CN113604378A - 一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用 - Google Patents
一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113604378A CN113604378A CN202110758825.XA CN202110758825A CN113604378A CN 113604378 A CN113604378 A CN 113604378A CN 202110758825 A CN202110758825 A CN 202110758825A CN 113604378 A CN113604378 A CN 113604378A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mogroside
- metabolite
- microbial inoculum
- mogrol
- percent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229930189775 mogroside Natural products 0.000 title claims abstract description 78
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000192031 Ruminococcus Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000604449 Megasphaera Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims abstract description 5
- 241001464948 Coprococcus Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000195634 Dunaliella Species 0.000 claims abstract 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 25
- JLYBBRAAICDTIS-UHFFFAOYSA-N mogrol Natural products CC12C(O)CC3(C)C(C(CCC(O)C(C)(C)O)C)CCC3(C)C1CC=C1C2CCC(O)C1(C)C JLYBBRAAICDTIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- JLYBBRAAICDTIS-AYEHCKLZSA-N mogrol Chemical compound C([C@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]([C@]2(C[C@@H](O)[C@]11C)C)[C@@H](CC[C@@H](O)C(C)(C)O)C)C=C2[C@H]1CC[C@H](O)C2(C)C JLYBBRAAICDTIS-AYEHCKLZSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- KYVIPFHNYCKOMQ-YMRJDYICSA-N (2r,3s,4s,5r,6r)-2-(hydroxymethyl)-6-[[(2r,3s,4s,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-[(3r,6r)-2-hydroxy-6-[(3s,8s,9r,10r,11r,13r,14s,17r)-11-hydroxy-4,4,9,13,14-pentamethyl-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,7,8,10,11,12,15,16,1 Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1O)O)O[C@H](CC[C@@H](C)[C@@H]1[C@]2(C[C@@H](O)[C@@]3(C)[C@H]4C(C([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)CC4)(C)C)=CC[C@H]3[C@]2(C)CC1)C)C(C)(C)O)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O KYVIPFHNYCKOMQ-YMRJDYICSA-N 0.000 claims description 7
- KYVIPFHNYCKOMQ-UHFFFAOYSA-N Mogroside III Natural products C1CC2(C)C3CC=C(C(C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)CC4)(C)C)C4C3(C)C(O)CC2(C)C1C(C)CCC(C(C)(C)O)OC(C(C(O)C1O)O)OC1COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O KYVIPFHNYCKOMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229930191873 mogroside II Natural products 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 5
- 241000160321 Parabacteroides Species 0.000 claims description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 claims description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 235000003846 Ricinus Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000322381 Ricinus <louse> Species 0.000 claims description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 7
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 26
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- -1 heme chloride Chemical class 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 6
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 6
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 6
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 6
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 4
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 4
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241001202853 Blautia Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 241000043362 Megamonas Species 0.000 description 3
- ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N Menaquinone 1 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 3
- 235000019175 phylloquinone Nutrition 0.000 description 3
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 3
- 229960001898 phytomenadione Drugs 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000605314 Ehrlichia Species 0.000 description 2
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 2
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 244000185386 Thladiantha grosvenorii Species 0.000 description 2
- 235000011171 Thladiantha grosvenorii Nutrition 0.000 description 2
- VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N [4-fluoro-2-(hydroxymethyl)phenyl]methanol Chemical compound OCC1=CC=C(F)C=C1CO VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- GHBNZZJYBXQAHG-KUVSNLSMSA-N (2r,3r,4s,5s,6r)-2-[[(2r,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,8s,9r,10r,11r,13r,14s,17r)-17-[(2r,5r)-5-[(2s,3r,4s,5s,6r)-4,5-dihydroxy-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H](CC[C@@H](C)[C@@H]1[C@]2(C[C@@H](O)[C@@]3(C)[C@H]4C(C([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]6[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)O5)O)CC4)(C)C)=CC[C@H]3[C@]2(C)CC1)C)C(C)(C)O)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GHBNZZJYBXQAHG-KUVSNLSMSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000586288 Alipes Species 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001046548 Anaerobium Species 0.000 description 1
- 241001600407 Aphis <genus> Species 0.000 description 1
- 235000016795 Cola Nutrition 0.000 description 1
- 244000228088 Cola acuminata Species 0.000 description 1
- 235000011824 Cola pachycarpa Nutrition 0.000 description 1
- 241001464956 Collinsella Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 1
- 241001468125 Exiguobacterium Species 0.000 description 1
- 241001608234 Faecalibacterium Species 0.000 description 1
- 241000412001 Fusicatenibacter Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000973040 Macrococcus Species 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 235000009815 Momordica Nutrition 0.000 description 1
- 241000218984 Momordica Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241001148769 Woodwardia Species 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-L ammonium ferric citrate Chemical compound [NH4+].[Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011869 dried fruits Nutrition 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960004642 ferric ammonium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 1
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 235000000011 iron ammonium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004313 iron ammonium citrate Substances 0.000 description 1
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- TVJXHJAWHUMLLG-UHFFFAOYSA-N mogroside V Natural products CC(CCC(OC1OC(COC2OC(CO)C(O)C(O)C2OC3OC(CO)C(O)C(O)C3O)C(O)C(O)C1O)C(C)(C)O)C4CCC5(C)C6CC=C7C(CCC(OC8OC(COC9OC(CO)C(O)C(O)C9O)C(O)C(O)C8O)C7(C)C)C6(C)C(O)CC45C TVJXHJAWHUMLLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000021096 natural sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- DKVBOUDTNWVDEP-NJCHZNEYSA-N teicoplanin aglycone Chemical compound N([C@H](C(N[C@@H](C1=CC(O)=CC(O)=C1C=1C(O)=CC=C2C=1)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)OC=1C=C3C=C(C=1O)OC1=CC=C(C=C1Cl)C[C@H](C(=O)N1)NC([C@H](N)C=4C=C(O5)C(O)=CC=4)=O)C(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3NC(=O)[C@@H]1C1=CC5=CC(O)=C1 DKVBOUDTNWVDEP-NJCHZNEYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/20—Preparation of steroids containing heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用，所述复合菌剂包含：普雷沃菌、纺锤链杆、巨单胞菌、拟杆菌、大肠埃氏菌‑志贺氏菌、长栖粪杆菌、林斯氏菌、布劳特氏菌、巨球型菌、考拉杆菌、阿利斯佩斯菌、双歧杆菌、狄氏副拟杆菌、粪厌氧棒杆菌、粪球菌、链球菌、颤螺旋菌、瘤胃球菌、多尔氏菌、丁蓖麻球菌、梭状芽胞杆菌XlVa。所述复合菌剂可以高效制备罗汉果甜苷代谢产物，将罗汉果甜苷完全转化，并且复合菌剂来源于健康人群肠道，安全高效，而且来源广泛且成本低廉。并且与罗汉果甜苷相比，罗汉果甜苷代谢产物具有更强的抗氧化活性，具有一定的药用价值。
Description
技术领域
本发明属于食品微生物组学技术领域，具体涉及一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用。
背景技术
罗汉果甜苷即罗汉果苷V，是一种提取自罗汉果干燥果实的葫芦烷型三萜苷类物质，因其具有甜度高、热量低、生理特性安全良好、稳定性高等优点被作为一种天然的甜味剂和食品添加剂广泛使用。最近的研究表明，罗汉果甜苷在降血糖血脂、清除自由基、抗肿瘤等方面具有潜在的应用价值，因而作为一种健康的功能性食品受到了广泛的关注。
罗汉果甜苷主要是通过其苷元罗汉果醇以β型糖苷键与吡喃葡萄糖苷相连构成，多糖苷的结构在一定程度上限制了其在体内的生物利用度与生物学活性，由于人体缺乏β型糖苷酶，而在肠道微生物中β型糖苷酶具有广泛的分布，因此罗汉果甜苷在进入人体后能够保持其结构的稳定性，直至被肠道微生物进行代谢和消化。目前，经微生物代谢的三萜类化合物被认为具有更强的生物学活性与生物利用度，而次级罗汉果苷及罗汉果醇的获得主要是通过对植物原料中特定成分的提取、富集、分离来进行的。但次级罗汉果苷及罗汉果醇在罗汉果中含量较低，且传统的制备方法分离难度大，成本较高。由人肠道来源的微生物群代谢对高抗氧化活性的罗汉果甜苷代谢产物进行富集具有操作简单，高效等优势。
目前公开的两种罗汉果甜苷衍生物(次级罗汉果苷及罗汉果醇)的制备方法，CN111217880A采用化学法对罗汉果粉碎物进行水提取，通过树脂吸附及乙醇洗脱后浓缩干燥获得罗汉果糖苷复合物，但未对复合物的具体成分进行阐述；CN111187328B主要通过化学法对罗汉果提取物进行高温高压酸水解后进行柱层析及精制后获得罗汉果醇及11-O-罗汉果醇，两种方法均存在成本较高，且原液成分复杂增加分离纯化难度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以高效制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种微生物混合物，包含：普雷沃菌(Prevotella)、纺锤链杆(Fusicatenibacter)、巨单胞菌(Megamonas)、拟杆菌(Bacteroides)、大肠埃氏菌-志贺氏菌(Escherichia/Shigella)、长栖粪杆菌(Faecalibacterium)、林斯氏菌(Collinsella)、布劳特氏菌(Blautia)、巨球型菌(Megasphaera)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)、阿利斯佩斯菌(Alistipes)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides)、粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes)、粪球菌(Coprococcus)、链球菌(Streptococcus)、颤螺旋菌(Oscillibacter)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、多尔氏菌(Dorea)、丁蓖麻球菌(Butyricicoccus)、梭状芽胞杆菌XlVa(Clostridium_XlVa)。
在本发明的一些实施方式中，所述普雷沃菌、纺锤链杆、巨单胞菌、拟杆菌、大肠埃氏菌-志贺氏菌、长栖粪杆菌、林斯氏菌、布劳特氏菌、巨球型菌、考拉杆菌、阿利斯佩斯菌、双歧杆菌、狄氏副拟杆菌、粪厌氧棒杆菌、粪球菌、链球菌、颤螺旋菌、瘤胃球菌、多尔氏、丁蓖麻球菌属、梭状芽胞杆菌XlVa的配比为：(95～100)：(40～45)：(20～24)：(15～18)：(12～14)：(12～14)：(10～13)：(5～9)：(5～9)：(5～9)：(3～5)：(3～5)：(3～5)：(2～4)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～2)：(1～2)：1。
在本发明的一些实施方式中，所述普雷沃菌、纺锤链杆、巨单胞菌、拟杆菌、大肠埃氏菌-志贺氏菌、长栖粪杆菌、林斯氏菌、布劳特氏菌、巨球型菌、考拉杆菌、阿利斯佩斯菌、双歧杆菌、狄氏副拟杆菌、粪厌氧棒杆菌、粪球菌、链球菌、颤螺旋菌、瘤胃球菌、多尔氏菌、丁蓖麻球菌、梭状芽胞杆菌XlVa的配比为99.11：42.11：21.57：16.17：12.63：12.83：11.49：6.91：6.09：6.14：3.97：3.66：3.8：2.51：1.94：1.69：1.80：1.54：1.03：1.06：1。
本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述复合菌剂在制备罗汉果甜苷代谢产物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述罗汉果甜苷代谢产物为罗汉果苷III、罗汉果苷II、罗汉果苷I、罗汉果醇中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述罗汉果甜苷代谢产物包含：0.2％～1％罗汉果苷III、1％～3％罗汉果苷II、5％～10％罗汉果苷I、80％～90％罗汉果醇。在本发明的一些更优选实施方式中，所述罗汉果甜苷代谢产物为罗汉果醇。
本发明的第三方面，提供一种制备罗汉果甜苷代谢产物的方法，使用本发明第一方面所述复合菌剂进行厌氧发酵。
在本发明的一些实施方式中，所述厌氧发酵的条件为：150～250rpm、35～39℃下反应20～28h。
在本发明的一些实施方式中，所述厌氧发酵的条件为：200rpm、37℃下反应24h。
在本发明的一些实施方式中，所述厌氧发酵为N2环境，气体配比：100％N2。
在本发明的一些实施方式中，厌氧发酵的培养基的配方为：2.0g/L酵母提取物，2.0g/L蛋白胨，0.1g/L氯化钠，0.04g/L磷酸二氢钾，0.04g/L磷酸氢二钾，0.01g/L七水合硫酸镁，0.01g/L氯化钙，2.0g/L碳酸氢钠，0.02g/L氯化血红素，0.5g/L盐酸半胱氨酸，0.5g/L胆盐，2.0mL/L吐温80，1.0mL/L 1％刃天青，10μL/L维生素K1。
在本发明的一些实施方式中，所述罗汉果甜苷的纯度为≥90％，浓度为5～15mg/mL。
在本发明的一些优选实施方式中，所述罗汉果甜苷的浓度为10mg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述厌氧发酵后通过离心-洗涤-醇溶-浓缩分离出罗汉果代谢产物。
本发明的第四方面，提供一种罗汉果甜苷代谢产物，由本发明第三方面所述方法制备而成。
在本发明的一些实施方式中，所述罗汉果甜苷代谢产物包含罗汉果苷III、罗汉果苷II、罗汉果苷I、罗汉果醇中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述代谢产物包含：0.2％～1％罗汉果苷III、1％～3％罗汉果苷II、5％～10％罗汉果苷I、80％～90％罗汉果醇。
在本发明的一些优选实施方式中，所述罗汉果甜苷代谢产物为罗汉果醇。
本发明的第五方面，提供本发明第四方面所述罗汉果甜苷代谢产物在制备抗氧化产品中的应用。
发明人研究了罗汉果甜苷代谢产物的抗氧化活性各项指标均有显著提高，能够更好的用于制备抗氧化产品。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种复合菌剂，包含普雷沃菌、纺锤链杆、巨单胞菌、拟杆菌、大肠埃氏菌-志贺氏菌、长栖粪杆菌、林斯氏菌、布劳特氏菌、巨球型菌、考拉杆菌、阿利斯佩斯菌、双歧杆菌、狄氏副拟杆菌、粪厌氧棒杆菌、粪球菌、链球菌、颤螺旋菌、瘤胃球菌、多尔氏菌属、丁蓖麻球菌、梭状芽胞杆菌XlVa。复合菌剂可以高效制备罗汉果甜苷代谢产物，将罗汉果甜苷完全转化，并且复合菌剂来源于健康人群肠道，安全高效，而且来源广泛且成本低廉。
与其他化学法制备高抗氧化活性的罗汉果糖苷及罗汉果醇等代谢产物的方法相比，本发明采用微生物组发酵法以罗汉果甜苷为底物，利用人源的肠道菌剂发酵获得次级罗汉果甜苷代谢产物，更加安全高效，而且与其它罗汉果甜苷代谢产物制备方法相比次级罗汉果苷水溶性低，能够自动从发酵液体系中析出，从而分离反应液体系与产物，进一步缩短工艺流程，降低分离成本。经鉴定产物中成分组成相对简单易于分离，且与罗汉果甜苷相比具有更强的抗氧化活性，抗氧化活性各项指标均有显著提高，DPPH、ABTS、超氧自由基、羟自由基清除率分别提高约130％、35％、150％、210％；亚铁离子螯合率提高约60％，还原力提高约140％。具有一定的药用价值。
附图说明
图1为不同发酵时间点罗汉果甜苷消耗情况液相色谱图。
图2为罗汉果甜苷(MV)与其代谢产物(MVM)的抗氧化活性比较。A图为DPPH自由基的清除活性测定；B图为ABTS自由基清除活性的测定；C图为超氧阴离子自由基清除活性的测定；D图为羟自由基清除能力；E图为Fe2+螯合能力的测定；F图为样品还原力的测定。
图3为筛选菌株在七叶苷平板上酶活表征情况。
图4为8株高β葡萄糖苷酶活菌株单菌发酵罗汉果苷V 48h上清液相图谱。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
厌氧发酵培养基：2.0g/L酵母提取物，2.0g/L蛋白胨，0.1g/L氯化钠，0.04g/L磷酸二氢钾，0.04g/L磷酸氢二钾，0.01g/L七水合硫酸镁，0.01g/L氯化钙，2.0g/L碳酸氢钠，0.02g/L氯化血红素，0.5g/L盐酸半胱氨酸，0.5g/L胆盐，2.0mL/L吐温80，1.0mL/L 1％刃天青，10μL/L维生素K1。
富集培养基(basal nutrient growth medium supplemented with momordicagrosvenori,BNMM)：液体培养基成分(100mL)：0.2g酵母提取物，0.2g蛋白胨，0.01g NaCl，0.004g KH2PO4，0.004g K2HPO4，0.001g MgSO4·7H2O，0.001g CaCl2，0.2g NaHCO3，0.002g氯化血红素，0.05g半胱氨酸-盐酸，0.05g胆盐，0.2mL吐温80，5μL 1％刃天青溶液和1μL维生素K1，添加1.0g的罗汉果提取物干粉(终浓度为10.0mg/mL)作为主要碳源。
筛选培养基：CMC固体培养基：K2HPO4·3H2O 1.96g/L，KH2PO4 0.75g/L，MgCl2·6H2O 0.4g/L，NH4Cl 0.9g/L，NaCl 0.9g/L，FeSO4·7H2O 5.5mg/L(1％FeSO4 0.3mL)，羧甲基纤维素钠(简称CMC-Na，是β-葡萄糖苷酶的底物)1％，用盐酸调节pH值为6.0，1.6％琼脂，高压灭菌(115℃，20min)，倒平板备用。
CMC培养基的配制方法：将CMC-Na和琼脂先分装到锥形瓶，再将已调好pH的其他物质溶解液分装，高压灭菌时CMC-Na和琼脂会直接溶解。灭菌后的培养基在60℃的温度下倒平板，以确保表面光滑。涂布之前，将平板在37℃的厌氧室中放置过夜，以干燥培养基表面。
七叶苷固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，NaCl 5g/L，七叶苷1g/L，柠檬酸铁铵0.5g/L，琼脂粉15g/L，高压灭菌(115℃，20min)，倒平板备用。
实施例1人源肠道菌微生物组菌液的制备
本研究中用于发酵的肠道菌群由4名供体(2男2女)提供，由当地伦理委员会批准同意了这项过程。这些志愿者在实验前三个月内都没有服用抗生素，无任何肠胃疾病；微生物组样品采集后按20％的比例(w/v)用灭菌的厌氧培养基进行重悬预孵育，获得含有稳定肠道微生物的菌群悬浊液作为罗汉果甜苷体外孵育的菌液。
实施例2肠道菌群组成的鉴定
菌液以最高转速离心1min后收集沉淀，采用PowerSoil DNA提取试剂盒(MoBio,Carlsbad,USA)对总DNA进行提取，分别用正向引物(5'-CCTACGGGNGGCWGCAC-3'SEQ IDNO.1)和反向引物(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'SEQ ID NO.2)扩增16S rRNA基因的V3-V4高变区进行文库构建及高通量测序，测序结果与RDP数据库进行比对，代表序列按照97％相似度进行聚类，实验用肠道菌群组分主要见表1。
表1肠道菌群组分分析
实施例3肠道菌群对罗汉果甜苷的体外转化
肠道菌群孵育培养基采用厌氧培养基，向厌氧培养基中分别添加罗汉果甜苷干粉，添加量为10mg/mL。随后，1mL过滤后的菌群悬浊液被接种到含有罗汉果甜苷的25mL厌氧培养基中进行发酵，在N2环境，200rpm转速下进行37℃下厌氧孵育反应24h。
高效液相色谱结果见图1，表明发酵上清液中罗汉果甜苷在经过肠道菌群24h代谢后被完全转化。
实施例4质谱检测
1)浓缩、重悬
取24h罗汉果甜苷肠菌发酵液进行12000rpm离心5min分离沉淀与上清液，弃去上清，沉淀用无菌水重复洗涤3次后，用等体积甲醇溶解沉淀，涡旋混匀，12000rpm离心2min分离沉淀与上清，再次用等体积甲醇溶解沉淀并离心分离，直至离心后沉淀含量不变，合并多次甲醇提取液进行进一步浓缩。
取罗汉果苷复合物的甲醇溶液于新的15mL离心管(离心管预先称重)，采用氮吹仪对溶液进行浓缩干燥，吹干后称量离心管质量，减去空管质量得罗汉果苷复合物质量，按照10mg/mL浓度加入适量甲醇进行复溶，溶液经过0.22μm滤膜过滤后用于抗氧化活性检测与质谱检测。
2)高分辨质谱鉴定罗汉果苷复合物组成
对获得的罗汉果苷复合物进行质谱分析采用高分辨液质联用仪(UHPLC-MS)进行组分鉴定。液相分离采用Hypersil GOLD C18柱(100mm×2.1mm.,1.9μm；Thermo FisherScientific)，流动相甲酸(0.1％，v/v，A相)与甲醇(B相)梯度洗脱比例为：0～1min，2％B相维持1min；1～9min B相比例从2％升至98％；9～12min，B相维持3分钟。
进样量为5μL，流速为0.35mL/min，柱箱保持35℃。离子源参数为，喷淋电压：3kV；毛细管温度：320℃；保护气流量：40L/h；辅助气流量：10L/h；扫描范围：m/z 133.4～2000；负离子模式下进行。分子量结果与已报道罗汉果苷数据集进行比对。结果见表2。
表2罗汉果甜苷孵育前后成分质谱响应值鉴定结果
结果表明，罗汉果甜苷经过肠道微生物代谢后转化为难溶于水的代谢产物从发酵液中析出，经过高分辨质谱鉴定，罗汉果甜苷代谢产物中罗汉果醇为主要代谢产物及代谢终产物。
实施例5罗汉果苷复合物抗氧化活性评价
1对DPPH自由基的清除活性测定
反应在96孔微孔板上进行，每孔加入100μL样品溶液、25μL无水乙醇溶解的DPPH溶液(0.4mM)并混匀。在30℃黑暗中反应30min，用酶标仪在515nm处测定吸光值。
清除DPPH自由基活性(％)：
其中Abs0是对照(甲醇)的吸光值，Abs1是样品的吸光值，Abs2是样品在与Abs1相同条件下用无水乙醇代替DPPH溶液的吸光值。结果见图2中A图。
2ABTS自由基清除活性的测定
将ABTS原液(7.0mM)用等体积过硫酸钾(K2S2O8，4.95mM)室温黑暗过夜氧化，生成ABTS自由基溶液。ABTS自由基溶液用PBS(0.2M，pH7.4)稀释，使其在734nm波长处的吸光值为0.70±0.02，得到ABTS+反应液。将20μL样品和200μL反应液混合在96孔板中，室温下反应6min，在734nm波长处测定吸光值。计算公式参照DPPH自由基清除率计算。
其中Abs0是对照的吸光值，Abs1是样品的吸光值，Abs2是样品在与Abs1相同条件下用PBS代替ABTS反应液的吸光值。结果见图2中B图。
3超氧阴离子自由基清除活性的测定
NADH、NBT和PMS用PBS(0.1M，pH7.4)溶液溶解。将50μL的样品、50μL的NADH(468μM)、50μL的NBT(156μM)和50μL的PMS(60μM)混合在96孔板中，25℃孵育5min，560nm处测定吸光值。计算公式参照DPPH自由基清除率计算。
其中Abs0是对照的吸光值，Abs1是样品的吸光值，Abs2是样品在与Abs1相同条件下用0.1M PBS代替NBT溶液的吸光值。结果见图2中C图。
4羟自由基清除活性的测定
将50μL样品、50μL FeSO4·7H2O(6.0mM)和50μL H2O2(2.4mM)混合，室温反应10min，加入50μL水杨酸(6.0mM)，30℃下孵育30min，测量510nm的吸光值。计算公式参照DPPH自由基清除率计算。
其中Abs0是对照的吸光值，Abs1是样品的吸光值，Abs2是样品在与Abs1相同条件下用无菌水代替H2O2的吸光值。结果见图2中D图。
5Fe2+金属螯合能力测定
将50μL的样品、2.5μL的FeCl2(3.0mM)、10μL的Ferrozine(5.0mM，菲洛嗪)溶液和137μL的无菌水混合，在25℃下孵育10min，然后在562nm处测定吸光值。计算公式参照DPPH自由基清除率计算。
其中Abs0是对照的吸光值，Abs1是样品的吸光值，Abs2是样品在与Abs1相同条件下用无菌水代替FeCl2溶液的吸光值。结果见图2中E图。
6样品还原力的测定
样品的还原反应在96孔微孔板上进行，每孔含有50μL样品溶液、50μL PBS缓冲液(0.2M，pH6.6)和50μL K3Fe(CN)6溶液(铁氰化钾，1％，w/v)的混合物，在50℃孵育20min。加入50μL三氯乙酸(10％，w/v，终止反应)和30μL FeCl3(0.1％，w/v)后，在700nm处测定吸光值。
还原力＝Abs1-Abs2。
其中Abs1是样品的吸光值，Abs2是样品在与Abs1相同条件下用无菌水代替FeCl3溶液的吸光值。结果见图2中F图。
结果表明罗汉果甜苷复合物抗氧化活性各项指标均有显著提高，DPPH、ABTS、超氧自由基、羟自由基清除率分别提高约130％、35％、150％、210％；亚铁离子螯合率提高约60％，还原力提高约140％。
对比例1糖苷水解酶活性菌株筛选及单菌发酵
1)将实施例3中获得的菌群发酵液采用0.02M PBS(pH＝7.2)缓冲液梯度稀释至10-8，吸取10-1～10-8稀释液各200μL分别涂布于以CMC为唯一碳源的固体平板初筛培养基上，37℃下厌氧培养3d，待能利用CMC的菌落长出后，在菌落密度合适且分离良好的稀释度平板上挑取形态大小不一的单菌落划线分离。将划线纯化3次后得到的单菌落接种于10mLGAM液体培养基中，37℃厌氧培养48h后，将菌液保存在15％甘油中，置于-80℃保存，作为供试菌种进行后续实验。同时，将划线纯化后的单菌落点到七叶苷固体培养基平板上，37℃下培养48h，定性检测纯化菌株是否产β-葡萄糖苷酶，图3为筛选菌株在七叶苷平板上酶活表征情况。
2)单菌发酵罗汉果甜苷(MV)
根据酶活大小的定性表征(黑色圈大小)将筛选出的1、3、4、5、8、9、10、12号产β葡萄糖苷酶能力的保种菌株在GAM平板上划线活化，将活化长出的单菌落接种于10mL GAM培养基中，厌氧培养24h后作为种子液。同时，将活化长出的单菌落分别点板于在好氧和厌氧条件下培养的七叶苷平板，观察对比菌株在好氧和厌氧条件下的产酶能力，综合不同条件平板上产生黑色圈的结果，挑选产酶变色圈更早出现且颜色较深的菌株进行罗汉果甜苷(MV)的发酵培养，种子液分别调节OD值为1.0接种于10mL液体发酵培养基中，每株菌作3个平行样，并以不接菌的发酵培养基作对照，在37℃、200r/min的好氧条件下发酵培养。48h发酵液取上清待用于高效液相测定，探究单一菌株是否发酵降解了罗汉果甜苷(MV)，结果见图4。
可以看出，发酵48h后，发酵液上清中罗汉果甜苷(MV)峰面积几乎没有下降，表明以上单一菌株无法代谢罗汉果甜苷(MV)，肠道菌群对罗汉果甜苷(MV)的代谢可能存在不同菌株之间潜在的协同作用。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
cctacgggng gcwgcac 17
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gactachvgg gtatctaatc c 21
Claims (10)
1.一种复合菌剂，包含：普雷沃菌、纺锤链杆、巨单胞菌、拟杆菌、大肠埃氏菌-志贺氏菌、长栖粪杆菌、林斯氏菌、布劳特氏菌、巨球型菌、考拉杆菌、阿利斯佩斯菌、双歧杆菌、狄氏副拟杆菌、粪厌氧棒杆菌、粪球菌、链球菌、颤螺旋菌、瘤胃球菌、多尔氏菌、丁蓖麻球菌、梭状芽胞杆菌XlVa。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述普雷沃菌、纺锤链杆、巨单胞菌、拟杆菌、大肠埃氏菌-志贺氏菌、长栖粪杆菌、林斯氏菌、布劳特氏菌、巨球型菌、考拉杆菌、阿利斯佩斯菌、双歧杆菌、狄氏副拟杆菌、粪厌氧棒杆菌、粪球菌、链球菌、颤螺旋菌、瘤胃球菌、多尔氏、丁蓖麻球菌属、梭状芽胞杆菌XlVa的配比为：(95～100)：(40～45)：(20～24)：(15～18)：(12～14)：(12～14)：(10～13)：(5～9)：(5～9)：(5～9)：(3～5)：(3～5)：(3～5)：(2～4)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～2)：(1～2)：1。
3.权利要求1～2任一项所述复合菌剂在制备罗汉果甜苷代谢产物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述罗汉果甜苷代谢产物为罗汉果苷III、罗汉果苷II、罗汉果苷I、罗汉果醇中的至少一种，优选为罗汉果醇。
5.一种制备罗汉果甜苷代谢产物的方法，具体为：以罗汉果甜苷为底物，使用权利要求1～2任一项所述复合菌剂进行厌氧发酵。
6.根据权利5所述的方法，其特征在于，所述厌氧发酵的条件为：150～250rpm、35～39℃下反应20～28h。
7.一种罗汉果甜苷代谢产物，由权利要求5或6所述的方法制备而成。
8.一种罗汉果甜苷代谢产物，包含罗汉果苷III、罗汉果苷II、罗汉果苷I、罗汉果醇中的至少一种，优选为罗汉果醇。
9.根据权利要求8所述的罗汉果甜苷代谢产物，其特征在于，所述代谢产物包含：0.2％～1％罗汉果苷III、1％～3％罗汉果苷II、5％～10％罗汉果苷I、80％～90％罗汉果醇。
10.权利要求8或9所述的罗汉果甜苷代谢产物制备抗氧化产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110758825.XA CN113604378A (zh) | 2021-07-05 | 2021-07-05 | 一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110758825.XA CN113604378A (zh) | 2021-07-05 | 2021-07-05 | 一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113604378A true CN113604378A (zh) | 2021-11-05 |
Family
ID=78304031
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110758825.XA Pending CN113604378A (zh) | 2021-07-05 | 2021-07-05 | 一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113604378A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140342438A1 (en) * | 2011-09-14 | 2014-11-20 | University Of Guelph | Media supplements and methods to culture human gastrointestinal anaerobic microorganisms |
| US20170306289A1 (en) * | 2014-09-30 | 2017-10-26 | Rna Inc. | Method for preparing microbial preparation and microbial preparation produced by the same |
| CN108289917A (zh) * | 2015-08-24 | 2018-07-17 | 努比约塔有限公司 | 使用粪源细菌群落来治疗微生态失衡的系统和方法 |
-
2021
- 2021-07-05 CN CN202110758825.XA patent/CN113604378A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140342438A1 (en) * | 2011-09-14 | 2014-11-20 | University Of Guelph | Media supplements and methods to culture human gastrointestinal anaerobic microorganisms |
| US20170306289A1 (en) * | 2014-09-30 | 2017-10-26 | Rna Inc. | Method for preparing microbial preparation and microbial preparation produced by the same |
| CN108289917A (zh) * | 2015-08-24 | 2018-07-17 | 努比约塔有限公司 | 使用粪源细菌群落来治疗微生态失衡的系统和方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 卢凤来;黄振聪;颜小捷;陈月圆;徐风;蔡少青;李典鹏;: "罗汉果皂苷Ⅴ在人工胃液中的稳定性和体外代谢研究" * |
| 杨秀伟;张建业;徐嵬;: "罗汉果皂苷Ⅲ的人肠内细菌生物转化" * |
| 黄振聪: "罗汉果皂苷 V 的体内、体外代谢研究" * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Production, characterization and antioxidant activities in vitro of exopolysaccharides from endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3 | |
| CN104293699B (zh) | 一株具有γ‑氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌及其应用 | |
| Wang et al. | Production and characterization of exopolysaccharides and antioxidant from Paenibacillus sp. TKU023 | |
| CN109971681B (zh) | 老窖梭状芽孢杆菌及其用途 | |
| CN111849836B (zh) | 一种具有抗氧化的鼠李糖乳杆菌及其应用 | |
| CN106434483A (zh) | 一种布氏乳杆菌及其应用 | |
| WO2018155485A1 (ja) | 新規微生物、およびそれを用いたウロリチン類の製造方法 | |
| CN115181682B (zh) | 一株高富集有机锌的发酵乳杆菌 | |
| CN109943617A (zh) | 生产丁酸及／或其盐类的方法 | |
| CN110982759A (zh) | 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及其应用 | |
| WO2012174978A1 (zh) | 维生素c二步混菌发酵的菌种改造和过程优化 | |
| CN107012095B (zh) | 猪结肠微生物组体外模拟培养的发酵参数 | |
| CN113604378A (zh) | 一种制备罗汉果甜苷代谢产物的复合菌剂及其应用 | |
| CN115093985B (zh) | 一种乳双歧杆菌及其发酵方法和应用 | |
| CN110527650A (zh) | 一种假诺卡氏菌及其应用 | |
| CN116047080A (zh) | 一种基于体外发酵模型评价肠道菌群色氨酸代谢的方法及其应用 | |
| CN114916610A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的方法及应用 | |
| CN101285048A (zh) | 类球红细菌突变株及其应用 | |
| Zeng et al. | Development of new strategies for the production of high-purity fructooligosaccharides using β-fructofuranosidase and a novel isolated Wickerhamomyces anomalus | |
| CN106399181A (zh) | 布氏乳杆菌8‑2n及在制备苯乳酸中的应用 | |
| CN101948767A (zh) | 一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法 | |
| CN114908019B (zh) | 一种屎肠球菌复合菌剂及其复配方法和应用 | |
| CN109735473A (zh) | 发酵法制水溶性姜黄素 | |
| CN115725475B (zh) | 一种具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物及其制备方法 | |
| Rabkin et al. | Thermophilic bacteria: a new cause of human disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211105 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |