 농도 보다 2배 이상 높음을 확인하였다.
상기 파쇄물은 물리적인 방법을 사용하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 미생물을 비드 밀(bead mills), 프레스 (Presses), 소니케이터(Sonicator) 또는 마이크로플루다이저 (Microfluidizer)를 사용하여 4-9회 파쇄시킨 후 동결건조하여 분말화 시킬 수 있다. 필요에 따라 파쇄균체를 80℃에서 30분간 유지시켜 배양액을 사균화 시키고 다시 냉각시킬 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 미생물 또는 이의 파쇄물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
상기 미생물 또는 이의 파쇄물은 항산화용 조성물, 정장용 조성물, 화장품 원료 조성물, 생균용 조성물로 사용될 수 있다. 특히, 사료용 조성물, 식품첨가용 조성물 및 기타 발효제품으로도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 미생물 또는 이의 파쇄물의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심 분리하여 균주를 제거한 여액 (원심분리한 상층액), 상기 배양액을 초음파 처리 또는 효소 (lysozyme) 처리하여 얻은 세포 파쇄액 등을 포함한다. 본 발명의 조성물 내 미생물 또는 이의 파쇄물에 대한 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 미생물 또는 이의 파쇄물 또는 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키 (troche), 캡슐 (capsule), 엘릭실 (elixir), 시럽 (syrup), 산제 (powder), 현탁제 (suspension) 또는 과립제 (granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으며, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는 1일 10 mg의 유효용량으로 투여할 수 있고, 생균제용 조성물의 경우 조성물 내 생균수는 108~1010 CFU/일 인 것이 바람직하다.
상기 항산화용 조성물은 활성 산소를 제거하기 위하여 이용될 수 있으며, 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 이소플라본의 체내 흡수를 촉진하여 소화불량 또는 설사를 예방 또는 개선할 수 있다.
또한, 상기 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일리지 (silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효 사료는 본 발명의 미생물 또는 이의 파쇄물과 여러 가지 다른 공지의 미생물 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유산균을 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일리지는 청예사료를 본 발명에 따른 유산균으로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.
또한, 미생물 또는 이의 파쇄물 또는 이의 배양물은 이유식, 김치, 음료, 유제품 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 미생물 또는 이의 파쇄물을 함유하는 식품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물 또는 이의 파쇄물 또는 이의 배양물은 화장품 조성물로 사용될 수 있는데, 구체적으로는 기초 화장용, 화장용 화장품용, 모발용 화장품용, 미백용 화장품용, 주름개선용 화장품용, 노화억제 화장품용 등과 같은 다양한 용도에 이용될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 미생물 또는 이의 파쇄물을 함유하는 피부 기능 개선용 조성물을 제공한다. 상기 피부 기능 개선은 피부보습, 피부색, 피부탄력, 주름 또는 진피치밀도를 개선시키는 것을 의미할 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 미생물 또는 이의 파쇄물은 발효제품의 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있다. 상기 발효제품은 햄 및 소시지와 같은 발효육제품, 발효생식제품, 발효유제품, 발효대두액, 김치 등을 포함한다. 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 발효 생식제품은 현미와 율무 등의 곡류 분말, 과채류 분말, 버섯류 분말에 미생물 또는 이의 파쇄물 원말을 혼합하여 제조되거나, 상기 곡류 분말을 미생물 또는 이의 파쇄물 또는 이를 포함하는 2~5종의 혼합 유산균으로 적정 온도에서 발효시킨 후, 과채류, 버섯류 분말을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 제조될 수 있다. 또한 상기 발효유제품은 원유 또는 탈지분유를 본 발명에 따른 유산균 또는 이를 포함하는 2~5종의 혼합 유산균으로 적정 온도에서 발효시켜 제조될 수 있으며 상기 발효대두액은 대두액을 본 발명에 따른 유산균 또는 이를 포함하는 2~5종의 혼합 유산균으로 적정 온도에서 발효시켜 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 락토바실러스 플란타럼 K8의 생화학적 특성 검사
한국의 전통 발효식품인 김치로부터 분리·동정한 락토바실러스 플란타럼 K8의 항산화 활성을 평가하기 위하여 API test (Biomerieux, France)를 수행하였다. 상기 유산균의 생화학적인 특성과 당 이용성은 하기 표 2와 표 3에 기재된 바와 같다.
[표 2] 락토바실러스 플란타럼 K8 특성
Figure 112015094864135-pat00002
[표 3] 락토바실러스 플란타럼 K8의 당 이용성
Figure 112015094864135-pat00003
* Abbreviation: MDX, Methyl-βD-xylopyranoside; MDM, Methyl-αD-mannopyranoside; MDG, Methyl-αD-glucopyranoside; NAG, N-acetylglucosamine; ESC, Esculin ferric citrate; GNT, Potassium gluconate; 2KG, Potassium 2-ketogluconate; 5KG, Potassium 5-ketogluconate.
* 24 시간 측정에서 음성을 나타냈으나 48 시간 측정에서 색깔이 약간 변한 경우 '?'로 표시함.
실시예 2: 락토바실러스 플란타럼 K8의 비배당체 생산
락토바실러스 플란타럼 k8을 대두 extracts를 첨가한 배지에 배양하고, microfluidizer를 이용하여 파쇄 한 다음, 파쇄된 유산균을 용매계통분획을 통하여 분획 하였다. 이소플라본이 존재하는 EtOAc 분획에 대하여 2000 ppm농도로 조제 한 다음 LC-MS/MS를 사용하여 분석을 수행하였다. 그 결과 대두 원료의 경우 배당체 이소플라본인 daidzin과 genistin의 함량이 높은 반면, 락토바실러스 플란타럼 K8과의 배양 후 비배당체 이소플라본인 daidzein과 genistein의 함량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 반면 배당체 이소플라본의 함량은 락토바실러스 플란타럼 K8과의 배양 후 감소하였다 (도 1). 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 K8을 접종하기 전에, 1 ㎖/L 알카라제, 1 ㎖/L 뉴트라제 및 0.2 g/L 파파인을 가하여 60℃에서 8시간 교반하는 전처리 과정을 포함할 경우 비배당체로의 전환 후 세포내 축척율이 약 10% 증가하였다 (표 4).
[표 4] 효소 전처리에 의한 비배당체 전환 후 세포내 축척율
Figure 112015094864135-pat00004
*1 ㎖/L 알카라제, 1 ㎖/L 뉴트라제 및 0.2 g/L 파파인
실시예 3: 비배당체 생산 활성 평가
유산균의 비배당체 이소플라본 전환능력 및 세포 내 비배당체 이소플라본 축적능력을 알아보기 위하여 락토바실러스 델브루키 (L. delbrueckii), 락토바실러스 람노서스 GG (L. rhamnosus GG), 락토바실러스 플란타럼 K8 (L. plantarum K8), 락토바실러스 사케 (L. sakei)를 대두 extracts가 함유된 배양배지에 접종하고 37℃에서 12시간 배양한 후 microfluidizer를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포는 LC/MS-MS를 통하여 이소플라본의 함량을 측정하였고 도 2에 나타내었다. 그 결과 4종류의 유산균 모두에서 비배당체 daidzein과 genistein이 검출되었다 (도 2). 이러한 결과는 β-글루코시다제를 분비하는 모든 종류의 유산균 또는 미생물에 의하여 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 생물전환 시킬 수 있다는 것을 의미하며 또한 전환된 비배당체 이소플라본을 세포 내에 축적 시킬 수 있다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 4: 유산균의 공정별 비배당체 이소플라본 생산 활성
유산균 파쇄물 제작 과정중의 이소플라본 함량을 측정하는 실험을 수행하였다. 대두 추출물이 함유된 배지에 락토바실러스 람노서스 GG, 락토바실러스 델브루키, 락토바실러스 플란타럼 K8을 37℃에서 12시간 동안 배양한 후 멸균수를 이용하여 3회 세척하였다. 세척한 세척액과 유산균 파쇄물을 각각 LC/MS-MS를 이용하여 이소플라본 함량을 측정하였다. 그 결과 3회의 세척액 및 유산균 파쇄물에서 배당체 이소플라본은 검출되지 않았다. 반면 비배당체 이소플라본의 경우 세척액에서 소량 검출되었고 유산균 파쇄물에서 고농도로 검출되었다 (도 3). 또 다른 실험에서 락토바실러스 플란타럼 K8 배양배지 (Media), 배양 후 배지 (Culture sup.), 세척액 (Wash 1, 2, 3), 유산균 파쇄물 (Lysates), 유산균 파쇄물 상등액 (Lysates sup.), 유산균 파쇄물 침전액 (Lysates ppt.)에서의 배당체 및 비배당체 이소플라본의 함량을 측정하였다. 그 결과 유산균 파쇄물 (Lysates), 유산균 파쇄물 상등액 (Lysates sup.), 유산균 파쇄물 침전액 (Lysates ppt.)에서 이소플라본, 특히 비배당체 이소플라본의 함량이 크게 증가하는 것을 확인하였다 (표 5). 이러한 결과는 비배당체 이소플라본이 유산균에 묻었거나 잔류 배양액에서 기인하였다고 할 수 없으며, 따라서 유산균 내에 축적되었음을 의미하는 것이다.
[표 5] 제조공정별 비배당체 이소플라본 함유량 비교
Figure 112015094864135-pat00005
*N.D. : not determined
실시예 5: 유산균에 의한 사포닌의 사포제닌으로의 전환
인삼 사포닌의 비배당체 사포제닌으로의 전환 및 세포 내 축적을 알아보기 위하여 락토바실러스 플랜타럼 K8을 인산 추출물이 첨가된 배양액에서 배양한 후 microfluidizer를 사용하여 유산균을 파쇄 하였다. 파쇄 후 LC/MS-MS를 통하여 ginsenoside 화합물을 분석하였다. 그 결과 이소플라본에서의 결과와 같은 맥락으로 락토바실러스 플란타럼 K8이 ginsenoside를 uptake한 것을 확인하였다 (washing과 파쇄물의 area값 비교). 즉, 세척액 및 인삼 추출물에서는 나타나지 않던 피크가 유산균 파쇄물에서 나타났는데, 이는 유산균의 효소에 의해 transfomation된 것임을 알 수 있다 (점선으로된 박스로 표시). 인삼 ginsenoside 전환의 핵심은 양은 많고 활성은 좋지 않은 ginsenoside 즉, rg1과 rb1등에서 양은 적지만 활성은 뛰어난 rg3, rc, f2등의 ginsenoside로의 전환이다. 본 실험결과에서도 락토바실러스 플란타럼 K8에 의하여 고급사포닌의 일종인 rg3로 전환된 것을 확인할 수 있다.
실시예 6: 최소배지를 이용한 비배당체의 세포 내 축척 증대
락토바실러스 플란타럼 K8을 MRS 배지 5mL에 접종한 후 37 ℃에서 24 시간 동안 정치 배양한 후 MRS 배지 50mL로 옮겨 12 시간 동안 추가 배양하였다. 배양된 세포를 1L MRS 배지로 옮긴 후 15 시간 동안 배양 한 후 PBS로 3회 세척을 하였다. 세척한 세포는 배당체 사포닌이 포함된 M9 Minimal medium (최소배지) 1L, 배당체 사포닌과 lysozyme (0.5g/L)이 포함된 MRS배지에 동 수를 접종한 후 6시간 동안 정치 배양을 하였다. 또 다른 실험에서는 배당체 사포닌이 포함된 MRS 배제에 세포를 옮긴 후 42℃에서 6시간을 배양하였다. 대조군으로는 동일양의 세포를 배당체 사포닌이 포함된 MRS 배지에서 6 시간동안 배양하였다. 배양된 세포는 세척 후 microfluidizer를 사용하여 세포를 파쇄 하고 LC/MS-MS를 통하여 ginsenoside 화합물을 분석하였다. M9 최소배지를 사용한 세포의 경우 대조군에 비해 3.84배 이상 비배당체 사포제닌 화합물이 증가하는 것으로 나타났다 (표 6).
[표 6] 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 K8의 배양 조건별 비배당체 사포제닌 검출량 비교
Figure 112015094864135-pat00006

실시예 7: 쥐의 혈액으로부터 인삼 진세노사이드 검출
3일간 인삼 추출물과 기능성 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8을 섭취한 쥐로부터 분리한 혈액에서 인삼 사포닌의 함량을 측정하였다. 인삼 추출물의 경우 총 섭취량 1,085,630 ng 중 약 150 ng의 인삼 사포닌이 흡수된 것으로 나타났다. 반면 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8에 의해 섭취된 인삼추출물의 양은 11,653 ng이고 이중 혈액에서 검출된 인삼 사포닌의 총 함량은 약 2160 ng 이다 (도 6). 이를 비율로 환산하면 인삼 추출물의 경우 0.014%의 흡수율을 보인 반면 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8에 의한 인삼 사포닌의 흡수율은 약 20%에 달한다 (도 7).
특히 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8을 섭취한 쥐에서는 F2와 Rg3 인삼 사포닌이 다량 흡수되는 것으로 나타났는데, F2와 Rg3는 인삼 사포닌 중에도 가장 큰 기능성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
인삼 추출물은 많이 섭취해도 흡수율이 낮기 때문에 섭취 양적인 면에서 큰 의미가 없다. 반면 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8의 경우 추출물을 직접 섭취하는 것에 비해 약 1300배 이상 높은 흡수율을 보인다. 즉, 같은 100g의 인삼 추출물을 섭취할 경우에 직접 섭취하는 경우 섭취한 양의 99% 이상이 흡수되지 않고 버려지는 반면 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8은 20g을 흡수할 수 있다. 이러한 결과는 비배당체 함유 락토바실러스 플란타럼 K8 내에 존재하는 저분자 인삼 사포닌이 쥐의 소화과정을 거치는 동안 유산균에 의해 자연적으로 보호되었다는 것을 의미한다.
실시예 8: Yeast를 이용한 비배당체 사포닌의 세포내 축척
saccharomyces cerevisiae를 5ml YPD 배지에 접종하고 37 ℃에서 24 시간 동안 진탕배양한 후 인삼 추출물 (1g/L)이 첨가된 500ml의 YPD 배지로 옮긴 후 12시간 동안 추가 배양하였다. 원심분리 후 상등액은 따로 냉장 보관, pellet은 멸균 증류수를 이용하여 3회 세척하였다. 세척한 효모는 microfluidizer를 이용하여 3회 파쇄하여 LC/MS-MS를 통하여 비배당체 ginsenoside 화합물을 분석하였다. 본 실험에서 분석을 위하여 준비한 시료는 배양 후 상등액 (1), 세척 1회 (2), 세척 2회 (3), 세척 3회 (4), 파쇄 전 (5), 파쇄 후 (6)으로 총 6개 군의 sample을 준비하였다. 그 결과를 아래 표 7에 나타내었다.
[표 7] 본 발명에 따른 비배당체 함유 효모의 제작
Figure 112015094864135-pat00007

실시예 9: 락토바실러스 플란타럼 K8 파쇄물을 함유하는 사탕에 대한 임상시험 결과
락토바실러스 플란타럼 K8 파쇄물 (Lactobacillus plantarum K8-LTA)에 대한 인체 피부 보습 및 피부색 개선 효능을 평가하기 위하여 임상시험을 수행하였다. 본 연구는 의뢰인의 요청내용과 인체적용시험가이드라인(식품의약품안전청, 2011.12 제정), 건강기능식품의 인체적용시험(식품의약품안전청, 2008.12) 및 인체시험관리기준 (Good Clinical Practice, GCP)에 근거하여 수행되었으며, 경희대학교 임상연구 심의위원회의 승인 (연구번호 KHUSBC 2012-011)을 득하였다.
건성피부이면서 피부색이 칙칙해지기 시작해지거나 이미 진행된 25세~60세의 여성 피험자 41명 시험대상자로 선정하였으며 공복에 제품 (표 27)을 아침 2정, 저녁 2정을 섭취하였다. 선정된 피험자들에게 시험제품 (2.1% Lactobacillus plantarum K8-LTA 함유 사탕)과 대조제품 (2.1% Lactobacillus plantarum K8-LTA가 함유되지 않은 사탕)을 이중맹검 무작위로 할당하여 8주간 복용하도록 한 후 시험제품 사용 전, 사용 4주 후, 8주 후 각 시점에 피부색 육안평가, 피부 수분, 각질량, TEWL, 피부색(L* value) 및 설문 평가, 안전성 평가, 식이조사, 체중(BMI포함)조사 실시하여 피부 개선 효과를 평가 하였다. 또한 제품복용 전과 제품복용 8주 후 시점에 혈액 분석을 실시하였다. Lactobacillus plantarum K8-LTA를 함유한 사탕을 LC/MS-MS로 분석하여 비배당체 이소플라본이 포함되어 있는 것을 확인 하였다 (표 28).
1. 육안평가 결과
제품복용 전과 비교시, 제품복용 4주 후, 8주 후 시점에 대조군, 시험군 모두에서 통계적으로 피부색(밝기)이 유의하게 개선(감소)하였다. 군간 비교시, 제품 복용4주 후, 8주 후에서 그룹간의 통계적 유의한 차이는 없었다(p<0.05).
2. 기기평가
2-1. 피부 수분량
제품복용 전과 비교시, 제품복용 4주 후 시점에는 얼굴, 전박부위 모두 시험군에서, 8주 후 시점에는 얼굴부위에서는 시험군과 대조군 모두, 전박부위에서는 시험군에서 통계적으로 유의하게 피부 수분량이 증가하였다. 군간비교 시, 얼굴부위에서는 제품복용 4주 후, 8주 후 시점에서, 전박부위에서는 제품 복용 4주 후 시점에서 대조군에 비해 시험군에서 통계적으로 유의하게 피부 수분량이 증가하였다(p<0.05) (표 8).
[표 8] 군간 수분함량 변화 측정
Figure 112015094864135-pat00008
†p-value : Independent t-test (*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001)
†p-value^: Mann-Whitney test
2-2. 경피수분손실량(TEWL)
제품복용 전과 비교 시, 제품복용 8주 후 시점에서 얼굴, 전박 부위 모두 시험 군에서 통계적으로 유의하게 TEWL이 감소하였다. 군간 비교시, 제품복용 8주 후 시점에 전박부위에서 대조군에 비해 시험군에서 통계적으로 유의하게 TEWL이 감소하였다(p<0.05) (표 9).
[표 9] 군간 수분손실량 비교 (TEWL value)
Figure 112015094864135-pat00009
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001)
†p-value ^: Wilcoxon singled rank test.
°Intensification factor(IF): (WX-W0)/W0X100,calculated by mean value
2-3. 피부 각질량
제품복용 전과 비교시, 제품복용 4주 후, 8주 후에 얼굴부위에서는 시험군, 전박 부위에서는 대조군과 시험군 모두 피부 각질량이 통계적으로 유의하게 감소하였다. 군간 비교시, 얼굴, 전박부위 모두 제품복용 4주 후, 8주 후 시점 에서 대조군에 비해 시험군에서 통계적으로 유의하게 피부 각질량이 감소하였다 (p<0.05) (표 10).
[표 10] 군간 피부각질량 변화 비교
Figure 112015094864135-pat00010
†p-value : Independent t-test (*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001)
†p-value^: Mann-Whitney test
2-4. 피부색 밝기(L*value)
제품복용 전과 비교시, 뺨부위에서는 제품복용 4주 후에 시험군에서, 제품복용 8주 후 시점에서는 대조군, 시험군 모두에서 유의하게 피부색 밝기 정도가 증가하였고, 색소침착부위에서는 제품복용 4주 후, 8주 후에서 대조군과 시험군 모두에서 유의하게 피부색 밝기(L*value) 정도가 증가하였다(p<0.05). 군간 비교시, 뺨부위에서는 제품복용 4주 후, 8주 후 시점에서 색소침착부위 에서는 제품복용 8주 후 시점에서 대조군에 비해 시험군에서 유의하게 피부 색 밝기(L*value) 정도가 증가하였다(p<0.05) (표 11).
[표 11] 시점별 피부색 밝기(L*value) 변화량의 군간비교 (n=41)
Figure 112015094864135-pat00011
†p-value : Independent t-test (*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 2개의 그룹간에 유의한 차이가 있음)
†p-value^: Mann-Whitney test
2-5. 혈액분석
분석결과, 제품복용 전과 비교시 제품복용 8주 후 T. Protein, Albumin, Creatinine항목은 대조군에서 T. Protein, Creatinine, Pulse항목은 시험군에서 유의한 차이를 보였으나 파라미터들의 평균값은 모두 정상범위 내에 있었다 (p <0.05). 군간 비교시, 제품복용 8주 후 모든 파라미터에서 두 군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다 (표 12).
[표 12] 제품복용에 따른 혈액분석 군간 비교 (n=41)
Figure 112015094864135-pat00012
†p-value : Independent t-test (*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 2개의 그룹간에 유의한 차이가 있음)
†p-value^: Mann-Whitney test
2-6. 식이조사 및 체중
분석결과, 제품복용 전과 비교시 제품복용8주 후 시점 시험군에서 체중이 유의하게 증가한 것을 제외한 식이조사, 체중, BMI지수 모두 제품복용 4주 후, 8주 후 시점에서 유의한 차이가 없었다(p<0.05). 군간 비교시, 대조군과 시험 군 모두 제품복용 4주 후, 8주 후 시점에서 식이조사, 체중, BMI지수의 유의한 차이는 없었다(p<0.05) (표 13).
[표 13] 시점별 군간 식이조사 및 체중조사 변화량 (n=41)
Figure 112015094864135-pat00013
†p-value : Independent t-test (*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 2개의 그룹간에 유의한 차이가 있음)
†p-value^: Mann-Whitney test
3. 설문 평가 결과
3-1. 효능에 관한 설문 분석결과
'피부가 촉촉해짐', '부드러워짐', '당김이 줄어듬', '각질이 줄어듬', '피부가 건강해짐' 항목은 제품복용 4주 후 시점과 8주 후 시점에서 각각 피험자의 60%, 70% 이상이 대조제품, 시험제품 모두 에서 긍정적으로 개선되었다고 응답하였다. 특히, '당김이 줄어듬', '피부결이 정돈됨' 항목은 제품복용 4주 후 시점에서 대조제품에 비해 시험제품에서 10%이상 높게 나타났다 (표 14).
[표 14] 시점별 효능에 관한 설문평가 결과 (n=41)
Figure 112015094864135-pat00014

설문척도†: 0,변화없음/ 1,미미한 변화는 느껴지나 모르겠음/ 2,약간 개선됨을 느낌/ 3,개선됨을 느낌/
4,매우 개선되었음.
-긍정적으로 답변한 피험자(%): 2~4
설문척도: 1.아주 그렇지 않다/2.그렇지 않다/3.그렇지 않은 것 같다/4.그런 것 같다/5.그렇다/6.아주 그렇다.
-긍정적으로 답변한 피험자(%): 4~6
3-2. 제품 사용성에 관한 설문 분석결과
'씹는 느낌'을 제외한 모든 항목에서 피험자들의 70%이상이 대조제품, 시험제품 모두에 긍정적으로 응답하였다. 특히 '제품의 맛', '전체적인 제품 만족도' 항목은 시험군에서 피험자의 100% 가 만족한다고 응답하였다 (표 15).
[표 15] 제품사용 후 사용성에 관한 설문 (n=41)
Figure 112015094864135-pat00015
설문척도: 1.전혀 좋지 않다/2.좋지 않은 편이다/3.보통이다/4.좋은 편이다/5.매우 좋다 긍정적으로 답변한 피험자(%): 4~5
4. 안전성 평가 결과
본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부, 전신적 증상에 아무런 이상반응이 관찰되지 않았다.
이상의 결과로 본 시험제품은 피부수분, 피부각질량, 경피수분손실량(TEWL), 피부색 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다.
실시예 9: 락토바실러스 플란타럼 K8 파쇄물 ( Lactobacillus plantarum K8-LTA)을 함유하는 화장품의 제조 및 인체 적용 실험
임상시험 결과
Lactobacillus plantarum K8-LTA를 포함하는 화장품 3종을 제조하여 인체 피부보습, 피부색, 피부탄력, 눈가주름 및 진피치밀도 개선 효능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
주름 및 색소 침착이 이미 생성된 35~50세의 여성 피험자 32명을 대상으로 시험을 진행하였다. 시험제품 (표 16)을 시험기간 8주 동안 연속 사용하도록 하면서 제품사용 전, 4주 후, 8주 후 시점에서 육안평가(눈가주름, 피부색)와 기기측정(피부의 보습, 피부색, 피부탄력, 눈가주름 및 진피치밀도)을 실시하였다. 좌측/우측 측정부위는 Block randomization로 정하였으며(A: 좌측 뺨의 보습, 진피치밀도, 우측 뺨의 피부색측정, 탄력, 눈가주름 측정 / B: 우측 뺨의 보습, 진피치밀도, 좌측 뺨의 피부색측정, 탄력, 눈가주름 측정), 안전성 및 설문평가는 제품 사용 4주 후, 8주 후 시점에 시행하였다.
[표 16] 화장품 정보
Figure 112015094864135-pat00016

피험자들은 세안 후 공기의 이동과 직사광선이 없으며 항온ㅇ항습조건(22±2℃, 50±5%)이 유지되는 공간에서 최소 20분 이상 안정을 취한 후 기기 측정에 참여하도록 하였다.
1. 육안 평가
1-1. 시점별 눈가주름 육안 평가 분석
시험제품 사용 전과 비교 시, 제품사용 4주 후, 8주 후 시점에서 유의하게 주름이 개선됨을 보였으며(P<0.05), 주름 개선 최대 증감율은 5.50%의 감소(개선)율을 보였다 (표 17).
[표 17] 제품 사용 전과 사용 후의 시점별 눈가 주름의 변화 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00017
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 제품 사용 전과 비교하여 유의한 차이가 있음)
1증감율: (Wx-W0)/W0X100, calculated by mean value
1-2. 시점별 피부색 육안 평가 분석
시험제품 사용 전과 비교 시, 제품사용 4주 후, 8주 후 시점에서 유의하게 피부색이 개선됨을 보였으며(P<0.05), 피부색 개선 최대 증감율은 9.04%의 감소(개선)율을 보였다 (표 18).
[표 18] 제품 사용 전과 사용 후의 시점별 피부색의 변화 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00018
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 제품 사용 전과 비교하여 유의한 차이가 있음)
1증감율: (Wx-W0)/W0X100, calculated by mean value
2. 기기 측정
2-1. 수분량 측정
시험제품 사용 전과 비교 시, 제품사용 4주 후, 8주 후 시점에서 수분량이 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였으며(P<0.05), 수분량 개선 최대 증감율은 42.97%의 증가(개선)율을 보였다 (표 19).
[표 19] 제품 사용 전과 사용 후의 시점별 수분량 분석 결과 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00019
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 제품 사용 전과 비교하여 유의한 차이가 있음)
1증감율: (Wx-W0)/W0X100, calculated by mean value
2-2. 피부색 밝기(L*value) 측정
시험제품 사용 전과 비교 시, 뺨 부위의 피부색 밝기 정도는 제품사용 4주 후, 8주 후 시점에서 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였고, 색소 침착 부위의 밝기 정도는 제품사용 8주 후 시점에서 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였다(P<0.05). 피부색 밝기 개선 최대 증감율은 뺨 부위가 1.59%, 색소 침착 부위가 1.25%의 증가(개선)율을 보였다 (표 20).
[표 20] 제품 사용 전과 사용 후의 시점별 피부색 밝기 분석 결과 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00020
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 제품 사용 전과 비교하여 유의한 차이가 있음)
1증감율: (Wx-W0)/W0X100, calculated by mean value
2-3. 피부 탄력 측정(Moire topography system)
제품사용 전과 비교 시, 제품 사용 후 4주 후, 8주 후 시점에서 등고선의 전체 거리(Distance)와 평균 각도(Angle)가 통계적으로 유의하게 감소(개선)하였다
(p<0.05). 등고선 전체 길이의 최대 감소율은9.64%였고, 각도의 최대 감소율은 14.70% 였다 (표 21).
[표 21] 제품 사용 전과 사용 후의 시점별 피부 탄력 분석 결과 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00021
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 제품 사용 전과 비교하여 유의한 차이가 있음)
1증감율: (Wx-W0)/W0X100, calculated by mean value
2-4. 눈가 주름 측정
제품사용 전과 비교 시, 제품 사용 후 4주 시점에서 주름의 평균 깊이(Mean depth)와 최대 깊이(Max wrinkle depth)가 통계적으로 유의하게 감소(개선)하였고, 사용 후8주 시점에서 주름의 최대 깊이(Max wrinkle depth)가 통계적으로 유의하게 감소(개선)하였다(p<0.05).
'주름의 평균 깊이'의 최대 감소율은8.36% 였고, '주름의 최대 깊이'의 최대 감소율은 26.17% 였다 (표 22).
[표 22] 제품 사용 전과 사용 후의 시점별 눈가 주름 분석 결과 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00022
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 제품 사용 전과 비교하여 유의한 차이가 있음)
1증감율: (Wx-W0)/W0X100, calculated by mean value
2-5. 피부 진피치밀도 측정
제품사용 전과 비교 시, 진피의 두께(distance)는 제품사용 8주 후 시점에서 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였고, 진피의 밀도(intensity)는 제품사용 4주 후, 8주 후 시점에서 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였다(p<0.05).
진피 두께의 최대 증가율은10.16% 였고, 진피 밀도의 최대 증가율은 13.55% 였다 (표 23).
[표 23] 제품 사용 전과 사용 후의 시점별 피부 진피치밀도 분석 결과 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00023
†p-value: Paired t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 제품 사용 전과 비교하여 유의한 차이가 있음)
1증감율: (Wx-W0)/W0X100, calculated by mean value
3. 설문 평가
3-1. 효능에 관한 설문 평가
제품 사용 4 주 후, 8주 후 시점에 피험자들이 설문을 통해 답변한 제품의 효능에 대한 평가 결과는 아래와 같다 (표 24).
[표 24] 효능에 관한 설문평가 결과 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00024
설문척도†: 0,변화없음/ 1,미미한 변화는 느껴지나 모르겠음/ 2,약간 개선됨을 느낌/ 3,개선됨을 느낌/4,매우 개선되었음, 긍정적으로 답변한 피험자(%): 3~4
설문척도: 1.아주 그렇지 않다/2.그렇지 않다/3.그렇지 않은 것 같다/4.그런 것 같다/5.그렇다/6.아주 그렇다. 긍정적으로 답변한 피험자(%): 4~6
3-2. 제품 사용성 설문 평가
제품 사용 8주 후 시점에 피험자들이 설문을 통해 답변한 제품의 최종 사용성에 대한 평가 결과는 아래와 같다 (표 25).
[표 25] 제품 사용성에 관한 설문 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00025
설문척도: 1.전혀 좋지 않다/2.좋지 않은 편이다/3.보통이다/4.좋은 편이다/5.매우 좋다. 긍정적으로 답변한 피험자(%): 4~5
4. 안전성 평가
제품 사용 후 4주, 8주 시점에 시험자가 피험자의 피부상태를 관찰 및 질의응답을 통해 주관적, 객관적 자극에 대한 평가를 실시하였다.
본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 아무런 피부 이상반응이 관찰되지 않았다. (표 26)
[표 26] 안전성 평가: 피부 이상반응 (n=32)
Figure 112015094864135-pat00026

본 시험제품(화장품3종)은 피부보습, 피부색, 피부탄력, 피부색, 눈가주름 및 진피치밀도 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다.
[제조예]
제조예 1: 락토바실러스 플란타럼 K8 파쇄물 ( Lactobacillus plantarum K8-LTA)을 함유하는 사탕의 제조
식물성 유산균 락토바실러스 플란타럼 K8 파쇄물을 함유하는 사탕을 제조하였다. 사탕제작에 사용된 원료는 정제 포도당, 락토바실러스 플란타럼 K8 파쇄물 2.1%, 자일리톨 2%, 비타민C, 블루베리엑기스분말, 무수구연산, DL-사과산, 합성착향료(블루베리향, 라즈베리향,), 효소처리스테비아, 스테아린산마그네슘을 포함하며 표 7에 표시하였다. 다음으로 제조된 사탕에서 비배당체 이소플라본의 함유여부를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 서로 다른 롯트번호를 갖고 있는 실험군용 사탕과 대조군용 사탕 (표 27에 성분 표시) 3개씩을 선택하여 막자사발을 이용하여 간 후 멸균 증류수에 현탁(suspension) 시켰다. 현탁시킨 사탕 샘플을 sonicator 를 사용하여 파쇄시킨 후 에탄올을 이용하여 추출하였다. 에탄올 층을 메탄올과 섞은 후 LC/MS-MS 분석을 수행하였다. 그 결과 비배당체 이소플라본인 daidzein과 genistein이 실험군용 사탕으로부터 검출된 반면 대조군용 사탕에서는 검출되지 않았다 (표 28).
[표 27] 사탕 성분 비교
Figure 112015094864135-pat00027

[표 28] 사탕 내 비배당체 이소플라본 함량 측정
Figure 112015094864135-pat00028
†Aglycone isoflavone contents in candies: Mean±S.D. (ng/ml)
제조예 2: 비배당체 함유 유산균 정장제의 제조
락토바실러스 플란타럼 K8을 당업계에 공지된 방법에 따라 사포닌 또는 이소플라본 배당체와 같은 다양한 배당체를 첨가한 MRS 배지에서 대량 배양 하여 유산균 원말을 제조하였다. 제조된 락토바실러스 플란타럼 K8 원말에 소량의 칼슘 및 비타민 D를 혼합하여 정장제품을 제조하였다. 구체적인 조성은 하기 표 29에 기재하였다. 정장효과를 높이기 위해 정장효과가 있는 다른 유산균 원말, 예컨대, 대장에 존재하는 것으로 알려진 비피더스균 원말을 소량 첨가할 수 있다.
[표 29] 락토바실러스 플란타럼 K8을 함유하는 정장제의 조성
Figure 112015094864135-pat00029

제조예 3: 비배당체 함유 유산균을 포함하는 생식의 제조
대두 배아 발효분말에 각종 곡류 분말, 해조류 분말, 과채류 분말, 버섯류 분말 및 본 발명의 비배당체 유산균 원말을 혼합하여 생식제품을 제조하였다. 구체적인 조성은 하기 표 30에 기재하였다.
[표 30] 락토바실러스 플란타럼 K8을 함유하는 생식의 조성
Figure 112015094864135-pat00030

제조예 4: 비배당체 유산균을 함유하는 발효유의 제조
탈지유 또는 원유에 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 K8을 전배양한 배양액 1%를 혼합하여 40℃에서 6~8시간 동안 발효하여 발효유를 제조하였다. 구체적인 조성은 하기 표 31에 기재하였다. 상기 탈지유 또는 원유를 발효함에 있어서, 발효시간의 단축 및 발효유의 풍미를 향상시키기 위하여 상업용으로 판매되고 있는 스트렙토코커스 서모필러스 또는 락토바실러스 엑시도필러스를 함께 이용할 수 있다.
[표 31] 비배당체 유산균을 함유하는 발효유의 조성
Figure 112015094864135-pat00031

제조예 6: 락토바실러스 플란타럼 K8을 이용한 발효대두액의 제조
대두액에 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 K8을 전배양한 배양액 1%를 혼합하여 40℃에서 6~8시간 동안 발효하여 발효대두액을 제조하였다. 구체적인 조성은 하기 표 32에 기재하였다. 상기 대두액을 발효함에 있어서, 발효시간의 단축 및 발효유의 풍미를 향상시키기 위하여 상업용으로 판매되고 있는 스트렙토코커스 서모필러스 또는 락토바실러스 엑시도필러스를 함께 이용할 수 있다.
[표 32] 락토바실러스 플란타럼 K8을 함유하는 발효대두액의 조성
Figure 112015094864135-pat00032

제조예 7: 홍삼유산균의 제조
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 K8을 홍삼추출물 0.1%가 포함된 최소배지 100L에서 12 시간 배양한 후 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 물로 세척한 후 동결건조하여 마이크로 캡슐에 담아 홍삼유산균을 제조하였다. 마이크로 캡슐은 Wall material과 응고액에 의한 matriX 형성시 가소제 첨가조건과 가소제의 종류 및 캡슐의 표면장력등을 고려하여 점착력과 응집력을 향상 시킬수 있게 하였고, 캡슐의 외부뿐만 아니라 내부까지도 단단하게 젤화를 시키기 때문에 위산에서 유산균의 생존률을 높이고 장에서 높은 활성을 보이는 유산균 캡슐을 만들 수 있게 하였다. 1차 coating solution으로 Na alginate 1.8%, Glycerol 10%, Xanthan gum 0.32%, Tween 20 0.05%, MRS 5 %을 사용하였고 hardening solution으로 CaCl2 0.5 M, Tween 80 0.5%를 사용하였으며 2차 coating solution으로 Chitosan 1.5%, Lactic acid 1.5%을 사용하였다. 이러한 조건으로 생산된 홍삼유산균 캡슐은 pH 7.4인 인공장액에서 녹는 것을 실험을 통하여 확인하였다. 또한 내산성 시험을 위하여 pH 1.4인 인공위액에서 시간의 간격을 두어 180분까지 반응시킨 후 각각을 인공장액으로 방출하여 생균수를 측정한 결과 인공위액에서의 생존율은 약 95% 이었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. β-글루코시다아제를 발현하는 미생물을 배당체 함유 배지에서 배양하거나, 배당체 함유 반응물과 반응시켜, 상기 미생물 내에 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체를 축적시키는 단계를 포함하는, 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체가 세포 내에 축적되어 있고, 상기 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체의 체내 흡수율을 증진시킬 수 있는 미생물 제제의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배당체는 인삼, 산삼, 콩, 더덕, 메밀, 도라지, 미나리, 녹두, 마늘, 양파, 은행, 칡으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배당체는 이소플라본 배당체, 사포닌 배당체, 페놀배당체, 청산 배당체, 안트라키논 배당체, 강심 배당체, 쓴맛 배당체, 쿠마린 배당체, 유황 배당체 또는 플라보노이드 배당체인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배당체는 다이드진 (daidzin), 제니스틴 (genistin), 글리시틴 (glycitin), 사포닌 (saponin), 루틴(rutin), 헤스페리딘 (hesperidin), 바이칼린 (baicalin), 워고노사이드 (wogonoside), 모그로사이드 V (Mogroside V), 모그로사이드 IIIE (Mogroside IIIE), 아미그달린 (amygdalin) 및 진세노사이드 rg1 및 rb1으로 구성된 군에서 선택되고, 상기 전환된 배당체는 진세노사이드 rg3, rc 및 f2로 구성된 군에서 선택되며, 상기 전환된 비배당체는 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 사포제닌 (sapogenin), 3,4-하이드록시페닐아세트산 (3,4-Hydroxyphenylactic acid), 4-HPA, m-쿠마린산 (m-coumaric acid), p-쿠마린산 (p-coumaric acid), 스틸베노이드 (stilbenoids), 퀘르세틴 (quercetin), 헤스페레틴 (hesparetin), 바이칼레인 (baicalein), 오고닌 (wogonin), 멘델로나이트릴 (mendelonitrile), 벤즈알데하이드 (benzaldehyde), 프로시아니딘 (procyanidin), 나린제닌 (naringenin) 및 쿠마린-유래 화합물 (coumarin-derivated compounds)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물은 유산균, 비피더스, 효모, 코리네박테리움, 아스페르길루스 및 클로스트리디움으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타럼 (L. plantarum), 락토바실러스 사케 (L. sakei), 락토바실러스 람노서스 GG (L. rhamnosus GG), 락토바실러스 델브루키 (L. delbrueckii), 락토바실러스 엑시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스 존스니 (L. johnsonii), 락토바실러스 카제이 (L. casei) 및 락토바실러스 가세리 (L. gasseri)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타럼 K8 (L. plantarum K8) (기탁번호: KCTC 10887BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 β-글루코시다아제를 생산하는 미생물은 그라스 (GRAS(Generally recognized as safe)) 미생물, 비피더스, 효모, 스트렙토코커스 써모필러스 (S. thermophiles), 락토바실러스 카제이 (L. casei), 비피도박테리아 (Bifidobacteria), 락토바실러스 델브릭키이 (Lactobacillus delbrueckii), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 아스퍼질러스 오크라세우스 (Aspergillus ochraceus), 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 아스퍼질러스 소제 (Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 아와모리 (Aspergillus awamori), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 아스퍼질러스 파라시티쿠스 스피어 BGB (Aspergillus parasiticus Speare BGB), 아스퍼질러스 아큘레아투스 (Aspergillus aculeatus), 및 아스퍼질러스 니게르 (Aspergillus niger)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 배양은 미생물 활성화를 위해 미생물을 정치 배양하는 단계, 진탕 배양하는 단계 및 피딩 배양하는 단계를 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 정치 배양은 37℃에서 12시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 진탕 배양은 37℃에서 12시간 동안 6rpm의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 배양은 배지에 미생물 접종 후 배양한 다음, 배당체가 함유된 최소배지로 옮겨 1-36 시간 동안 추가 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단백질 분해효소로 배당체 함유 식물체를 전처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 프로모드 (promod), 알카라제 (alkalase), 뉴드라제 (neutrase) 및 파파인 (papain)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 세포 내 축적된 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체의 농도는 미생물 배양 배지 중 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체의 농도 보다 2배 이상 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되고, 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체가 세포 내에 축적되어 있고, 상기 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체의 체내 흡수율을 증진시킬 수 있는 미생물 제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포 내 축적된 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체의 농도는 미생물 배양 배지 중 전환된 배당체 또는 전환된 비배당체의 농도 보다 2배 이상 높은 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  18. 삭제
  19. 제16항에 있어서, 건조된 분말 형태인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  20. 삭제
  21. 제16항에 따른 미생물 제제를 함유하는 식품.
  22. 제16항에 따른 미생물 제제를 함유하는 항산화, 피부보습, 피부미백, 피부탄력, 주름 또는 진피치밀도 관련 피부 기능 개선용 조성물.
  23. 삭제
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