CN116047080A - 一种基于体外发酵模型评价肠道菌群色氨酸代谢的方法及其应用 - Google Patents

一种基于体外发酵模型评价肠道菌群色氨酸代谢的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于体外发酵模型评价肠道菌群色氨酸代谢的方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明利用体外发酵模型发现大枣多糖、牛樟芝多糖、黄精多糖改变了肠道菌群α多样性；灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖改变了菌群β多样性；灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖增加肠道有益菌的相对丰度，促进肠道健康；褐藻多糖和茯苓多糖显著促进色氨酸代谢物I3C、ILA产生。因此，本发明提供的体外发酵模型可以高效灵敏的判断不同膳食多糖对肠道菌群、肠道微生态以及肠道菌群色氨酸代谢能力的影响，可以在体外广泛用于筛选对于肠道菌群有益的膳食多糖。

Description

一种基于体外发酵模型评价肠道菌群色氨酸代谢的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于体外发酵模型评价肠道菌群色氨酸代谢的方法及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
多糖是由十个以上的单糖分子通过缩合、失水而成的高分子聚合物，是构成生命体的基础物质之一。大多数多糖不能被人类基因组中编码的酶降解，但肠道微生物能够通过分泌碳水化合物活性酶(CAZyme)将多糖分解，包括多糖裂解酶(PLs)、糖苷水解酶(GHs)和碳水化合物酯酶(CEs)，并且肠道微生物基因组约为人类宿主基因的150倍，可诱导数千种互补的CAZymes，可以靶向消化代谢数十种多糖，帮助人体更好地吸收利用多糖，促进机体健康，多糖又能增加肠道中有益菌的比例，以此调节肠道微生物组成改善宿主的健康。此外多糖中不可被直接消化的成分和发酵产物，例如短链脂肪酸或者色氨酸代谢物可进一步调节肠道菌群的组成，改善肠道功能，参与调控抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤等基因的表达，达到治疗疾病和维持机体健康的目的。
色氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，人体肠道中的色氨酸代谢主要分为三个途径：其一，在肠道上皮细胞和免疫细胞中，约90％的色氨酸通过吲哚胺2，3-双加氧酶1(IDO1)代谢为犬尿氨酸，即犬尿氨酸通路(KP通路)；其二，在肠腔内，肠道菌群直接代谢约4％-6％的色氨酸，产生多种小分子物质，包括芳香烃受体(AhR)的配体；第三，肠嗜铬细胞中约3％色氨酸通过色氨酸羟化酶1(Tph1)代谢为5-羟色胺，即5-羟色胺(5-HT)通路，产生了全身90％以上的5-HT。肠道菌群色氨酸代谢物影响着屏障、蠕动、消化吸收、分泌、免疫等多种肠道功能，外源性补充色氨酸可提高肠道中有益菌的丰度，并通过提升其代谢物含量以维持肠黏膜稳态。色氨酸在肠道免疫耐受及肠道菌群维持之间的平衡中起到重要作用，肠道菌群通过调节色氨酸代谢影响宿主免疫系统，内源性菌群色氨酸代谢产物影响肠道菌群组成。
肠道内菌群色氨酸代谢物包括多种小分子，如吲哚及其衍生物，例如犬尿氨酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、吲哚乳酸和吲哚甲醛，它们是AhR配体，而AhR信号被认为是屏障免疫反应的关键组成部分，因此对肠道内稳态至关重，它有助于肠上皮细胞的更新和肠黏膜屏障的完整性，并且其作用于许多种类的免疫细胞，包括上皮内淋巴细胞、Th17细胞、先天性淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞(DCs)和中性粒细胞。
研究认为，多糖可作为益生元来促进肠道中有益菌增殖、抑制致病菌的生长，维持肠道微生物多样性及微生态平衡，也可通过调节肠道菌群丰度及其菌群代谢物改善多种由于菌群紊乱引起的一系列疾病，而肠道菌群反过来也可以通过分泌多种多糖降解酶协助机体利用本身无法直接代谢吸收的多糖，促进机体健康。但多糖对某些肠道菌群具体调节机制目前还不明确，甚至某些多糖还会引起疾病，目前对于大批量探究多糖干预肠道菌群的研究方法也相对较少，对多糖干预肠道菌群色氨酸代谢也知之甚少。
发明内容
技术问题：
本发明要解决的技术问题是提供粪便体外发酵模型并应用该模型筛选出改善肠道菌群色氨酸代谢的膳食多糖。
技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种体外发酵模型评价膳食多糖对肠道菌群色氨酸代谢影响的方法，所述方法为将新鲜粪便预处理后，将粪便匀浆液接种于含有膳食多糖的基础培养基中，厌氧发酵，离心，测定上清液中色氨酸代谢产物以及沉淀中肠道菌群的多样性。
在一种实施方式中，所述预处理为将新鲜粪便与缓冲液按体积比混合并去除大颗粒，制得粪便匀浆液。
在一种实施方式中，所述缓冲液为含有半胱氨酸并去除氧气的磷酸盐缓冲液。
在一种实施方式中，所述缓冲液为含有半胱氨酸并去除氧气的pH 7.3、0.01MPBS。
在一种实施方式中，所述体积比为(1:5)～(1:20)。
在一种实施方式中，将粪便匀浆液按照体积比10％～30％接种于含有膳食多糖的基础培养基中。
在一种实施方式中，所述厌氧发酵的条件为35～38℃厌氧培养20～30h。
在一种实施方式中，所述基础培养基包括胰蛋白胨4～6g/L，大豆蛋白胨2.5～3.5g/L，
Figure BDA0004035326030000021
蛋白胨4～6g/L，消化血清粉8～12g/L，酵母浸膏2～3g/L，牛肉浸膏2～3g/L，肝脏浸膏1～1.5g/L，膳食多糖4～6g/L，L-色氨酸0.2g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，硫代乙醇酸钠0.3g/L，L-精氨酸1.0g/L，维生素K 4～6mg/L，血红素8～12mg/L，磷酸二氢钾2～3g/L，氯化钠2.5～3.5g/L。
在一种实施方案中，所述膳食多糖选自灵芝多糖子实体、黄芪多糖、燕麦葡萄糖、灰树花多糖、灰树花多糖、蛹虫草多糖子实体、桑黄多糖、白桦茸多糖、褐藻多糖、金针菇多糖、氨基葡聚糖、枸杞多糖、姬松茸多糖、树舌灵芝多糖、大枣多糖、猴头菇多糖、香菇多糖、山药多糖、银耳多糖、白耙齿菌多糖、白耙齿菌多糖、木耳多糖、黄精多糖或茯苓多糖中至少一种。
在一种实施方案中，所述膳食多糖包括50％灵芝多糖子实体、90％黄芪多糖、80％燕麦葡萄糖、50％灰树花多糖、50％灰树花多糖、50％蛹虫草多糖子实体、50％桑黄多糖、70％白桦茸多糖、85％褐藻多糖、50％金针菇多糖、99％氨基葡聚糖、50％枸杞多糖、70％姬松茸多糖、50％树舌灵芝多糖、50％大枣多糖、50％猴头菇多糖、50％香菇多糖、30％山药多糖、50％银耳多糖、50％白耙齿菌多糖、50％白耙齿菌多糖、50％木耳多糖、50％黄精多糖或50％茯苓多糖中的至少一种。
在一种实施方式中，所述培养基中膳食多糖添加量为0.5％。
在一种实施方式中，所述培养基的pH为7.2～7.4。
在一种实施方式中，所述离心的条件为5000～10000g离心5～15min。
在一种实施方式中，所述沉淀中肠道菌群的多样性的测定方法为通过提取沉淀菌泥的基因组，进行16S rRNA测序。
在一种实施方式中，采用液相色谱-质谱联用分析法检测色氨酸代谢产物。
在一种实施方式中，采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用分析法检测色氨酸代谢产物。
在一种实施方式中，所述色氨酸代谢产物包括犬尿氨酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、吲哚乳酸、吲哚3甲醛、色胺和色氨酸。
有益效果：
本发明提供一种筛选对肠道微生态具有促进作用的物质的体外发酵方法及其用于筛选膳食多糖的应用，进而筛选出促进色氨酸代谢物的膳食多糖，具体体现在：
(1)大枣多糖、牛樟芝多糖、黄精多糖显著提高了肠道微生物的丰富度和均匀度，改变了肠道菌群α多样性；
(2)灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖改变了菌群β多样性，其他多糖如黄芪多糖、白桦茸多糖和猴头菇多糖维持肠道菌群β多样性；
(3)灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖增加肠道有益菌Bifidobacterium和Lactobacillus相对丰度，改善肠道属水平物种组成，促进肠道健康；
(4)褐藻多糖和茯苓多糖显著促进色氨酸代谢物I3C、ILA产生；
(5)膳食多糖促进Lactobacillus,Faeclibacterium,Bifidobacterium的相对丰度。
因此，本发明提供的体外发酵模型可以高效灵敏的判断不同膳食多糖对肠道菌群、肠道微生态以及肠道菌群色氨酸代谢能力的影响，可以在体外广泛用于筛选对于肠道菌群有益的膳食多糖。
附图说明
图1：不同膳食多糖对肠道菌群α多样性的影响。
图2：不同膳食多糖对肠道菌群β多样性的影响。
图3：不同膳食多糖对肠道菌群属水平的影响。
图4：不同膳食多糖对色氨酸代谢物的影响。
图5：膳食多糖促进过敏患者粪便中乳酸杆菌属的相对丰度。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
mGAM培养基(1L)：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨3g，
Figure BDA0004035326030000042
蛋白胨5g，消化血清粉10g，酵母浸膏2.5g，牛肉浸膏2.2g，肝脏浸膏1.2g，L-色氨酸0.2g，L-精氨酸1.0g，L-半胱氨酸0.3g，硫代乙醇酸钠0.3g，维生素K 5mg，氯化血红素10mg，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3.0g，溶剂为纯净水，pH为7.2～7.4。膳食多糖添加量为0.5％(A～Y任一)，具体见表1。
表1膳食多糖分组信息
Figure BDA0004035326030000041
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
酸度检测方法：采用国标GB 431334-2010。
实施例1：膳食多糖改变肠道菌群α多样性
新鲜粪便立即收集于35mL采样管中，盖子未拧紧的条件下放置于实验室专用小袋中，并放入产气厌氧袋，以此形成无氧的密闭环境。随后放置于4℃条件下暂存，并在2h内完成后续粪便体外发酵实验。对粪便样品进行预处理，在厌氧条件下称取定量新鲜粪便，与灭菌后且加有半胱氨酸并去除氧气的pH 7.3、0.01M PBS按1:10的体积比稀释，混合均匀后并用双层纱布过滤去除大颗粒，滤液即为粪便匀浆液，按20％体积比将其接种于含有膳食多糖的mGAM培养基中，37℃厌氧培养24h，获得含有肠道微生物的发酵液，离心，收集菌泥，提取DNA，通过16S rRNA测序。结果见图1。
由图1可知。采用Pielou’s Evenness、Observed OTUs和Shannon 3种α多样性指数探究膳食多糖对肠道菌群的丰富度和均匀度的影响。Observed OTUs指数主要用来表示某一群落中的物种丰富度，Pielou’s Evenness指数是最常用的均匀度指数，Shannon指数则反映群落中的物种的丰富度及均匀度。通过选取相对丰度在一个样本中至少大于千分之一的属水平物种丰度表作为原始数据集。产生的代表性序列OTU通过total sum scaling(TSS)进行标准化，采用Mann-Whitney/Kruskal-Wallis检验(非参数)比较两组间α多样性，与空白组相比，多数多糖组的Evenness指数，Observed OTUs和Shannon指数升高但这些变化都无显著性，而对比加入可溶性淀粉的阳性对照组，黄芪多糖、褐藻多糖、大枣多糖、山药多糖、银耳多糖、牛樟芝多糖和黄精多糖显著提升Evenness指数，姬松茸多糖、树舌灵芝多糖、猴头菇多糖、香菇多糖、山药多糖、白耙齿菌多糖、木耳多糖和黄精多糖显著提升Observed_otus指数，大枣多糖、牛樟芝多糖和黄精多糖显著提升Shannon指数，表明多糖改变肠道微生物的丰富度和均匀度，维持肠道健康。
以上结果表明，大枣多糖、牛樟芝多糖、黄精多糖显著提高了肠道微生物的丰富度和均匀度，改善肠道菌群组成，而其他多糖对菌群多样性调节不显著。
实施例2：膳食多糖改变肠道菌群β多样性
新鲜粪便立即收集于35mL采样管中，盖子未拧紧的条件下放置于实验室专用小袋中，并放入产气厌氧袋，以此形成无氧的密闭环境。随后放置于4℃条件下暂存，并在2h内完成后续粪便体外发酵实验。对粪便样品进行预处理，厌氧条件下称取定量新鲜粪便，与灭菌后且加有半胱氨酸并去除氧气的pH 7.3、0.01M PBS按1:10的体积比稀释，混合均匀后并用双层纱布过滤去除大颗粒，滤液即为粪便匀浆液，将其按20％体积比接种于含有膳食多糖的mGAM培养基中，37℃厌氧培养24h，获得含有肠道微生物的发酵液，离心，收集菌泥，提取DNA，通过16S rRNA测序。结果见图2。
由图2可知。通过基于Bray-Curtis index的非度量多维尺度分析(non-metricmultidimensional scaling,NMDS)计算菌群β多样性，使用ANOSIM进行数据统计计算显著性。NMDS结果的评估标准是stress值，表示观察距离和拟合距离的不一致性，也可以理解为样品在降维后形成的空间距离与其在原始多维空间距离的差值。这个值越小越好，说明在低维空间更完整地捕获了高维空间的信息。通过比较两个群落微生物组成上的差异，发现灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖的Stress值小于0.2，显著改变菌群β多样性(P<0.05)。
以上结果表明，灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖改变菌群群落，但其他多糖如黄芪多糖、白桦茸多糖和猴头菇多糖不会造成肠道微生物组大幅扰动，保持肠道健康。
实施例3：膳食多糖对肠道菌群属水平的影响。
新鲜粪便立即收集于35mL采样管中，盖子未拧紧的条件下放置于实验室专用小袋中，并放入产气厌氧袋，以此形成无氧的密闭环境。随后放置于4℃条件下暂存，并在2h内完成后续粪便体外发酵实验。对粪便样品进行预处理，厌氧条件下称取定量新鲜粪便，与灭菌后且加有半胱氨酸并去除氧气的pH 7.3、0.01M PBS按1:10的体积比稀释，混合均匀后并用双层纱布过滤去除大颗粒，滤液即为粪便匀浆液，将其按20％体积比接种于含有膳食多糖的mGAM培养基中，37℃厌氧培养24h，获得含有肠道微生物的发酵液，离心收集菌泥，提取DNA，通过16S rRNA测序。结果见图3。
由图3可知，通过选取相对丰度在一个样本中至少大于千分之一的属水平物种丰度表作为原始数据集。经过属水平相对丰富分析发现对比对照组，灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖促进肠道微生物Bifidobacterium和Lactobacillus属水平相对丰度。
以上结果说明，灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖增加肠道有益菌Bifidobacterium和Lactobacillus相对丰度，改善肠道属水平物种组成，促进肠道健康。
实施例4：膳食多糖对色氨酸代谢物的影响
新鲜粪便立即收集于35mL采样管中，盖子未拧紧的条件下放置于实验室专用小袋中，并放入产气厌氧袋，以此形成无氧的密闭环境。随后放置于4℃条件下暂存，并在2h内完成后续粪便体外发酵实验。对粪便样品进行预处理，厌氧条件下称取定量新鲜粪便，与灭菌后且加有半胱氨酸并去除氧气的pH 7.3、0.01M PBS按1:10的体积比稀释，混合均匀后并用双层纱布过滤去除大颗粒，滤液即为粪便匀浆液，将其按20％体积比接种于含有膳食多糖的mGAM培养基中，37℃厌氧培养24h，获得含有肠道微生物的发酵液，离心收集发酵液上清液进行色氨酸靶向代谢组检测。吸取发酵上清液至无酶EP管中，加入混合液(乙腈：甲醇：异丙醇＝8:1:1)后置于冰上以沉淀蛋白，随后真空浓缩直至水分蒸发，加入10％甲醇水重悬离心过膜等待上机检测。采用ACQUITY
Figure BDA0004035326030000071
BEH C181.7μm(100mm×2.10mm)色谱柱，柱温36.5℃，自动进样温度为4℃。流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸水。梯度洗脱时采用先A液再B液洗脱，最后平衡至20min。结果见图4。
由图4可知，通过色氨酸靶向代谢检测发酵上清液发现对比可溶性淀粉组，灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖不能显著增加粪便中Kyn、IPA和IAA，但促进ILA和I3C产生。值得注意的是蛹虫草多糖显著降低菌群色氨酸代谢物物Kyn的含量，褐藻多糖和茯苓多糖干预下菌群色氨酸代谢能力强，对粪便中色氨酸代谢物ILA，I3C增加显著(P<0.05)。
以上实验结果表明，褐藻多糖和茯苓多糖改善菌群色氨酸代谢能力，增加肠道菌群色氨酸代谢物ILA，I3C。
实施例5：膳食多糖促进过敏患者粪便中的乳酸杆菌相对丰度
新鲜粪便立即收集于35mL采样管中，盖子未拧紧的条件下放置于实验室专用小袋中，并放入产气厌氧袋，以此形成无氧的密闭环境。随后放置于4℃条件下暂存，并在2h内完成后续粪便体外发酵实验。对粪便样品进行预处理，厌氧条件下称取定量新鲜粪便，与灭菌后且加有半胱氨酸并去除氧气的pH 7.3、0.01M PBS按1:10的体积比稀释，混合均匀后并用双层纱布过滤去除大颗粒，滤液即为粪便匀浆液，将其按20％体积比接种于含有膳食多糖的mGAM培养基中，37℃厌氧培养24h，获得含有肠道微生物的发酵液，离心收集菌泥。
由图5可知，按试剂盒要求提取发酵后粪便的DNA及其胶回收，简单来说就是针对微生物rRNAV3-V4区的特异性引物进行polymerase chain reaction(PCR)扩增。PCR时正向引物5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'和反向引物5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'。按照试剂盒要求对琼脂糖凝胶电泳后的胶块进行切胶和DNA纯化。在MiSeq PE300(Illumina)平台测序。菌群测序结果经过合并双端及质控，利用QIIME2(https://view.qiime2.org/)平台分析。利用最新的Silva 16s rRNAv132数据库对物种进行注释。基于OTU表，对比发酵前后菌群差异(图5a和b)，多糖调节了过敏人组肠道微生物Lactobacillus(P<0.05),Faeclibacterium(P<0.05),Bifidobacterium(P>0.05)丰度。
以上结果表明，灵芝多糖、蛹虫草多糖、褐藻多糖、金针菇多糖和茯苓多糖等多糖改善过敏患者肠道菌群结构，提升物种丰富度，尤其是促进Lactobacillus和Faeclibacterium，改善肠道健康。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种体外发酵模型评价膳食多糖对肠道菌群色氨酸代谢影响的方法，其特征在于，所述方法为将新鲜粪便预处理后，将粪便匀浆液接种于含有膳食多糖的基础培养基中，厌氧发酵，离心，测定上清液中色氨酸代谢产物以及沉淀中肠道菌群的多样性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理为将新鲜粪便与缓冲液按体积比混合后，去除大颗粒，制得粪便匀浆液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为含有半胱氨酸并去除氧气的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将粪便匀浆液按照体积比10％～30％接种于含有膳食多糖的基础培养基中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述厌氧发酵的条件为35～38℃厌氧培养20～30h。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述基础培养基包括胰蛋白胨4～6g/L，大豆蛋白胨2.5～3.5g/L，
Figure FDA0004035326020000011
蛋白胨4～6g/L，消化血清粉8～12g/L，酵母浸膏2～3g/L，牛肉浸膏2～3g/L，肝脏浸膏1～1.5g/L，膳食多糖4～6g/L，L-色氨酸0.2g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，硫代乙醇酸钠0.3g/L，L-精氨酸1.0g/L，维生素K4～6mg/L，血红素8～12mg/L，磷酸二氢钾2～3g/L,氯化钠2.5～3.5g/L。
7.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，所述膳食多糖选自灵芝多糖子实体、黄芪多糖、燕麦葡萄糖、灰树花多糖、灰树花多糖、蛹虫草多糖子实体、桑黄多糖、白桦茸多糖、褐藻多糖、金针菇多糖、氨基葡聚糖、枸杞多糖、姬松茸多糖、树舌灵芝多糖、大枣多糖、猴头菇多糖、香菇多糖、山药多糖、银耳多糖、白耙齿菌多糖、白耙齿菌多糖、木耳多糖、黄精多糖或茯苓多糖中至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀中肠道菌群的多样性的测定方法为通过提取沉淀菌泥的基因组，进行16S rRNA测序。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用分析法检测色氨酸代谢产物。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述色氨酸代谢产物包括犬尿氨酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、吲哚乳酸、吲哚3甲醛、色胺和色氨酸。
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